钙黄绿素和奥司他韦联合在防治h7n9型流感药物中的应用

钙黄绿素和奥司他韦联合在防治h7n9型流感药物中的应用
【专利摘要】钙黄绿素和奥司他韦联合在防治H7N9型流感药物中的应用，是通过以下技术方案实施的：首先将H7N9野生型或突变型流感病毒神经氨酸酶液和钙黄绿素以及奥司他韦得混合液孵育30分钟，再加入底物进行检测，实验结果表明两种药物联合使用对H7N9野生型和突变型流感病毒神经氨酸酶活性的均有抑制作用，而后检测了钙黄绿素与奥司他韦联合使用在细胞水平上的抗流感作用，发现两者联合使用能对感染H7N9野生型和突变型流感病毒的细胞起到治疗作用，最后，检测了两者联合使用对小鼠流感模型的影响，发现加入钙黄绿素与奥司他韦混合物后，可以明显缓解流感小鼠体重的减轻，使小鼠逐渐恢复到健康水平，并且能显著降低流感小鼠的肺指数。
【专利说明】
钙黄绿素和奥司他韦联合在防治H7N9型流感药物中的应用
技术领域
[0001]本发明具体涉及钙黄绿素和奥司他韦联合在防治H7N9型流感病毒药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 流感是由流感病毒引起的一种急性病毒性呼吸道传染性疾病，传染性强，传播迅 速，每年都给全球人类健康带来了严重的威胁和经济的巨大损失，是人类至今尚不能有效 控制的世界性传染病。流感爆发的随机性，并没有规律可言更无法对下次行病毒预知。所以 到目前为止，无法通过疫苗的方式有效预防未知流感的发生，而抗流感病毒药物便成为治 疗流感发生展的最有效手段。近年来靶向研究抑制剂药物有了显著进展，其中主要有基质 蛋白2(M2)离子通道抑制剂金刚烷胺和金刚乙胺、神经氨酸酶(NA)抑制剂奥司米韦（达菲） 和扎那米韦及广谱抗病毒药利巴韦林等三类药物。金刚烷胺临床上应用了多年，多种亚型 流感毒株对其已产生严重的耐药性，而达菲价格昂贵，且病毒对其耐药性的报道也日渐增 多。2013年，在我国爆发的可以传染人类的新型H7N9甲型禽流感病毒，其神经氨酸酶突变型 病毒株对奥司他韦的耐受性是野生型病毒株的10000多倍。为提高药物疗效，减缓流感毒株 耐药性的产生，抗流感药物的联合使用成为近年来国际医药界的研究热点。
[0003] 钙黄绿素 (Calcein)是一种小分子水溶性荧光素，具有络合指示剂、荧光指示剂和 测定钙、铭、钡、和锰等用途。钙黄绿素经常作为脂质体载药模型，评价药物泄露情况。目前 并没有其有抗流感病毒方面功效的报道。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供钙黄绿素和奥司他韦联合使用在防治H7N9型流感药物中 的应用。钙黄绿素与羧酸奥斯他韦联合使用能够有效的抑制H7N9野生型和突变型流感病毒 神经氨酸酶的活性，从而抑制流感病毒在体内的繁殖，进而减轻或治愈流感患者。本发明对 钙黄绿素和羧酸奥斯他韦对H7N9野生型以及突变型神经氨酸酶进行了体外酶学抑制性的 检测，发现羧酸奥斯他韦对H7N9野生型以及突变型神经氨酸酶的半数抑制浓度（IC 5q)分别 为1.75±0.12nmol/L和26.52 ± 1.06ymol/L;钙黄绿素对H7N9野生型以及突变型神经氨酸 酶的IC5q分别为12.68 ± 2.26μπιοI/L和30.19 ± 1.61 μπιοI/L。而后进行了钙黄绿素与羧酸奥 司他韦联合使用体外酶学抑制性的检测，联合用药的作用效果用联合指数值表示:联合指 数值小于1表明两种药物联合使用起到协同作用。实验结果表明两种药物对Η7Ν9野生型神 经氨酸酶的抑制起到协同作用，且对Η7Ν9突变型神经氨酸酶抑制的协同效果更加明显。我 们又对这两种Η7Ν9流感病毒感染MDCK细胞并加入钙黄绿素与羧酸奥司他韦混合物进行了 细胞存活率的测定，发现钙黄绿素与羧酸奥司他韦混合物均能提高Η7Ν9病毒感染后细胞的 存活率。最后，我们对钙黄绿素与奥司他韦混合物对Η7Ν9野生型和突变型流感病毒对小鼠 的体重变化、致死率及肺指数进行了测定，发现钙黄绿素与奥司他韦混合物能明显缓解 Η7Ν9型流感病毒对小鼠的症状。本发明为开发以神经氨酸酶为靶点的新药提供基础，为钙 黄绿素与奥司他韦联合使用应用于人类流感的治疗提供了参考。
【附图说明】
[0005] 图1是不同浓度钙黄绿素与羧酸奥司他韦联合使用对H7N9野生型流感病毒神经氨 酸酶的抑制作用。
[0006] 图2是不同浓度钙黄绿素与羧酸奥司他韦联合使用对H7N9突变型流感病毒神经氨 酸酶的抑制作用。
[0007] 图3是不同浓度钙黄绿素与羧酸奥司他韦联合使用对感染H7N9野生型流感病毒的 MDCK细胞的治疗作用。
[0008] 图4是不同浓度钙黄绿素与羧酸奥司他韦联合使用对感染H7N9突变型流感病毒的 MDCK细胞的治疗作用。
[0009] 图5是钙黄绿素与奥司他韦联合使用对感染H7N9野生型流感病毒的小鼠体重的影 响。
[0010] 图6是钙黄绿素与奥司他韦联合使用对感染H7N9突变型流感病毒的小鼠体重的影 响。
[0011] 图7是钙黄绿素与奥司他韦联合使用对感染H7N9野生型或突变型流感病毒小鼠肺 中病毒载量的影响。
【具体实施方式】
[0012] 以下通过实例形式的【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明。
[0013] 实施例1
[0014] H7N9野生型或突变型神经氨酸酶溶液用pH 6.5MES缓冲液(32.5mM)进行配制，将 一定量的神经氨酸酶加入到反应缓冲液中，使得总体积为40yL，再分别加入IOyL不同浓度 的钙黄绿素或羧酸奥斯他韦。在37°C孵箱中放置30min，然后加入50yL 20μΜ MU-NANA底物 缓冲液，终反应体系为l〇〇yL，反应液置于黑色酶标板中，酶标仪上进行检测，激发波长为 360nm，发射波长为450nm，检测时长8min。检测的荧光强度变化就代表酶降解底物活力的强 弱。检测结果为:羧酸奥斯他韦对H7N9野生型以及突变型神经氨酸酶的IC 5q分别为1.75土 0 · 12nmol/L和26 · 52± 1 · 06ymol/L;钙黄绿素对H7N9野生型以及突变型的IC5Q分别为12 · 68 ± 2·26ym/L和30·19 ±1·61ymol/L。
[0015] 实施例2
[0016]根据测定的钙黄绿素与羧酸奥司他韦对H7N9野生型与突变型神经氨酸酶的1(：50来 确定钙黄绿素与羧酸奥司他韦的加入浓度。钙黄绿素与羧酸奥司他韦的浓度选择为各自相 对于H7N9野生型与突变型神经氨酸酶的0.25，0.5，1，2和4倍的IC 5q浓度。并且所加入的钙黄 绿素的浓度与羧酸奥司他韦的浓度的比例是维持一致的，为其IC5Q值的比值。首先在96孔酶 标板中加入30yL的稀释后的H7N9野生型或突变型神经氨酸酶液，而后在每个孔中加入10μ1 不同浓度的钙黄绿素和IOyL对应浓度的羧酸奥司他韦，每个浓度做4次重复。在37°C下孵育 30min后，再加入50μ1 20μΜ的NA特异性底物MU-NANA，检测H7N9野生型与突变型神经氨酸酶 的荧光强度。记录数据，然后运用CalcuSyn软件计算这两种药物的联合指数(Cl值），结果如 下：
[0018] 〈注>:ED50、ED75和ED90分别表示酶活性被抑制50%、75%和90%。
[0019] CI值小于1说明两种药物联合起到协同作用，且CI值越小协同效果越好。由表中数 据可知两种药物联合使用对H7N9神经氨酸酶的抑制起到协同作用。
[0020] 实施例3
[0021]为了检测钙黄绿素与羧酸奥司他韦混合物在MDCK细胞上抗H7N9野生型与突变型 流感病毒的效果，选取对数生长期MDCK细胞。铺96孔板，3000个/孔，37°C，5 %⑶:^温箱中培 养24h，至单层细胞融合度达50-60%。次日，弃培养液，用无血清DMEM洗2次除去残留血清。 再用IOOyL的H7N9野生型或突变型流感病毒尿囊液(浓度为100倍的TCID 5q浓度)和不同浓度 下的钙黄绿素与羧酸奥司他韦混合物100μΙ 37°C下混合2h，钙黄绿素与羧酸奥司他韦的浓 度选择为各自相对于H7N9野生型与突变型神经氨酸酶的0.25，0.5，1，2和4倍的IC50浓度， 所加入的钙黄绿素的浓度与羧酸奥司他韦的浓度的比例维持一致，为其IC 5Q值的比值。之 后，分别将孵育混合液分别加入已铺好细胞的96孔，每孔200yL，每种孵育液做3个复孔，置 于培养箱培养2h，此为病毒吸附感染过程。2h后，弃掉各孔的上清，各孔MDCK细胞用无血清 DMEM培养基清洗3次，每孔加入IOOyL病毒稀释液，置培养箱中培养24h，之后弃上清，各孔用 无血清DMEM培养基清洗3次，每孔加入IOOyL细胞维持液(含2%血清的DMEM培养液+lyg/mL 胰酶），培养箱中培养3天后，观察各孔的CPE，结合MTT法检测各孔细胞病变程度，这同时反 映了检测药物对流感病毒的抑制程度。将终止观察的96孔培养板孔中每孔加入15yL MTT (5mg/mL)溶液，轻轻混匀，置37 °C培养箱中孵育4h后，弃上清，每孔加入IOOyL DMSO，轻轻混 勾，30min内于酶联免疫测定仪上读取570nm处的OD值，计算细胞的活力的百分比，活力百分 比在一定程度上代表了药物对病毒致MDCK细胞损伤的保护程度。
[0022] 结果如图3和图4所示，在不同处理条件下，加入钙黄绿素与羧酸奥司他韦混合液 与H7N9野生型或突变型流感病毒时，随着药物浓度的增加，细胞存活率也随之增加。说明钙 黄绿素与奥司他韦混合液可以抑制H7N9野生型与突变型流感病毒，保护MDCK细胞免受病毒 破坏，而且保护效应也随着钙黄绿素与羧酸奥司他韦混合物浓度的增加呈现剂量依赖性。
[0023] 实施例4
[0024]为了检测钙黄绿素与奥司他韦混合物对感染了 H7N9野生型流感病毒的小鼠是否 有治疗作用，18_20g雌性BABL/c小鼠50只，用0.2%的戊巴比妥钠溶液50yL/只麻醉，再通过 滴鼻的方式将10倍LD 5q浓度的Η7Ν9野生型流感病毒稀释液滴入小鼠鼻腔内建立小鼠流感模 型，以滴入50yL PBS缓冲液的小鼠作为对照组。我们将50只小鼠随机分为5组，分别为对照 组(PBS组）；病毒组（10倍LD5QH7N9野生型流感病毒）；钙黄绿素组（10倍LD 5QH7N9野生型流感 病毒+25mg/kg|丐黄绿素）；奥司他韦组（10倍LD5〇H7N9野生型流感病毒+25mg/kg奥司他韦）； 钙黄绿素与奥司他韦混合物组（10倍LD5〇H7N9野生型流感病毒+251]?/!?^黄绿素与25mg/kg 奥司他韦混合物）。每组10只。对小鼠接种病毒2天前开始给药，每天2次，连续灌胃10天，每 只小鼠一次给药〇.2mL。每天记录每组小鼠的体重及死亡情况。在第15天时，对小鼠断食断 水8h后，进行脱臼处死，取出小鼠的肺脏并进行称重。按照公式进行计算：
[0025] 肺指数=X Tra佯?
[0026] 结果如图7所示，说明钙黄绿素与奥司他韦混合液能显著降低H7N9野生型流感病 毒感染小鼠的肺指数，可以缓解H7N9野生型流感病毒感染小鼠体重的减轻，改善小鼠的生 存状态，使小鼠逐渐恢复到健康水平。
[0027]结果如下表所示，说明钙黄绿素与奥司他韦混合液能显著降低H7N9野生型流感小 鼠的肺指数。
[0029]以上结果均说明，钙黄绿素与奥司他韦混合液能对感染H7N9野生型流感的小鼠起 到治疗的作用，使小鼠逐渐恢复到健康水平。
[0030] 实施例5
[0031]为了检测钙黄绿素与奥司他韦混合物对感染了 H7N9突变型流感病毒的小鼠是否 有治疗作用，18_20g雌性BABL/c小鼠50只，用0.2%的戊巴比妥钠溶液50yL/只麻醉，再通过 滴鼻的方式将10倍LD 5q浓度的Η7Ν9突变型流感病毒稀释液滴入小鼠鼻腔内建立小鼠流感模 型，以滴入50yL PBS缓冲液的小鼠作为对照组。我们将50只小鼠随机分为5组，分别为对照 组(PBS组）；病毒组（10倍LD5QH7N9突变型流感病毒）；钙黄绿素组（10倍LD 5QH7N9突变型流感 病毒+25mg/kg钙黄绿素）；奥司他韦组（10倍LD5QH7N9突变型流感病毒+25mg/kg奥司他韦）； 钙黄绿素与奥司他韦混合物组（10倍LD5QH7N9突变型流感病毒+2511^/1^11?黄绿素与25mg/kg 奥司他韦混合物）。每组10只。对小鼠接种病毒2天前开始给药，每天2次，连续灌胃10天，每 只小鼠一次给药〇.2mL。每天记录每组小鼠的体重及死亡情况。在第15天时，对小鼠断食断 水8h后，进行脱白处死，取出小鼠的肺脏并进行称重。按照实施例4所示公式进行计算。 [0032]结果图7所示，说明钙黄绿素与奥司他韦混合液能显著降低H7N9突变型流感病毒 感染小鼠的肺指数，可以缓解H7N9突变型流感病毒感染小鼠体重的减轻，改善小鼠的生存 状态，使小鼠逐渐恢复到健康水平。
[0033]结果如下表所示，说明钙黄绿素与奥司他韦混合液能显著降低H7N9突变型流感小 鼠的肺指数。
[0035]以上结果均说明，钙黄绿素与奥司他韦混合液能对感染H7N9突变型流感的小鼠起 到治疗的作用，使小鼠逐渐恢复到健康水平。
【主权项】
1. 钙黄绿素和奥斯他韦联合在防治H7N9型流感药物中的应用。2. 如权利要求1中钙黄绿素和奥斯他韦联合以口服给药方式的应用。3. 如权利要求1中钙黄绿素和奥斯他韦联合以注射给药方式的应用。
【文档编号】A61P31/16GK106074498SQ201610550473
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】王烨, 房学迅, 于淼, 李源博, 张金瑞, 李响, 于大海
【申请人】吉林大学