一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体及其制备与应用
【专利摘要】本发明涉及一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，该靶向载体包括靶头和支架，所述的靶头为多肽，靶头的质量接枝率为5～10％，摩尔接枝率为2～6％；该靶向载体是将多肽和载体通过聚二乙醇羧酸共价连接进行制备得到，用于装填治疗骨折、骨质疏松、骨关节炎、类风湿性关节炎或肿瘤骨转移的药物。与现有技术相比，本发明具有成骨细胞靶向性、高度骨组织亲和性和高效药物递送能力，能够很好的增强成骨效果，减少用药量，减少细胞毒性和副作用。将为未来骨质疏松治疗提供重要药物载体工具。
【专利说明】
一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体及其制备与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体及其 制备与应用。
【背景技术】
[0002] 骨是高等脊椎动物体内一种高度特异的结缔组织，它提供了对机体的支持作用和 肌肉附着部位。它也是无机离子的主要来源，并积极参与体内的钙磷平衡。骨骼的正常发育 和维护需要骨不断吸收和重建。生理状态下，这种平衡是协调的，骨细胞、破骨细胞以及成 骨细胞的功能正常，骨量和微观结构的完整性保持在一个稳定的状态。然而，这种骨改建失 衡是众多骨疾病包括骨质疏松症，佩吉特氏症，骨质疏松症，骨转移癌，类风湿性关节炎，骨 髓炎等的重要原因。
[0003] 作为一个复杂的活组织，骨主要由三种不同类型的细胞:成骨细胞，破骨细胞和骨 细胞。成骨细胞是骨形成细胞，来源于局部的成骨祖细胞，负责合成骨基质。破骨细胞是骨 吸收细胞，核大，来源于多种造血组织。这两种类型的细胞只存在于骨表面的矿化骨基质， 而骨细胞位于骨基质内，并能吸收并形成骨基质。由于其通过突触相连的特性。骨细胞外基 质是由有机质以及高度矿化的羟基磷灰石组成的。随着骨生物学研究的不断深入，近几年 骨代谢疾病的治疗药物不断发展，骨形成表面、骨吸收表面、破骨细胞、骨基质等已经作为 新的治疗靶点纳入研究。虽然有些研究产物已应用于药物的开发，但具体到骨及细胞受体， 大多数新开发的治疗药物不具备骨特异性。
[0004] 骨质疏松症(Osteoporosis)是一种由骨代谢失衡引起的骨量减少、骨骼微细结构 发生破坏所导致骨骼脆弱而易发生骨折的全身性疾病。骨质疏松症是一个世界范围内重要 的健康问题。随着人口老龄化的加重，骨质疏松症的患病人数显著增加。目前，全世界约有2 亿人罹患骨质疏松症，其发病率已跃居常见病的第七位。其中绝经后女性的患病率更高。65 岁以上的女性高发骨折，严重影响中老年的生活质量、健康和寿命。
[0005] 目前治疗骨质疏松症的药物分为三类：1)抑制骨吸收药物，如双磷酸盐、雌激素 等;2)促进骨形成药物，如甲状旁腺素、氟化物等;3)双向作用药物:维生素 K、锶盐等。由于 骨组织有着硬度大、局部血供不丰富、渗透性差和生理生化过程特殊等特点，按一般的给药 途径很难使药物转运至病灶部位。这些药物常通过全身给药，增大使用剂量才能在骨组织 中达到有效的治疗浓度。由于药物缺乏骨特异性，不仅降低了药物的治疗指数，而且会对病 人的非骨组织或器官造成不必要的毒副作用，如激素替代疗法的长期副作用的最近的报告 显示，以代表药物甲状旁腺素为例，应用超过两年疗效降低，骨量丢失，甚至严重副作用可 有神经症状，肾衰竭等。因此通过药物递送系统将药物靶向递送至骨组织或成骨细胞，从而 增加治疗效果，并降低毒副作用十分重要。目前，根据对羟基磷灰石的靶向作用研究的骨靶 向递送系统包括:四环素类、双磷酸盐类、生长因子类以及多肽类。
[0006] 四环素作为抗菌药，用作骨靶向靶头，不能消除其本身生物学效应，且具有副作用 而导致作用受到限制；由双膦酸盐构建的骨靶向递送系统，能在骨表面以及牙本质表面富 集，很难排除;生长因子具有天然的骨趋向性，但又有半衰期短，易变性，且过量应用可能有 潜在毒性和致癌性等缺点。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种靶向性能好、毒 性和副作用小的基于多肽构建的成骨细胞靶向载体及其制备与应用。
[0008] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种基于多肽构建的成骨细胞靶向 载体，该靶向载体包括靶头和支架，所述靶头通过聚二乙醇羧酸共价连接于所述支架，所述 的靶头为多肽，靶头的质量接枝率为5~10%，摩尔接枝率为2~6%。
[0009] 所述的多肽由丝氨酸和天门冬氨酸两种氨基酸组成，所述多肽中含有2~50个氨 基酸，所述丝氨酸和天门冬氨酸的个数比为(0.25~4): 1。
[0010] 所述的多肽包括丝氨酸和天门冬氨酸，所述多肽的序列优选为Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表丝氨酸，Asp代表天门冬氨酸。
[0011] 牙和骨组织作为人体中矿化程度最高的器官，其中重要的促进矿化蛋白具有增加 骨量，治疗骨质疏松的潜力。Ser Asp Ser Ser Asp选自牙本质磷蛋白（DPP)-级结构，该蛋 白氨基酸排列顺序有特征性的Ser Asp以及Ser Ser Asp重复序列。选择该序列有以下原 因：（1 )DPP来源于人体矿化程度最高的硬组织，牙齿，其表达位置为矿化的牙本质，骨组织 中也有表达；（2)DPP是牙本质中表达量最高的细胞外基质蛋白，在牙槽骨中也有显著表达； (3)DPP缺乏的小鼠其牙本质和骨组织矿化受到明显抑制，牙齿变薄，牙槽骨吸收明显；（4) 蛋白质化学，细胞学及组织学实验证实，DPP中氨基酸Asp是高度酸性的氨基酸，导致Ser Asp Ser Ser Asp酸性较高，能够特异性结合骨组织表面的羟基磷灰石，明显促进成牙细胞 和成骨细胞的成熟和分泌矿化基质。作为较特异的矿化调节蛋白，在牙本质的发育与矿化 过程中起重要作用。（5)体内体外研究发现Ser Asp Ser Ser Asp多肽，能够通过与成骨细 胞表面特异性蛋白骨膜蛋白（periostin)结合，并胞吞进入细胞，从而特异性靶向作用于成 骨细胞。
[0012] 所述的支架为聚氨酯支架，所述支架为60~120纳米，电镜下呈扁球形，可包裹递 送小核酸类药物。聚氨酯材料既有良好的物理机械性能，又具有良好的血液相容性和生物 相容性，因而广泛应用于生物医学领域。其有优良的抗凝血性能和生物相容性，毒性测试复 核医用要求，无致畸变作用，无过敏反应，以及优良的韧性、弹性、耐磨耐湿性、耐腐蚀性和 热稳定性，并在制备成纳米微球后能有效地负载药物，通过血液循环作用于靶器官或靶细 胞。
[0013] -种如上所述基于多肽构建的成骨细胞靶向载体的制备方法，主要包括以下几个 步骤：
[0014] (1)靶头的制备:通过十二通道半自动多肽合成仪按比例将氨基酸缩合成靶头，待 用；
[0015] ⑵支架的制备:将LDI和MEDA以1:(0.5~1)的摩尔比溶于丙酮中，进行混合反应， 然后加入PEG和PCL，加入的PEG、PCL的摩尔量与所述加入的LDI的摩尔量之比为PEG: PCL: LDI = (0.05~0.25): (0.01~0.05): (0.2~2)，反应后加入无水乙醇进行反应，加入的无水 乙醇与所述LDI的摩尔量之比为(0.1~10): (1)，得到粗PU液，然后在粗PU液中加入石油醚 进行沉淀，过滤将沉淀物溶解于丙酮，离心后透析得到PU纳米胶束液，待用；
[0016] (3)靶向载体的合成:将步骤（1)所得靶头溶于去离子水中，然后加入与靶头等质 量的EDC和NHS进行靶肽的活化，然后加入步骤⑵所得PU纳米胶束液，其中靶头的质量与PU 纳米胶束液的体积比为1: (1~10)，静置后透析即得所述成骨细胞靶向载体。
[0017] 上述步骤中，LDI为赖氨酸二异氰酸酯，MEDA为:N-甲基二乙醇胺，PEG为聚乙二醇 二元醇，PCL为聚己内酯二元醇，EDC为1-( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS为 N-羟基琥珀酰亚胺。
[0018] 步骤(2)所述LDI、MEDA的反应温度为50~100°C，反应时间为20~30h;
[0019] 所述PEG，PCL的反应温度为50~100°C，反应时间为70~80h;
[0020] 所述无水乙醇的反应温度为50~100°C，反应时间为40~50h;
[0021 ]所述加入的石油醚与粗PU液的体积之比为1: (0.2~0.5)。
[0022] 步骤(3)所述活化的温度为2~10°C，活化时间为5~20min;
[0023] 静置温度为2~10°C，静置时间为10~20h。
[0024] 因为多肽靶头的长短决定了合成的难易程度，该靶头的成分只包含两种氨基酸就 能够有良好的骨靶向性，因此可以实现短肽就能够完成靶向，因此靶向性得到实现的基础 上，能够满足短肽的特征。
[0025] -种如上所述基于多肽构建的成骨细胞靶向载体的应用，所述的靶向载体用于装 填治疗骨折、股佝偻病、骨质疏松、骨关节炎、类风湿性关节炎或肿瘤骨转移的药物。
[0026] 所述靶向载体和药物的质量比为1: (5~10%)。
[0027] 其主要成分为Ser氨基酸和Asp氨基酸，按照一定比例和顺序连接起来。应用该革巴 向载体递送的小核酸药物能够高效的将小核酸药物递送到特性的靶细胞成骨细胞，并且其 促进骨形成和骨沉积的作用非常明显，可以治疗包括0VX导致的骨质疏松等骨疾病。
[0028] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：
[0029] (1)本发明的靶头来源于具有高矿化调节能力的天然蛋白DPP，具有很高的靶向 性，可以将药物准确送至骨细胞中，减少了药物的副作用；
[0030] (2)本发明的靶头采用短肽，合成简单，生产成本低；
[0031] (3)本发明所用支架为具有良好的亲水性、生物活性和降解性的聚氨酯材料，这种 材料具有很强的可塑性和低毒性，且不会在体内富集，保证了药物的安全性。
[0032] (4)本发明的优选靶头来源于具有高矿化调节能力的天然蛋白DPP，其促进生物矿 化能力明确，同时，减少了药物的副作用。
【附图说明】
[0033]图1为本发明的合成原理示意图；
[0034]图2a为实施例1靶向载体在透射电镜下形貌的图片；
[0035] 图2b为实施例1革E1向载体在透射电镜下革E1向载体的电位分布图；
[0036] 图3a为实施例1中靶头的紫外可见分光光度法测试结果；
[0037] 图3b为实施例1中载体的紫外可见分光光度法测试结果；
[0038] 图3c为实施例1中靶向载体的接枝率的检测结果图；
[0039] 图4为实施例1靶向载体在成骨细胞表面的靶向实验结果图；
[0040]图5为体内成骨细胞定向骨靶向载体验证结果示意图；
[0041 ]图6为成成骨细胞靶向载体的体内器官分布实验结果示意图；
[0042]图7为实施例1靶向载体防止RNA降解的性能检测结果；
[0043]图8成骨靶向载体增加骨量的效果图。
【具体实施方式】
[0044]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0045] 实施例1
[0046] -种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，该靶向载体包括靶头和支架，靶头和支 架靶头和支架通过聚二乙醇羧酸(PEG-C00H)共价连接。其靶头质量接支率约为6%，靶头摩 尔接支率为3%。靶头为由丝氨酸和天门冬氨酸组成的多肽，其中该多肽的序列为Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表丝氨酸，Asp代表天门冬氨酸;支架为聚氨酯支架。
[0047] 上述靶向载体，其合成方法如图1所示，包括以下几个步骤：
[0048] (1)靶头的制备:采用十二通道半自动多肽合成仪，应用氨基酸缩合次序连接方法 合成革E 头，将丝氨酸(？111〇〇-48。(〇丨1311)-0!1)和天门冬氨酸(？1]1〇〇-361'(1'1311)-0!1)按361-六8卩-Ser-Ser-Asp顺序连接，即得革巴头Ser Asp Ser Ser Asp，待用；
[0049] (2)支架的制备:第一步、PU的合成：7.85g LDI、2.98g MEDA和89.17g丙酮于密闭 反应瓶中混合，60°C振荡密封反应24小时。取反应后的溶液49.98g，加入4.44g PEG，0.58g PCL和45g丙酮（总质量为100g)，混合液于60°C振荡反应72小时后再加入0.5g无水乙醇，无 水密封60 °C振荡反应48小时，即可获得TO液。第二步、TO提纯：1 OOmL石油醚中缓慢加入 35mL粗PU液，石油醚沉淀，静置过滤得PU沉淀，将PU沉淀真空烘干得粗提纯PU。将PU溶解于 丙10%的PU丙酮溶液，PU丙酮液与丙酮按体积比为1:9,将PU丙酮稀释液与去离子水为1:1 的比例混合，低温高速离心10min，15000g;离心后的上清液透析丙酮，待透析袋内的液体变 成乳白色即可获得PU纳米胶束液，PU胶束液经冷冻干燥后密封冷冻保存。
[0050] (3)靶向载体的合成:将成骨靶肽Ser Asp Ser Ser Asp溶于lmL去离子水中，再加 入与靶肽等质量的m)C和NHS进行靶肽的活化，4°C孵育lOmin后再往靶肽活化混合液中按一 定的质量体积比（多肽质量:PU液体积~1:5)加入PU纳米胶束液，PU靶肽混合液4 °C反应过 夜。反应结束后，用去离子水对反应液进行透析(Mff=3500)以除去无机盐等杂质，透析后即 可得靶肽偶联的PU纳米胶束液(Ser Asp-PU)，冷冻干燥后密封冷冻保存。
[0051] 用电镜扫描对上述靶向载体进行扫描，其结果如图2a和图2b所示。
[0052]采用紫外可见分光光度法测试上述所得的靶向载体的接枝率，测试结果如图3a、 图3b和图3c所示，结果表明：该靶向载体的接枝率为6.8 %。
[0053] 将上述靶头带上荧光标记，然后让小鼠和人服用该靶向载体，并对小鼠及人进行 追踪，结果如图4所示，结果显示，Ser Asp Ser Ser Asp能多肽够与骨膜蛋白（periostin) 共定位，说明Ser Asp Ser Ser Asp能够结合骨膜蛋白，并进入成骨细胞。
[0054]小鼠尾静脉所述载体递送FITC荧光标记小核酸后，切片观察，结果如图5所示，结 果显示，荧光蛋白在成骨细胞中特异性富集，说明该载体具有成成骨细胞靶向作用。
[0055]小鼠尾静脉注射所述载体递送FITC荧光标记小核酸后，通过活体成像仪观察，其 结果如图6所示，结果显示，荧光信号在软组织器官中相近，在骨组织中实验组明显高于空 载体组，说明该载体具有骨靶向作用。
[0056]将上述所得的靶向载体中装填上siRNA，体内注射。并增加对比组，直接体外注射 siRNA，测试siRNA在体内的降解情况，其结果如图7所示，结果显示，利用本发明负载的 s iRNA在体内的降解速度更小，使得s iRNA可以有更多的时间接触成骨细胞，增大siRNA的有 效性。
[0057]将上述所得的靶向载体中装填上miRNA214的抑制剂，体内注射，靶向干预雌激素 缺乏造成的骨质疏松，注射一月后，骨质疏松症小鼠骨量明显增加，结果如图8所示，说明该 载体能够递送miRNA并治疗骨质疏松症。
[0058] 实施例2
[0059] -种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，该靶向载体包括靶头和支架，靶头和支 架通过聚二乙醇羧酸(PEG-C00H)共价连接。其靶头质量接支率约为5%，。靶头为由丝氨酸 和天门冬氨酸组成的多肽，其中该多肽的序列为Ser Asp，其中，Ser代表丝氨酸，Asp代表天 门冬氨酸;支架为聚氨酯支架。
[0060] 上述靶向载体，其合成方法如，包括以下几个步骤：
[0061] (1)靶头的制备:采用十二通道半自动多肽合成仪，应用氨基酸缩合次序连接方法 合成革E 头，将丝氨酸(?111〇〇-48。(〇丨1311)-0!1)和天门冬氨酸(?1]1〇〇-361'(1'1311)-0!0按361-48卩顺 序连接，即得祀头Ser Asp，待用；
[0062] (2)支架的制备:第一步、PU的合成：将lmol的LDI和0.5mol的MEDA溶于丙酮中，置 于密闭反应瓶中混合，振荡密封反应，反应温度为50°C，反应时间为20h。然后加入0.05mol 的PEG和0.0 lmo 1的PCL，混合振荡反应，反应温度为50 °C，反应时间为70h，再加入0. lmo 1的 无水乙醇，振荡反应，反应温度为50°C，反应时间为40h，即可获得粗PU液。第二步、PU提纯： 加入所得粗PU液体积的5倍的石油醚，进行沉淀，得粗提纯PU。将粗提纯PU溶解于丙酮，离心 后透析可获得PU纳米胶束液，冷冻干燥后保存。
[0063] (3)靶向载体的合成:将成骨靶肽Ser Asp溶于lmL去离子水中，再加入与靶肽等质 量的EDC和NHS进行靶肽的活化，2 °C孵育20min后，再往靶肽活化混合液中加入PU纳米胶束 液，其中靶头质量:PU纳米胶束液=1:5，PU靶肽混合液2 °C反应20h。反应结束后，用去离子 水对反应液进行透析(MW=3500)以除去无机盐等杂质，透析后即可得靶肽偶联的PU纳米胶 束液(Ser Asp-PU)，冷冻干燥后密封冷冻保存。
[0064]应用荧光标记Ser Asp，在人与小鼠成骨细胞中，Ser Asp能多肽够与骨膜蛋白 (periostin)共定位，说明Ser Asp能够结合骨膜蛋白，并进入成骨细胞。透射电镜下观察该 革巴向载体的大小和形貌特征。所述载体PU-Ser Asp能够包裹siRNA并降低siRNA的体外降解 速度。小鼠尾静脉所述载体递送FITC荧光标记小核酸后，切片观察发现，荧光蛋白在成骨细 胞中特异性富集，说明该载体具有成成骨细胞靶向作用。小鼠尾静脉注射所述载体递送 FITC荧光标记小核酸后，通过活体成像仪观察发现，荧光信号在软组织器官中相近，在骨 组织中实验组明显高于空载体组，说明该载体具有骨靶向作用。
[0065]将上述所得的靶向载体中装填上mi RNA214的抑制剂，装填的mi RNA214抑制剂的质 量与靶向载体的质量之比为5%: 1。体内注射，靶向干预雌激素缺乏造成的骨质疏松，注射 一月后，骨质疏松症小鼠骨量明显增加。说明该载体能够递送miRNA并治疗骨质疏松症。
[0066] 实施例3
[0067] -种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，该靶向载体包括靶头和支架，靶头和支 架通过聚二乙醇羧酸(PEG-C00H)共价连接。其靶头质量接枝率约为6%。靶头为由丝氨酸和 天门冬氨酸组成的多肽，长度为20个氨基酸，其中该多肽的序列为Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp(Ser:Asp=1:4)，其 中，Ser代表丝氨酸，Asp代表天门冬氨酸;支架为聚氨酯支架。
[0068] 上述靶向载体，其合成方法如，包括以下几个步骤：
[0069] (1)靶头的制备:采用十二通道半自动多肽合成仪，应用氨基酸缩合次序连接方法 合成革E 头，将丝氨酸(?111〇〇-48。(〇丨1311)-0!1)和天门冬氨酸(?1]1〇〇-361'(1'1311)-0!0按361-48卩顺 序连接，即得靶头，待用；
[0070] (2)支架的制备:第一步、PU的合成:将lmol的LDI和lmol的MEDA溶于丙酮中，置于 密闭反应瓶中混合，振荡密封反应，反应温度为l〇〇°C，反应时间为30h。然后加入1.25mol的 PEG和0.25mol的PCL，混合振荡反应，反应温度为100°C，反应时间为80h，再加入lOmol的无 水乙醇，振荡反应，反应温度为100°C，反应时间为50h，即可获得粗PU液。第二步、PU提纯:加 入所得粗PU液体积的2倍的石油醚，进行沉淀，得粗提纯PU。将粗提纯PU溶解于丙酮，离心后 透析可获得PU纳米胶束液，冷冻干燥后保存。
[0071] (3)靶向载体的合成:将成骨靶肽Ser Asp溶于lmL去离子水中，再加入与靶肽等质 量的EDC和NHS进行靶肽的活化，10°C孵育5min后，再往靶肽活化混合液中加入PU纳米胶束 液，其中靶头质量:PU纳米胶束液=1:1，PU靶肽混合液10 °C反应10h。反应结束后，用去离子 水对反应液进行透析(MW=3500)以除去无机盐等杂质，透析后即可得靶肽偶联的PU纳米胶 束液(Ser Asp-PU)，冷冻干燥后密封冷冻保存。
[0072] 应用焚光标记Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp，在人与小鼠成骨细胞中，Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp能多肽够与骨膜蛋白（periostin) 共定位，说明Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp能够结合骨膜蛋白，并进入成骨细胞。透射电镜下观察该革El向载体的大小 和形貌特征。所述载体PU-Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp能够包裹siRNA并降低siRNA的体外降解速度。小鼠尾静脉所述 载体递送FITC荧光标记小核酸后，切片观察发现，荧光蛋白在成骨细胞中特异性富集，说明 该载体具有成成骨细胞靶向作用。小鼠尾静脉注射所述载体递送FITC荧光标记小核酸后， 通过活体成像仪观察发现，荧光信号在软组织器官中相近，在骨组织中实验组明显高于空 载体组，说明该载体具有骨靶向作用。
[0073]将上述所得的靶向载体中装填上mi RNA214的抑制剂，装填的mi RNA214抑制剂的质 量与靶向载体的质量之比为10%: 1。体内注射，靶向干预雌激素缺乏造成的骨质疏松，注射 一月后，骨质疏松症小鼠骨量明显增加。说明该载体能够递送miRNA并治疗骨质疏松症。
[0074] 实施例4
[0075] -种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，该靶向载体包括靶头和支架，靶头和支 架通过聚二乙醇羧酸(PEG-C00H)共价连接。其靶头质量接枝率约为10%，靶头为由丝氨酸 和天门冬氨酸组成的多肽，该多肽具有50个氨基酸，其中丝氨酸与天门冬氨酸的个数比为 = 4:1其中该多肽的序列如下：
[0076] Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp，其中，Ser代表丝氨酸， Asp代表天门冬氨酸;支架为聚氨酯支架。
[0077] 上述靶向载体，其合成方法如，包括以下几个步骤：
[0078] (1)靶头的制备:采用十二通道半自动多肽合成仪，应用氨基酸缩合次序连接方法 合成革E 头，将丝氨酸(?111〇〇-48。(〇丨1311)-0!1)和天门冬氨酸(?1]1〇〇-361'(1'1311)-0!0按361-48卩顺 序连接，即得靶头，待用；
[0079] (2)支架的制备:第一步、PU的合成:将lmo 1的LDI和0.7mo 1的MEDA溶于丙酮中，置 于密闭反应瓶中混合，振荡密封反应，反应温度为75°C，反应时间为24h。然后加入0.025mol 的PEG和0.005mol的PCL，混合振荡反应，反应温度为75°C，反应时间为72h，再加入5mol的无 水乙醇，振荡反应，反应温度为75°C，反应时间为48h，即可获得粗PU液。第二步、PU提纯：加 入所得粗PU液体积的3倍的石油醚，进行沉淀，得粗提纯PU。将粗提纯PU溶解于丙酮，离心后 透析可获得PU纳米胶束液，冷冻干燥后保存。
[0080] (3)革E1向载体的合成:将成骨革E1肽Ser Asp溶于lmL去离子水中，再加入与革E1肽等质 量的EDC和NHS进行靶肽的活化，4°C孵育lOmin后，再往靶肽活化混合液中加入PU纳米胶束 液，其中靶头质量:PU纳米胶束液=1:5，PU靶肽混合液4 °C反应12h。反应结束后，用去离子 水对反应液进行透析(MW=3500)以除去无机盐等杂质，透析后即可得靶肽偶联的PU纳米胶 束液(Ser Asp-PU)，冷冻干燥后密封冷冻保存。
[0081] 应用焚光标记Ser Asp，在人与小鼠成骨细胞中，革巴头够与骨膜蛋白（periostin) 共定位，说明革El头能够结合骨膜蛋白，并进入成骨细胞。所述载体PU-Ser Ser Ser Ser Asp 能够包裹siRNA并降低siRNA的体外降解速度。小鼠尾静脉所述载体递送FITC荧光标记小核 酸后，切片观察发现，荧光蛋白在成骨细胞中特异性富集，说明该载体具有成成骨细胞靶向 作用。小鼠尾静脉注射所述载体递送FITC荧光标记小核酸后，通过活体成像仪观察发现，荧 光信号在软组织器官中相近，在骨组织中实验组明显高于空载体组，说明该载体具有骨靶 向作用。
[0082]将上述所得的靶向载体中装填上mi RNA214的抑制剂，装填的mi RNA214抑制剂的质 量与靶向载体的质量之比为7.5%: 1。体内注射，靶向干预雌激素缺乏造成的骨质疏松，注 射一月后，骨质疏松症小鼠骨量增加。说明该载体能够递送miRNA并治疗骨质疏松症。 <110>同济大学 <120> -种基于多肽构建的成骨细胞祀向载体及其制备与应用 <、160>3 <210> 1 <211> 5 <212> PR I <213>人工序列 <220> <221>多肽 <400> 1 Ser Asp Ser Ser Asp I 5 <2I0>2 <211> 20 <212> PRT <213>人工序列 <400> 2
[0083] Ser Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp. Asp Asp I 5 10 Ser Asp Asp \sp Asp Ser Asp \sp Asp Asp II 15 20 <210> 3 <2!1>50 <2i2> PR1' <2丨3>人工序列 <400> 3 Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp I 5 10 Ser Ser Ser Ser A：sp Ser Ser Ser Sei· Asp II 15 20 Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Α?ρ 2:1 25 30 Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp 31 35 40 Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp 41 45 50
【主权项】
1. 一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，其特征在于，该靶向载体包括靶头和支架， 所述靶头通过聚二乙醇羧酸共价连接于所述支架，所述的靶头为多肽，靶头的质量接枝率 为5~10%〇2. 根据权利要求1所述的一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，其特征在于，所述的 多肽由丝氨酸和天门冬氨酸两种氨基酸组成，所述多肽中含有2~50个氨基酸，所述丝氨酸 和天门冬氨酸的个数比为(0.25~4) :1。3. 根据权利要求2所述的一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，其特征在于，所述的 多肽包括3个丝氨酸和2个天门冬氨酸，所述多肽的序列为Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser 代表丝氨酸，Asp代表天门冬氨酸。4. 根据权利要求2所述的一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体，其特征在于，所述的 支架为聚氨酯支架，所述支架呈扁球形，所述支架的粒径为60~120nm。5. -种如权利要求1~4任一所述基于多肽构建的成骨细胞靶向载体的制备方法，其特 征在于，该方法主要包括以下几个步骤： (1) 靶头的制备:通过十二通道半自动多肽合成仪按比例将氨基酸缩合成靶头，待用； (2) 支架的制备:将LDI和MEDA以1: (0.5~1)的摩尔比溶于丙酮中，进行混合反应，然后 加入PEG和PCL，加入的PEG、PCL的摩尔量与所述加入的LDI的摩尔量之比为PEG:PCL:LDI = (0.05~0.25) :(0.01~0.05) :(0.2~2)，反应后加入无水乙醇进行反应，加入的无水乙醇 与所述LDI的摩尔量之比为(0.1~10): 1，得到粗PU液，然后在粗PU液中加入石油醚进行沉 淀，过滤将沉淀物溶解于丙酮，离心后透析得到PU纳米胶束液，待用； (3) 靶向载体的合成：将步骤（1)所得靶头溶于去离子水中，然后加入与靶头等质量的 EDC和NHS进行靶肽的活化，然后加入步骤(2)所得PU纳米胶束液，其中靶头的质量与PU纳米 胶束液的体积比为1:(1~10)，静置后透析即得所述成骨细胞靶向载体。6. 根据权利要求5所述的一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体的制备方法，其特征 在于，步骤(2)所述LDI、MEDA的反应温度为50~100°C，反应时间为20~30h; 所述PEG，PCL的反应温度为50~100 °C，反应时间为70~80h; 所述无水乙醇的反应温度为50~100 °C，反应时间为40~50h; 所述加入的石油醚与粗PU液的体积之比为1: (0.2~0.5)。7. 根据权利要求5所述的一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体的制备方法，其特征 在于，步骤(3)所述活化的温度为2~10°C，活化时间为5~20min; 静置温度为2~10°C，静置时间为10~20h。8. -种如权利要求1~4任一所述基于多肽构建的成骨细胞靶向载体的应用，其特征在 于，所述的靶向载体用于装填治疗骨折、股佝偻病、骨质疏松、骨关节炎、类风湿性关节炎或 肿瘤骨转移的药物。9. 根据权利要求8所述的一种基于多肽构建的成骨细胞靶向载体的应用，其特征在于， 所述靶向载体和药物的质量比为1: (5~10%)。
【文档编号】A61K47/34GK106039316SQ201610288361
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】孙瑶
【申请人】同济大学