利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体、制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体、制备方法和应用，该利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体包括利妥昔单抗和氧化石墨烯，利妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接，形成复合抗体，可大幅度的增强抗肿瘤的生物学反应。相比利妥昔单抗在体外只有轻微抑制作用，上述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体可直接杀死淋巴瘤细胞。
【专利说明】
利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体、制备方法及应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及抗体领域，特别地，涉及一种利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体。此外，本发明还涉及一种包括上述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]靶向治疗是指作用于专门分子(分子靶向)从而阻止肿瘤生长、增殖、扩散的药物或者小分子物质，也被称为分子靶向治疗，分子靶向药物和精准医学。靶向治疗与化疗不同:(I)靶向治疗只专门作用于肿瘤相关的分子，而化疗抑制细胞代谢，影响细胞周期，作用于所有快速分裂的细胞既包括肿瘤，也包括正常细胞，换而言之，化疗的特异性相对较差；
[2]靶向治疗是瞄准靶细胞或者靶点精心设计和选择的，而化疗的选择仅仅是因为可以杀死或者抑制肿瘤细胞；(3)革E向治疗是抑制细胞的增殖分化(Cytostatic)，与细胞周期无关，而化疗药物是利用细胞周期的敏感阶段引起细胞中毒而杀伤细胞(Cytotoxic)。
[0003]利妥昔单抗是一种已经使用20年的CD20抗体的靶向治疗药物，疗效肯定但是微弱。随着化疗对免疫系统的损害，耐药复发，先天性反应低等情况的出现，亟需更加高效的CD20抗体。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体，以解决现有的利妥昔单抗疗效弱的技术问题。
[0005]本发明采用的技术方案如下:
[0006]本发明一方面提供了一种利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体，利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体包括利妥昔单抗和氧化石墨烯，利妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接。
[0007]进一步地，妥昔单抗和氧化石墨烯的质量比为50?5:1。
[0008]进一步地，氧化石墨稀的粒径小于22μηι。
[0009]本发明另一方面提供了利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法，包括以下步骤:将利妥昔单抗、氧化石墨烯加入体积百分数为10?50%的磷酸盐缓冲液中，在37?42°C下震荡摇匀，反应4?24小时得到利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体。
[0010]进一步地，磷酸盐缓冲液的体积百分数为10%，磷酸盐缓冲液的用量为Img氧化石墨烯加入100ml磷酸盐缓冲液。
[0011]进一步地，反应温度为37 °C。
[0012]进一步地，反应时间为12?24小时，优选为12小时。
[0013]进一步地，氧化石墨烯的制备包括以下步骤:
[0014]将氧化石墨烯原材料在O?4°C的条件下，通过超声波破碎，经过孔径0.22μπι的滤网过滤，得到氧化石墨稀。
[0015]进一步地，超声波破碎的操作包括以下步骤:
[0016]将氧化石墨烯原材料配置为I?2mg/ml，在超声波破碎的强度为3.5的条件下，超声2小时，超声模式为工作10s，休息5s。
[0017]本发明还提供了一种利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体在制备治疗淋巴瘤药物中的应用。
[0018]本发明具有以下有益效果:上述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体，利妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接，形成复合抗体，可大幅度的增强生物学反应。相比利妥昔单抗在体外只有抑制作用，上述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体可直接杀死淋巴瘤细胞。
[0019]除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
【附图说明】
[0020]构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0021 ]图1是氧化石墨烯原材料的结构示意图；
[0022]图2是本发明优选实施例的超声处理的氧化石墨烯示意图；
[0023]图3是氧化石墨烯原材料和超声处理的氧化石墨烯在人血清中稳定性对照图；
[0024]图4是对比例I制备的RTX/G0在小鼠肺中的分布图；
[0025]图5是实施例1制备的RTX/G0在小鼠肺中的分布图；
[0026]图6是对比例I制备的RTX/G0在小鼠肝中的分布图；
[0027]图7是实施例1制备的RTX/G0在小鼠肝中的分布图；
[0028]图8是制备温度不同的RTX/G0的杀伤效果图；
[0029]图9是制备时间不同的RTX/G0的杀伤效果图；
[0030]图10是溶剂不同的RTX/G0的杀伤效果图。
【具体实施方式】
[0031]以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
[0032]本发明的优选实施例提供了本发明一方面提供了一种利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体(RTX/G0)，利安昔单抗/氧化石墨稀复合抗体包括利安昔单抗(RTX)和氧化石墨稀(GO)，利妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接。
[0033]氧化石墨烯含有sP2杂化带羟基和羧基的苯环，不仅性质稳定、生物相容性好，还可以通过键、疏水作用、氢键和离子键与抗体、药物分子、金属离子、荧光基团或者细胞非共价结合。其次，二维结构的GO的表面比任何其他纳米材料都高出至少4个量级，它的每个原子都暴露在表面，适合于运载药物。GO是其他石墨材料的基本构建块，可以裹成O维的球体，滚成I维的碳纳米管，层叠成3维结构的石墨。
[0034]尽管GO溶于水，如生理盐水，然而由于盐的电荷屏蔽作用使得GO易发生聚集。良好的药物载体具有优良的表面化学性质，不仅生物相容性好，而且生物变化可控。因此，GO的表面修饰势在必行，目前主要分两种:共价和非共价，前者通常是通过氧化石墨烯的非饱和结构破坏而形成的原子掺杂或反应的技术;后者不改变GO的自然结构，只通过非共价键，范德华力，电荷吸引，结合更加灵活。本申请中的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体中，利妥昔单抗(RTX)和氧化石墨烯通过非共价键连接，结合灵活，并且杀伤淋巴瘤细胞的效果强。
[0035]本发明具有以下有益效果:上述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体，利妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接，形成复合抗体，可大幅度的增强生物学反应。相比利妥昔单抗在体外只有抑制作用，上述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体可直接杀死淋巴瘤细胞。
[0036]可选地，妥昔单抗和所述氧化石墨烯的质量比为50?5:1。
[0037]可选地，氧化石墨烯的粒径小于22μπι。颗粒较大的氧化石墨烯在生理盐溶液下容易发生聚集，生成沉淀，性质不稳定。采用粒径小于22μπι的氧化石墨烯可在人血清中稳定均勾分散。粒径小于22μηι的氧化石墨稀可直接购买或通过大颗粒的氧化石墨稀经超声波破碎制取。
[0038]本发明另一方面提供了一种利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法，包括以下步骤:将利妥昔单抗、氧化石墨烯加入体积百分数为10?50%的磷酸盐缓冲液中，在37?42°C下震荡摇匀，反应4?24小时得到所述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体。
[0039]磷酸盐缓冲液(PBS)为本领域常用试剂，其pH值范围为7.35?7.45。体积百分数为10?50%的磷酸盐缓冲液即PBS溶液在原配方的基础上调整水的加入量，将其稀释。
[0040]利妥昔单抗、氧化石墨烯在振荡摇匀的条件下反应，二者通过非共价键结合得到利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体。并且利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体可从作为溶剂的磷酸盐缓冲液中分离出来，也可不予分离仍在磷酸盐缓冲液中保持。
[0041]在上述条件得到的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体在稀释一倍之后仍具有一定的杀伤效果。
[0042]反应时间过短，利妥昔单抗和氧化石墨结合时间不够，导致二者结合量较小，结合不稳定。而反应时间过长，则增加了抗体变异的风险。因此反应时间可优选为4?24小时。在研究中随着RTX/G0的浓度稀释，大部分不同温度下制备的RTX/G0杀伤细胞的能力逐步减弱，但是只有在37 0C和42 °C合成的RTX/G0并没有随着浓度稀释明显降低疗效，提示37 °C和42 °C制备的RTX/G0的治疗效果最好。并且制备温度越高，抗体分子高温变性越严重，抗体活性越弱，而且温度过高时，氧化石墨烯的结构也会遭到破坏，这两方面的因素损害了RTX/G0的杀伤功能。
[0043]可选地，磷酸盐缓冲液的体积百分数为10%，磷酸盐缓冲液的用量为Img氧化石墨烯加入100ml磷酸盐缓冲液。10%PBS的条件下，RTX的结合量较高，更重要的是10%PBS有比较稳定的缓冲系统，更接近生理情况。
[0044]可选地，反应温度为37 °C。
[0045]反应温度选择37°C。原因有二:第一，这个温度下杀伤效果最好;第二，这个温度也是生理温度，有利于保障体外和体内实验结果的稳定，并为得到体外和体内一致的结果奠定了基础。
[0046]可选地，反应时间为12?24小时，优选为12小时。反应时间为12?24小时，利妥昔单抗和氧化石墨量大，结合稳定，继续增加反应时间，利妥昔单抗和氧化石墨结合数量并不会明显增加。考虑到时间成本，反应时间可选优为12小时。
[0047]可选地，氧化石墨烯的制备包括以下步骤:
[0048]将氧化石墨烯原材料在O?4°C的条件下，通过超声波破碎，经过孔径0.22μπι的滤网过滤，得到氧化石墨稀。
[0049]氧化石墨烯的制备很重要，严格控制大小和厚度。可从Sigma购得氧化石墨烯原材料，透析纯化去除酒精。将氧化石墨烯原材料在超声波破碎仪破碎成细小颗粒。然后将经过孔径0.22μπι的滤网过滤。可采用全程在冰水混合物中进行操作以保证反应温度在O?4°C的条件。
[0050]可选地，超声波破碎的操作包括以下步骤:
[0051 ]将氧化石墨烯原材料配置为I?2mg/ml，在超声波破碎的强度为3.5的条件下，超声2小时，超声模式为工作10s，休息5s。
[0052]在美国Misonix超声波破碎仪Sonicator 3000，强度3.5，持续超声2小时，模式工作1秒，休息5秒。在该条件下，氧化石墨稀的粒径小于50nm，厚度为I?3nm。参照图1，超声过滤处理过的GO能在人血清中稳定均匀分散，然而未经超声的一般GO(即一般的颗粒较大的氧化石墨稀，如从Sigma购得的氧化石墨稀原材料，其粒径>0.5-1μηι和厚度> 1nm)在4小时之内就发生沉淀。为了直观比较一般GO与处理后的GO的差异，我们使用德国JPKNanoWizard原子力显微镜拍摄GO，参照图3。可见，处理后的GO比一般GO更薄(约8.6倍)更小，稳定性更好，生物分布更佳。
[0053]实施例1
[0054]从Sigma购得氧化石墨稀原材料，透析纯化去除酒精，配制为浓度lmg/ml，在美国Misonix超声波破碎仪Sonicator 3000强度3.5的条件下，持续超声2小时，模式工作10秒，休息5秒。注意全程在冰水混合物中进行。超声结束后，用0.22μπι的过滤器过滤，制得氧化石墨稀，Nanodrop测量最终浓度，冷藏备用。
[0055]将Img利妥昔单抗、0.2mg氧化石墨烯加入Iml体积百分数为10%的磷酸盐缓冲液中，在4°C下震荡摇匀，反应12小时，得到含利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的混合液。
[0056]实施例2
[0057]和实施例1的区别在于，制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体时的温度为37°C。
[0058]实施例3
[0059]和实施例1的区别在于，制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体时的温度为42°C。
[0060]实施例4
[0061]和实施例1的区别在于，制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体时的反应时间为O小时。
[0062]实施例5
[0063]和实施例1的区别在于，制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体时的反应时间为24小时。
[0064]实施例6
[0065]和实施例1的区别在于，制备利安昔单抗/氧化石墨稀复合抗体时的溶剂为水。
[0066]实施例7
[0067]和实施例1的区别在于，制备利安昔单抗/氧化石墨稀复合抗体时的溶剂为PBS。
[0068]对比例I
[0069]和实施例1的区别在于，氧化石墨稀原材料为破碎直接与利妥昔单抗反应。
[0070]实验数据
[0071]1、关于稳定性
[0072]静脉注射RTX/G0后，对比例I制备的RTX/G0仅可见于肺脏血管内，而肺组织或者远处脏器例如肝脏未能测得。而实施例1制备的RTX/G0并无血管内潴留，而是在组织中均匀分布，参照图4?7。
[0073]2、制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体最佳温度的确定
[0074]圆底96孔板培养Raji细胞，细胞浓度为4Χ106/πι1，200μ1。分别取实施例1?3中制备的混合液与Ra ji细胞(即淋巴瘤细胞)混合，其最终化学当量为G02.5yg/ml,RTX12.5yg/ml，并按照2倍的比例稀释，共5个浓度梯度，PBS作为对照组。在恒温，恒湿，恒定二氧化碳浓度的情况下培养12小时。Raji细胞经冷PBS洗涤后，经过Flow缓冲液(1%福尔马林)固定，再经流式细胞仪分析细胞数目，整理数据比较各组活细胞数目或者比例。INPUT组是细胞培养开始时加入96孔板的细胞数目，就是直接取培养Raji细胞的相同浓度和体积的细胞，直接PBS洗涤，I %福尔马林缓冲液固定，随后流式细胞仪分析采集数据。
[0075]实验数据如图8所述，其中横轴为浓度梯度，竖轴为细胞存活率。4°C合成的RTX/G0的治疗效果最弱，可能是因为温度低，分子活动减慢，分子间相互碰撞的机会减少，RTX与GO结合的可能性减少，致使RTX-GO的生成量减少。并且随着RTX/G0的浓度稀释，不同温度下制备的大部分RTX/G0杀伤细胞的能力逐步减弱。而在37°C和42°C合成的RTX/G0并没有随着浓度稀释明显降低疗效，提示37°C和42°C制备的RTX/G0的治疗效果最好。因此制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的温度可优选为37 °C?42 °C。
[0076]考虑到37°C下杀伤效果最好且该温度为生理温度，有利于保障体外和体内实验结果的稳定，并为得到体外和体内一致的结果奠定了基础。因此更优地，制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的温度为37°C。
[0077]3、制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体最佳反应时间的确定
[0078]圆底96孔板培养Raji细胞，细胞浓度为知106/1111，20(^1。分别取实施例1、4和5中制备的混合液与Ra ji细胞(即淋巴瘤细胞)混合，其最终化学当量为G02.5yg/ml,RTX12.5μg/ml，并按照2倍的比例稀释，共5个浓度梯度，PBS作为对照组。在恒温，恒湿，恒定二氧化碳浓度的情况下培养12小时。Ra ji细胞经冷PBS洗涤后，经过I %福尔马林缓冲液固定，再经流式细胞仪分析细胞数目，整理数据比较各组活细胞数目或者比例。INPUT组是细胞培养开始时加入96孔板的细胞数目，就是直接取培养Ra j i细胞的相同浓度和体积的细胞，直接PBS洗涤，I %福尔马林缓冲液固定，随后流式细胞仪分析采集数据。
[0079]实验数据如图9所述，其中横轴为浓度梯度，竖轴为细胞存活率。除PBS对照组外，其余各组随着RTX/G0浓度降低Raji细胞的杀伤作用都有降低。其中，反应12小时组与24小时组杀伤Raji细胞效果最佳，而O小时组效果最弱，随着浓度的稀释，很快就没有任何杀伤作用了，提示制备过程中，足够的反应时间是杀伤效果的重要保证。本实验提示，单独分别加入的RTX和G0，在没有RTX-GO存在的情况下是没有杀伤作用的。之所以O小时高浓度会有些许杀伤作用，可能是因为分别加入的RTX和GO在细胞培养的过程中形成RTX/G0，从而产生杀伤作用。然而在低浓度情况下，RTX和GO分子数目偏少，彼此碰撞反应的机会小，加上反应的条件比如盐浓度，并不是形成RTX/G0的最佳条件，致使RTX/G0的杀伤效果迅速丧失。因此，制备利安昔单抗/氧化石墨稀复合抗体的反应时间优选为12?24小时。更优地，考虑到时间成本，最终选择12小时作为最佳反应时间。
[0080]4、制备利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体最佳盐浓度的确定[0081 ]取将实施例1、6和7的制得的混合液。为了检测结合到GO上RTX的量，分别将RTX-GO离心沉淀，洗涤，在含有Dith1threi to I (DTT)的SDS胶(SDS聚丙稀酰胺凝胶)loadingbuffer中煮沸10分钟，并以已知浓度的RTX 25yg，50yg和10yg作为对照，分别加入12% SDSP ο I y a c r y I am i d e胶电泳(PAG E )，电泳结束后封存电泳胶并扫描结果。
[0082]样品在电泳中的速度或相对迀移率(Mr)与蛋白质本身性质(如分子大小)、凝胶孔径和电泳条件(如电流、电压)等密切相关，蛋白质结合SDS PolyacryIamide后，将会抵消各组之间的形状和电荷差异，此时蛋白质的泳动速度仅与各自分子量的大小有关。
[0083]结果如图10所示，与PBS相比，实施例6S卩纯水组中结合GO的RTX量最高，实施例1即1 % PBS (0.09 % NaCl)组中次之。结合已知浓度的RTX对照组，就可以估算在1 % PBS(0.09 % NaCl)组中结合GO的RTX约为10yg。同理可以估算，纯水组中结合GO的RTX约为200μg，实施例7S卩PBS组约为50yg。由此显然可见，能结合到GO上RTX的量与盐浓度呈反比，盐浓度越高，结合的RTX量越低。因为盐浓度可以影响GO的稳定性，所以发明人推测，盐浓度高可能影响GO表面的电荷性质和分布，与RTX的结合能力受到影响，导致RTX-GO的生成量降低，因而PBS组在蛋白电泳上的颜色浓度最低。虽然纯水组中RTX的结合量最高，但其与生物体的实际情况相差较远。而虽PBS更接近生物体的实际情况，但PBS组RTX的结合量过低。10%PBS组RTX的结合量较高，更重要的是1 % PBS有比较稳定的缓冲系统，更接近生理情况。因此综合考虑之下，10% PBS作为溶剂为优选的方案。
[0084]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体，其特征在于，所述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体包括利妥昔单抗和氧化石墨烯，所述利妥昔单抗和氧化石墨烯通过非共价键连接。2.根据权利要求1所述的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体，其特征在于，所述妥昔单抗和所述氧化石墨稀的质量比为50?5:1。3.根据权利要求1所述的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体，其特征在于，所述氧化石墨稀的粒径小于2 2m。4.一种权利要求1?3中任一项所述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将利妥昔单抗、氧化石墨烯加入体积百分数为10?50%的磷酸盐缓冲液中，在37?42°C下震荡摇匀，反应4?24小时得到所述利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体。5.根据权利要求4所述的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的体积百分数为10%，所述磷酸盐缓冲液的用量为Img所述氧化石墨烯加入100ml所述磷酸盐缓冲液。6.根据权利要求4所述的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法，其特征在于，反应温度为37 °C。7.根据权利要求4所述的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法，其特征在于，反应时间为12?24小时，优选为12小时。8.根据权利要求4?7中任一项所述的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法，其特征在于，所述氧化石墨烯的制备包括以下步骤: 将氧化石墨稀原材料在O?4 °C的条件下，通过超声波破碎，经过孔径0.22μηι的滤网过滤，得到氧化石墨稀。9.根据权利要求4所述的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体的制备方法，其特征在于，所述超声波破碎的操作包括以下步骤: 将氧化石墨稀原材料配置为I?2mg/ml，在超声波破碎的强度为3.5的条件下，超声2小时，超声模式为工作10s，休息5s。10.—种权利要求1?3任一项所述的利妥昔单抗/氧化石墨烯复合抗体在制备治疗淋巴瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106039321SQ201610364619
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】罗承科
【申请人】中南大学湘雅医院