使用仙台病毒作为载体的抗结核杆菌疫苗的制作方法

使用仙台病毒作为载体的抗结核杆菌疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供表达结核分枝杆菌免疫优势抗原的重组仙台病毒载体疫苗，可作为治疗性和预防性抗结核疫苗使用。通过鼻内免疫该疫苗，成功而有效地诱导针对结核菌的保护性免疫应答，且未观察到免疫接种引起的病理症状。将其作为预防性抗结核疫苗，鼻内接种在小鼠模型中成功诱导明显的抗原特异性细胞免疫应答。结核菌的攻击保护实验发现，与对照动物相比被免疫小鼠的肺脏和脾脏中的结核杆菌明显减少，其机制与在肺部诱导产生的强烈抗原特异性T细胞免疫应答尤其是CD8+T细胞免疫反应相关。作为治疗性疫苗，获得与利福平(RFP)相当的疗效，二者联用后能明显提高抗结核效果。因此本发明的重组仙台病毒载体疫苗是非常有前景的抗结核候选疫苗之一。CCTCC V20151820150419
【专利说明】使用仙台病毒作为载体的抗结核杆菌疫苗 发明领域
[0001] 本发明涉及利用仙台病毒作为载体的抗结核杆菌疫苗。本发明也涉及使用仙台病 毒载体接种的方法，以及其在结核分枝杆菌感染的预防或治疗中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 结核病是影响人类健康的主要杀手之一。作为结核病（TB)的病原体，结核分枝杆 菌（Mycobacterium tuberculosis)是全世界细菌感染疾病中最主要的死亡原因--潜伏 性感染影响世界人口的三分之一。根据世界卫生组织最新的报告，2012年全球共有新发病 例860万，死亡病例130万。作为人类历史上对抗传染病最有效的方式之一，疫苗在诸多疾 病的预防控制中发挥了重要作用。卡介苗（Bacillus Calmette-Gu6rin，BCG)源自牛分枝 杆菌（Mycobacterium bovis)的减弱菌株，其迄今为止仍是针对TB的唯一经过批准的疫 苗。然而，发现BCG对于成人的效果差异较大，特别是在不同种族中。BCG的有效性随着年 龄的增长而下降，因此对于预防成人的疾病效果并不好，特别是在TB高发地区。BCG疫苗接 种已经用于预防结核脑膜炎并帮助防止肺结核分枝杆菌向肺外部位扩散，但是不能预防感 染。BCG疫苗的另一局限是胃肠外投递不能在肺粘膜中诱导有力的T细胞免疫，而这一点恰 是针对肺结核分枝杆菌进行保护关键性的。
[0004] 已提出几种假说来解释BCG对肺结核病的不佳的保护效果，其中一种认为BCG未 能诱导充分的⑶8+T细胞应答（参见）。最近的研究显示，除了 Thl型⑶4+T细胞免疫以 外，诱导CD8+T细胞应答对于针对结核分枝杆菌感染的免疫是至关重要的。
[0005] BCG效果的局限性和TB的全球流行性促使各国研究人员致力于产生新的更有效 的抗结核疫苗。
[0006] 基于活病毒载体的疫苗具有诱导有效而持久的抗原表达的能力，是研究最广泛的 疫苗载体之一（Cairns, J. S.和Sarver，N.，1998年，《人逆病毒的AIDS研究》）（AIDS Res. Hum. Retroviruses) 14 卷：第 1501-1508 页；Hirsch, V. Μ·等人，1996 年，《病毒学杂志》70 卷：第3741-3752页；Buge，S. L.等人，1997年，《病毒学杂志》71卷：第8531-8541页）。其 中，痘病毒和腺病毒载体是研究最广泛的载体，均已完成临床试验。但是，II a期临床试验 发现，抗结核痘病毒载体疫苗并不能够诱导足够的保护性抗结核免疫应答。研究认为，病毒 载体引发有效的保护性免疫应答取决于许多因素，如抗原表达的水平和持久性、载体病毒 复制的动力学，以及载体病毒的趋性和致病性等。目前可用的病毒载体都有各自的优缺点。 因此，选择最佳的基于病毒载体的免疫方案需要精确的评估和比较。
[0007] 基于病毒载体的疫苗免疫方案的一个致命缺点是它会诱导靶抗原以外的针对载 体病毒本身的强烈免疫应答。这一问题可以利用两个或两个以上不同种类的载体疫苗分别 进行"初次免疫（priming)"和"加强免疫（boosting)"的方法来解决。其中，DNA载体初 次免疫（下文简称为初免）_病毒载体加强是研究最广泛的免疫形式之一（Hanke，T.等人 1999年，《病毒学杂志》，73卷：第7524-7532页；Robinson, H. L.等人，1999年，《自然学方 法》（Nat. Med)，第5卷：第526-534页）。所以，仍然有必要开发病毒载体的新种类。
[0008] 由于结核分枝杆菌感染不断增加的危险和全球流行性，本领域中迫切需要开发有 效而安全的结核疫苗。

【发明内容】

[0009] 本发明提供一种含有编码结核杆菌蛋白质的仙台病毒载体及从该载体制备的疫 苗。具体地，本发明提供一种融合表达结核分枝杆菌蛋白Ag85的仙台病毒载体及其疫苗。
[0010] 在一个优选的实施方案中，编码的结核杆菌蛋白质为Ag85,其包含选自如下的蛋 白质或片段的氨基酸序列：Ag85A、Ag85B、其片段或上述任一项的组合。在一个实施方案中， 所述结核杆菌蛋白包含Ag85A与Ag85B蛋白或其片段的氨基酸序列的嵌合体。在一个进一 步的实施方案中，所述结核杆菌蛋白包含Ag85A蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N〇:2)与Ag85B 的第125-282位氨基酸（SEQ ID No:5)的氨基酸序列的嵌合体（SEQ ID No:8)，所述编码 Ag85B蛋白第125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在Ag85A基因的序列中，嵌合位点为 Ag85A基因的第245-250位限制性内切酶Κρη I识别序列和/或第430-435位内切酶Acc I识别序列。
[0011] 在一个实施方案中，本发明涉及将一种结核杆菌嵌合基因通过本领域公知的质粒 构建方法插入到仙台病毒载体中，如上文所述的，该嵌合基因优选包含Ag85A蛋白的编码 序列（SEQ ID N〇:l)与编码Ag85B的第125-282位氨基酸（SEQ ID N〇:5)的核苷酸序列的 嵌合体（SEQ ID No: 6或7)，嵌合位点优选为Ag85A基因的第245-250位限制性内切酶Κρη I识别序列和/或第430-435位内切酶Acc I识别序列。本发明还涉及由该嵌合基因所编 码的嵌合结核杆菌Ag85蛋白。
[0012] 在一个实施方案中，要插入编码结核杆菌蛋白质的基因的所述仙台病毒载体 (SeV)有F基因缺陷。具体地，所述仙台病毒载体缺失F基因。在一个实施方案中，构建得 到的重组仙台病毒载体在LLC-MK2细胞中成功表达Ag85蛋白。
[0013] 本发明进一步涉及如上述的任一种重组仙台病毒载体在制备预防和/或治疗结 核杆菌感染或结核病的疫苗中的用途。另外，本发明还涉及一种预防和/或治疗结核杆菌 感染或结核病的方法，包括对受试者施用如上文所述的重组仙台病毒载体的疫苗。优选地， 所述结核病为肺结核病。
[0014] 在一个实施方案中，本发明提供如上述的任一种仙台病毒载体的疫苗可作为抗结 核预防性疫苗使用。在另一个实施方案中，本发明提供上述任一种仙台病毒载体疫苗可作 为抗结核治疗性疫苗使用。
[0015] 在一个方面，本发明的仙台病毒载体的疫苗可以经鼻腔内给药或肌肉内注射的方 式一次或多次地施用给受试者。
[0016] 在一个实施方案中，本发明的仙台病毒载体疫苗以多价疫苗接种的形式接种至少 一次。具体地，所述仙台病毒载体疫苗与BCG疫苗联合施用，BCG疫苗的施用可在所述仙台 病毒载体疫苗的施用之前、同时或之后。优选地，受试者先前已接受过BCG疫苗的初次免 疫，然后使用本发明的仙台病毒载体疫苗进行加强免疫。本发明还提供一种包含上文所述 的重组仙台病毒载体疫苗任选和至少一种另外的免疫学作用剂用于在受试者中预防结核 杆菌感染的用途，其中所述另外的免疫学作用剂可以是BCG疫苗或表达结核杆菌免疫优势 抗原的任何其他免疫制剂，如核酸疫苗或重组亚单位疫苗等。优选地，本发明提供上述仙台 病毒载体疫苗与BCG疫苗组合用于预防结核病。
[0017] 在一个实施方案中，本发明提供编码上述结核杆菌蛋白的仙台病毒载体在制备治 疗结核病的疫苗中的用途。本发明还提供一种包含上文所述的重组仙台病毒载体疫苗用于 治疗患有结核病的受试者的用途，任选地所述重组仙台病毒载体疫苗与至少一种另外的结 核杆菌治疗剂一起施用，其中所述另外的结核杆菌治疗剂可以是利福平（RFP)或抑制结核 杆菌的任何其他药剂。优选地，本发明提供上述仙台病毒载体疫苗与利福平组合用于治疗 结核病。
[0018] 所述受试者可以是有感染结核杆菌风险或已患有结核病的动物，比如小鼠，或者 是人。
[0019] 在一个实施方案中，本发明还提供一种编码结核杆菌蛋白的仙台病毒载体用于诱 导特异性针对该结核杆菌蛋白的细胞免疫应答。在另一个实施方案中，本发明提供一种编 码结核杆菌蛋白的仙台病毒载体在制备诱导特异性针对该结核杆菌蛋白的细胞免疫应答 的药物中的用途。在一个实施方案中，本发明的重组仙台病毒载体在肺脏和脾脏中均诱导 强烈的针对该结核杆菌蛋白的细胞免疫应答。在又一个实施方案中，本发明的重组仙台病 毒载体在肺脏中诱导更强的针对该结核杆菌蛋白的细胞免疫应答。
[0020] 在一个实施方案中，本发明提供一种诱导特异性针对结核杆菌蛋白的细胞免疫 应答的方法，包括：(a)将融合表达结核杆菌相关蛋白的仙台病毒载体导入抗原递呈细胞； (b)使抗原递呈细胞与细胞毒性T淋巴细胞接触。所述方法可以体外、离体或体内进行。 具体地，编码的结核杆菌蛋白质为Ag85,其包含选自如下的蛋白质或片段的氨基酸序列： Ag85A、Ag85B、其片段或上述任一项的组合。在一个实施方案中，所述结核杆菌蛋白包含 Ag85A与Ag85B蛋白或其片段的氨基酸序列的嵌合体。在一个进一步的实施方案中，所述结 核杆菌蛋白包含Ag85A蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N〇:2)与Ag85B的第125-282位氨基酸 (SEQ ID No: 5)的氨基酸序列的嵌合体（SEQ ID No:8)，所述编码Ag85B蛋白第125-282位 氨基酸序列片段的基因嵌合在Ag85A基因的序列中，嵌合位点为Ag85A基因的第245-250 位限制性内切酶Κρη I识别序列和/或第430-435位内切酶Acc I识别序列。
[0021] 在一个实施方案中，本发明提供一种疫苗组合物，其包含如上述的任一种重组仙 台病毒载体和至少一种药学可接受的载体或媒介物。在一个实施方案中，所述药学可接受 的载体为佐剂。优选地，佐剂为左旋咪唑。
[0022] 在一个实施方案中，本发明涉及编码结核杆菌蛋白Ag85AB的仙台病毒载体，其已 被保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072)，分 类：副粘病毒科/属，保藏日期：2015年4月19日，保藏编号为CCTCC V201518。
[0023] 具体地，本发明涉及以下项：
[0024] 1. -种仙台病毒载体的疫苗，其中所述载体表达结核分枝杆菌免疫抗原，优选表 达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85。
[0025] 2.权利要求1的疫苗，其中所表达的结核分枝杆菌抗原包含Ag85A蛋白、和/或 Ag85B蛋白、和/或其一部分以及上述它们的嵌合体的氨基酸序列
[0026] 3.项1或2的疫苗，所使用的载体为F基因缺陷的仙台病毒载体。
[0027] 4.项1-3中任一项的仙台病毒载体疫苗作为抗结核预防性疫苗使用的用途。
[0028] 5.项4的用途，其中所述疫苗通过鼻内接种的方式免疫。
[0029] 6.项4或5的用途，其中所述疫苗以多价疫苗的形式接种至少一次。
[0030] 7.项1-3中任一项的仙台病毒载体疫苗作为抗结核治疗性疫苗使用的用途。
[0031] 8. -种诱导特异性针对结核杆菌蛋白的细胞免疫应答的方法，包括：(a)将融合 表达结核杆菌相关蛋白的仙台病毒载体导入抗原递呈细胞；(b)使抗原递呈细胞与细胞毒 性T淋巴细胞接触，其中所述结核杆菌的蛋白包括选自如下的蛋白：Ag85A，Ag85B，其片段， 或上述任一者的任何组合。
[0032] 9.权利要求8的方法，其在体外进行。
[0033] 10. -种编码结核杆菌蛋白Ag85的仙台病毒载体在制备诱导特异性针对该蛋 白的细胞免疫应答的药物中的用途，其中所述结核杆菌Ag85蛋白包括选自如下的蛋白： Ag85A，Ag85B，其片段，或上述任一者的任何组合。
[0034] 11. -种重组仙台病毒载体，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC V201518。
[0035] 上文概述仅为例示性的，且不意图以任何方式进行限制。除了上文描述的例示性 的方面、实施方案和特征以外，其它方面、实施方案和特征将通过下文详细描述阐明。
[0036] 附图简述
[0037] 从下文描述和所附权利要求书，结合所附附图，本公开的前述特征和其它特征将 变得更为明显。应理解这些附图仅描绘了依照本公开的数个实施方案且不意图视为限制其 范围，将部分地，经由所附图的使用更特定并详细地描述本公开。
[0038] 图1表示pSeV85AB质粒的构建，其中构建的Ag85A和Ag85B的嵌合体被插入F基 因缺陷性的SeV载体的Not I位点处。
[0039] 图2表示对构建的pSeV85AB质粒表达SeV85AB的鉴定结果，其中在用不同感染复 数（Μ0Ι)的SeV85AB感染LLC-MK2细胞后，利用小鼠抗Ag85A抗体和与荧光素结合的山羊 抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)进行对细胞裂解物的Western影印分析。
[0040] 图3和4分别是经鼻腔免疫接种SeV85AB后，通过ELISP0T对小鼠肺脏或脾脏中 T淋巴细胞经过体外刺激后分泌IFN-γ的水平的测定。
[0041] 图5显示对小鼠施用PBS、两个剂量的SeV85AB和两个剂量的SeV空白载体后小鼠 体重的变化。结果显示，SeV85AB的滴鼻免疫不会造成小鼠体重的异常变化。
[0042] 图6和7分别是肌肉内免疫接种SeV85AB后，通过ELISP0T对小鼠肺脏或脾脏中 T淋巴细胞经过体外刺激后分泌IFN-γ的水平的测定。
[0043] 图8显示对小鼠施用PBS、两个剂量的SeV85AB和两个剂量的SeV空白载体后小鼠 体重的变化。结果显示，SeV85AB的肌肉内免疫不会造成小鼠体重的异常变化。
[0044] 图9和10显示采用如实施例6中所述的8种初次免疫一加强免疫方案得到的小 鼠肺脏和脾脏细胞的T细胞应答结果。
[0045] 图11显示对小鼠施用8种初次免疫一加强免疫方案后小鼠体重的变化。结果显 示，采用BCG+SeV85AB免疫的小鼠与其它试验组相比，没有观察到任何明显的体重变化。
[0046] 图12显示使用SeV空白载体、BCG和不同剂量的SeV85AB来免疫小鼠后用结核杆 菌进行攻击所测定到的免疫效果。图13显示使用PBS、BCG、BCG-SeV85AB和SeV85AB的不同 免疫方案来免疫小鼠后用结核杆菌进行攻击所测定到的免疫效果。纵坐标为对数CFU(菌 落形成单位），左图为在肺脏中的结果，右图为在脾脏中的结果。结果显示高浓度（l〇 7CIU) SeV85AB免疫小鼠即可诱导产生与BCG疫苗接种相当的免疫保护效果，而加强BCG初免小鼠 后则能显著提高降低其细菌荷菌量，说明SeV85AB载体疫苗有望作为BCG的候选加强疫苗 之一。
[0047] 图14显示用利福平或SeV85AB对已受结核杆菌攻击的小鼠的治疗效果。图15显 示用仅PBS、仅利福平（RFP)、利福平联合SeV85AB对已受结核杆菌攻击的小鼠的治疗效果， 从中可见单独利用SeV85AB进行免疫治疗即可获得与RFP药物治疗相当的治疗效果，而利 福平和SeV85AB的联合治疗则能显著降低小鼠肺脏中的荷菌量，说明SeV85AB免疫治疗与 抗痨药物联用可提高抗结核治疗效果。
【具体实施方式】
[0048] 本发明提供了融合表达结核分枝杆菌免疫优势抗原的重组仙台病毒载体疫苗。该 疫苗可作为治疗性和预防性抗结核疫苗使用。通过鼻内免疫该疫苗，本发明人成功而有效 地诱导了针对结核菌的保护性免疫应答，且并没有观察到免疫引起的病理症状。将其作为 预防性抗结核疫苗，其鼻内接种在小鼠模型中成功诱导了明显的抗原特异性细胞免疫应 答。结核菌的攻击保护实验发现，与对照动物相比，被免疫小鼠的肺脏和脾脏中的结核杆菌 明显减少，其机制与在肺部诱导产生的强烈抗原特异性T细胞免疫应答尤其是CD8+T细胞 免疫反应相关。同时，将其作为治疗性结核疫苗，结核分枝杆菌感染小鼠经鼻内免疫治疗8 周后，肺、脾细菌数量与利福平（RFP)药物治疗组相当，与RFP联合治疗后则显著提高了 RFP 的治疗效果。
[0049] 本疫苗至少利用了一种结核杆菌的蛋白质。根据本发明，甚至在只表达Ag85抗原 时也能够诱导有效的免疫诱导。另外，利用多个类型的蛋白质作为抗原，可以得到更高的 免疫性。使用结核杆菌Ag85蛋白结核杆菌Ag85A与Ag85B抗原蛋白的1-125位氨基酸序 列二者彼此差异不大，而125-282位氨基酸序列之间有较大差异，约有40个左右氨基酸不 相同，此区段二者的编码核酸序列中共有90多个碱基不同。在此区段中Ag85B存在有重 要的可诱导Thl型应答反应细胞因子IFN-γ和IL-2的表位（S. D'Souza，V. Rosseels，M. Romano, A et al ；Mapping of Murine ThlHelper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January 2003,71 (1):483-493)〇
[0050] 本
【发明人】通过计算机软件服务公司Intenet-Based Applied Bioinformatics Company的Epitope Informatics软件对结核杆菌结构蛋白Ag85A基因的抗原表位进行 搜索，发现其抗原表位主要集中在Ag85A的氨基端和羧基端（S. D' Souza, V. Rosseels, M. Romano, A et al ；Mapping of Murine ThlHelper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January 2003, 71 (1):483-493)。在不含抗原表位的 Ag85A 母体基因中 间区段第245-250位含有Κρη I酶切位点(GGTACC)，第430-435位含有Acc I酶切位点 (GTCTAC)，故设计在此嵌合插入编码Ag85B的125-282位氨基酸的核苷酸序列片段。
[0051] 本发明中，插入仙台病毒载体的结核杆菌蛋白编码基因可以是编码Ag85A，Ag85B， 其片段，或上述任一者的任何组合的多核苷酸序列，还可以是该多核苷酸序列的衍生物或 变体。该衍生物或变体与编码该Ag85A、Ag85B蛋白或其片段的多核苷酸序列具有至少 70 %同源性，优选为具有至少75 %同源性，更优选为具有至少80 %同源性，更优选为具有 至少85 %同源性，优选为具有至少90 %同源性，更优选为具有至少95%同源性，更优选为 具有至少96 %，97%，98 %，99%同源性，只要所述核苷酸序列编码的蛋白质具有与Ag85A、 Ag85B蛋白或其片段或其任意组合相同的免疫原性。
[0052] 本
【发明人】先前已经建立了一个利用重组型仙台病毒（Sendai virus, SeV)的有效 的抗原表达系统（Kato, A.等人，1996年，基因细胞第1卷：第569-579页）。1型小鼠副流 感病毒SeV是带有非分节段型负链RNA基因组的包膜病毒，属于副粘病毒属（Nagai，Y. 1999 年，《医学病毒学综述》（Rev. Med. Virol.)第9卷：第83-99页）。该病毒在小鼠中引起致 命的呼吸道系统疾病，但对非人灵长类动物和人是不致病的（Nagai，Y. 1999年《医学病毒 学综述》(Rev. Med. Virol.)，第9卷：第83-99页；Hurwitz，J. L.等人，《疫苗》，第15卷：第 533-540 页，1997 年）。
[0053] 因为仙台病毒在细胞质中复制，所以抗原蛋白可以利用重组仙台病毒载体疫苗通 过不依赖细胞核的方式有效地表达。更重要的是，仙台病毒载体的感染并不会造成细胞的 分裂，从而能够高效持续地表达外源基因。例如，在培养上清中，重组仙台病毒载体表达的 1型人免疫缺陷病毒（HIV-l)Env蛋白的gpl20量高达6微克/毫升（相当于每10 6个细胞 6微克），是目前用于哺乳动物细胞培养系统中的载体中最高的（Yu，D.等人1997年《基因 细胞》，第2卷：457-466页）。
[0054] 因为SeV的复制需要修饰包被的蛋白酶，所以它复制的趋性限制于特定的组织如 呼吸道上皮细胞（Nagai，Y.，1993年，《微生物学趋势》（Trends Microbiol.)，第1卷：第 81-87页）。而且预期它不会传播到呼吸道以外的其它组织中，这暗示了 SeV载体及其复制 活性形式也在安全方面有其优点。
[0055] 本发明人利用F基因缺陷性SeV作为载体，构建了表达结核分枝杆菌免疫优势抗 原Ag85A和Ag85B片段的抗结核重组仙台病毒载体疫苗，命名为SeV85AB。Western Blot 证实了该重组疫苗能够有效地表达这两种结核杆菌蛋白的嵌合蛋白。
[0056] -方面，我们将该疫苗用作抗结核杆菌的预防性疫苗：在小鼠模型中，评估其对于 结核杆菌感染的预防作用。具体的，在SPF实验室中，使用10 7CIU剂量的SeV85AB通过鼻 内接种或肌肉注射方式免疫Balb/c小鼠（雌性，6-8周龄）。以BCG免疫和PBS作为对照。 免疫四周后，一方面，处死小鼠，取其肺脏和脾脏器官，无菌研磨后消化为单细胞悬液。使用 抗原特异性的多肽和PH)进行体外刺激，利用ELISP0T和多色流式的方法评估这部分细胞 在特异性刺激后，分泌细胞因子的能力。另一方面，将免疫后的小鼠送至P3实验室进行结 核分枝杆菌H37Rv毒株的气雾攻击，并于攻击4周后，取其肺脏和脾脏组织组织匀浆后进 行CFU菌落计数以分析该疫苗的免疫对小鼠的保护效率。实验结果证明，SeV85AB的免疫， 尤其是鼻内接种，能够诱导小鼠产生强烈的抗原特异性免疫反应，单剂免疫即可产生与BCG 疫苗免疫相当的抗结核分枝杆菌攻击的保护效力；如果采取BCG初次免疫-SeV85AB加强免 疫的策略，则可显著提高感染小鼠对结核分枝杆菌攻击后的保护效率。
[0057] 另一方面，我们将该疫苗用作抗结核杆菌治疗性疫苗：在小鼠模型中，评估其对于 结核杆菌感染的治疗作用。具体的，在P3实验室中，使用结核分枝杆菌H37Rv毒株感染（气 雾攻击，100CFU)Balb/c小鼠（雌性，6-8周龄）。在感染后的第4周、第6周、第8周进行三 剂10 7CIU SeV85AB的滴鼻免疫治疗，空白对照组滴鼻PBS，药物对照组则从第4周起在小鼠 的饮用水中加入l〇mg/kg/天剂量的利福平（RFP)，分别在感染的第4、6、8、12周，每组分别 杀3-4只小鼠，分析SeV85AB的治疗效果。结果发现，SeV85AB免疫治疗8周后，小鼠的肺、 脾的细菌数量与RFP药物治疗组相当；在另一个独立的试验中，小鼠感染三周后，在小鼠饮 用水中加入RFP进行治疗，或在RFP治疗的同时鼻内接种10 7CIU SeV85AB，隔周治疗一次， 共三次。对照组仅接种PBS。治疗结束后1周，取小鼠的肺脏组织，组织匀浆后进行CFU菌 落计数以分析其治疗效果。实验结果证明，较之RFP单独治疗组，RFP+SeV85AB的联合治疗 方案能够显著降低小鼠肺脏中的菌落数，证明该重组病毒作为抗结核疫苗有良好的免疫治 疗效果，与抗痨药物联合应用，其治疗效果更佳。
[0058] 鼻内接种具有可以诱导粘膜免疫应答的优点。咽后LN(retropharyngeal LN) 和下颂下LN(submandibular LN)是来自鼻腔的淋巴细胞最初流入的LN(Suen，J. Y.，和 Stern, S. J. 1996 年《在头和颈癌》第三版，Ε· N. Myers 和 J. Y. Suen，编辑者，W. B. Saunders 公司，Philadelaphia，第462-484页，颈的癌症）。这些LN很可能参与了粘膜免疫应 答。研究已经表明，在小鼠中NALT(nasalassociated lymphoid tissue:与鼻相关的淋 巴组织）是粘膜免疫应答的重要组成部分（Yangagita，Μ.等人，1999年，免疫学杂志162 卷3559-3565)。通过对小鼠 NALT的Waldeyer' s ring制备的细胞的分析，可以证实在该 组织中有SeV的表达和免疫应答。但是，在检测咽后LN(retropharyngeal LN)和下颂下 LN(submandibular LN)中的SeV的表达时，在两种组织中都检测到了显著的RNA。由于在这 些LN中不存在SeV蛋白质修饰所必需的蛋白酶（Nagai，Y. 1993年，微生物学趋势第1卷： 81-87)，所以可以预测在LN中没有SeV的复制。在这些LN中的mRNA是来自从鼻腔流出的 SeV感染的淋巴细胞。利用鼻内SeV接种，不仅仅是在鼻粘膜，而且在局部LN也高效地表 达了抗原，表明了 SeV在诱导粘膜免疫应答中的能力（Gallichan，W.S.，和Rosenthal，K. L. 1996年，实验方法杂志第184卷，1879-90)。
[0059] 细胞免疫应答是机体控制结核分枝杆菌感染和复制的重要组成部分（Nature Reviews Immunology l，20_30(0ctober 2001))。所以，诱导结核菌特异性的T细胞免疫应 答对TB的感染保护至关重要。并且，考虑到结核菌主要通过呼吸道和肺脏部位入侵人体， 在肺脏粘膜部位诱导的抗原特异性免疫反应非常重要。本发明人已通过ELISP0T、细胞内因 子染色和四聚体染色等方法证明，SeV85AB的免疫能够在小鼠的肺脏中诱导较强的抗原特 异性T细胞免疫反应。
[0060] 在接种了 F基因缺失的仙台病毒载体SeV或重组SeV85AB疫苗后，小鼠并没有出 现病毒感染症状和死亡情况。对小鼠的体重监测也证明，该病毒载体或重组疫苗的接种并 不会导致接种小鼠的体重异常变化，从而证明了该疫苗的安全性。
[0061] 具体地说，本发明首次公开了由重组SeV85AB介导的免疫而引起的小鼠抗结核分 枝杆菌的应答。我们的结果表明，在所有鼻内免疫的小鼠中都有效地诱导了特异于抗原的 细胞免疫应答。抗原表达方式是局部部位并且受到很好的控制。这些结果暗示SeV系统可 以作为有前途的结核疫苗的载体。
[0062] 本发明的目的是提供含有编码结核杆菌蛋白质的仙台病毒载体的疫苗。本发明的 疫苗可以很好地用于预防和治疗结核病。本发明也包括该疫苗的接种方法。具体地说，本 发明涉及：
[0063] (1)含有编码结核杆菌蛋白质的仙台病毒载体的疫苗；
[0064] (2) (1)中的疫苗，其中重组的蛋白质含有Ag85A、和/或Ag85B蛋白质和/或它们 的一部分以及上述它们的嵌合体；
[0065] (3)⑴或⑵的疫苗，其中仙台病毒载体是F基因缺失的；
[0066] (4)接种的方法，该方法包括接种含有编码结核杆菌的蛋白质的仙台病毒载体的 疫苗；
[0067] (5)⑷的方法，其中通过鼻内接种疫苗；
[0068] (6)⑷或（5)的方法，其中在多个疫苗的接种中本疫苗至少接种一次；
[0069] (7)诱导特异于结核杆菌的蛋白质的细胞免疫应答的方法，该方法包括步骤（a) 在抗原递呈细胞中导入编码结核杆菌蛋白质的仙台病毒载体和（b)将抗原抗原递呈细胞 与T辅助细胞和细胞毒性T细胞接触。
[0070] 本发明所用的术语"疫苗"是指用于预防或治疗感染疾病的组合物。疫苗含有抗 原或者可以表达抗原，所以，它可以诱导对抗原的免疫应答。本发明的含有仙台病毒载体的 疫苗，能够以所需的形式用于病原微生物的感染，传播和流行的预防或治疗。
[0071] "接种"是指通过接种疫苗在生物体或培养系统中能动地产生免疫性（体液免疫 性，细胞免疫性，或两者）。由此可以预防阻止病原体的感染，繁殖，传播和/或流行。而且 也可以抑制感染了病原体后病症的表现和/或发展。
[0072] "抗原"指含有一个或多个表位并且可以通过刺激宿主的免疫系统诱导特异于抗 原的免疫应答的蛋白。免疫应答可以是体液免疫应答和/或细胞免疫应答。虽然3个到几 个氨基酸可以构成表位，在蛋白质中，一个表位通常含有约7到15个氨基酸，例如8、9、10、 12或14个氨基酸。抗原又称为免疫原。在本发明中，当用编码抗原蛋白质的聚核苷酸或载 体表达抗原时，该聚核苷酸或载体定义为抗原。这也可以用作疫苗的成分。
[0073] "免疫应答"或"免疫学应答"指针对抗原或疫苗的体液免疫应答和/或细胞免疫 应答。体液免疫应答指抗体分子介导的免疫应答。细胞免疫应答指T淋巴细胞和/或其它 白细胞介导的免疫应答。细胞免疫应当包括诸如CTL的产生、辅助T细胞的产生或活化。细 胞免疫应答可以通过检测诸如CD8+T细胞等活化T细胞或其它白细胞产生的细胞因子或趋 化因子来测定。另外，还可以通过诸如已知的淋巴细胞增殖测试、CTL测试、特异于抗原的T 细胞测试来确定。
[0074] "重组"体指通过重组的聚核苷酸产生的化合物或组合物。重组聚核苷酸指与天然 一样非结合的聚核苷酸。表达重组聚核苷酸可以得到重组蛋白质。另外，"重组"病毒载体 的定义是通过基因工程由重组聚核苷酸或它的扩增产物构建的病毒载体。
[0075] 本发明所用的术语"副粘病毒"定义为Paramyxoviridae科的病毒。副粘病毒 包括，但不限于此。例如，仙台病毒（Sendai virus)、新城病病毒（New castle disease virus)、流行性聰腺炎病毒（Mumps virus)、麻疹病毒（measles virus)、呼吸多核（RS) 病毒（Respiratory syncytial virus)、牛伤寒病毒（rinderpest virus)、温热病毒 (distemper virus)、猴副流感病毒（SV5)，I型、II型和III型人副流感病毒等等。仙台病 毒可以是野生型菌株、突变体菌株、实验室传代菌株，或者是人工构建的菌株等等。DI颗粒 (病毒学杂志，1994年，68卷：8413-8417页）等不完全病毒和合成的寡核苷酸等等可以用 作生产本发明的疫苗的物质。
[0076] 编码副粘病毒的蛋白质的基因包括即、？、1^、圆，和1^基因。本文中，"即、？、1、 F、HN，和L基因"分别表示编码核壳蛋白质、磷蛋白、基质蛋白质、融合蛋白质、血凝素-神 经氨酸酶和巨大蛋白质。副粘病毒亚族的每个病毒的基因通常如下所述。通常，NP基因也 可以表示为"N基因"。
[0077]
[0078] 属于副粘病毒（Paramyxoviridae)呼吸病毒（Respirovirus)的仙台病毒的每 个基因的核苷酸序列的数据库登记号分别为，对于NP基因参照M29343、M30202、M30203、 M30204, M51331、M5565、M69046,和 X17218 ;对于 P 基因参照 M30202、M30203、M30204、 M55565、M69046、X00583、X17007,和 X17008 ;对于 Μ 基因参照 D11446、K02742、M30202、 M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、X53056 ;对于 F 基因参照 D00152、D11446、D17334、 D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152 和 X02131 ;对于 HN 基因参照 D26475、 M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、X56131 ;对于 L 基因参照 D00053、 M30202、M30203、M30204、M69040、X00587,和 X58886。
[0079] 本发明所用的术语"基因"定义为含有核酸如RNA、DNA等的遗传物质。基因可以 是天然得到或带有人工设计的序列。本文利用的副粘病毒载体含有编码结核杆菌的蛋白质 或其一部分的外源基因。该外源基因可以是天然的结核杆菌含有的基因或或其片段。外源 基因也可以包括例如编码缺损的、突变的、失活的或与其他蛋白质融合的天然结核杆菌蛋 白质的核酸。另外，本文的"DNA"包括单链DNA和双链DNA。
[0080] 本发明所用术语"结核分枝杆菌"是指引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官， 以肺结核为最多见。结核分枝杆菌根据基因组和地区等的不同，可分为多种菌株。比如在中 国和东南亚普遍流行的是北京家族结核菌。本发明中所使用的菌株为结核菌的标准毒株， 即H37Rv株。
[0081] 本发明所用的术语"仙台病毒载体"定义为来自仙台病毒的并且用于将基因转化 到宿主细胞的载体。仙台病毒可以是核糖核蛋白（RNP)，也可以是具有感染性的病毒颗粒。 在此，"感染性"定义为重组仙台病毒载体通过它的细胞吸附和膜融合能力将载体内部的基 因转化到载体所吸附的细胞中的能力。本发明的仙台病毒载体以可表达的方式携带编码可 成为抗原的结核杆菌蛋白质的外源基因。仙台病毒载体可以具有与野生型载体一样的复制 能力，也可以因基因突变而减弱。另外，本发明的仙台病毒载体还可以是没有复制能力的缺 陷型载体。"复制能力"定义为病毒载体在感染细胞中复制并生产感染性病毒颗粒的能力。
[0082] 本发明提供了包含结核杆菌蛋白质的基因或其一部分的仙台病毒载体的疫苗。仙 台病毒编码的结核杆菌的蛋白质没有局限性，只要蛋白质具有抗原性。结核杆菌蛋白质包 括结核杆菌的结构蛋白、调节蛋白和修饰蛋白。这些蛋白质或者它们的一部分多肽等可用 于疫苗的生产。本疫苗可以通过构建表达上述的蛋白质或其一部分的仙台表达载体来生 产。这些蛋白质可以是单独的，也可以是复数的组合。在本发明中，特定优选利用表达结核 杆菌的结构蛋白质的SeV。
[0083] 本发明人先前已发现，鼻内接种弥猴的重组SeV载体的基因表达在接种后一星期 内达到峰值，并且持续至少13天。另外，重复给药可以使表达持久。这些特征在利用重组 SeV载体进行接种时，具有获得快速和持续的治疗效果的优点。
[0084] 从安全性的角度来看，SeV载体也表现出适宜于人的临床应用的可能性。首先，在 许多载体中，外源基因表达要求转染后的DNA必须进入核内，这成为影响基因转染成功率 的主要障碍。但是，在仙台病毒的情况下，外源基因的表达是在细胞质中由细胞微管蛋白和 其本身具有的RNA聚合酶（L蛋白质）两者来驱动的。这表明SeV不会与寄主细胞的基因组 相互作用，这避免了致瘤等安全性方面的问题。其次，已知SeV对啮齿类动物是致病性的， 可以引起肺炎。但对人没有病原性。鼻内给药野生型SeV没有对非人灵长类产生严重的有 害作用的报告也证明了这一点（Burwitz J.L.等人《疫苗》，1997年，第15卷，第533-540 页）。SeV的这些特征表明，SeV载体用于人时，是非常安全的，并且有望成为能够表达抗原 蛋白质的载体之一。事实上，在本发明中，在SeV接种后的小鼠本身没有表现出任何明显的 病理症状，也没有观察体重的明显降低。本发明的疫苗特别优选用于以结核杆菌为对象的 接种。用另一句话说，接种本发明的疫苗可以诱导对结核杆菌的免疫从而达到防止结核杆 菌的感染和/或繁殖。本发明的疫苗优选用于没有感染结核杆菌之前的预防和感染后的治 疗。
[0085] 在本发明中用于接种的SeV载体没有特别的限制。例如较理想的SeV载体可以是 具有复制能力并且能够自我繁殖的载体。例如，通常野生型SeV的基因组紧接着短3'引导 区是编码N(核壳）、P(磷）、M(基质）、F(融合）、HN(血凝素-神经氨酸酶）和L(大）蛋 白质的6个基因，并且在另一末端具有短5'非转录尾区。通过设计具有与上面所述的载体 相似的结构的基因组可以得到能够自我复制的载体。另外，通过在基因组中插入外源基因 可以获得表达外源基因的载体。SeV载体的病毒基因的排列可以与野生型不同。
[0086] 本发明的用于免疫的SeV载体可以缺损一部分野生型SeV中含有的基因。例如， 为了构建SeV载体和表达基因，NP、P/C和L基因编码的蛋白质被认为是必需的，所以，编码 这些蛋白质的基因必需包含在SeV载体的基因组中。而其他基因，比如M、F和HN蛋白质可 在构建SeV载体时，通过反式方法（Trans:其他形式）供应。可以将携带编码这些蛋白质 的基因的表达载体与编码SeV载体基因组的表达载体共转染于寄主细胞，来构建SeV载体。 还可以将编码病毒基因组的表达载体转染于携带编码这些蛋白质的基因的寄主细胞，利用 寄主细胞提供的蛋白质来再构建SeV载体。只要在核酸转化中具有和天然的蛋白质具有相 当的或更高的活性，这些蛋白质的氨基酸序列可以与病毒本身的序列不同，并且可以是突 变的或使用另一个病毒的同源基因。
[0087] 当以RNP的形式制备SeV载体时，可以不要被认为是SeV载体的细胞间传播所必 需的M、F和HN基因编码的蛋白质。只要RNP中含有的基因组包含M、F和HN基因，当将其 导入宿主细胞时，可以产生这些基因的产物，并且产生具有感染性的病毒颗粒。产生感染性 病毒的RNP载体可以是含有编码N、P、M、F、HN和L基因的基因组RNA和N、P和L蛋白质的 RNP。当将这样的RNP导入细胞时，通过N、P和L蛋白质的作用，病毒基因组得到了表达和 复制，以致感染性病毒载体得到扩增。
[0088] RNP可以与脂转染胺试剂、聚阳离子脂质体等形成复合物导入细胞。具体地说，可 以利用各种转染试剂，例如 DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、D0TAP、D0PE、 D0SPER(Boehringer#1811169)。可以加入氯喹以防止在核内体内的降解（Calos Μ. P.，美 国科学院年报，1983年，80卷，第3015页）。在复制型病毒的情况下，可以将产生的病毒通 过再感染培养细胞、鸡胚或生物个体（例如小鼠等哺乳动物）进行扩增或传代。
[0089] 相反，M、F和/或HN基因缺陷的SeV载体也可用于本发明。可以通过从外源提供 缺损的基因产物来再构建这些载体。这样的载体和野生型病毒一样仍然与宿主细胞吸附并 且诱导细胞融合。但是由于导入细胞的载体的基因组上缺乏上述的某一基因，因此不能形 成和最初一样的有感染性的子病毒颗粒。所以，这些载体可以用于只有一次基因转导能力 的非常安全的病毒载体。基因组中缺损的基因可以是F和/或HN基因。将编码缺损F基 因的重组副粘病毒的基因组的表达质粒，F蛋白质的表达载体和NP、P/C和L蛋白质的表达 载体共转染于寄主细胞可以再构建病毒载体（W000/70055和W000/70070)。还可以利用基 因组内已整合了 F基因的寄主细胞来生产。从外源提供这些蛋白质时，其氨基酸序列可与 野生型的不相同，并且只要它们提供与天然的蛋白质相当的或更高的基因转化活性，可以 是突变的或使用另外的病毒的同源蛋白质。
[0090] 可以在病毒的包被蛋白中含有和来自病毒基因组的包被蛋白质不同的蛋白质。这 些蛋白质不受任何限制。可以包括其他病毒的包被蛋白质，如水泡性口膜炎病毒（VSV)的 G蛋白质（VSV-G)。所以，构成本发明的疫苗的SeV载体包括包含来自和病毒基因组非同源 的病毒的包被蛋白质的假型病毒载体。
[0091] 同时，用于本发明的疫苗的SeV载体在它的包被的表面可以具有一个靶向特定的 细胞的粘连分子、配体或受体等蛋白质，或者可以是在胞外区域含有这些蛋白质，而在胞内 区域含有起源于病毒包被蛋白质的多肽的嵌合蛋白质。由此可以制作以特定组织为靶标的 载体。这些蛋白质可以是病毒基因组编码的，或在病毒的再构建时，通过病毒基因组以外的 基因（例如，其他的表达载体或宿主细胞的染色体的基因）的表达来提供。
[0092] 为了减少针对SeV蛋白质的抗原性，或者为了增强RNA的转录效率和复制效率，可 以改变用于本发明的疫苗的SeV载体中含有的病毒基因。具体地说，至少可以改变复制因 子基因 NP、P/C和L基因中的某一个基因来增强转录或者复制能力。此外，作为结构蛋白 质之一的HN蛋白质具有血凝素（hemagglutinin)活性和神经氨酸酶（neuraminidase)活 性，如果可以减弱前者的活性，可望增强血液中病毒的稳定性。如可以改变后者的活性，则 可望可望调节感染性。同样，改变与膜融合相关的F蛋白质，可望调节与膜融合的脂质体的 融合能力。另外，还可望通过分析在细胞表面的F蛋白质和HN蛋白质的可能的抗原分子的 表位，并利用它们来制作降低了抗原表达能力的SeV。
[0093] 另外，缺少修饰基因的SeV也可以用于本发明的疫苗。例如，当SeV的一个修饰基 因 V基因被去掉后，虽然不影响基因在培养细胞中的表达和复制，但SeV对小鼠的致病能力 大大降低（Kato, A等人，1997年《病毒学杂志》71卷：第7266-7272页；Kato, A等人，1997 年《EMBO 》第 16 卷：第 578-587 页；Curran, 等人，W001/04272, EP1067179)。这样弱 毒化后的载体特别优选作为构成本发明的疫苗的载体。
[0094] 用于本发明的疫苗的病毒载体在其基因组RNA中编码结核杆菌蛋白质或该蛋白 质的一部分。通过在上面提到的在SeV载体的基因组中插入外源基因可以得到表达外源基 因的重组的SeV载体。外源基因可以是编码结核杆菌蛋白质或该蛋白质的一部分的基因片 段。这样的基因片段可以是编码结核杆菌蛋白质的天然存在的基因片段，也可以是编码经 过缺损、替代或者插入等由天然蛋白质经修饰而得到的基因，只要该基因编码的蛋白质至 少具有一部分与天然蛋白质相当的抗原性。
[0095] 结核分枝杆菌蛋白质是指结核菌中包含的蛋白质。已有研究证明，H37Rv株的免 疫优势抗原是Ag85A和Ag85B等。在本发明中，优选利用的是表达这些蛋白质的任何一个 或一部分，或它们的混合体的SeV载体。我们构建了 SeV载体以表达任何这些蛋白质（包 括加工的和未加工的蛋白质）的全长或它们的一部分，或它们的组合。作为蛋白质的一部 分，其长度和位点不受任何限制，只要这部分具有抗原的活性。例如，它可以包含一个或多 个表位的多肽。这样的多肽通常至少含有结核杆菌蛋白质的氨基酸序列中的3到几个邻接 的氨基酸。优选含有结核杆菌蛋白质的氨基酸序列中的约7到约15个氨基酸，例如，8、9、 10、12或14个氨基酸。
[0096] 本疫苗至少利用了一种结核杆菌的蛋白质。根据本发明，甚至在只表达Ag85抗原 时也能够诱导有效的免疫诱导。另外，利用多个类型的蛋白质作为抗原，可以得到更高的免 疫性。
[0097] 另外，疫苗可以使用来自结核杆菌的一个菌株的蛋白质，但如果用从复数的菌株 得到的菌体蛋白质作为抗原，可以获得针对更宽范围的菌株的结核杆菌的免疫能力。在利 用复数的菌株作为抗原的情况下，它们之间的组合不受任何限制。例如，可以利用从各种分 离菌株中得到的基因生产疫苗。可以将多个结核杆菌基因分别整合进不同的SeV载体基因 组中构建SeV后利用它们的组合，也可以将多个基因整合进同一 SeV载体的基因组来表达 这些基因。
[0098] 为了构建表达结核杆菌的蛋白质的SeV，例如，可以将编码靶结核杆菌的蛋白的基 因插入编码SeV基因组的DNA(SeV载体DNA)。在将外源基因插入SeV载体DNA中时，需 要在转录终止序列（E)和转录起始序列（S)之间插入含有是六的倍数个的核苷酸的序列 (Calain P.和Roux L.，《病毒学杂志》，1993年，67 (8)，第4822-4830页）。外源基因可以 插入在各个SeV基因（即、？、14、圆和1^基因）的上游和/或下游。为了不干扰上下游的 基因的表达，可在外源基因的上游或下游插入E-I-S序列（转录终止序列-中介序列-转 录起始序列）或它的一部分，使得各个基因之间都有E-I-S序列。或者可以通过插入IRES 表达外源基因。
[0099] 插入的外来基因的表达水平可以由附随于这些基因的上游的转录起始序列的类 型来进行调节。也可以由插入的位点和基因前后的序列来调节。例如，在SeV中，插入位点 越靠近病毒基因组的负链RNA的3'末端（越靠近野生型病毒基因组中的NP基因），插入 基因的表达水平就越高。为了达到外源基因的高表达，优选将外源基因插入在负链基因组 的上游区如NP基因的上游（负链的3'侧区）或插入在NP和P基因之间。与此相反，插入 位点越靠近负链RNA的5'末端（越靠近野生型病毒基因组的L基因），插入基因的表达水 平就越低。为了减少外源基因的表达，可以将它插入在负链的最5'端位置，即野生型病毒 基因组的L基因的下游（负链的L基因的5'侧区）或L基因的上游（负链的L基因的3' 侧区）。由此可知，为了得到所望的外源基因的表达水平，可以适当地调节外源基因的插入 位置，或通过前后的编码病毒蛋白质的基因的组合来调整。例如，当投放高滴度的病毒载体 时，由于导入基因的高表达会出现毒性。在这种情况下，除了可以控制所投放的病毒的滴度 以外，还可以通过将外来基因的插入位点设计在靠近负链的5'末端区域，或使用低效的转 录起始序列来控制。
[0100] 通常，因为没有细胞毒性，抗原蛋白质的高表达在免疫性的获得上是有利的，所 以，优选将编码抗原蛋白质的基因与高效的转录起始序列连接，并且将该基因插入负链基 因组的3'末端附近。优选的载体的例子包括结核杆菌的蛋白质在副粘病毒载体的负链基 因组中位于任何副粘病毒的病毒蛋白质的3'侧的载体。例如，优选抗原基因插入在N基因 的上游（负链的3'侧）的载体。或者抗原基因插入在紧接N基因的下游。
[0101] 为了使外源基因的插入容易些，可以在插入位置设计一个克隆位点。例如，克隆位 点可以是限制酶的识别序列。可以将外源基因插入病毒载体DNA的限制位点。克隆位点还 可以是含有多个限制酶的识别序列的多克隆位点。用于本发明的疫苗的载体可以在上述插 入了结核杆菌的蛋白质以外的位置中含有其它外源基因。这样的外源基因不受任何限制， 它可以是与免疫诱导有关的细胞因子或趋化因子基因，也可以是其它的基因。
[0102] 含有外源基因的重组仙台病毒载体可以根据Hasan，M.K.等人《遗传病毒学杂志》 78卷：2813-2820页，1997年；Yu D.等人，基因细胞，1997年，2,457-466的记载，按如下方 法构筑。
[0103] 首先制备含有所需的外源基因的cDNA序列的DNA样品。优选浓度为25纳克/毫 升或更高，并且通过电泳检测为单个质粒的DNA样品。下面的描述是将外源基因插入病毒 基因组DNA的Notl位点的例子。如果要插入的cDNA序列中含有Notl位点，那么需要预先 通过定位诱变法在不改变所编码的蛋白质的氨基酸序列的前提下改变核苷酸序列以来除 去这个位点。从DNA样品进行PCR以扩增并回收需要的DNA片段。为了使扩增的片段在两 端都具有Notl位点，并且在一个末端附加一个拷贝的仙台病毒的转录终止序列（E)、中介 序列（I)和转录起始序列（S) (EIS序列），合成了含有Notl限制酶切位点及转录终止序列 (E)、中介序列⑴和转录起始序列⑶以及一部分目的基因的序列的正向引物（正向链） 和反向引物（反义链）的引物对。
[0104] 例如，正向的合成DNA序列在5'末端含有任意的两个或更多核苷酸以保证Notl 消化成功（优选不含有起源于Notl识别位点如GCG和GCC的4个核苷酸，更优选ACTT)。 在此序列的3'末端加入Notl识别序列GCGGCCGC。另外，在3'末端加入任意的9个或9+6 的倍数个核苷酸作为间隔区。另外，在3'末端，再加上对应于所需的cDNA的0RF的从起始 密码ATG开头的约25个核苷酸的序列。优选合成的正向的低聚DNA的3'末端含有约25 个所需的cDNA的核苷酸序列并且使最后的核苷酸是G或C。
[0105] 反向的合成DNA序列在5'末端含有任意的两个或更多核苷酸（优选不含有起源 于Notl识别位点，如GCG和GCC的4个核苷酸；更优选ACTT)。在此序列的3'末端加上 Notl识别序列GCGGCCGC。另外，在3'末端，加入一个间隔低聚DNA来调节引物的长度。如 下所述，将包括Notl识别序列GCGGCCGC、与cDNA互补的序列、来自仙台病毒基因组的EIS 序列在内的低聚DNA的长度设计成使它核苷酸的总数为6的倍数（所谓的"6的规则"； Kolakofski D.等人《病毒学杂志》，1998 年，72 卷，第 891-899 页；Calain P.和 Roux L·， 《病毒学杂志》，1993年，67卷：4822-4830)。另外，在加上的序列的3'末端再加上与仙台病 毒的S序列互补的序列，优选5' -CTTTCACCCT-3'，与I序列互补的序列，优选5' -AAG-3'，和 与E序列互补的序列，优选5' -TTTTTCTTACTACGG-3'。最后，再在3'末端加上所需的cDNA 的从终止密码子往上游数的约25个核苷酸的互补序列并使最后的核苷酸为G或C。这样， 制备了反向合成低聚DNA的3'末端。
[0106] PCR通过普通的方法，例如利用ExTaq聚合酶（TaKaRa)进行。优选利用Vent聚合 酶（NEB)，扩增的DNA片段用Notl消化后，插入质粒载体pBluescript的Notl位点。用自 动DNA序列仪检测得到的PCR产物的核苷酸序列。选择具有正确序列的质粒。通过Notl 消化从质粒中切出插入的片段，亚克隆进含有副粘病毒基因组cDNA的质粒中的Notl位点。 也可以不通过pBluescript质粒，直接将PCR产物克隆进后述的质粒的Notl位点而得到重 组的仙台病毒cDNA。
[0107] 例如，可以根据文献（Yu，D.等人《基因细胞》2卷：457-466，1997年；Hasan Μ. K.等人，《遗传病毒学杂志》1997年，78卷：2813-2820)记载的方法构建重组仙台病毒基 因组cDNA。例如，将含有Notl位点的18bp的间隔序列（5' _(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'） 插入克隆的仙台病毒基因组cDNA(pSeV(+))的导前置序列和编码N蛋白质的序列的5'末 端之间的邻近的基因座中，得到了含有来自丁型肝炎病毒反义链的可自我裂解的核酶位点 的质粒pSeV18 + * b (+) (Hasan, Μ· K.等人，《遗传病毒学杂志》1977年，78卷：2813-2820)。 将外源基因片段插入pSeVIS * b(+)的Notl位点，得到已经插入所需的外源基因的重组仙 台病毒cDNA。
[0108] 在体外或细胞中转录如此制作的重组的副粘病毒载体DNA，在L、P和NP蛋白质存 在的条件下再构建RNP，可以产生含有RNP的病毒载体。本发明提供了生产含有编码结核 杆菌的蛋白质副粘病毒载体的疫苗的方法，这一方法包括转录病毒的基因组DNA的工序。 本发明还提供了由该DNA生成的，用于生产作为本发明的疫苗的成分的副粘病毒载体的 DNA。本发明涉及生产作为本发明的疫苗的成分的副粘病毒载体的，编码本载体的基因组的 DNA的用途。可以根据已知的方法从病毒载体DNA再构建病毒（W097/16539 ;W097/16538 ; Durbin A. P.等人，《病毒学》，1997年，235卷：第323-332页；Whelan S.P.等人《美国自然 科学进程》1995年，92卷，第8388-8392页；Schnell M. J.等人《ΕΜΒ0 J》1994年，13卷，第 4195-4203 页；Radecke F.等人，《ΕΜΒ0 J.》1995 年，14卷，第 5773-5784 页；Lawson N.D.等 人，《美国自然科学进程》，1995年，92卷，第4477-4481页；Garcin D.等人，《ΕΜΒ0 J.》，1995 年，14卷，6087-6094 ;Kato A.等人，《基因细胞》1996年，1卷，第569-579页；Baron M.D.和 Barrett T·，《病毒学杂志》，1997 年，71 卷，第 1265-1271 页；Bridgen A.和 Elliott R.M·， 《美国科学院年报》1996年，93卷：第15400-15404页）。根据这些方法能够从DNA再构建 包括副流感病毒、水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙台病毒等副粘 病毒载体。如果病毒载体DNA中缺少F、HN和/或Μ基因，光此不能形成有感染性的病毒颗 粒。可以将这些缺少的基因或编码来自其他病毒的包被蛋白质的基因导入寄主细胞并使之 表达来生产感染性病毒颗粒。
[0109] 将载体DNA导入细胞的方法可以包括⑴形成可以掺入所需的细胞的DNA沉淀， (2)生成包含带正电的DNA的复合物的方法，该复合物适于掺入所需的细胞，并且细胞毒性 低，和（3)利用电脉冲在所需的细胞膜上快速地打开一个能让DNA通过的足够大的孔。
[0110] 在⑵中，可以利用各种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)、 Superfect(QIAGEN#301305)、D0TAP、D0PE 和 D0SPER(Boehringer#1811169)。对于方法（1)， 可以利用磷酸钙转染。在这一方法中，已知掺入细胞中的DNA会被吸收进吞噬泡，但核中也 有足够量的DNA(GrahmF·L·和vanDerEbJ·，《病毒学》，1973 年，52,456;WiglerM·和 Silverstein S·，《细胞》，1977年，11卷，223页）。chen和Okayama对转化技术进行了最 佳化研究，并报告：（1)细胞和沉淀的培养条件为2到4%的C0 2, 35°C，15到24小时，（2)环 状DNA比线性DNA活性高，和⑶混合溶液中DNA浓度在20到30毫克/毫升之间时，可以 得到最佳的沉淀（Chen C.和Okayama H.，《细胞分子生物学》，1987年，7卷，第2745页）。 方法（2)适用于瞬时转染。更早的方法是将DEAE-dextran(Sigma#D-9885M.W.5X10 5)溶 液与DNA以所需的浓度比例混合后进行转染。因为大多数复合物在核内体中降解，可以加 入氯喹增强转染的效率（Calos M.P.，《美国科学院年报》，1983年，第80卷，3015)。方法 (3)，称为电穿孔法，由于它可以用于任何种类的细胞，因而和方法（1)和（2)相比用途更 广。在最佳脉冲流的持续时间、脉冲的形式、电场的强度（电极之间的空隙和电压）、缓冲液 的导电性、DNA浓度和细胞密度的条件下效率最大。
[0111] 在上述3个方法中，方法（2)由于其操作简便，并且可以利用大量的细胞来测试 多数的样品，比较适于在再构建载体时往细胞中导入DNA。优选利用Superfect转染试剂 (QIAGEN，#301305)或 D0SPER 脂质体转染试剂（Boeringer Mannheim#1811169)。
[0112] 从cDNA的再构建可按以下步骤来具体进行：
[0113] 在24孔-6孔的塑料平板中，或在100毫米的培养皿中，在含有10%的胎牛血 清（FCS)和抗生素（100单位/毫升青霉素 G和100晕克/毫升链霉素）的极限必需培养 基（MEM)中培养从猴肾得到的细胞系LLC-MK2,直到70-80%融合。然后，用2pfu/细胞的 已经在1毫克/毫升的补骨脂素存在下，用20分钟的UV曝光失活的表达T7聚合酶的重 组牛痘病毒VTF7-3感染细胞（Fuerst T. R.等人《美国自然科学进程》，1986年，83卷：第 8122-8126页；Kato. A.等人，《基因细胞》1996年，1卷，第569-579页）。补骨脂素的量和 UV曝光的时间可以进行适宜调整。感染后1小时，例如通过Superfect (QIAGEN)将2到60 毫克，更优选3到5毫克的重组仙台病毒cDNA和生产全长的仙台病毒基因组所必需的，以 反式起作用的病毒蛋白质的表达质粒（例如，24-0. 5毫克的pGEM-N，12-0. 25毫克pGEM-P， 和24-0. 5毫克pGEM-L，或更优选地1毫克pGEM-N，0. 5毫克pGEM-P，和1毫克pGEM-L)脂 转染细胞（Kato. A.等人，《基因细胞》，1996年，1卷，第569-579页）。转染的细胞在无血清 的，如果需要，可含有100毫克/毫升利福平（Sigma)，和阿糖胞苷（AraC) (Sigma)，更优选 在只含40毫克/毫升的阿糖胞苷的MEM中培养。可根据需要调节药物的浓度到最佳，从而 使牛痘病毒的细胞毒性最小和病毒的回收率最大（Kato. A.等人，《基因细胞》，1996年，第1 卷：569-579)。转染后培养细胞48到72小时，然后回收细胞，用三个冻融循环破碎细胞后， 将其转染进LLC-MK2细胞。培养3-7天后，收集培养液。为了再构建不能复制的缺乏编码 包被蛋白质的基因的病毒载体，可以将载体转染进表达包被蛋白质的LLC-MK2细胞、或与 包被蛋白质的表达质粒共转染。还可以将表达包被蛋白质的LLC-MK2细胞铺在转染的细胞 上并施培养来繁殖缺损的病毒载体（W000/70055和W00070070)。培养液中的病毒滴度可以 通过测量血凝素活性（HA)来确定。而HA可以用"终点稀释法"来确定（Kato. A.等人，《基 因细胞》，1996年，1卷，569-579 ;Yonemitsu Y.和Kaneda Y.，日本凝血病毒-脂质体介导 的微管细胞的基因转导，微管疾病的分子生物学，分子医药方法，Baker A.H.编辑，Humana 出版，1999年，295-306页）。可能混入（残留）的vTF7-3可以通过将得到的尿囊样品适当 稀释（例如1〇6倍），并在鸡蛋中再扩增来除去。再扩增例可以重复3或更多次。得到的病 毒可以储藏在-80 °C。
[0114] 用于病毒载体构建的寄主细胞不限于任何特定的细胞类型，只要病毒载体可以在 该细胞中再构建。寄主细胞可以包括LLC-MK2细胞、从猴肾得到的CV-1细胞、从仓鼠肾得 到的BHK细胞等培养的细胞系，也可使用人起源的细胞。为了获得大量的仙台病毒载体， 可以用从上面的寄主细胞得到的病毒载体感染已成胚胎的鸡卵来扩增载体。用鸡卵生产 病毒载体的方法是已确立的（神经科学研究的先进技术方案III，神经科学分子生理学， Nakanishi等人编辑，Kouseisha, Osaka, 1993年，第153-172页）。具体地说，例如将受精 的鸡卵在温育器中，在37-38Γ培养9到12天直到长成胚胎。将病毒载体接种进尿囊腔， 继续培养鸡蛋几天繁殖载体。培养的时间等条件可以根据所用的重组仙台病毒的类型而变 化。然后，回收含有病毒的尿囊液。根据标准方法，从尿囊样品中分离和纯化仙台病毒载体 (Tashiro M.，病毒实验方案，Nagai和Ishihama编辑，医药观察，1995年，第68-73页）。
[0115] 例如，可以按如下方法构建和制备缺陷F蛋白质的仙台病毒载体（W000/70055和 W000/70070)〇
[0116] (1)构建缺陷F基因的仙台病毒基因组cDNA和F的表达质粒
[0117] 用SphI和ΚρηΙ消化全长的仙台病毒（SeV)基因组cDNA^=jpSeV18(Hasan Μ K.等 人，《遗传病毒学杂志》，1997年，78卷，2813-2820页）（pSeV18+b(+)也称为pSeV18(+))， 回收得到的片段（14673bp)，克隆进pUC18得到质粒pUC18/KS。F缺陷区域利用pUC18/ KS来构建。F基因的缺陷通过PCR-连接法来进行，最终除去F基因的0RF(1698bp)，用 序列5' -atgcatgccggcagatga连接构筑缺陷F基因的SeV基因组cDNA (pSeV18+/ Λ F) 用 EcoT22I 消化并连接用引物（正向：5' -gttgagtactgcaagagc ;反向：5' -tttgccggc atgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc)得到的F基因上游的PCR产物和引物（正向： 5' -atgcatgccggcagatga ;反向：5' -tgggtgaatgagagaatcagc)得到的 F 基因下游的 PCR 产 物。然后用SacI和Sail消化得到的质粒，回收含有F基因缺损部位的片段（4931bp)，克隆 进PUC18得到pUC18/dFSS。用Drain消化pUC18/dFSS，回收片段并取代pSeV18+的含有F 基因的Drain片段，连接得到pSeV18/ Λ F。在pUC18/dFSS的F基因缺损部位中的Nsil 或NgoMIV位点可以插入外源基因。为此，可以用以Nsil接尾的引物及NgoMIV接尾的引物 扩增含有外源基因的片段。
[0118] (2)制备诱导表达SeV-F蛋白质的辅助细胞
[0119] 如下构建表达仙台病毒F基因（SeV-F)的Cre/loxP可诱导表达质粒。通过PCR扩 增SeV-F基因，克隆进pCALNdLw质粒的唯一的Swal位点（Arai等人，《病毒学杂志》，1998 年，第72卷，第1115-1121页），这一质粒被设计成可以通过Cre DNA重组酶的作用诱导基 因产物的表达，这样得到了 pCALNdLw/F。
[0120] 为了从缺损F基因的基因组得到感染性病毒颗粒，建立了一个表达SeV-F蛋白质 的辅助细胞系。可以利用从弥猴肾得到的，通常用于SeV繁殖的LLC-MK2细胞。在37°C， 5%的C0 2条件下，用含有10%的热失活的胎牛血清（FBS)、50单位/毫升的青霉素 G钠和 50毫克/毫升的链霉素的MEM培养LLC-MK2细胞。由于SeV-F基因产物有细胞毒性，所以 将该基因克隆进pCALNdLw，在这一质粒中，F基因可由Cre DNA重组酶诱导表达。根据标准 方法，通过磷酸妈方法（哺乳动物转染试剂盒（Stratagene))，将上面的pCALNdLw/F转染于 LLC-MK2 细胞。
[0121] 用10毫克pCALNdLw/F转染在10厘米的平板中培养至40%融合的LLC-MK2细胞 用10毫升含有10% FBS，在37°C和5%的C02下培养24小时。然后，剥离细胞，悬浮于10 毫升的培养基中后，铺到5个10厘米的盘上，其中在一个盘铺5毫升细胞悬浮液，2个铺2 毫升，两个铺0. 2毫升。在10毫升含有10% FBS和1200毫克/毫升G418(GIBC0-BRL)的 MEM中培养14天，每两天更换培养基，选择稳定的转染体。用克隆环回收的培养基上生长的 抗G418的细胞。继续培养回收的每个菌落的细胞，直到它们在10厘米的盘中到100%融 合。
[0122] 为了诱导F蛋白质的表达，在6厘米的盘中培养细胞到100%融合，根据Saito等 人的方法（Saito等人，《核酸综述》，1995年，23卷，第3816-3821页；Arai T.等人《病毒学 杂志》，1998年，72卷，第1115-1121页），用moi = 3的AxCANCre腺病毒感染。
[0123] (3)缺损F基因的SeV病毒的再构建与繁殖
[0124] 如下，将已经插入外源基因的pSeV18+/AF转染进LLC-MK2细胞。将5X106个 细胞/盘的LLC-MK2细胞铺在100毫米的盘里，培养24小时后，用补骨脂素和20分钟的长 UV(365nm)处理过的表达T7RNA聚合酶的重组牛痘病毒感染1小时（Furest T. R.等人，《美 国自然科学进程》，1986年，第83卷，第8122-8126页）在室温下感染1小时（moi = 2-3 ; 优选用moi = 2)。牛痘病毒的紫外线照射采用装备了 5个15瓦的灯泡的UV Stratakinker 2400 (目录号 400676 (100V)，Stratagene，La Jolla, CA，USA)。洗涤细胞三次后，以 12 毫 克/盘，4毫克/盘，2毫克/盘，和4毫克/盘将质粒pSeV18+/DF-GFP，pGEM/NP，pEGM/P， 和pGEM/L悬浮于OptiMEM(GIBCO) (Kato A.等人，《基因细胞》，1996年，1卷，第569-579 页），并与SuperFect转染试剂（1毫克DNA用5毫升SuperFect(QIAGEN))混合后，在室 温下放置10分钟，最后加入3毫升浓度为3%的FBS的OptiMEM，然后加到细胞中。在温 育器中培养3小时后，用无血清的MEM洗涤细胞2次，继续在含有40毫克/毫升阿糖胞苷 (AraC，Sigma)，和7. 5毫克/毫升的胰蛋白胨（GIBC0)的MEM中培养70小时。然后，收集 细胞，并以1〇7个细胞/毫升将细胞再悬浮于OptiMEM中。冻融细胞3次，然后与脂转染试 剂D0SPER(Boehringer mannheim)混合（每25毫升D0SPER中106个细胞），在室温下放置 15分钟，转染进上述选择的一个表达F的辅助细胞系，例如LLC-MK2/F7细胞（10 6个细胞 /孔，12孔的平板），在含有40毫克/毫升的Arac和7. 5毫克/毫升的胰蛋白胨的无血清 MEM中培养，收集上清液。有可能混入的牛痘病毒可以采取重复稀释得到的上清液并感染 LLC-MK2F7细胞的过程来除去。
[0125] 在制备缺损的病毒载体时，可以将在病毒基因组上缺失不同包被基因的两个不同 的病毒载体转染进相同的细胞。在这种情况下，各自缺损的包被蛋白可以通过另一载体的 表达提供，这样的相互补充可以导致感染性病毒颗粒的形成并使病毒复制链运转从而复制 病毒载体。换句话说，可以同时接种两个或更多的，包被蛋白互补的病毒载体的组合，从而 低价并大规模地生产各个缺失包被的病毒载体的混合物。因为这些病毒缺失包被基因，与 不缺损包被基因的病毒相比病毒的基因组更小，所以它们允许插入更长的外源基因。另外， 这些本身不具感染性的病毒，在细胞外稀释后很难保持共感染状态，由于其是不孕的，所以 在环境管理上是有利的。
[0126] 为了使回收的副粘病毒真正纯净，可以进行精制。可以采用已知的纯化和分离方 法，包括过滤、离心、柱层析纯化或这些方法的组合进行纯化。"真正纯净"指分离到的物 质，例如化合物、多肽、病毒等等其在作为物质存在的样品中的成分在样品中占主要的比 例。典型地，样品中存在的真正纯净的成分占了含有其它成分的整个样品的50%或更多， 优选70 %或更多，更优选80 %或更多，更优选90 %或更多。可以用本领域技术人员已知的 方法，例如重量比重量的比例（W/V)计算这一比例。计算比例时必需除去溶剂、盐、加入的 化合物等等。副粘病毒的精制方法，具体地说，例如有米用纤维素硫酸酯或交联的多糖硫 酸酯的方法（日本专利申请公开号（JP-B) :Sho62-30752 JP-B Sho 62-33879 JP-B Sho 62-30753)。以及使之与含有硫酸的多糖和/或它的降解产物吸收（WO 97/32010)，等等方 法。
[0127] 可以将回收的SeV载体用作活的重组疫苗。本文中，活疫苗被定义为能够在给药 的个体的细胞中扩增载体基因组，表达抗原蛋白质，和获得免疫性的组合物。如实施例中所 示，SeV载体的接种在弥猴中较好地诱导了免疫性，并且没有表现出明显的临床症状，所以 优选地用于活疫苗。接种这样的活疫苗的对象没有限制，可以包括免疫缺陷病毒可以感染 的所有动物，例如人、猴、猫、狗、猪、马、牛等等。另外，利用上面提到的缺乏传播能力的SeV 载体，可以生产载体不传播的活疫苗。
[0128] 另外，在表达蛋白质惨入SeV颗粒的情况中，可以利用SeV载体作为失活的颗粒疫 苗。或者，在表达蛋白质掺入SeV颗粒的情况中，可以从SeV载体分离和纯化表达的免疫缺 陷病毒蛋白质用作疫苗。因为SeV载体含有的蛋白质种类有限，与从整个细胞溶菌物分离 用表达载体在细胞中表达的免疫缺陷病毒蛋白质相比要容易得多。已知的分离技术可以用 于蛋白质的纯化，例如利用针对免疫缺陷病毒蛋白质的抗体，通过免疫亲和柱层析来纯化。 可以期望，与活疫苗和失活疫苗相比，用纯化的蛋白质作为疫苗可以抑制接种后发生的发 烧和局部反应的频率。
[0129] 如果需要，含有SeV载体的疫苗可以与所需要的药物学可接受的载体或者媒介物 结合或者可以包含所需要的药物学可接受的载体或者媒介物。在本文中，"药物学可接受载 体"定义为可以与载体一起给药，但没有明显抑制载体的基因转化的那些物质。例如，可以 用生理盐水、磷酸缓冲生理盐水（PBS)等等适当地稀释SeV载体制成组合物。如果在鸡蛋中 繁殖SeV载体，组合物可以含有尿囊液。同样，含有SeV载体的疫苗组合物可以含有如去离 子水或5%的葡聚糖水溶液这样的媒体。它还可以进一步含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、 稳定剂、抗生素等等。另外，可以加入保存剂和其它添加剂。为了提高免疫原性，可以加入细 胞因子、霍乱毒素、伤寒毒素等等免疫催速剂。另外还可以将矾、不完全佛氏佐剂、MF59(油 乳剂）、MTP-PE (从分枝杆菌细胞壁得到的胞壁酰三肽）和QS-21 (从soapbark树Quilaja saponaria得到）与疫苗组合。在一个优选的实施方案中，将SeV载体与佐剂左旋咪唑组合 配制为疫苗组合物。
[0130] 利用本发明的疫苗接种可以预防结核杆菌感染和/或在感染后除去结核杆菌或 抑制结核杆菌的繁殖。另外，它可以用于预防结核的发作，或在发作后进行治疗。它也可以 在结核杆菌感染模型中用于预防及/或治疗的方法的开发或评估。
[0131] 本发明的疫苗可以用足够剂量给药，使有效量的载体转化到靶组织的细胞中。本 文中，"有限量"定义为能够将基因导入靶组织的细胞以致至少产生部分所需的免疫应答的 剂量。给药有效量的含有所需基因的SeV载体能够在转染细胞中产生基因产物。优选给药 含有所需基因的有效量的SeV使转染基因在给药组织或血液中呈明显的表达水平。"明显 水平"定义为由SeV载体转染的基因的表达（转录产物或翻译产物的量）可被检测。但是， 转染的基因的表达水平必需考虑它的有效水平和毒性水平而决定。
[0132] 通过本领域的技术人员周知的测试方法可以测定转染进细胞的基因的表达水平。 可以用Northern杂交、RT-PCR、RNA防护测试等等检测和定量转录物。还可以在原位进行 Northern杂交、RT-PCR等检测。为了检测翻译产物，可以利用采用抗体的Western影印、免 疫沉淀、RIA，ELISA，pull down测试方法等等。为了容易地检测转染的基因的表达，可以在 待表达的蛋白质上附加尾标，或在载体中包含一个报告基因。报告基因可以是编码β-半 乳糖苷酶、CAT、碱性磷酸酶，或GFP的基因，但不局限于这些。
[0133] 可以通过检测抗体或免疫细胞来检测免疫应答。例如，可以通过各种周知的测试 方法，如通过测试与各种病原蛋白质的结合（ELISA测试、Western影印，等等）、对合胞体的 形成的抑制、互补固定、依赖抗体的细胞介导的细胞毒性（ADCC)能力、对感染或细胞融合 的中和能力、等等，来测试针对结核杆菌的体液性免疫应答。
[0134] 可以通过例如测试特异于抗原的CTL活性、CTL的产生、或者辅助性T细胞的产生 和活性等等来检测细胞的免疫应答。另外，通过检测激活的T细胞，如CD8+T细胞，或其它 的由白细胞产生的细胞因子或趋化因子同样可以检测细胞的免疫应答。还有，可以通过周 知的淋巴细胞增殖测试、CTL测试、特异于抗原的T细胞测试等等进行检测。
[0135] 用于给药的载体的剂量可以根据疾病、患者的体重、年龄、性别、症状、给药的目 的、疫苗的形式和给药方法等等而变化，可以由本领域的技术人员适当地确定。疫苗中包含 的载体的剂量优选在约l〇 5pfu/毫升到10npfu/毫升的范围内，更优选在约107pfu/毫升到 l〇9pfu/毫升，但最优选的是在约1 X 10spfu/毫升到5 X 10spfu/毫升内，与药物学可接受载 体一起给药。疫苗可以在皮内、皮下、鼻内、跨支气管、肌肉内、静脉内或口服接种。例如，可 以通过往上呼吸道的附近的疫苗接种，即接种到鼻内粘膜和上呼吸道来诱导粘膜免疫性。 因此，将SeV疫苗通过鼻内喷洒等等接种于气管是非常有效的。也可以鼻内给药，例如用导 管介导给药。另外，可以将已经导入SeV的细胞作为疫苗接种。例如，用SeV感染从待接种 疫苗的个体得到的细胞，然后，通过来自体内的给药进行接种。
[0136] 另外，不仅仅单次接种，例如通过两次或多次的接种也可以有效地诱导足够的免 疫性。在人的情况中，多次接种的间隔通常是2到4星期。
[0137] 在多次接种时，可以多次接种含有SeV的本发明的疫苗，但利用SeV疫苗和其它疫 苗的组合也是优选的。如上所述，基于病毒载体的疫苗方案的一个缺点是最终诱导了针对 载体病毒起源的抗原而不是靶抗原的强烈的免疫应答。这个问题可以利用在引导和加强时 分别使用两个或更多不同种类的病毒载体来解决这一问题。所以，如上所述，在基于DNA疫 苗的引导之后使用基于病毒载体进行加强也是可选之策。另外，再接种相同的重组病毒对 于加强特异于抗原的应答可能会不够。所以，用SeV载体引导并用不同的病毒载体或DNA 疫苗进行加强也是有效的。除此之外，用重组SeV载体表达多个抗原可以提高防御效率。
[0138] 所以，在利用不同种类的疫苗进行引导-加强的方案中，与SeV疫苗组合的疫苗不 受限制，可以利用所需的疫苗。例子包括重组的亚单位疫苗、基于SeV以外的病毒或微生物 的活重组疫苗、BCG、多肽疫苗、DNA疫苗，等等，但不局限于这些。亚单位疫苗定义为不具有 靶结核杆菌的所有抗原、只含有一个或复数个选定的蛋白质抗原的疫苗。这样的疫苗至少 是从结核杆菌的其它成分或感染细胞得到的成分中部分地分离的。而亚单位疫苗可以通过 至少部分地纯化结核杆菌蛋白质来制备。另外，也可以利用重组或通过合成生产亚单位疫 苗。用作活重组疫苗的基本成分的微生物的例子包括痘病毒、腺病毒、伤寒病毒、脊髓灰质 炎病毒、分枝杆菌、流感病毒、以及Semliki森林病毒，等等，但不局限于这些。在SeV疫苗 和其它疫苗的接种顺序上是不限制的。可以在接种SeV疫苗后，接种其它疫苗，相反，也可 以在接种其它疫苗后，接种SeV疫苗。
[0139] 例如，在用DNA疫苗引导后，再用SeV疫苗加强。这样的接种是一个包括以下步骤 的方法：(a)给药DNA疫苗，然后（b)给药编码结核杆菌蛋白质的副粘病毒。DNA疫苗可以 利用编码例如结核杆菌基因组的DNA。可以例如通过肌肉内给药和/或基因枪给药接种DNA 疫苗。在接种DNA疫苗几次后，例如接种基于本发明的SeV的疫苗。接种的间隔通常是几 天到几星期。
[0140] 可以接种疫苗的动物可以是具有免疫系统并且可以用结核杆菌感染的所有寄主， 包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、羊、猪、牛、马、鸟等所有的哺乳动物。本发明的疫苗接种的动物 优选灵长类。除了人以外，可以进行本发明的疫苗的接种的灵长类的例子（非人灵长类） 包括狐猴、loris及tarsier等原猴；广鼻猴和狭鼻猴等真猴；类人猿如gibbbon、猩猩、 gorilla、黑猩猩、bonobo等等。狭鼻类中特别是弥猴，具体地，包括日本弥猴、食蟹弥猴、恒 河弥猴、bonnet猴、猪尾弥猴、棕粧尾弥猴、阿萨姆猴等等。对非人灵长类接种疫苗特别适 用于为了对人临床应用的结核疫苗的开发和评估。
[0141] 含有编码结核杆菌的蛋白质的SeV载体的疫苗可以局部地或全身性地诱导寄主 的免疫反应。特别是导入本载体后的细胞作为特异于抗原的免疫反应的刺激细胞起作用并 诱导细胞的免疫反应。本发明提供了诱导特异于结核杆菌蛋白质的细胞性免疫反应的方 法，该方法包括步骤：(a)在抗原递呈细胞中导入编码结核杆菌蛋白质的仙台病毒载体和 (b)将抗原递呈细胞与T辅助细胞和细胞毒性T细胞接触的过程。本文中，使细胞"接触" 也包括允许细胞相互接触。用其它话说，这包括，例如，将载体导入的细胞注入血液中（能 够接触体内的T辅助细胞和细胞毒性T细胞）；在同一种培养基中将载体导入的细胞与T辅 助细胞和细胞毒性细胞进行共培养；等等。另外，特异于抗原的"细胞性免疫反应的诱导" 指至少诱导了该细胞性免疫反应的一部分。例如，特异于抗原的CTL的刺激，该CTL的频率 和活性（例如，细胞毒性）上升，等等。
[0142] 抗原递呈细胞指I类主要组织相容复合物（MHC)或II类MHC被提呈的细胞，并且 具有将抗原蛋白质的肽结合到每个分子上的能力的细胞。抗原递呈细胞的例子有树突细胞 (DC)。I类MHC分子是结合抗原肽并且将它提呈于细胞毒性T细胞（⑶8+)的分子。II类 MHC分子是结合抗原肽并且将它提呈于细胞毒性T细胞（CD4+)上的分子。T辅助细胞是指 T细胞家族的一群细胞，它识别II类MHC分子提呈的抗原并整合一连串的免疫反应的信号 传递的细胞。细胞毒性T细胞也指T细胞家族的一群细胞，它识别I类MHC分子提呈的抗 原，杀死如感染结核杆菌的细胞、癌细胞、以及移植片的细胞等等的细胞（Xu Μ等人，《生物 技术趋势》18 (4) : 167-72, 2000)。
[0143] 例如，在外周血液单核细胞（PBMC)等等中转导编码结核杆菌蛋白质的SeV载体 后，通过在体外与PBMC的共培养，可以诱导IFM-γ的产生及特异于结核杆菌蛋白质的CTL 的增殖等细胞性免疫应答。另外，体内给药能够在寄主中诱导特异于抗原的细胞性免疫应 答。
[0144] 通过测试IFN- γ的量和测量⑶8+IFN- γ +T细胞的频度可以确认细胞免疫应答。 另外，以表达结核杆菌蛋白质的细胞为靶细胞并通过测量靶细胞的溶解也可以测量CTL的 活性。可以通过转导上面提到的SeV载体制备这样的祀细胞。例如，在自身Herpesvirus papio无限增殖的B淋巴细胞系（BLC)中导入表达结核杆菌蛋白质的SeV，然后与预期含有 CTL的样品一起温育，利用51Cr释放等等作为指标可以测量BLC的溶解程度。另外，无限增 殖的细胞系H9 (来自人T细胞）等等也可以作为例证。
[0145] 本发明涉及用于诱导或检测特异于结核杆菌蛋白质的细胞性免疫反应的，编码结 核杆菌蛋白质的SeV载体或本载体导入的细胞的使用。另外，本发明还涉及包含导入了编 码结核杆菌蛋白质的SeV载体的细胞在内的，特异于结核杆菌蛋白质的细胞性免疫应答的 刺激细胞。本发明涉及包含导入了编码结核杆菌蛋白质的SeV载体的细胞在内的，特异于 结核杆菌蛋白质的细胞免疫应答的靶细胞。另外，本发明还涉及在上述刺激细胞或靶细胞 中表达结核杆菌蛋白质的，编码结核杆菌蛋白质的SeV载体的使用。
[0146] SeV载体编码的结核杆菌蛋白质不受限制。如上所示，它们可以是结核杆菌结构蛋 白质、调节蛋白质、修饰蛋白质等等。结构蛋白质的例子包括Ag85A、Ag85B,等等。例如，利 用编码结核杆菌的Ag85A蛋白质的SeV，可以诱导特异于Ag85A的细胞性免疫应答。
[0147] 实施例
[0148] 下面，用实施例具体地说明本发明，但本发明不局限于这些实施例。在本说明书中 引用的参考文献的内容均通过提述组入本说明书。
[0149] [实施例l]Ag85AB嵌合基因的分离、扩增和构建
[0150] 通过PCR从结核分枝杆菌基因组扩增Ag85A基因，PCR扩增后通过Nhel/ BamHI双酶切后连接至pVAXl载体中，使用的引物为针对该序列5'端的上游引物P1序 列和 3' 端的下游引物 P2 序列（5,-ΑΤΑ GCT AGC ATG GTT TCC CGG CCG GGC TTG 03' 和 5' -ΤΑΑ GGA TCC CTA GGC GCC CTG GGG CGC-3'）；然后选择在 Ag85A 基因中可插 入外源DNA片段的第245-250位Κρη I酶切位点，或第430-435位Acc I酶切位点， 分别用内切酶Κρη I或内切酶Acc I消化Ag85A基因，并用碱性磷酸酶去磷酸化。接 着，分别用带有内切酶Κρη I识别序列的引物对，或带有内切酶Acc I识别序列的引 物对，通过聚合酶链反应从结核分枝杆菌基因组扩增编码Ag85B蛋白125-282位氨基 酸序列的DNA片段。本
【发明人】设计了针对该序列5'端的上游引物P3序列和3'端
者均带有Κρη I酶切位点（GGTACC)，分别用内切酶Κρη I或内切酶Acc I消化Ag85A基因， 并用碱性磷酸酶去磷酸化。
[0151] 然后将经消化的Ag85A基因与Ag85B片段用T4DNA连接酶连接起来，将所得质粒 转化大肠杆菌后在卡那霉素抗性培养基平皿上培养生长出菌落。挑选单个菌落分别小试管 培养后，分别抽提质粒作电泳鉴定，再作酶切和电泳鉴定，初步选出正确者经测序确认，重 组的Ag85AB嵌合型基因构建成功。
[0152] [实施例2]SeV85AB重组仙台病毒载体的构建
[0153] F基因缺失的SeV载体（SEQ ID N〇:9)由日本生物载体公司构筑提供（H. Li.等 人，2000年，《病毒学杂志》，74卷：第6564-6569页）。利用该载体构建表达结核分枝杆菌 Ag85AB蛋白的重组SeV载体疫苗，即SeV85AB，下文简称SeV85AB。具体的，前期实验已证 明，通过重组技术敲除SeV融合蛋白F基因并不会影响该载体病毒在培养细胞中的复制和 基因表达，且感染细胞不会产生和释放感染性病毒颗粒。因此，F基因的敲除在保证了病毒 感染和复制效力的同时，增强了该载体的安全性。如上述论文中记载的（H. Li.等人，见上 文），本发明人已对含有全长的F基因缺失的减毒SeV基因组cDNA质粒pSeV (+) 18/dF进行 了描述。
[0154] 通过PCR扩增制备编码Ag85AB (以Acc I为嵌合位点）的基因片段，并将它克隆到 pSeV(+) 18/dF 中，得到 pSeV(+) 18dF/Ag85AB。用于 PCR 的引物 P7 和 P8 序列是 5' -ATT GCG GCC GCG ACA TGG TTT CCC GGC CGG GCT TG-3' ；5'-ATT GAT GAA CTT TCA CCC TAA GTT TTT CTT ACT ACG GCT AGG CGC CCT GGG GCG CGG GCC CGG TGT TGG GCG TG-3,。首先，我 们通过[实施例1]分离并利用上述引物扩增了结核分枝杆菌免疫优势基因 Ag85AB，然后， 将其通过N端编码区上游的Not I位点插入至pSeV(+) 18/dF载体中（图1)。在T7RNA聚合 酶的作用下，这一质粒pSeV(+) 18dF/Ag85AB可以产生全长的SeV85AB的反基因组RNA。接 着将质粒pSeV (+) 18dF/Ag85AB转染到LLC-MK细胞并回收重组的SeV,即SeV85AB (Kato, A. 等人，1996年，《基因细胞》1卷：第569-579页）。具体地说，用表达T7RNA聚合酶的重组牛 痘病毒（VV)，vTF7-3(Fuerst，T. R.等人，1986年《美国科学院年报》，83卷：8122-8126)感 染 LLC-MK2 细胞，然后将 pSeV (+) 18dF/Ag85AB 与 pGEM-N、pGEM-P、和 pGEM-L (Garcin, D.等 人，1995年，《EMBO J.》14卷：6087-6094)共转染该细胞。在细胞培养箱中培养3小时后， 去除细胞培养上清，用无血清的DMEM培养基洗涤细胞2次，继续在含有40毫克/毫升的阿 糖胞苷（AraC，Sigma)和7. 5毫克/毫升的胰蛋白胨（GIBC0)的DMEM中培养70小时。然 后，收集细胞，并以1〇7个细胞/毫升的比例将细胞重悬于培养基中。反复冻融细胞3次， 然后与脂质体转染试剂DOSPER(Boehringer mannheim)混合（每25毫升D0SPER中106个 细胞），在室温下放置15分钟，转染至一个表达F基因的辅助细胞系，例如LLC-MK2/F7细胞 (10 6个细胞/孔，12孔板），在含有40晕克/毫升的Arac和7. 5晕克/毫升的胰蛋白胨的 无血清DMEM培养基中继续培养，收集上清。
[0155] 我们利用同样的方法制备空白SeV作为SeV85AB的对照。利用LLC-MK2细胞和抗 SeV抗体进行免疫染色来筛选和鉴定重组SeV载体疫苗，滴度（CIU [细胞感染单位]/毫升） 的检测则如文献（Kiyotani，K.等人，1990年《病毒学》177:第65-74页）所述。
[0156] 本实施例中得到的SeV85AB重组仙台病毒载体已被保藏于中国典型培养物保藏 中心（CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山，邮编：430072)，分类：副粘病毒科/属，保藏日期： 2015年4月19日，保藏编号为CCTCC V201518。
[0157] [实施例3]表达Ag85AB的SeV85AB重组病毒的鉴定
[0158] 用SeV85AB感染细胞，并对其表达的蛋白质进行分析。具体的，在六孔板中，以每 孔4X 105个细胞的密度过夜培养LLC-MK2细胞，然后以感染复数m. o. i.为1、3、10、30、100 的SeV或SeV85AB感染该细胞。2天后，回收细胞，并用1XSDS sample buffer溶解细胞。 经100°C热处理后，在各个电泳道中加入10微升的细胞溶解物进行SDS-PAGE电泳。利用 抗Ag85A小鼠单克隆抗体作为一抗，与荧光素结合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G (IgG)二抗对 细胞裂解物进行Western Blot分析。数据证实了 SeV85AB感染的LLC-MK2细胞中表达了 Ag85AB，而SeV空白载体对照为阴性结果（图2)。
[0159] [实施例4]对小鼠鼻腔免疫SeV85AB能够诱导抗原特异性T细胞免疫应答
[0160] 无特定病原体（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）购自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.，Ltd.(中国上海）。利用该小鼠来验证经鼻腔免疫SeV85AB能否 诱导Ag85AB特异性免疫反应。用2X10 6CIU/动物和107CIU/动物的SeV85AB(20ul，于PBS 中）经鼻腔免疫小鼠，而将接种空白病毒（未表达结核抗原的SeV载体）和PBS的小鼠作 为对照。免疫两周后，杀死小鼠，从小鼠中摘取肺脏（包括气管组织）和睥脏。
[0161] 如下制备肺淋巴细胞和脾细胞的单细胞悬液：将脾脏机械破碎，并经纱网（mesh gauze)过滤单个的脾细胞。将红血球细胞（RBC)用RBC裂解缓冲液（BD Biosciences)裂 解。同时，无菌取出肺并用剪刀切成碎片，在37°C与10ml R10培养基（含有10% FBS[胎牛 血清]和1%青霉素加链霉素的RPMI-1640培养基）中的lmg/ml胶原酶IVdnvitrogen) 和10U DNase I (Thermo)温育30min。为了将组织解离成单细胞，将经胶原酶处理的肺碎片 经由70 μπι细胞过滤器（Fisher Scientific)温和过滤并通过注射器栓塞挤压。然后，将 细胞悬液离心并进行RBC裂解。清洗后，将单个肺淋巴细胞重悬于R10培养基，计数用于进 一步分析。
[0162] 利用ELISP0T法检测在Ag85AB多肽或蛋白质（5 μ g/ml)和PPD (结核菌素纯蛋白 衍生物，购自丹麦血清研究所Statens Serum Institute，SSI，10μg/ml)的刺激下，特异 性分泌IFN- γ的⑶4+T和⑶8+T细胞数量。用于刺激的Ag85AB多肽或蛋白质信息如下： Ag85A-CD4 肽（结核分枝杆菌蛋白 Ag85A(LTSELPGWLQANRHVKPTGS，II 类 MHC 特异性肽）， 卩1]熟1(03!11目录号[4熟]62425)、48854-〇)8肽（结核分枝杆菌蛋白48854-〇)8(]\0^660551'， I类MHC特异性肽），FUNAK0SHI目录号[ASI]62424)、Ag85B-CD4肽（结核分枝杆菌蛋白 Ag85B (240-254) (FQDAYNAAGGHNAVF，能引发 CD4+T 辅助细胞（Th) 1)，Sigma-Aldrich，目录 号[ANA]65391)、rAg85A(重组Ag85A蛋白，实验室纯化，序列如SEQIDNo :10所示）。
[0163] 数据证明，SeV85AB的鼻腔免疫能够在小鼠肺脏和脾脏中诱导较强的抗原特异性 T细胞免疫反应，而空白载体和PBS作为阴性对照并不能诱导相应的免疫应答。图3是肺 脏淋巴细胞的检测结果。该结果确认Ag85A-⑶4多肽、rAg85A蛋白和PPD的刺激能够诱导 被免疫小鼠的淋巴细胞分泌IFN-γ。在脾脏内也得到同样结果（图4)。从剂量看，10 7CIU 高剂量免疫组比2 X 106CIU低剂量免疫组诱导抗原特异性T细胞的效果更好（图3-4)。从 这些结果可知，相比于用空白Sev载体和PBS，SeV85AB疫苗经鼻腔免疫后，可显著诱导产 生对结核抗原Ag85A的局部（肺）以及系统性（脾脏）免疫反应。此外，在10 7CIU免疫组 和2X106CIU免疫组，无论有无表达结核抗原，均未观察到体重的明显减轻等毒性反应（图 5) 〇
[0164] [实施例5]对小鼠肌肉内免疫SeV85AB能够抗原特异性T细胞免疫应答
[0165] 无特定病原体（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）购自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.，Ltd.(中国上海）。利用该小鼠检测通过肌肉内注射接种 SeV85AB是否能诱导Ag85AB特异性的免疫反应。用2X106CIU/动物和107CIU/动物的 SeV85AB(20ul，于PBS中）经鼻内接种小鼠。使用接种空白病毒（未表达结核抗原的SeV载 体）和PBS的小鼠作为对照。免疫两周后，杀死小鼠，从小鼠中摘取肺脏（包括气管组织） 和睥脏并如实施例4所述的制备肺淋巴细胞和脾细胞的单细胞悬液。
[0166] 利用ELISP0T法检测在Ag85AB多肽或蛋白质（5 μ g/ml)和PPD (结核菌素纯蛋白 衍生物，购自丹麦血清研究所Statens Serum Institute，SSI，10μg/ml)的刺激下，特异 性分泌IFN- γ的⑶4+T和⑶8+T细胞数量。用于刺激的Ag85AB多肽或蛋白质信息如下： Ag85A-CD4 肽（结核分枝杆菌蛋白 Ag85A(LTSELPGWLQANRHVKPTGS，II 类 MHC 特异性肽）， 卩1]熟1(03!11目录号[4熟]62425)、48854-〇)8肽（结核分枝杆菌蛋白48854-〇)8(]\0^660551'， I类MHC特异性肽），FUNAK0SHI目录号[ASI]62424)、Ag85B-CD4肽（结核分枝杆菌蛋白 Ag85B (240-254) (FQDAYNAAGGHNAVF，能引发 CD4+T 辅助细胞（Th) 1)，Sigma-Aldrich，目录 号[ANA]65391)、rAg85A(重组Ag85A蛋白，实验室纯化，序列如SEQIDNo :10所示）。
[0167] 数据显示，肌肉内免疫pSeV85AB能够在小鼠的肺脏及脾脏诱导抗原特异性T细 胞免疫应答，而免疫空白载体以及PBS的对照组没有检测到相应的免疫反应。图6是从肺 脏淋巴细胞的检测结果。该结果确认Ag85A-⑶4多肽、rAg85A蛋白和PH)能够诱导肺脏淋 巴细胞特异性分泌IFN-γ。在脾脏内也得到同样结果（图7)。从这些结果可知，相比于用 空白Sev载体和PBS，SeV85AB疫苗经肌肉内免疫时，可诱导产生对结核抗原Ag85A的局部 (肺）以及系统性（脾脏）免疫反应。此外，在10 7CIU免疫组和2X 106CIU免疫组，无论有 表达无结核抗原，均未观察到体重的明显减轻等毒性反应（图8)。
[0168] [实施例6] SeV85AB与BCG疫苗作为多价疫苗联合免疫时的加强效应
[0169] 如上文所述，无特定病原体（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）购自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中国上海）。利用该小鼠评估SeV85AB对BCG疫苗 (BCG Danish株，来源于中生集团上海生物制品有限公司）的加强免疫效果。将小鼠随机分 为8组，每组先用BCG或作为对照的PBS初免，8周后，再用PBS、BCG、SeV/对照或SeV85AB 进行加强免疫。检测能否诱导结核抗原Ag85AB特异性的细胞免疫反应。试验具体设计如 下：
[0170]
[0171] 用PBS初免时，将100 μ 1注射于右后肢腹股沟皮下部位（内外侧各50 μ 1)。用 BCG初免时，将106菌落形成单位（CFU)/100 μ 1/动物注射于右后肢腹股沟皮下部位（内外 侧各50 μ 1)。
[0172] 初免8周后采用经鼻腔免疫的方式施行加强免疫。PBS加强免疫的剂量为20 μ 1/ 动物，BCG的剂量为106CFU/20 μ 1/动物，空白SeV载体的剂量为107CIU/20 μ 1/动物， SeV85AB载体的剂量为107CIU/20 μ 1/动物。加强免疫后2周，从小鼠中摘取肺脏（包括气 管组织）和睥脏并如实施例4所述的制备肺淋巴细胞和脾细胞的单细胞悬液。
[0173] 利用ELISP0T法检测在Ag85AB多肽或蛋白质（5 μ g/ml)和PPD (结核菌素纯蛋白 衍生物，购自丹麦血清研究所Statens Serum Institute，SSI，10μg/ml)的刺激下，特异 性分泌IFN- γ的⑶4+T和⑶8+T细胞数量。用于刺激的Ag85AB多肽或蛋白质信息如下： Ag85A-CD4 肽（结核分枝杆菌蛋白 Ag85A(LTSELPGWLQANRHVKPTGS，II 类 MHC 特异性肽）， 卩1]熟1(03!11目录号[4熟]62425)、48854-〇)8肽（结核分枝杆菌蛋白48854-〇)8(]\0^660551'， I类MHC特异性肽），FUNAK0SHI目录号[ASI]62424)、Ag85B-CD4肽（结核分枝杆菌蛋白 Ag85B (240-254) (FQDAYNAAGGHNAVF，能引发 CD4+T 辅助细胞（Th) 1)，Sigma-Aldrich，目录 号[ANA]65391)、rAg85A(重组Ag85A蛋白，实验室纯化，序列如SEQIDNo :10所示）。
[0174] 肺脏淋巴细胞的ELISP0T实验结果如图9所示。接受BCG初免一SeV85AB加强免 疫的小鼠与BCG加强免疫相比，能够更好的诱导分泌IFN-γ的淋巴细胞。脾脏的实验结果 如图10所示。接受BCG初免一SeV85AB加强免疫的小鼠与BCG加强免疫时相比，同样能够 诱导显著更多的分泌IFN-γ的淋巴细胞。亦即，接受第8组免疫方案的小鼠诱导产生了远 优于其余7组的针对结核抗原Ag85A的局部（肺）以及系统性（脾脏）免疫反应。同时， SeV85AB免疫的小鼠与其它试验组相比，没有观察到任何明显的体重变化（图11)。
[0175] [实施例7]与BCG相比SeV85AB对结核分枝杆菌感染的预防作用
[0176] 如上文所述，无特定病原体（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）购自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中国上海）。利用该小鼠来检测SeV85AB对结核杆菌 感染的预防作用。
[0177] 将该小鼠分为4组，分别用空白SeV载体、BCG疫苗（皮下注射接种106CFU -次）、 低剂量（2父106(：11])36￥8548和高剂量36￥8548(107(：11])免疫一次。4周后，在？3实验室对 其进行结核分枝杆菌H37Rv株的气雾攻击（100-200CFU)。接着，5周后，杀死小鼠并取小鼠 的肺脏和脾脏组织，研磨成匀浆物后涂布于Middlebrook 7H11琼脂板上，该琼脂板补充有 10% 0ADC富集和预防污染性微生物生长的四抗生素混合物（40U/ml多链丝霉素 B、4 μ g/ml 两性霉素、50 μ g/ml羧苄青霉素、2 μ g/ml甲氧苄氨嘧啶）。在37°C培养三周后，对CFU菌 落计数，评估疫苗的保护效力。使用student's t检验比较任意两组之间的显著性，并在图 12中表示为*(若p〈0. 05)和(若p〈0. 01)。如图12所示，低剂量SeV85AB的单次经鼻 免疫至少能够诱导与BCG相当的免疫保护效力，而高剂量SeV85AB的效果甚至比BCG更好。
[0178] [实施例8]不同免疫方案下SeV85AB对结核分枝杆菌感染的预防作用
[0179] 如上文所述，无特定病原体（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）购自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中国上海）。利用该小鼠来检测SeV85AB对结核杆菌 感染的预防作用。
[0180] 首先将该小鼠分为4组，第1-3组分别用PBS (20 μ 1)、BCG (皮下注射接种106CFU 一次）、和BCG(皮下注射接种106CFU-次）处理，4周后，第3组鼻内加强接种107CIU SeV85AB -次（加强免疫），第4组使用107CIU SeV85AB经鼻腔接种一次。再4周后，在P3 实验室对其进行结核分枝杆菌H37Rv株的气雾攻击（100-200CFU)。接着，5周后，杀死小鼠 并取小鼠的肺脏和脾脏组织，研磨成匀浆物后涂布于Middlebrook 7H11琼脂板上，该琼脂 板补充有10% OADC富集和预防污染性微生物生长的四抗生素混合物（40U/ml多链丝霉素 Β、4 μ g/ml两性霉素、50 μ g/ml羧苄青霉素、2 μ g/ml甲氧苄氨嘧啶）。在37°C培养三周后， 对CFU菌落计数，评估疫苗的保护效力。使用student' s t检验比较任意两组之间的显著 性，并在图13中表示为*(若p〈0.05)和***(若p〈0.01)。如图13所示，在肺中，仅使用 SeV85AB的单次经鼻免疫能够诱导与仅使用BCG相当的免疫保护效力，而若将SeV85AB作为 BCG的加强疫苗，则会显著提高保护效力（图13右图）；而在脾中，仅使用SeV85AB的单次 经鼻免疫能够诱导与仅使用BCG相当的免疫保护效力，而若将SeV85AB作为BCG的加强疫 苗，其效果也明显优于仅使用BCG或SeV85AB(图13左图）。
[0181] [实施例9]与利福平相比SeV85AB对感染结核杆菌小鼠体内结核杆菌的抑制作用
[0182] 如上文所述，无特定病原体（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）购自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中国上海）。利用该小鼠来检测SeV85AB对体内结核 杆菌的抑制作用。
[0183] 首先，该小鼠经气雾攻击100-200CFU H37Rv MTB毒株，感染4周后，将小鼠分为3 组，每组20只。第1组在小鼠饮用水中加入利福平（RFP)进行治疗（剂量为10mg/kg/d);第 2组鼻内接种10 7CIU SeV85AB，隔周治疗一次，共治疗三次；对照组仅滴鼻接种PBS(20 μ 1)。 在感染后第1天和感染后4、6、8、12周时，在每个时间节点分别从每组取3-4只小鼠，杀死 小鼠，并取小鼠的肺脏和脾脏，研磨成匀浆物后涂布于Middlebrook 7Η11琼脂板上，该琼 脂板补充有10% 0ADC富集和预防污染性微生物生长的四抗生素混合物（40U/ml多链丝霉 素 Β、4 μ g/ml两性霉素、50 μ g/ml羧苄青霉素、2 μ g/ml甲氧苄氨嘧啶）。在37°C培养三周 后，进行CFU菌落计数以分析其治疗效果。结果证明，使用SeV85AB治疗4周后较之PBS组 细菌数量明显下降，治疗8周后的治疗效果与RFP组相当（图14)。
[0184] [实施例10] SeV85AB与利福平联合施用对感染结核杆菌小鼠体内结核杆菌的抑 制作用
[0185] 如上文所述，无特定病原体（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周龄）购自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中国上海）。利用该小鼠来检测SeV85AB对体内结核 杆菌的抑制作用。
[0186] 首先，该小鼠经气雾攻击100-200CFU H37Rv MTB毒株，感染3周后，将小鼠分为3 组。第1组在小鼠饮用水中加入利福平（RFP)进行治疗（剂量为10mg/kg/d)，第2组在施 用利福平治疗的同时鼻内接种l〇 7CIU SeV85AB，每周治疗一次，共治疗三次；对照组仅滴鼻 接种PBS (20 μ 1)。感染6周后，杀死小鼠，并取小鼠的肺脏和脾脏，研磨成匀浆物后涂布于 Middlebrook 7Η11琼脂板上，该琼脂板补充有10% 0ADC富集和预防污染性微生物生长的 四抗生素混合物（40U/ml多链丝霉素 Β、4 μ g/ml两性霉素、50 μ g/ml羧节青霉素、2 μ g/ml 甲氧苄氨嘧啶）。在37°C培养三周后，进行CFU菌落计数以分析其治疗效果。如图15中显 示的，在肺中的结果表明，相比于PBS对照和仅使用利福平，采用利福平和SeV85AB的联合 治疗能够显著降低小鼠肺脏中的荷菌量（图15)。
[0187] 工业应用
[0188] 本发明提供了含有编码结核杆菌蛋白质的仙台病毒载体的疫苗。仙台病毒的毒性 低并且可以用培养细胞大量生产，因此可望能够安全而容易地生产活的重组疫苗。本发明 的疫苗还提供了有前途的阻遏结核杆菌的感染和/或结核病的发病和进展的疫苗的方案。
[0189] 保藏：
[0190] 重组SeV85AB载体，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC，地址：武汉市武昌 珞珈山，邮编：430072)，分类：副粘病毒科/属，保藏日期：2015年4月19日，保藏编号为 CCTCC V201518。
【主权项】
1. 一种仙台病毒载体的疫苗，其中所述载体表达结核分枝杆菌免疫抗原，优选表达结 核分枝杆菌分泌蛋白Ag85。2. 权利要求1的疫苗，其中所表达的结核分枝杆菌抗原包含Ag85A蛋白、和/或Ag85B 蛋白、和/或其片段以及上述它们的嵌合体的氨基酸序列。3. 权利要求1或2的疫苗，所使用的载体为F基因缺陷的仙台病毒载体。4. 权利要求1-3中任一项的仙台病毒载体疫苗作为抗结核预防性疫苗使用的用途。5. 权利要求4的用途，其中所述疫苗通过鼻内接种的方式免疫。6. 权利要求4或5的用途，其中所述疫苗以多价疫苗的形式接种至少一次。7. 权利要求1-3中任一项的仙台病毒载体疫苗作为抗结核治疗性疫苗使用的用途。8. -种体外诱导特异性针对结核杆菌蛋白的细胞免疫应答的方法，包括：(a)将融合 表达结核杆菌相关蛋白的仙台病毒载体导入抗原递呈细胞；(b)使抗原递呈细胞与细胞毒 性T淋巴细胞接触，其中所述结核杆菌的蛋白包括选自如下的蛋白：Ag85A，Ag85B，其片段， 或上述任一者的任何组合。9. 一种编码结核杆菌蛋白Ag85的仙台病毒载体在制备诱导特异性针对该蛋白的细胞 免疫应答的药物中的用途，其中所述结核杆菌Ag85蛋白包括选自如下的蛋白的氨基酸序 列：Ag85A，Ag85B，其片段，或上述任一者的任何组合。10. -种重组仙台病毒载体，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC V201518。
【文档编号】C12N15/86GK106063932SQ201510187738
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2015年4月20日 公开号201510187738.8, CN 106063932 A, CN 106063932A, CN 201510187738, CN-A-106063932, CN106063932 A, CN106063932A, CN201510187738, CN201510187738.8
【发明人】范小勇, 朱亚峰, 胡志东, 罗道良
【申请人】上海市公共卫生临床中心, 株式会社爱迪药业