L型胞嘧啶丙氨酸在制备抗癌药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种L型胞嘧啶丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，属于药物新用途技术领域。其中L型胞嘧啶丙氨酸的化学结构式，并且具体公开了该L型胞嘧啶丙氨酸在制备抗肝癌药物中的应用。本发明制得的L型胞嘧啶丙氨酸对肝癌细胞具有显著的抑制作用，可用于抗肝癌药物的开发，也可以考虑用于作为化疗辅助药物，从而为改善肝癌等恶性肿瘤的临床治疗提供一种新的有效的治疗方法，具有良好的开发应用前景。
【专利说明】
L型胞嘧啶丙氨酸在制备抗癌药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物新用途技术领域，具体涉及L型胞嘧啶丙氨酸的新用途，即L型胞 嘧啶丙氨酸在制备抗癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤一直是危害人类健康的严重问题之一，其原因是细胞内原癌基因和抑癌 基因表达失控的结果，一般都会经历一段漫长的致病过程。细胞内癌基因表达失调，使细胞 不受控制地生长和繁殖，并且能够随机体体液运输转移。细胞凋亡机制对保持自身平衡十 分重要，肿瘤的生长速率很难控制，这与凋亡能力的减弱和增殖能力的提升密切相关。
[0003] 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球性第五大常见肿瘤，具有预后 恶劣和死亡率高等特点，严重威胁人类的生命与健康。尽管近年来随着影像诊断与手术技 术的不断进步以及以索拉非尼为代表的肝癌靶向治疗药物的面世，为肝癌的早期诊断与治 疗提供了可能与更多且更有效的治疗选择，使肝癌的治疗水平得到了一定的提高。然而，综 观目前肝癌临床治疗现状，现今尚缺乏真正有效且副作用少的肝癌治疗药物，肝癌术后复 发转移率仍高居不下，术后5年生存率仍徘徊在30%左右，严重制约了肝癌总体治疗水平的 提高，无法使之得到根本性的改善。
[0004] 目前对恶性肿瘤的治疗方法中，化疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一。随着化疗 药的广泛使用以及随之而来的多药抗性现象的出现，肿瘤对化疗药物的敏感性越来越低， 某些化疗药的抗肿瘤作用日益下降，导致患者的救治率进一步降低。有鉴于此，目前亟待开 发特异性靶向的能够抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的药物。目前临床上用于治疗 肝癌的化疗药物毒副作用较大。因此，研制和开发新型高效低毒的抗癌药物已经成为治疗 和攻克癌症的新希望。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供L型胞嘧啶丙氨酸的新用途，即L型胞嘧啶丙氨酸在制备抗癌 药物中的应用。
[0006] 本发明的技术方案为，L型胞嘧啶丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，其中L型胞嘧 啶丙氨酸的化学结构?
[0007] 进一步优选，所述的L型胞嘧啶丙氨酸在制备抗肝癌药物中的应用。
[0008] 进一步优选，所述的药物为化疗辅助药物。
[0009] 进一步优选，所述的L型胞嘧啶丙氨酸的具体合成过程为： (1) 导入氨基保护基的L-丝氨酸在偶氮二羧酸二乙酯和三苯基膦的作用下被亲核试剂 取代，同时与羟基所连的碳原子构型发生瓦尔登翻转生成N_(叔-丁氧羰基1)-L-丝氨酸-内 醋； (2) 将氢化钠加入到胞嘧啶的有机溶液中，所得悬液于(TC静置后加入氨基保护试剂， 然后用盐酸溶液中和，产生的固体产物经过滤，洗涤，干燥得到导入氨基保护基的胞嘧啶化 合物单体； (3) 在有机碱催化剂的作用下，步骤(2)所得产物与N-(叔-丁氧羰基1)-L-丝氨酸-内酯 化合反应生成胞嘧啶的丙氨酸衍生物； (4) 将步骤(3)反应所得产物脱去氨基保护基，经过滤，洗涤，干燥得到L型胞嘧啶丙氨 酸。
[0010] 进一步优选，步骤（1)中的氨基保护基为节氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、荷甲 氧基(Fmoc)、稀丙氧羰基(AlIoc)、三甲基娃乙氧羰基(Teoc)、甲氧羰基或乙氧羰基。
[0011] 进一步优选，步骤(2)中溶解胞嘧啶的有机溶剂为二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲 基亚砜，氨基保护试剂为氯甲酸苄酯、氯甲酸-9-芴基甲酯、氯甲酸烯丙酯、N-[2-(三甲基硅 基）乙氧羰氧基]琥珀酰亚胺或氯甲酸-2，2，2-三氯乙酯。
[0012] 进一步优选，步骤(3)中的有机碱催化剂为1，8_二氮杂二环(5,4,0)-7-烯(DBU)或 四甲基胍(TMG)。
[0013] 本发明用MTT方法检测L型胞嘧啶丙氨酸对BRL-3A和RH35成活的影响。结果表明受 L型胞嘧啶丙氨酸两者处理的RH35的活性比对照下降58%，受处理的BR1-3A活性顺次比对照 下降33%，统计分析表明L型胞嘧啶丙氨酸对RH35的活性有明显的抑制作用，而对BRL-3A活 性的抑制作用不显著，L型胞嘧啶丙氨酸对肝癌细胞有较高的毒性和选择性。
[0014] 用不同浓度L型胞嘧啶丙氨酸（l-8mmol/L)分别处理BRL-3A和RH35细胞48h后，用 酶联免疫检测仪在570nm波长下测定吸光度值(0D)，并计算出细胞增殖抑制率。经测定L型 胞嘧啶丙氨酸在浓度为l-8mmol/L之间对BRL-3A细胞生长具有显著的抑制作用，且这种抑 制作用呈剂量依赖关系。
[0015] 用SPSS软件分析L型胞嘧啶丙氨酸的半致死量表明，L型胞嘧啶丙氨酸对RH35的 半致死量为9.8mM，对BRL-3A的半致死量为13.7mM(如图1所示），结果表明L型胞嘧啶丙氨酸 对肝癌细胞有较高的毒性和选择性。
[0016] 本发明制得的L型胞嘧啶丙氨酸对肝癌细胞具有显著的抑制作用，可用于抗肝癌 药物的开发，也可以考虑用于作为化疗辅助药物，从而为改善肝癌等恶性肿瘤的临床治疗 提供一种新的有效的治疗方法，具有良好的开发应用前景。
【附图说明】
[0017]图1是本发明L型胞嘧啶丙氨酸对细胞的毒性作用曲线； 图2是本发明L型胞嘧啶丙氨酸对细胞周期的影响曲线，其中A为L型胞嘧啶丙氨酸处理 的BRL-3A细胞，B为对照BRL-3A细胞，C为L型胞嘧啶丙氨酸处理的RH35细胞，D为对照RH35细 胞； 图3是本发明L型胞嘧啶丙氨酸对细胞调亡的影响曲线，其中A为L型胞嘧啶丙氨酸处理 的BRL-3A细胞，B为对照BRL-3A细胞，C为L型胞嘧啶丙氨酸处理的RH35细胞，D为对照RH35细 胞； 图4是本发明L型胞嘧啶丙氨酸对、#rc、057?、057^、似Z和表达的影 响曲线。
【具体实施方式】
[0018] 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 明的范围。
[0019] 实施例1 L型胞嘧啶丙氨酸的合成 步骤1)合成N-(叔-丁氧羰基1)-L-丝氨酸-内酯2:将无水四氢呋喃(THF)(IOOmL)逐滴 加入到偶氮二乙酸乙酯（3.8mL，24.22mmo 1)与三苯基磷(Ph3P) (6.3g，24. OOmmo 1)的溶液物 中，并搅拌超过IOmin。由此得到的产物溶液再搅拌IOmin。在N-(叔-丁氧羰基I)-L-丝氨酸 (5g，24.36mmol)中逐滴加入上述四氢呋喃的混合溶液(25mL)，搅拌超过20min。得到的溶液 在_78°C条件下搅拌20min。再在常温条件下进一步搅拌2.5h。用层析柱(体积比为3:1的正 已烷/乙酸乙酯）除去溶剂纯化粗制品，最后从乙酸乙酯/正已烷中重结晶进一步纯化得到 白色固体化合物2( 2.4g，产率53%)。
[0020] 步骤2)合成N-CBZ-胞嘧啶6:在氢化钠(NaH) (60%分散在油中，1.35g，33.8mmol)溶 液中加入胞嘧啶5(2g，8.2mmo 1)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液。悬浮液在0 °C下搅拌45min，用 氯甲酸苄酯（ClCO2Bn) (50.7mL，355mmo 1)滴加上述二甲基甲酰胺的混合溶液超过Ih。所得 溶液在室温下搅拌16h。由此产生的黄色溶液倒入冰水中，用盐酸溶液中和。经过滤得到固 体产物，经水和乙醚洗涤，干燥后得到白色粉末状固体化合物6( 1.5g，产率75%)。
[0021] 步骤3)合成N-叔丁氧羰-β-(Ν4-苄氧羰基-1-胞嘧啶）-L-丙氨酸3:在氩气气氛下 将二氮杂二环(DBU)(0 · 48g，3 · IOmmol)添加到N-CBZ-胞嘧啶6( 1 · 07g，4 · 37mmol)的二甲基 甲酰胺(4mL)悬浮液中。在15min内向上述二甲基甲酰胺的混合溶液中加入溶于二甲基甲酰 胺(4mL)的N-(叔-丁氧羰基1)-L-丝氨酸-内酯2(0.41g，2.18mmol)。在室温下搅拌反应3h 后，在真空条件下除去二甲基甲酰胺，所得粗产物用硅胶层析柱纯化(洗脱液:DCM/MeOH/ AcOH =9:1:0 · 1)得到固体化合物3( 500mg，产率53%)。
[0022] 步骤4)合成1-胞嘧啶-L-丙氨酸4:化合物3(0.538，1.23111111 〇1)加入到三氟乙酸 (TFA ) (34mmo 1)的苯甲硫醚(6mmo 1)溶液中搅拌3h。反应完成后，在产品中加入盐酸溶液沉 淀并在真空中除去溶剂。由此产生的固体经过滤并用乙醚洗涤以获得白色固体产物L型胞 嘧啶丙氨酸4(0. llg，产率45%)。
[0023] L型胞嘧啶丙氨酸的合成路线如下：
实施例2 细胞培养:配制含l〇wt%的胎牛血清、100mg/L的链霉素和I X 105U/L青霉素的完全培养 液于37°C、饱和湿度、含体积分数5%的CO2的培养箱中进行培养。
[0024] 实施例3 MTT检测:取对数期生长期细胞分别接种于96孔培养板，每孔5 X IO3个细胞，培养箱中 孵育24h后更换含L型胞嘧啶丙氨酸(0、1、2、3、4、6、8111111〇1/1)的完全培养液，每个浓度组设 置3个复孔，以使用不添加化合物的完全培养基培养的细胞为对照组，并设置只含有培养液 的调零组。培养48h后，加入20yL MTT(5mg/mL)，继续培养4h后缓慢吸除上清液，加150yL DMS0,振荡摇晃IOmin使结晶充分溶解后用酶标仪检测570nm吸光度(A)值。计算相对活细胞 抑制率（IR) : IR=[ 1-(A鱗脚(t_A爾细植)/(A_!脚[t_ A爾细植)]X 100%，用SPSS软件非线性回 归计算半数抑制浓度(/Cm)。
[0025] 实验结果用浓度为4mmol/L的L型胞嘧啶丙氨酸处理大鼠正常肝细胞BRL-3A和大 鼠肝癌细胞RH35 48h，用MTT方法检测它们对BRL-3A和RH35成活的影响。结果表明RH35的活 性比对照下降58%，BR1-3A活性比对照下降33%，统计分析表明L型胞嘧啶丙氨酸对RH35活性 的抑制作用显著，而对BRL-3A活性的抑制作用差异不显著(P>0.05)。用SPSS软件分析两种 化合物的半致死量表明，L型胞嘧啶丙氨酸对RH35的半致死量为9.8mM，对BRL-3A的半致死 量为13.7mM(如图1所示），结果说明L型胞嘧啶丙氨酸对肝癌细胞有较高的毒性和选择性 (结果见表1)。
实施例4 流式细胞术检测细胞周期:取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔2 X IO5个细胞，孵育 24h后，用含0.1%胎牛血清的培养液同步化12h，更换含4mM/L L型胞嘧啶丙氨酸的完全培养 液。培养48h，胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，用预冷体积分数为70%的乙醇在-20 °C固定 24h。离心去除乙醇，PBS洗两遍，加入500yL含1% RNase(DNasefree)的缓冲液，37°C孵育 30min。然后加入5yL PI染料，4°C避光反应15min，lh内用流式细胞仪检测DNA含量，数据用 Modf it软件分析。
[0027] 实验结果用浓度为4mM的L型胞嘧啶丙氨酸处理BRL-3A和RH35 48h，用流式细胞术 检测它对BRL-3A和RH35细胞周期的影响。结果表明L型胞嘧啶丙氨酸处理RH35后，G0/G1期 细胞比对照上升13.12%，处理BRL-3A后，G0/G1期细胞比对照上升22.45%。对两种细胞周期 有显著影响(P<〇.〇5)(如图2所示）。分析该化合物影响两种细胞周期的具体时间表明，L型 胞嘧啶丙氨酸主要抑制细胞G0/G1期进程。
[0028] 实施例5 Annexin V-FITC/7-AAD法检测细胞凋亡:取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔2 X IO5 个细胞，孵育24h后，更换含4mM/L L型胞嘧啶丙氨酸的完全培养液。培养48h，胰酶消化收集 细胞，预冷PBS洗两遍，用Binding buffer重悬并调整细胞密度至(0.25 X 107)-( 1.0 X IO7) 个细胞每毫升，取IOOyL细胞悬液加入5yL Annexin V-FITC混匀后加入5yL 7-AAD混匀，室 温避光反应5-10min，样品补加 Binding buffer至500yL，Ih内用流式细胞仪检测细胞凋亡， 数据用Flow jo软件分析。
[0029] 实验结果用浓度为4mM的L型胞嘧啶丙氨酸处理BRL-3A和RH35 48h，用流式细胞术 检测它们对细胞凋亡的影响。结果表明L型胞嘧啶丙氨酸处理RH35后，细胞凋亡率比对照上 升3.55%，处理BRL-3A后，细胞凋亡率比对照上升1.06%。统计分析表明该化合物诱导肝癌 细胞凋亡的作用显著(PS0.05)，但诱导正常肝细胞凋亡的作用不显著(P>0.05)(如图3所 示）。
[0030] 实施例6 实时定量PCR检测基因表达变化:取对数生长期细胞接种于6孔板，每孔2 X IO5个细胞， 孵育24h后，更换含4mM/L L型胞嘧啶丙氨酸的完全培养液。培养48h，胰酶消化收集细胞，预 冷I3BS洗两遍，离心去除I3BS后加入ImL Trizol。按Trizol试剂说明书方法提取细胞总RNA， 采用逆转录试剂盒进行逆转录反应合成cDNA，以cDNA为模板采用SYBR Green技术进行mRNA 定量。扩增条件:94°C、2min，94°C、20s，52-56 °C、20s，60°C、30s，45个循环。实时采集每一反 应管中荧光强度的变化，得出待测样品荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数（cycle threshold，Ct)值，采用T zvxet法进行统计分析。
[0031] 实验结果用浓度为4mM的L型胞嘧啶丙氨酸处理BRL-3A和RH35 48h，用qRT-PCR检 测它们对细胞增殖和凋亡相关基因表达的影响。结果表明L型胞嘧啶丙氨酸处理RH35后，它 们的增殖相关基因 CCNA2和MYC表达依次比对照下降80.7%和70.5%，凋亡相关基因 CASP3、 CASP9、BAX和BCL2表达依次比对照上升81.5%、178.9%、100%和158.5%，处理BRL-3A后，它们 的CCNA2和MYC表达依次比对照下降83.5%和65.9%，凋亡相关基因未发生显著变化(如图4所 示）。
[0032] 以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该 了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入 本发明保护的范围内。
【主权项】
1丄型胞喀晚丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，其中L型胞喀晚丙氨酸的化学结构式2. 根据权利要求1所述的L型胞喀晚丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，其特征在于:所 述的L型胞喀晚丙氨酸在制备抗肝癌药物中的应用。3. 根据权利要求1或2所述的L型胞喀晚丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，其特征在于： 所述的药物为化疗辅助药物。4. 根据权利要求1或2所述的L型胞喀晚丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，其特征在于 所述的L型胞喀晚丙氨酸的具体合成过程为： (1) 导入氨基保护基的心丝氨酸在偶氮二簇酸二乙醋和Ξ苯基麟的作用下被亲核试剂 取代，同时与径基所连的碳原子构型发生瓦尔登翻转生成N-(叔-下氧幾基1)A-丝氨酸-内 醋； (2) 将氨化钢加入到胞喀晚的有机溶液中，所得悬液于(TC静置后加入氨基保护试剂， 然后用盐酸溶液中和，产生的固体产物经过滤，洗涂，干燥得到导入氨基保护基的胞喀晚化 合物单体； (3) 在有机碱催化剂的作用下，步骤(2)所得产物与N-(叔-下氧幾基l)-k丝氨酸-内醋 化合反应生成胞喀晚的丙氨酸衍生物； (4) 将步骤(3)反应所得产物脱去氨基保护基，经过滤，洗涂，干燥得到L型胞喀晚丙氨 酸。5. 根据权利要求4所述的L型胞喀晚丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：步 骤（1)中的氨基保护基为卞氧幾基、叔下氧幾基、巧甲氧基、締丙氧幾基、Ξ甲基娃乙氧幾 基、甲氧幾基或乙氧幾基。6. 根据权利要求4所述的L型胞喀晚丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：步 骤(2)中溶解胞喀晚的有机溶剂为二甲基甲酯胺、四氨巧喃或二甲基亚讽，氨基保护试剂为 氯甲酸节醋、氯甲酸-9-巧基甲醋、氯甲酸締丙醋、Ν-[2-(Ξ甲基娃基）乙氧幾氧基]班巧酷 亚胺或氯甲酸-2，2，2-Ξ氯乙醋。7. 根据权利要求4所述的L型胞喀晚丙氨酸在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：步 骤(3)中的有机碱催化剂为1,8-二氮杂二环(5,4,0)-7-締或四甲基脈。
【文档编号】A61K31/513GK106074556SQ201610419434
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610419434.4, CN 106074556 A, CN 106074556A, CN 201610419434, CN-A-106074556, CN106074556 A, CN106074556A, CN201610419434, CN201610419434.4
【发明人】徐存拴, 丁一, 孟竺, 徐霆, 赵茜怡, 杨刚刚, 张全义, 史世会, 吕中原, 王绪洋
【申请人】河南师范大学, 河南新乡华星药厂