龙须菜多糖的新用途及一种去甲基化试剂盒与应用

龙须菜多糖的新用途及一种去甲基化试剂盒与应用
【专利摘要】本发明公开了龙须菜多糖作为抑癌基因甲基化抑制剂的新用途及其在制备抗肿瘤药物中的应用，还公开了一种含龙须菜多糖的去甲基化试剂盒。本发明首次从DNA甲基化角度揭示了海洋中药龙须菜多糖抗肺癌作用的表观遗传学调控机制，发现肺癌、胃癌和宫颈癌细胞中SHP1、RARβ、MGMT、GADD45A、RASSF1A等抑癌基因表现为高甲基化状态，其基因表达关闭或表现为低表达，而龙须菜多糖对这些抑癌基因具有去甲基化和恢复表达的转录调节作用，这表明龙须菜多糖是潜在的甲基化抑制剂，在制备抗肿瘤药物中的应用中具有可观前景。
【专利说明】
龙须菜多糖的新用途及一种去甲基化试剂盒与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及龙须菜多糖的新用途及一种含龙须菜多糖的 去甲基化试剂盒与应用。
【背景技术】
[0002] 针对肿瘤细胞中抑癌基因甲基化，通过去甲基化进行抗肿瘤治疗已成为近年来肿 瘤治疗的研究热点之一。脱氧核糖核酸(DNA)甲基化是表观遗传学现象之一，是指在DNA甲 基转移酶(D匪T)的催化作用下，在基因组的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的胞嘧啶5^碳 位共价键结合1个甲基基团，形成5-甲基胞嘧啶（5mC)的过程。甲基化状态的改变是引起肿 瘤发生发展的一个重要因素，表现为肿瘤细胞基因组DNA整体甲基化水平降低和CpG岛等局 部甲基化水平的异常升高，异常的DNA甲基化特别是CpG岛甲基化通过影响基因转录，导致 抑癌基因转录失活并关闭其表达，增加染色体结构的不稳定性等多方面促进肿瘤的发生和 发展。
[0003] 由于DNA甲基化是一个可逆的表观遗传学修饰过程，具有去甲基化作用的药物可 以使甲基化逆转，从而恢复抑癌基因表达。近年来，在以DNA去甲基化作用为靶点的药物研 发方面有了较大的进展。例如，已进入临床使用的核苷类去甲基化药物包括5-氮胞苷和5-氮_2~脱氧胞苷，均对治疗骨髓异常增生综合征有效。处于临床试验阶段的核苷类去甲基 化药物包括5-氟-2^脱氧胞苷和l-(i3-D-呋喃核糖苷)-1，2-二氢嘧啶-2-酮，分别对白血 病、皮肤癌和骨髓异常增生综合征有效;非核苷类去甲基化药物中新发现的普鲁卡因、普鲁 卡因胺均对抑制肺癌发展具有潜在的应用价值;根据脱氧核糖核酸甲基转移酶模型设计合 成的新型去甲基化药物包括RG108和MG98,分别对结肠癌、白血病和肾癌有一定的抑制作 用。但目前常用的这些去甲基化药物大多为化学合成物，具有毒副作用大、药效成分提取纯 化制备过程复杂或成本较大等缺陷。
[0004] 从研制创新药物角度出发，海洋药物的研究是开发以传统中药为来源的新型天然 活性药物的热点及重要方向之一。目前国内外关于海藻抗肿瘤药物的报道日益增多，我国 海域辽阔，海藻资源丰富，利用藻类生产抗肿瘤物质很有潜力。利用资源丰富的海藻研制低 毒、高效的抗肿瘤药物在增强化疗药物疗效、提高机体免疫力、延长生存期、降低复发转移 率及减轻副作用等方面有着积极的意义。如果能将资源丰富的海藻开发为抗肿瘤药物，必 将降低新药研制和开发的成本。

【发明内容】

[0005] 鉴于现有技术及应用的上述缺陷，以及为了进一步开拓海洋中药抗肿瘤活性物质 的药用价值，本发明提供了一种红藻类植物龙须菜多糖作为抑癌基因甲基化抑制剂的新用 途及其在制备抗肿瘤药物中的应用。龙须菜(Gracilariopsis Iemaneiformis)是红藻门、 真红藻纲、杉藻目、江蓠科、江蓠属大型海藻，主要分布于我国山东、辽宁、江苏、福建、海南 等沿海地区。龙须菜性味甘、寒，主要入肝经，具有助消化、解积腻、清肠胃和止血降压、软坚 化痰、清热利水、温经止痛的功效。作为海洋药物资源，龙须菜多糖有着独特的生物学作用， 已被用来辅助治疗多种疾病。龙须菜多糖主要成分为D-半乳糖和3,6_内醚半乳糖，这种长 链、高分子量的天然多糖化合物由于其突出的生物活性、低毒性和在自然界的丰富性，明显 不同于常用细胞毒类抗肿瘤药物。由于海藻龙须菜多糖具有无毒高效、易于制备、药源丰富 的特点，能够提高肿瘤病人生活质量，因此可开发为去甲基化试剂盒，作为肿瘤抑癌基因甲 基化抑制剂的理想药剂，并将在临床抗肿瘤诊断及治疗中发挥重要作用。本发明通过以下 技术方案实现：
[0006] 本发明提供了龙须菜多糖作为抑癌基因甲基化抑制剂的新用途。
[0007] 本发明还提供了上述龙须菜多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0008] 进一步地，所述肿瘤包括肺癌、胃癌和宫颈癌。
[0009] 更进一步地，所述肿瘤为肺癌。
[0010] 进一步地，所述龙须菜多糖为海藻龙须菜多糖。
[0011] 进一步地，所述龙须菜多糖作用于肿瘤细胞的抑癌基因，所述抑癌基因包括在所 述肿瘤细胞中表现为高甲基化状态的3即1、1^邸、100'、6400454、1^33?14等抑癌基因。 [00 12]进一步地，所述龙须菜多糖作用于肿瘤细胞的浓度为不小于50ug/mL。
[0013] 本发明还提供了一种去甲基化试剂盒，所述去甲基化试剂盒包括龙须菜多糖或其 药学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯，溶剂以及药学上可接受的辅料。
[0014] 进一步地，所述溶剂为磷酸缓冲盐溶液，所述辅料为质谱级的双蒸水。
[0015] 更进一步地，所述龙须菜多糖或其药学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯的重量 份数为50份，所述溶剂的重量份数为900份，药学上可接受的辅料的重量份数为100份。 [00 16] 本发明中的龙须菜多糖可采用三氯乙酸法(Trichloroacetic acid，TAC法)从红 藻龙须菜中提取，再用DEAE-Sephadex A-25离子交换柱进行分步洗脱纯化、回收显著级分 获得的纯多糖。主要成分为D-半乳糖和3，6-内醚半乳糖，其中D-半乳糖含量为27.36 %，3， 6-内醚半乳糖含量为29.38%。提取方法具体可参见:红藻龙须菜多糖及其制备、抗肿瘤活 性检测方法和应用[P] ,201610006118.4。
[0017]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0018]本发明首次发现龙须菜多糖可以明显抑制肿瘤细胞抑癌基因甲基化状态的效果。 研究发现，龙须菜多糖对于多个不同组织来源的肿瘤细胞抑癌基因具有去甲基化的作用， 肿瘤细胞包括肺癌、胃癌和宫颈癌等，抑癌基因包括3冊1、1^肋、1?^1'、6400454、1^33?1六等。 龙须菜多糖的去甲基化效果呈作用时间依赖性，且龙须菜多糖体外细胞实验中工作浓度未 见毒性，具有药源丰富、安全无毒的特征，可进一步开发为用于抑癌基因甲基化抑制剂的抗 肿瘤药物或去甲基化试剂盒，具有临床应用前景。
[0019] 以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和 技术效果。
【附图说明】
[0020] 图1示出了本发明实施例1的龙须菜多糖对人正常细胞及三种肿瘤细胞的抑制增 殖作用图；
[0021] 图2示出了本发明实施例2的龙须菜多糖对肺癌A549细胞抑癌基因 SHPl的去甲基 化作用的研究图；
[0022]图3示出了本发明实施例3的龙须菜多糖对肺癌A549细胞抑癌基因 RARP的去甲基 化作用的研究图；
[0023]图4示出了本发明实施例4的龙须菜多糖对胃癌MKN45细胞抑癌基因 SHPl的去甲基 化作用的研究图；
[0024]图5示出了本发明实施例5的龙须菜多糖对宫颈癌MGMT基因启动子区亚硫酸盐测 序峰图及CpG位点的作用图；
[0025]图6示出了本发明实施例6的龙须菜多糖对肺癌SHPl基因启动子区甲基化位点及 CpG位点的作用图；
[0026] 图7示出了本发明实施例7的龙须菜多糖对肺癌SHP1、RAR0、MGMT、GADD45A、 RASSF1A等抑癌基因表达作用的研究图；
[0027] 图8示出了本发明实施例8的龙须菜多糖对胃癌SHP1、RAR0、MGMT、GADD45A、 RASSF1A等抑癌基因表达作用的研究图；
[0028] 图9示出了本发明实施例9的龙须菜多糖对宫颈癌SHP1、RAR0、MGMT、GADD45A、 RASSF1A等抑癌基因表达作用的研究图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0030] 实施例1
[0031] 龙须菜多糖对人正常细胞及三种肿瘤细胞的抑制增殖作用
[0032] 实验材料:龙须菜多糖是从红藻类植物龙须菜中提取并纯化得到的多糖。龙须菜 为981品种，采自浙江温州。人正常肺上皮细胞株BEAS-2B和肺癌细胞株A549、胃癌细胞株 MKN45及宫颈癌细胞株Hela购自中科院细胞库，本室保存培养。
[0033]实验方法:将纯化干燥的龙须菜多糖粉末溶于溶解剂磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)，配成lmg/mL母液，过滤除菌，分装，-20°C冻存备用。人肺癌细胞株 A549、胃癌细胞株MKN45和宫颈癌细胞株Hela均为贴壁细胞，细胞复苏后分别以5X 106/L的 接种密度种于新鲜的1640培养液（含有89v/v%的RPMI1640培养基，10v/v%的胎牛血清 FBS，Iv/v%的lU/mL的青-链霉素）中培养，置于37 °C、饱和湿度、5v/v %⑶:^培养箱中培养。 每2天换液、传代1次。分别取对数生长期的BEAS-2B、A549、MKN45和Hela细胞，以0.25v/v% 胰酶消化、计数，用含IOv/v%胎牛血清的RPMI-1640培养液稀释细胞，制成I X IO4AiL细胞 悬液，接种于4块96孔培养板内，每孔200yL，使每孔细胞密度为2 X IO3个，每组设4个平行复 孔，并设不含细胞的空白组，培养24h，待细胞贴壁后，每孔加入含不同浓度龙须菜多糖(0、 25、50、100ug/mL)的200L培养基换液，其中Oug/mL龙须菜多糖组为对照组。分别连续培养 48h后，加入含ΙΟv/v%CCK-8的培养基200L换液，继续培养2.5h，采用自动酶标读数仪检测 波长450nm的各孔吸光值A。按下列公式计算肿瘤细胞生长抑制率，分析待测药物对肿瘤细 胞的增殖活力的影响。
[0034] 计算公式：细胞生长和增殖活力（％) = [A450(加药）一A450(空白）]/[A450(对 照）一A450(空白）]X100%;细胞生长抑制率=1一细胞生长和增殖活力（％)
[0035] 实验结果:从图1可知，龙须菜多糖对人正常肺上皮细胞没有抑制增殖作用。而龙 须菜多糖对三种肿瘤细胞抑制生长和增值效果随着作用浓度的增加有所增加，但在25ug/ mL以内，作用均不明显(P>0.05)。而当作用浓度为50ug/mL时，肺癌A549、胃腺癌MKN45和宫 颈癌Hela细胞的生长和增殖能力分别是59.16%、51.29%和69.96% (P〈0.05)。作用浓度为 100ug/mL 时，对 A549、MKN45 和 Hela 细胞的增殖能力 46.27%、43.77%和50.67%(卩〈0.01)。 [0036]可见，各实验组与对照组抑制增殖效果相比，龙须菜多糖对人正常细胞没有毒性， 而对肿瘤细胞的生长和增殖能力有抑制作用，且随着浓度的增大，细胞增殖活力越小，抑制 作用增大越明显。龙须菜多糖对肿瘤细胞生长和增殖抑制的作用效果呈现出明显的浓度依 赖性，其中对肺癌的抑瘤效果最为显著。
[0037] 实施例2
[0038] 龙须菜多糖对对肺癌细胞抑癌基因 SHPl去甲基化作用的研究
[0039] 实验材料:龙须菜多糖为采用本发明提供的提取分离方法得到的龙须菜多糖成 品，同实施例1。肺癌细胞为常规培养于含10%的胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中的人 肺癌细胞株A549。
[0040] 实验方法：
[0041] (1)肿瘤细胞培养及药物处理:本实施例将龙须菜多糖作用于人肺癌细胞株A549。 龙须菜多糖作用浓度参照实施例1中的浓度选择50ug/mL，作用72小时。将纯化干燥的龙须 菜多糖加入溶剂?83配成111^/1^母液，过滤除菌，分装，-20°(：冻存备用。将4549细胞以5乂 l〇6/L的接种密度种于新鲜的RMPI1640培养液(含有89v/v%的RPMI1640培养基，ΙΟv/v%的 胎牛血清FBS，Iv/v %的lU/mL的青-链霉素）中培养，置于37 °C、饱和湿度、5v/v % CO2培养箱 中培养。每2~3天换液或传代1次。实验采用培养的对数生长期的细胞，加入50μg/ml PGL 后，与肺癌细胞A549共同培养48、72h，以0.25%Trypsin-EDTA胰酶消化、PBS洗涤、细胞计数 仪计数，收集细胞。
[0042] (2)基因组DNA的提取:将收集的细胞使用PBS清洗。将细胞的数量调整至2xl03。将 细胞悬浮在500μ1含有蛋白酶K的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.5;25mM EDTA pH 8.0; 150mM NaCl; 300mg/ml蛋白酶K ; 0.5 % SDS)中。水浴65 °C，过夜。使用酚氯仿进行抽提 (phenol: chloroform: isoamyl alcohol = 25: 24:1，v/v/v)，在上清液中加入RNA酶（20U/ ml) (Ambion; AM2286)，再进行酚抽提。在提取物中加入终浓度为300mM的NaAc和2.5倍体积 的无水乙醇，在-80 °C保存30min。乙醇沉淀之后离心使DNA附着在管壁上，用75 %的乙醇清 洗一遍后再风干，最终悬浮于200ml TE(10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH8.0)中。DNA浓度使用 ND-2000Nanodrop分光光度计进行检测。
[0043] (3)亚硫酸盐修饰：使用EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒（Zymo Research, Los Angeles ,USA)对400ng基因组DNA进行亚硫酸盐修饰，修饰步骤依照厂商的说明书进 行。最终修饰后的DNA抽提在20μ1试剂盒中的洗脱缓冲液(Elution Buffer)中，置于-20°C 冰箱进行保存。亚硫酸盐修饰导致未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在PCR循环扩增中转化 为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不会被转化，经过PCR扩增后成为胞嘧啶。
[0044] (4)检测甲基化状态：利用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)方 法检测SHPl基因启动子区的甲基化状态采用。将亚硫酸盐修饰后的DNA作为PCR反应的模 板，分别设计引物以区分甲基化和非甲基化的DNA链。甲基化特异性引物（1^:5'_ GAACGTTATTATAGTATAGCGTTC-3 ' ；MR: 5 ' -TCACGCATACGAACCCAAACG-3 '）用于扩增甲基化的 DNA，甲基化非特异性引物（UF : 5 ' -GTGAATGTTATTATAGTATAGTGTTTGG-3 ' ； UR : 5 ' -TTCACACATACAAACCCAAACAAT-3'）用于扩增非甲基化的DNA，PCR反应体积为50μ1，包括5μ1亚 硫酸盐修饰的DNA模板，25μ1 Zymo TaqTM PreMix(Zymo Research，Los Angeles，USA)，lyl 正向引物（I Oymo I /L)，I μ I逆向引物（I Ομπιο I /L)和18μ I ddH20。PCR反应条件：95 °C预变性 10min，95°C变性30s，58°C复性30s，72°C延伸30s，扩增39个循环，最后72°C延伸7min。将5μ1 PCR产物在加入2 %琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像仪观察拍照。
[0045] 结果如图2所示：对照组电泳图中仅呈现出甲基化的条带(M)，而未见非甲基化条 带(U)，表明在肺癌Α549细胞中，抑癌基因 SHPl启动子区呈现出高度甲基化的状态。龙须菜 多糖作用于肺癌细胞后，非甲基化条带出现，而甲基化条带变弱，表明龙须菜多糖具有抑制 抑癌基因 SHPl高甲基化的作用，随着龙须菜多糖作用时间的延长，去甲基化作用增强，呈现 时间依赖性。这说明龙须菜多糖具有抑制抑癌基因高甲基化的效果，对肺癌起到了一种甲 基化抑制剂的作用。
[0046] 实施例3
[0047] 龙须菜多糖对对肺癌细胞抑癌基因 RARg去甲基化作用的研究 [0048] 实验材料:同实施例2。
[0049] 实验方法:除药物处理时间梯度、基因名称及引物外，其余其他同实施例2。不同点 在于本实施案例加入50μg/ml PGL后，与肺癌细胞Α549共同培养24、48和72h。所选抑癌基因 为RARP，其甲基化特异性引物（MF : 5 ' -TCGAGAACGCGAGCGATTCG-3 ' ； MR : 5 ' -TCGTTTCGGTTGGATTGGTC-3 '）用于扩增甲基化的DNA，甲基化非特异性引物（即：5'-TTGAGAATGTGAGTGAITTGA-3 ' ；UR: 5 ' -TTGITTTGGTTGGATTGGTT-3 '）用于扩增非甲基化的DNA。
[0050] 实验结果如图3所示：对照组电泳图中仅呈现出甲基化的条带(M)，而未见非甲基 化条带(U)，表明在肺癌A549细胞中，抑癌基因 RARP启动子区呈现出高度甲基化的状态。龙 须菜多糖作用于肺癌细胞后，非甲基化条带出现并逐渐增强，而甲基化条带变弱，表明龙须 菜多糖具有抑制抑癌基因 RAR0高甲基化的作用，随着龙须菜多糖作用时间的延长，去甲基 化作用增强，呈现时间依赖性。这说明龙须菜多糖具有抑制抑癌基因高甲基化的效果，对肺 癌起到了 一种甲基化抑制剂的作用。
[0051 ] 实施例4
[0052] 龙须菜多糖对胃癌细胞抑癌基因 SHPl的去甲基化作用的研究
[0053]实验材料:除肿瘤细胞用胃癌MKN45代替肺癌A549外，其他材料同实施例2。
[0054]实验方法:除培养、收集的肿瘤细胞为胃癌MKN45外，其他同实施例2。
[0055]实验结果如图4所示：对照组电泳图中仅呈现出甲基化的条带(M)，而未见非甲基 化条带(U)，表明在胃癌MKN45细胞中，抑癌基因 SHPl启动子区呈现出高度甲基化的状态。龙 须菜多糖作用于肺癌细胞48h后，非甲基化条带出现，而甲基化条带变弱，作用72h后，甲基 化条带消失，而非甲基化条带较亮，表明龙须菜多糖具有抑制抑癌基因 SHPl高甲基化的作 用，随着龙须菜多糖作用时间的延长，去甲基化作用增强，呈现时间依赖性。这说明龙须菜 多糖具有抑制抑癌基因高甲基化的效果，对胃癌起到了一种甲基化抑制剂的作用。
[0056] 实施例5
[0057] 龙须菜多糖对宫颈癌MGMT基因启动子区亚硫酸盐测序峰图及CpG位点的影响 [0058]实验材料:除肿瘤细胞用宫颈癌Hela代替肺癌A549外，其他材料同实施例2。
[0059]实验方法：
[0060] (1)肿瘤细胞培养及药物处理:肿瘤细胞选用HeIa，其他同实施例2(1)。
[0061 ] (2)基因组DNA提取和亚硫酸盐修饰:同实施例2 (2)和(3)。
[0062] ( 3 )使用亚硫酸盐测序P C R ( B S P )法定量检测甲基化状态：上游引物：5 ' - TTGTAGTTGATTTATTGATGGATTTA-3 '，下游引物：5 ' -ACATATATACCTTACACACTCCAAAC-3 '，产物 长度329bp(内含11个0?6,8丨557889)。？〇?反应体积为5(^1，包括5以1亚硫酸盐修饰的0嫩模 板，25μ1 Zymo TaqTM PreMix(Zymo Research，Los Angeles ,USA), ΙμL 正向引物（IOymol/ 1)，1μ1 逆向引物（1〇μπιο1/1)和 18μ1 ddffiOlCR 反应条件:95°C 预变性 10min，95°C 变性 30s， 58°(：复性6〇8,72°(：延伸5〇8，扩增35个循环，最后72°(：延伸71^11。将5以1?0?产物在加入 GelRed.的2%琼脂糖凝胶上进行电泳、使用Zymoclean?Gel DNA Recovery Kit试剂盒 (Zymo Research，Los Angeles ,USA)切胶回收。将纯化的PCR产物克隆至pEASY-Tl载体 (Invitrogen，CA，USA)，每组至少挑选9个克隆进行Sanger测序。
[0063] (4)分析启动子区亚硫酸盐测序峰图及CpG位点：利用BLAST(Basic Local Al ignment Search Tool，http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/)分析经亚硫酸氢盐 (Bisulfite)修饰后的宫颈癌MGMT基因启动子区域Sanger测序数据，同时结合Chromas软件 对测序峰图进行分析，序列比对结果正确。将Bisulfite修饰前后的MGMT启动子区序列整齐 排列，并比较非甲基化C-U-T转化及CpG甲基化位点。
[0064I 实验结果如图5所示：箭头:分析的CpG位点示意。MGMT基因启动子区域的DNA序列 中含有大量的CpG岛，且CpG岛非甲基化DNA经Bisulf ite修饰后C变为U，经PCR扩增变成T，说 明宫颈癌MGMT基因确实存在甲基化状态。
[0065] 实施例6
[0066] 龙须菜多糖对肺癌细胞抑癌基因启动子区甲基化位点及CpG位点的作用 [0067] 实验材料：同实施例2。
[0068]实验方法:实验操作条件同实施例5。启动子区甲基化位点及CpG位点分析方法使 用QUMA软件对每个CpG岛的甲基化状态进行量化分析。每个处理组的总体甲基化水平为甲 基化的CpG岛的数量与总CpG数的比值，表示为百分数。
[0069]实验结果如图6所示：黑圈表示发生甲基化的CpG位点；白圈表示非甲基化的CpG位 点。随着龙须菜多糖作用时间的延长，非甲基化位点（白点）占比例越来越多，去甲基化作用 增强。表明龙须菜多糖具有抑制肺癌细胞抑癌基因 SHPl甲基化的作用，且这种去甲基化作 用呈现时间依赖性。
[0070] 实施例7
[0071] 龙须菜多糖对肺癌细胞抑癌基因表达作用的研究 [0072]实验材料:同实施例2。
[0073]实验方法：
[0074] (1)肿瘤细胞培养及药物处理:肿瘤细胞选用HeIa，其他同实施例2(1)。
[0075] (2)检测龙须菜多糖作用对抑癌基因 mRNA表达水平的影响：用RT-qPCR法检测龙须 菜多糖作用前后3冊1、1^邸、]\00'、6400454、1^35?认等抑癌基因的1111?嫩表达水平。了1?12〇1试 剂直接提取龙须菜多糖处理前后的A549细胞总RNA,Nanodrop 2000核酸定量仪检测RNA浓 度和纯度。取各实验组Iyg总RNA，按照Superscript IIIReverse Transcriptase说明书反 转录为cDNAjeal-time qPCR检测RAR0基因表达，扩增引物序列见表LPCR反应：SYBR Green PCR Master Mix(2X)5yl;正向引物（10μΜ)0·4μ1;逆向引物（10yM)0.4yl;cDNA 2μ I;补水至 1〇μ1 ICR扩增：95°C，2min; 95°C，IOs; 60°C，30s; 72°C30s。使用ABI Step One仪器 及软件分析龙须菜多糖作用不同时间（24、48和72h)前后抑癌基因的表达水平的变化情况。 [0076] 表1肿瘤细胞抑癌基因 RT-qPCR的引物序列
[0078] 实验结果如图7所示:对照组中，3册1、1^肋、]\00'、6400454、1^33?14等抑癌基因的 mRNA表达水平呈低表达或关闭状态。龙须菜多糖作用于肺癌细胞后，发现SHPI、RARi3、MGMT、 GADD45A、RASSF1A基因的mRNA表达重新启动，并且随着龙须菜多糖作用时间的延长，SHP1、 RAR0、MGMT、GADD45A和RASSF1A基因的mRNA表达水平上调。这表明肺癌细胞启动子区异常高 甲基化的抑癌基因始终保持沉默、功能丧失，而用龙须菜多糖去甲基化后抑癌基因的表达 则可以重新激活，从而达到抑制肿瘤的效果。
[0079] 实施例8
[0080] 龙须菜多糖对胃癌细胞抑癌基因表达作用的研究
[0081] 实验材料:同实施例4。
[0082]实验方法：同实施例7。
[0083] 实验结果如图8所示:对照组中，3册1、1^肋、]\00'、6400454、1^33?14等抑癌基因的 mRNA表达水平呈低表达或关闭状态。龙须菜多糖作用于胃癌细胞后，发现SHPl、RARi3、MGMT、 GADD45A、RASSF1A基因的mRNA表达重新启动，并且随着龙须菜多糖作用时间的延长，SHPl、 RAR0、MGMT、GADD45A和RASSF1A基因的mRNA表达水平上调。这表明胃癌细胞启动子区异常高 甲基化的抑癌基因始终保持沉默、功能丧失，而用龙须菜多糖去甲基化后抑癌基因的表达 则可以重新激活，从而达到抑制胃癌发生发展的效果。
[0084] 实施例9
[0085] 龙须菜多糖对宫颈癌细胞抑癌基因表达作用的研究 [0086] 实验材料：同实施例5。
[0087]实验方法：同实施例7。
[0088] 实验结果如图9所示:对照组中，宫颈癌细胞中SHP1、RAR0、MGMT、GADD45A、RASSF1A 等抑癌基因的mRNA表达水平呈低表达或关闭状态。龙须菜多糖作用于宫颈癌细胞后，发现 3冊1、1^邸、1?^1'、6400454、1^33?^基因的11^祖表达重新启动，并且随着龙须菜多糖作用时 间的延长，SHPl、1^肋、]\?^1'、6400454和1^33?认基因的11^祖表达水平上调。这表明宫颈癌细 胞启动子区异常高甲基化的抑癌基因始终保持沉默、功能丧失，而用龙须菜多糖去甲基化 后抑癌基因的表达则可以重新激活，从而达到抑制宫颈癌发生发展的效果。
[0089]在肿瘤形成过程中，抑癌基因的高甲基化是促进肿瘤细胞生长的关键因素。启动 子区CpG岛高甲基化沉默的基因包括细胞黏附基因、错配修复基因、谷胱甘肽转移酶等，所 有这些基因的表达改变都可促进肿瘤生长、逃避正常的生长抑制机制。启动子区异常高甲 基化的抑癌基因始终保持沉默、功能丧失，而去甲基化后抑癌基因则可以重新激活。因此， DNA去甲基化药物可治疗肿瘤。海藻龙须菜多糖具有抑制抑癌基因高甲基化的效果，对肿瘤 起到了一种甲基化抑制剂的作用，可进一步开发为用于抑癌基因甲基化抑制剂的抗肿瘤药 物或去甲基化试剂盒，具有临床应用价值。
[0090]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 龙须菜多糖作为抑癌基因甲基化抑制剂的新用途。2. 根据权利要求1所述的龙须菜多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、胃癌和宫颈癌。4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述龙须菜多糖为海藻龙须菜多糖。6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述龙须菜多糖作用于肿瘤细胞的抑癌基 因，所述抑癌基因包括在所述肿瘤细胞中表现为高甲基化状态的SHPl、RARi3、MGMT、 GADD45A、RASSF1A 抑癌基因。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述龙须菜多糖作用于肿瘤细胞的浓度为 不小于50ug/mL〇8. -种去甲基化试剂盒，其特征在于，所述去甲基化试剂盒包括龙须菜多糖或其药学 上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯，溶剂以及药学上可接受的辅料。9. 根据权利要求8所述的去甲基化试剂盒，其特征在于，所述溶剂为磷酸缓冲盐溶液， 所述辅料为质谱级的双蒸水。10. 根据权利要求8或9所述的去甲基化试剂盒，其特征在于，所述龙须菜多糖或其药学 上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯的重量份数为50份，所述溶剂的重量份数为900份，药学 上可接受的辅料的重量份数为100份。
【文档编号】A61P35/00GK106074594SQ201610561746
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】康亚妮, 赵小东, 邵志峰, 赖伊杰, 周盘婷, 杨炎昕
【申请人】上海交通大学