光合细菌在斑蝥抗癌功效中的减毒增效的应用

光合细菌在斑蝥抗癌功效中的减毒增效的应用
【专利摘要】本发明涉及光合细菌在斑蝥抗癌功效中的减毒增效的应用，所述光合细菌为紫色非硫菌群红细菌属的类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）。更具体地为光合细菌在具有抗肺癌、肝癌、子宫癌功效的斑蝥转化液中的应用。本发明首次将光合细菌应用在斑蝥提取液中用于对斑蝥提取液的生物转化，研究证明光合细菌对斑蝥提取液具有减毒增效的作用，生物转化后得到的斑蝥转化液的毒性降低、抗癌效果增强，所得斑蝥转化液下一步可尝试用于人肝癌、肺癌以及子宫癌的预防和治疗。
【专利说明】
光合细菌在斑蝥抗癌功效中的减毒増效的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及光合细菌在斑蝥抗癌功效中的减毒增效的应 用。
【背景技术】
[0002] 斑蜜为芫青科昆虫南方大斑蜜Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑蜜 Mylabris cichorii Linnaeus的干燥体，其性辛热有大毒，归肝、胃、肾经。内服有攻毒、逐 瘀散结、抗肿瘤的作用。斑蝥的主要成分斑蝥素及其衍生物对多种癌症尤其是原发性肝癌 有肯定的治疗效果。其具有较强的毒性，以消化系统和泌尿系统毒性反应为主，严重的出现 急性肾功能衰竭和中毒性休克，且毒性随给药剂量增加而增强，由于斑蝥的剧烈毒性限制 了其在临床的应用。在实际临床应用中多以复方、斑蝥素、斑蝥素衍生物等形式使用。而自 古以来对于斑蝥减毒的研究都集中在通过传统的炮制降低斑蝥的毒性，使部分的斑蝥素升 华而含量减少从而降低斑蝥的毒性。另外，还有少数学者提出用低浓度的NaOH碱水处理斑 蝥，以期将斑蝥素转化成毒性更低的斑蝥素酸钠。
[0003] 现有技术中的方法目前都无法满足在有效的去除斑蝥的毒性的同时保持或提高 斑蝥的抗癌性能；因此，仍需研究一种有效降低斑蝥毒性同时提高其抗癌性能的方法及产 品。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供光合细菌在斑蝥抗癌功效中的减毒 增效的应用，光合细菌对斑蝥提取液具有减毒增效的作用，生物转化后得到的斑蝥转化液 的毒性降低、抗癌效果增强，所得斑蝥转化液下一步可用于人肝癌、肺癌以及子宫癌的预防 和治疗。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种具有抗癌功效的斑蝥转化液的制备方法。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的斑蝥转化液。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种具有抗癌功效的斑蝥生物制剂。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 光合细菌在斑蝥抗癌功效中的减毒增效的应用，所述光合细菌为紫色非硫菌群红 细菌属的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
[0010] 优选地，光合细菌在具有抗肺癌、肝癌、子宫癌功效的斑蝥转化液中的应用。
[0011] 优选地，光合细菌在肝癌细胞株HepG-2、BEL-7402、SMCC-7211、QGY-7701中的应 用;光合细菌在肺癌细胞株A549中的应用;光合细菌在子宫癌细胞株Hela中的应用。
[0012] 本发明中的光合细菌购于中国科学院微生物研究所，其保藏名称为紫色非硫菌群 红细菌属的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，保藏编号为CGMCC 1.2174。
[0013] -种具有抗癌功效的斑蝥转化液的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：
[0014] Sl:用提取液提取斑蝥粉得斑蝥提取液；
[0015] S2:浓缩提取液并接种上述光合细菌，然后加入PSB培养基进行生物转化；
[0016] S3:生物转化结束后除去光合细菌菌体即得斑蝥转化液。
[0017]优选地，所述光合细菌为处于对数期的光合细菌，所述光合细菌的接种量为7~ 10%〇
[0018]优选地，所述步骤S2中的生物转化的时间为8~12天。
[0019]优选地，步骤S1中所述斑蝥提取液的质量浓度为7~I Omg/mL。
[0020]优选地，步骤Sl中的提取液为水;步骤S2中浓缩提取液的体积至转化液总体积的5 ~8 % ;优选地，所述转化液体系的pH为6~9。
[0021 ]上述方法制备得到的斑蝥转化液。
[0022] -种具有抗癌功效的斑蝥生物制剂，所述斑蝥生物制剂含有权利要求9所述的斑 蝥转化液。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0024] 本发明首次将光合细菌应用在斑蝥提取液中用于对斑蝥提取液的生物转化，研究 证明光合细菌对斑蝥提取液具有减毒增效的作用，生物转化后得到的斑蝥转化液的毒性降 低、抗癌效果增强，所得斑蝥转化液下一步可用于人肝癌、肺癌以及子宫癌的预防和治疗。
【附图说明】
[0025]图1为不同转化液中光合细菌的ODn/ODo生长变化曲线；
[0026] 图2为光合细菌的生长曲线；
[0027] 图3为不同斑蝥提取液质量浓度下光合细菌的生长情况；
[0028] 图4为斑蝥水提液组小鼠累积死亡数一时间曲线；
[0029] 图5为斑蝥转化液组小鼠累积死亡数一时间曲线；
[0030] 图6为斑蝥转化液对肝癌HepG-2细胞24h、48h、72h后的剂量效应曲线；
[0031]图7为斑蝥转化液对肝癌he Ia细胞24h、48h、72h后的剂量效应曲线；
[0032]图8为斑蝥转化液对肺癌A549细胞24h、48h、72h后的剂量效应曲线；
[0033]图9为斑蝥转化液对肝癌QGY-7701细胞24h、48h、72h后的剂量效应曲线；
[0034]图10为斑蝥转化液对肝癌SMC-7211细胞24h、48h、72h后的剂量效应曲线。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明 作任何限定。除非特别说明，所有本发明提供的实施例中，提供的原材料均可从市面采购获 得。
[0036]实施例1斑蝥提取液的制备 [0037] (1)药物与试剂
[0038] 斑蜜为芫青科昆虫南方大斑蜜Mylabris phalerata Pallas的干燥虫体，购于安 国路路通中药饮片有限公司；胎牛血清（杭州四季青产品）；RPMI1640培养液(Hyclone产 品）；0.25 % Trypsin-EDTA(美国GIBCO产品）；CCK-8试剂盒（碧云天公司产品）；PSB(美国 GIBCO产品）；乙醇(AR)。
[0039] (2)细胞株
[0040] 人肝癌细胞HepG-2、人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549均由广东药学院生命 科学与生命制药学院提供。
[0041] 1.主要仪器
[0042] GalaxyS+二氧化碳培养箱（华粵行仪器有限公司）；重庆奥特倒置生物显微镜 BDS200;BIO-RAD Mode 1-1680酶标仪;移液枪(Eppendorf公司）；0 · 22μπι滤器（美国Pal 1)。 [0043] (4)斑蝥各转化液的制备
[0044]准确称取相同质量的斑蝥粗粉(将斑蝥粉碎后过30目筛，50°C干燥6小时，得斑蝥 粗粉)4份，分别加20倍量的水、55 %乙醇、75 %乙醇、95 %乙醇溶液，浸泡30min，加热回流 提取2h，冷却、过滤，依次得到各提取液。
[0045] 将各提取液减压浓缩至低于转化液总体积的5%~8%，接种7%~10% (体积比） 处于对数期的光合细菌(PSB)，加入PSB培养基至所需体积，pH=6~9,相应得到以斑蝥药材 计算浓度为，7~10mg/mL的转化液I、II、III、IV。以不加入斑蝥提取液的PSB正常生长组为 对照组，置于人工气候箱中，厌氧培养，生物转化8~12天。
[0046] 每天定时在660nm处测定各转化液和对照组中PSB的光密度OD值，以转化液中PSB 的菌体浓度变化比0Dn/0DQ(0DQ初始光密度，ODn代谢η天的光密度)来反映光合细菌生长情 况，绘制PSB的生长变化曲线。
[0047] 生物转化结束时，取I、II、III、IV组的斑蝥各转化液，3500r/min离心20min除去 PSB菌体，上层液体浓缩成含斑蝥药材100mg/mL的药物母液，-20 °C冷藏备用。
[0048] (5)斑蝥各转化液的体外抗肿瘤活性比较
[0049] 1.细胞试药的配制
[0050] ①细胞培养液:每IOOmL的RPMI1640培养液中含10%胎牛血清、lOOU/mL青霉素和 100yg/mL链霉素。
[0051 ]②取适量药物母液用细胞培养液稀释配制成浓度为lmg/mL含药培养液，用0.22μπι 的滤器过滤除菌，密封冷藏备用，用时根据所需给药浓度用细胞培养液稀释调配即可。 [0052] 2.细胞的传代培养
[0053]取各种细胞用细胞培养液(含10%胎牛血清、lOOU/mL青霉素和100yg/mL链霉素）， 置于37 °C、5 %CO2的细胞培养箱中培养。待细胞生长2~3天至对数期时，弃去旧培养液，用 0.25%Trypsin-EDTA胰蛋白酶消化，于显微镜下见细胞间隙增大、胞质回缩变圆即终止消 化，去掉胰酶，加入新的培养液轻轻吹打制成单细胞悬液，传代培养，一般2~3天传代一次。 [0054] 3.各转化液的体外抗肿瘤活性测定
[0055] 根据不同细胞生长速率，调整细胞浓度8~12X X 104/mL，每孔IOOyL接种于96孔 板，培养24h使其贴壁后，吸掉旧培养液，加入含不同药物浓度的培养液IOOyL，并设置对照 组(不含药的细胞培养液）；空白组(不含细胞的细胞培养液），每组设计4个复孔。置于细胞 培养箱培养48h后，吸掉旧培养液，加入IOOyL新的培养液和IOyL的CCK-8试剂，轻摇混匀。继 续培养反应Ih后取出，按照CCK-8试剂盒方法，以630nm为参考波长，用BIO-RAD酶标仪在波 长450nm处测定吸光度（OD)值。计算细胞抑制率IR (%)=(对照组一实验组_ 勝）/(对照组空白组_顏）xxI00%。
[0056]根据统计学原理，实验数据以iV±.練表示，数据采用SPSS 20.0统计软件进行分 析，根据细胞抑制率IR用统计回归方法求半数抑制浓度IC50。
[0057]根据不同提取方法的转化液中PSB的生长快慢情况，以各转化液对各肿瘤细胞的 IC50作为指标，综合考虑优选斑蝥作为转化底物的提取方法。
[0058] (6)斑蝥提取方式的实验结果
[0059] ①不同转化液中光合细菌的生长情况
[0060] 图1为本实施例提供的不同转化液中光合细菌的生长情况示意图，从图1中可以看 出，斑蝥的加入会抑制PSB的生长，I组中光合细菌的生长增殖速率较快，PSB的生长周期趋 势也较接近对照组。而在II组、III组、IV组中的PSB生长缓慢，对数期延迟至第3天。提示在 相同斑蝥浓度下I组提取斑蝥的物质对光合细菌的生长毒性抑制作用比II组、III组和IV组 小。
[0061 ]②不同转化液对肝癌BEL-7402细胞的抑制作用
[0062] 在本实施例中，肝癌BEL-7402细胞接种密度为15 X X IO4个/mL。
[0063] 表1各转化液对肝癌BEL-7402细胞增殖的抑制率(n = 4，.f ±放± s)
[0065]由表1可知，各组药物对BEL-7402细胞的抑制率随着浓度增加而增大，在相同给药 浓度下，I组和ΠΙ组对细胞的抑制率比较接近，且比其他两组药物的抑制作用略强。SPSS 处理得出I组、II组、III组、IV组的药物对BEL-7402细胞的半数抑制浓度依次为：153.86yg/ mL; 187 · 93yg/mL; 160 · 05yg/mL，262 · 08yg/mL。提示 I 组药物对肝癌 BEL-7402 细胞的抑制效 果最好。
[0066]③不同转化液对肝癌HepG-2细胞的抑制效果
[0067]在本实施例中，肝癌HepG-2细胞接种密度为10 X X IO4个/mL。
[0068] 表2各转化液对肝癌HepG-2细胞增殖的抑制率(n = 4，f ±.拔土 s)
[0070] 由表2可知，在相同给药浓度下III组药物对肝癌HepG-2细胞的抑制率较高，计算 得至丨组、II组、III组、IV组对肝癌HepG-2细胞的IC 5Q依次是151.59yg/mL，206.11yg/mL， 133 · 38yg/mL，289 · 98yg/mL;提示III组药物对肝癌H印G-2细胞的抑制效果较好。
[0071] ④不同转化液对肺癌A549细胞的抑制效果
[0072]在本实施例中，肺癌A-549细胞接种密度为8 X X IO4个/mL。
[0073] 表3各转化液对肺癌A-549细胞增殖的抑制率(n = 4，± sf ± i')
[0075]由表3可知，各组药物对肺癌A-549细胞均有一定的抑制作用，且与给药浓度呈正 相关。在相同给药浓度下I组药物对细胞的抑制率略比其他组药物高。计算得到I组、II组、 III组、IV组对肝癌HepG-2细胞的IC5q依次是390 · 56yg/mL，611 · 19yg/mL，425 · 09yg/mL， 495.85yg/mL，提示I组药物对肺癌A-549细胞的抑制效果较其他组的好。
[0076]⑤药物作用于各肿瘤细胞的IC50
[0077]由实验结果，①对BEL-7402细胞的抑制效果由强到弱：I组>>III组>II组>IV组； ②对HepG-2细胞的抑制效果由强到弱：III组>I组>II组>IV组;③对A-549细胞的抑制效 果由强到弱：I组》111组>IV组>11组。总体来看斑蝥水提取转化液的体外抗肿瘤效果更 好，I组中的PSB生长受斑蝥毒性抑制最小，综合考虑PSB转化斑蝥中选择用水提取斑蝥来作 为转化的底物(I组）。
[0078]实施例2斑蝥提取液生物转化工艺
[0079] (1)主要材料
[0080] 光合细菌：紫色非硫菌群红细菌属的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)购 于中国科学院微生物研究所。
[0081 ]光合细菌的培养基：乙酸钠3. Og氯化钙0.05g磷酸氢二钾1.0 g硫酸铵1.0 g酵母膏 2 · Og硫酸镁0 · 2g磷酸二氢钾0 · 7g微量元素液5ml水1000 ml。
[0082] 微量元素溶液：乙二胺四乙酸二钠2 · OOOg七水合硫酸亚铁0 · 200g硼酸1 · 500g硫酸 铜0.030g二水合钼酸钠0.450g水合硫酸锰1.200g七水合硫酸锌0.150g六水合氯化镍 0·020g水1000 ml。
[0083] (2)主要仪器
[0084]岛津UV2450紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；人工气候箱（宁波江南仪器 厂）；BL-220H电子天平（日本SMMADZU公司）；DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌锅(上海申安）； SW-CJ-IF洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；移液枪(Eppendorf公司）。
[0085] (3)方法与结果
[0086]①光合细菌的生长曲线
[0087]配制光合细菌培养基，接种10% (体积比）的处于对数期的光合细菌，设空白组和 加药组(实验组），每组4个平行样，加药组的加药浓度为10mg/mL(斑蝥的量按生药量算），从 而测定在不加药和加药情况下光合细菌的生长曲线。每12小时测定菌液在660nm下的吸光 度，共测定12天。相应的生长曲线见附图2。
[0088]从图2可以看出空白组不存在适应期，加药组存在明显的适应期;第96小时空白组 结束对数期，进入稳定期，吸光度稳定于5左右。对于加药组，从第36小时开始到第96小时处 于明显的对数期，96小时之后，增幅变缓;空白组稳定期存在时间较长，第八天进入衰亡期。 加药组不存在明显的稳定期，但同样第八天进入衰亡期;确定生物转化的时间为4-~8天符 合光合细菌生长周期的特点。一方面，在这个过程中光合细菌生长旺盛，酶活更大，转化能 力更强;另一方面，进入衰亡期之后光合细菌转化废物增多，不利于生物转化后分析。
[0089]②斑蝥安全浓度的考察
[0090]准确称取适量的斑蝥粗粉加20倍量的水浸泡30min，加热回流提取2h，冷却、过滤， 得到斑蝥水提液。
[0091] 用PSB培养基依次配成含斑蝥药材浓度为0、4、8、10、12、16、20mg/ml的溶液，已培 养好处于对数期的PSB以10%接种量(体积比）接种，放置在光照培养箱中厌氧培养，每隔 12h分别取样，在660nm处测PSB的OD值以表示PSB的生长，连续测定96h。每个浓度平行3个 样，取平均值。以0D n/0DQ(0DQ是溶液的初始光密度，00"是11小时的光密度)反应光合细菌的 生长情况。
[0092] 说明书附图3为不同斑蝥提取液质量浓度下光合细菌的生长情况，由说明书图3可 以看出斑蝥药物浓度为0、4、8、10mg/mL时，PSB生长趋势大体相同，而浓度为12、16、20mg/mL 时PSB细菌生长缓慢，快速生长期延迟或未出现。可见转化液中斑蝥的浓度越大对PSB生长 抑制作用也越明显。
[0093] 利用测得的各溶液96h的OD值和Oh的OD值比值OD96h/OD〇h为指标(如表4)，用SPSS通 过均值最小差异法(LSD)比较各斑蝥浓度与Omg/mL的对照组是否有显著性差异(P<0.05)， 确定斑蝥对PSB生长的安全浓度。
[0094] 表4不同斑蝥浓度溶液的OD96h/OD〇h
[0097] 从表4可看出随着斑蝥浓度的增加，光合细菌的菌体浓度变化比值0D96h/0DQh逐渐 减小，说明斑蝥对PSB的生长抑制随着浓度增加而加强。从P值看出，斑蝥浓度为4、8、10mg/ mL的转化组和对照组没有显著性差异(P>0.05)，证明在浓度4、8、10mg/mL的浓度下对光合 细菌的生长影响与对照组没有显著性差异。故PSB转化斑蜜的安全浓度为4~I Omg/mL，大于 lOmg/mL将会对PSB产生明显的毒性作用，抑制PSB的生长。故光合细菌生物转化斑蝥时斑蝥 的药物浓度为4~I Omg/mL。
[0098] 实施例3光合细菌对斑蝥提取液生物转化前后的毒性比较
[0099] 1.主要材料
[0100] 斑蜜为芫青科昆虫南方大斑蜜Mylabris phalerata Pallas的干燥虫体，购于安 国路路通中药饮片有限公司;斑蝥水提液和斑蝥转化液均实验室自制。
[0101] 2.受试动物
[0102] 受试动物:SPF级昆明种健康小鼠（18~22g，），雌雄各半，购于广州中医药大学实 验动物中心，SCXK (粵)2013-0020。
[0103] 3.方法与结果
[0104] (1)药品的制备
[0105] 准确称取斑蝥粗粉(30目，50°C干燥6小时)4份，加20倍量的水，浸泡30min，加热回 流提取2h，冷却、过滤，得到提取液。
[0106] 将提取液减压浓缩至转化液总体积的5%，接种10% (体积比）对数期的光合细菌 (PSB)，得到以斑蝥药材计算浓度为I Omg/mL的转化液。厌氧培养，生物转化8天。取斑蝥转化 液，3500r/min离心20min除去PSB菌体，上层液体浓缩成含斑蜜药材lOOmg/mL的药物母液，-20°C冷藏备用。小鼠灌胃给药前用蒸馏水调成所需给药浓度。
[0107] (2)急性毒性实验
[0108] ①取SPF级昆明种小鼠，随机分组，每组10只，雌雄各半。根据预实验结果斑蝥代谢 液的全部致死的最小剂量为Dminl620mg/kg和全部不致死的最大剂量Dmax为3000mg/kg，将 斑蝥水提液和斑蝥转化液分别以不同剂量灌胃给药，药物均设置6个给药剂量组。对照组 灌胃相同体积的蒸馏水。小鼠给药前禁食不禁水12h，灌胃体积0.2mL/10g。给药后观察老鼠 中毒反应和死亡情况，连续观察14天，每2天称取存活小鼠的体重。根据不同剂量组小鼠的 死亡计算LD50。
[0109] ②小鼠肝脏和肾脏病理切片观察
[0110] 取高中低三个剂量组的小鼠，在小鼠死亡时和14天实验结束时处死，立即解剖小 鼠取出肝脏、肾脏，做成石蜡切片，显微镜下（100倍)观察拍照
[0111] (3)结果
[0112] ①小鼠毒性反应症状及出现时间
[0113] 斑蝥水提液和斑蝥转化液的毒性反应症状类似，剂量越大毒性反应越强烈、出现 时间也越早。斑蝥水提液组和斑蝥转化液组给药后均出现小鼠自发活动减少，四肢趴伏，腹 部变大，反应迟钝、性器官充血肿大；闭眼、拒食、尿失禁;死前呼吸急促、抽搐、流泪。斑蝥水 提液组中毒出现时间集中在给药后2~3h。存活小鼠多于4~5天症状减轻，并逐渐恢复正 常。斑蝥转化液组中毒出现时间集中在给药后4~6h，存活小鼠2~3天后逐渐恢复正常。
[0114] ②死亡率及剂量与反应的关系
[0115] 不同剂量组小鼠累积死亡数与剂量的关系见表5 [0116]表5斑蝥转化前后小鼠死亡情况和LD50
[0119]从表5可以看出斑蝥水提液和斑蝥转化液的给药剂量越高，小鼠死亡率越高，毒性 越大。采用SPSS20的回归方法求得斑蝥水提液LD5Q = 206mg/kg，95%可信限为：179~233mg/ kg;而斑蜜转化液LD5Q = 2036mg/kg，95 %可信限：1923~2150mg/kg。1^)5〇值越大则药物毒性 越小，由此证明斑蝥经光合细菌转化后对小鼠灌胃给药的毒性显著降低，从数量关系来看， 斑蝥经光合细菌转化后毒性大概降低10倍。
[0120] ③解剖学观察
[0121] 对不同给药剂量组的小鼠进行解剖，发现食管、胃粘膜溃烂出血；胃发泡水肿，胃 肠道充血，胸腹腔血性积液;肺水肿而表面有充血斑点，心脏色泽暗淡;肝脏边缘浊肿，色泽 暗淡;肾脏暗红色，浑浊无透明感。
[0122] ④小鼠肝脏和肾脏病理切片观察结果
[0123] 对照组的小鼠肝脏组织的肝小叶结构完整，表现为肝细胞以中央静脉为中心呈放 射状排列，汇管区无炎性细胞浸润及明显纤维组织增生，肝细胞完整正常，细胞核椭圆形， 可清晰看见核仁。给药组会出现不同程度的肝细胞排列混乱、炎性细胞浸润、肝小叶结构被 破坏等情况。
[0124] 对照组小鼠的肾脏肾小管正常，肾小球圆形完整，中毒的小鼠肾脏会选择性出现 肾小球固缩、体积增大，肾小管坏死等情况。
[0125] 从小鼠毒性反应症状及出现时间的结果来看，斑蝥水提液的小鼠中毒出现时间集 中在给药后2~3h，存活小鼠多于4~5天症状减轻，并逐渐恢复正常。而斑蝥转化液的小鼠 中毒出现时间集中在给药后4~6h，存活小鼠2~3天后逐渐恢复正常。中毒出现的时间延 后，恢复正常时间提前，提示毒性降低。斑蝥转化液的半数致死量LD 5q为1383mg/kg，斑蝥水 提液LD5q为206mg/kg，证明斑蝥经光合细菌转化后毒性显著降低，达到了减毒的效果。
[0126] 斑蝥转化前后对小鼠的肝组织减毒作用明显，病理主要表现在中央静脉淤血，炎 细胞浸润，肝小叶结构被破坏，局部坏死。肾脏病理毒性不明显，主要变现在轻微的肾小球 增大，肾小管细胞病变;可能是由于在单次给药情况下，毒性成分在短时间内未对肾脏产生 器质性损伤。但解剖观察到心脏外膜有充血点、胸腔有积血，提示小鼠急性中毒死亡可能与 血液循环系统有关。
[0127] 实施例4斑蝥转化液体外抑瘤作用试验
[0128] 1.药物与试剂
[0129] 斑蜜为芫青科昆虫南方大斑蜜Mylabris phalerata Pallas的干燥虫体，购于安 国路路通中药饮片有限公司；胎牛血清（四季青）；RPMI1640培养液（Hyclone); 0.25 % Trypsin-EDTA(GIBCO) ;CCK-8试剂盒（碧云天公司）；PBS(GIBC0)。
[0130] 2.细胞株
[0131] 人肝癌细胞HepG-2、人肝癌细胞BEL-7402、人肺癌细胞A549均由广东药学院生命 科学与生命制药学院提供。
[0132] 3.主要仪器
[0133] GalaxyS+二氧化碳培养箱（华粵行仪器有限公司）；重庆奥特倒置生物显微镜 BDS200;BI0-RAD Model-1680酶标仪;0·22μπι滤器（美国Pall)。
[0134] 4.方法与结果
[0135] (1)细胞试药的制备
[0136] 取适量斑蝥转化液用细胞培养液稀释配制成浓度为lmg/mL含药培养液，用0.22μπι 的滤器过滤除菌，密封冷藏备用。用时根据实验需要，稀释调配。
[0137] (2)细胞的复苏、培养
[0138] 细胞的复苏:常规灭菌在培养瓶中加入10-15mL的培养液，快速从液氮耀中取出肿 瘤细胞株的冷冻管，并迅速放入已预热的37°C水浴锅中，不断摇动，使冻存管迅速融化 (Imin内）；将冻存液移至加入细胞培养液中，第二天更换一次培养液，继续培养。
[0139] 细胞的扩大培养:常规处理，加入500ul 0.25%胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化，于 显微镜观察确定消化的程度，将细胞按照1: 2至1:4的比例传代，放在C02培养箱中进行培 养。待细胞状态好、增殖速度快时，将细胞进行冻存以及进行试验。
[0140] (3)四唑盐(MTT)比色法检测多种肿瘤细胞株生长的抑制作用
[0141] ① CCK-8法以630nm为参考波长，用BIO-RAD酶标仪在波长450nm处测定吸光度(OD) 值。计算细胞抑制率IR( % )=(对照组一实验组OD)/(对照组一空白组）100%。
[0142] ②体外抗肿瘤的抑制率测定
[0143] 人肝癌细胞HepG-2、人肝癌细胞SMCC-7211、人肺癌细胞A549、人子宫癌细胞He Ia 以8 X IO4个/mL作为接种量进行种板;人肝癌细胞QGY-7701以5 X IO4个/mL作为接种量进行 种板。
[0144] (4)试验结果
[0145] ①药物对肝癌HepG-2细胞的抑制作用
[0146] 表6药物对肝癌HepG-2细胞增殖的抑制率/% (η = 4，Λ:±>s.)
[0148]表7药物对HepG-2细胞作用的回归方程和中效浓度
[0150]从表6、表7可知，斑蝥转化液对HepG-2细胞具有抑制作用，一定剂量时，抑制率随 着作用时间的延长而上升，一定时间下，抑制率随着药物浓度的上升而上升，呈明显的剂 量-时间依赖性。经SPSS 22.0处理得出斑蝥转化液对HepG-2细胞的24h、48h、74h的IC50依 次为：249 · 44yg/mL(置信区间为（214 · 37-322 · 23yg/mL)); 168 · I lyg/mL(置信区间为 (155 · 00-183 · 87yg/mL)); 106 · 60yg/mL(置信区间为（68 · 13-131 · 68yg/mL))。
[0151]②药物对子宫癌Hela细胞的抑制作用
[0152] 表8各转化液对子宫癌HeIa细胞增殖的抑制率/% (η = 4，? 士^)
[0154]表9药物对He Ia细胞作用的回归方程和中效浓度
LU1&6J 田衣8、9巧知，圾蛩转化淞別Hela细M具有仰制作用，一疋刑重町，仰制準随宥作 用时间的延长而上升，一定时间下，抑制率随着药物浓度的上升而上升，呈明显的剂量-时 间依赖性。经SPSS 22.0处理得出斑蝥转化液对He Ia细胞的24h、48h、74h的IC5Q依次为： 452.79yg/mL(置信区间为（343.89-545.32yg/mL)) ; 279.76yg/mL(置信区间为（242.90_ 351 · 53yg/mL)); 126 · 19yg/mL(置信区间为（108 · 43-140 · 70yg/mL))。
[0157] ③药物对肺癌A549细胞的抑制效果
[0158] 表10各转化液对肝癌A549细胞增殖的抑制率(η = 4，?±$)
[0162] 由表10、11可知，斑蝥转化液对Α549细胞具有抑制作用，一定剂量时，抑制率随着 作用时间的延长而上升，一定时间下，抑制率随着药物浓度的上升而上升，呈明显的剂量-时间依赖性。经SPSS 22.0处理得出斑蝥转化液对Α549细胞的24h、48h、74h的IC5q依次为： 249.44yg/mL(置信区间为（214.37-322.23yg/mL)) ; 112.36yg/mL(置信区间为（98.39_ 126 · 48yg/mL)); 66 · 82yg/mL(置信区间为（53 · 37-78 · 50yg/mL))。
[0163] ④药物对肝癌QGY-7 7 01细胞的抑制作用
[0164] 表12各转化液对肝癌QGY-7701细胞增殖的抑制率/%(η = 4，〗:±Λ、）

[0169]从表12、表13可知，斑蝥转化液对QGY-7701细胞具有抑制作用，一定剂量时，抑制 率随着作用时间的延长而上升，一定时间下，抑制率随着药物浓度的上升而上升，呈明显的 剂量-时间依赖性。经SPSS 22.0处理得出斑蝥转化液对QGY-7701细胞的24h、48h、74h的IC50 依次为：234 · 80yg/mL(置信区间为（208 · 44-280 · 94yg/mL)); 165 · 98yg/mL(置信区间为 (151 · 85-183 · 18yg/mL)); 95 · 68yg/mL(置信区间为（84 · 44-105 · 12yg/mL)。
[0170]⑤药物对肺癌SMC-7 211细胞的抑制效果
[0171] 表14各转化液对肝癌SMC-7 211细胞增殖的抑制率(η = 4，5 士 ）
[0173] 表15药物对SMC-7211细胞作用的回归方程和中效浓度
[0175] 由表14、15可知，斑蝥转化液对SMC-7211细胞具有抑制作用，一定剂量时，抑制率 随着作用时间的延长而上升，一定时间下，抑制率随着药物浓度的上升而上升，呈明显的剂 量-时间依赖性。经SPSS 22.0处理得出斑蝥转化液对SMC-7211细胞的24h、48h、74h的IC50依 次为：289 · 30yg/mL(置信区间为（260.54-336 · 36yg/mL)); 207 · 45yg/mL(置信区间为 (189 · 78-228 · 95yg/mL)); 119 · 60yg/mL(置信区间为（105 · 54-131 · 40yg/mL))。
[0176] (5)细胞形态观察
[0177] 从细胞抑制率来看，药物对细胞48h的抑制率A549>QGY-7701>HepG-2>SMC-7211> Hela，选择抑制率前三种的细胞进行镜下的细胞形态观察，即药物对肝癌QGY-7701、A549、 H印G-2细胞48h作用后的细胞形态观察。
[0178] QGY-7701、A549、HepG-2空白对照组，肿瘤细胞贴壁生长，排列紧密，多边形呈现， 经药物作用后肿瘤细胞皱缩变圆或死亡，镜下观察细胞量也少于空白组的细胞贴壁不良而 漂浮在上面，有碎片状，随着给药浓度越高，细胞死亡皱缩漂浮的越多，这些现象表明斑蝥 转化液作用于细胞后能明显抑制肿瘤细胞的生长。从图中也可以看出随着药物浓度的增 加，A549细胞出现更加明显的细胞量减少，肿瘤细胞皱缩变圆死亡的现象，由镜下观察的图 片也可知斑蝥转化液对A549细胞的抑制作用较其他细胞明显，抑制作用更强。
[0179] 本实施例考察了斑蝥转化液对多种肿瘤细胞株的时效和量效，即采用CCK-8法检 测不同剂量、作用不同时间对癌细胞的敏感性，来初步探讨对肿瘤的抑制作用。体外实验作 为抗肿瘤药物的初筛，是在体实验的基础。
[0180] 从实验的结果可知，不同的斑蝥转化液浓度对不同的细胞株在不同的作用时间均 有抑制作用，且呈现明显的时间和剂量依赖性。
[0181] 在实验室前期的课题实验中，对转化前后成分研究表明，斑蝥经光合细菌转化过 程中的总斑蝥素含量在下降，经工艺优化后的斑蝥转化液的体外对多种细胞的抗肿瘤实验 提示斑蝥转化液的抗肿瘤作用增强，这一结果提示转化后可能产生抗肿瘤效果优于斑蝥素 的新化学成分。
[0182] 实施例5斑蝥转化液对移植性肝癌H22的作用
[0183] 1.菌种与动物
[0184] 瘤株:小鼠腹水型肝癌细胞株H22，由广东药学院基础教研室惠赠。
[0185] 动物：昆明小鼠，雌雄各半，体重(20 ± 2)g，购自广州中医药大学实验中心，合格证 号:SCXK(苏)2008-0010。
[0186] 2.主要材料与仪器(略）
[0187] 3方法与结果
[0188] (1)小鼠肝癌模型建立
[0189]首先常规进行H22肿瘤细胞株的复苏和传代，共进行三次传代。调整细胞数1.0 X 10%L，肿瘤的细胞活力在95%，按每鼠0.2mL接种于小鼠右腋皮下，制备成实体瘤动物模 型;另以每鼠〇. 2mL接种于小鼠腹腔，制备成腹水瘤动物模型。
[0190] (2)实验分组和给药
[0191]①斑蝥转化液给药剂量的换算
[0?92] 经预实验，设定斑蜜转化液的给药剂量为100mg/kg，200mg/kg，300mg/kg。昆明鼠 的灌胃容量为〇. 2mL/1 Og，因此低中高组的斑蜜转化液的浓度为5mg/mL，I Omg/mL，15mg/mL。
[0193] ②斑蝥水提液给药剂量
[0194] 斑蝥水提液的给药剂量为斑蝥转化液的低剂量100mg/kg，即浓度为5mg/mL。
[0195] ③5-Fu配置方法
[0?96] 每天5_Fu的给药剂量为15mg/kg，加入生理盐水配成0.75mg/mL，备用。
[0197] ④实验分组
[0198] 接种24h后随机设计分组，分为6组，每组10只。即空白对照组、荷瘤模型组、阳性对 照组（5-Fu组）、斑蝥转化液低剂量组(BMDX低剂量组）、斑蝥转化液中剂量组(BMDX中剂量 组)和斑蝥转化液高剂量组(BMDX高剂量组），。
[0199] ⑤给药处理
[0200]昆明鼠喂养于广东药学院动物中心。自接种肿瘤细胞24h后，开始灌胃和腹腔注 射，每天1次，连续10天。
[0201] 正常组、模型组均以0.9%NaCl溶液灌胃0.4ml/20g/d; 5-Fu组予5-Fu溶液腹腔注 射15mg/kg/d;第四组到第六组分别给与低、中、高不同剂量斑蝥转化液灌胃，按0.2mL/10g/ d进行。
[0202] (3)腹水瘤观察指标及检测方法
[0203]①一般状况的观察
[0204]实验过程中观测昆明鼠精神状态情况、自主活动情况、饮食情况、粪便情况、体型 外观情况、出现腹水的时间及毛发情况等。
[0205]②腹水量的测定
[0206]在第十天用药结束24h后处死小鼠，抽取腹水并测量腹水量。
[0207]③各组小鼠生存期的观察
[0208] 给药IOd后，停止给药，至20d止，记录，Kap Ian-Meier法绘制生存期曲线。
[0209] (4)实体瘤观察指标及检测方法
[0210]①一般状况的观察
[0211] 实验过程中观测昆明鼠精神状态情况、自主活动情况、饮食情况、粪便情况、体型 外观情况及毛发情况等。
[0212] ②肿瘤重量测定
[0213]称动物重量，处死，打开腋下，剥离瘤体，称重，记录。
[0214] ③胸腺系数和脾脏系数
[0215] 在实验给药结束后，处死小鼠，取出胸腺和脾，计算脾指数和胸腺指数。
[0216] (5)腹水瘤各指标结果
[0217]①一般状况的观察
[0218] 较模型组，阳性对照组(5-Fu组）、BMDX低、中剂量组均使得小鼠的精神状态情况有 所提高，其中5-Fu组小鼠的状况较好，随着斑蝥转化液的剂量的升高，BMDX高剂量组的小鼠 状态欠佳，出现了小鼠死亡的现象。
[0219] ②腹水量的测定见表16
[0220] 表16各组小鼠腹水量的观察(n = 10，? 土 d
L〇222」 注：与模型组比较*P〈0 · 05、#P〈0 · 01
[0223] 较模型组，5-Fu组在实验给药过程中没有出现有腹水的现象，即对腹水瘤的治疗 效果好；
[0224] 斑蝥水提液组的小鼠产生的腹水量比模型组的还要多，即对小鼠的腹水量无改善 作用；
[0225] 经过代谢后的斑蝥转化液低、中、高剂量组对小鼠的腹水瘤的治疗效果随着药物 浓度的增加，治疗效果也有所提高，但是效果不佳。
[0226] ③各组小鼠生存期的观察见表17
[0227] 表17小鼠的平均寿命
[0229]注：与模型组比较 *P〈0 · 05 ;#P〈0 · 01
[0230] 5-Fu组的小鼠在给药后小鼠在20d中止实验时小鼠未出现小鼠的死亡现象，较模 型组，5-Fu药物延长了小鼠的寿命。
[0231] 斑蝥转化液低、中剂量组较模型组，均延长了小鼠的生存时间，和模型组相比具有 非常显著性差异(林P〈〇.01);高剂量组的小鼠在给药时间还未达到IOd时，出现了小鼠死亡 的现象。
[0232] (6)实体瘤各指标结果
[0233] ①一般状况的观察(略）
[0234] ②肿瘤重量测定结果见表18.
[0235] 表18各组小鼠抑瘤率的观察(n = 10，i h)
[0237] 注：与模型组比较 *P〈〇 · 05 ;#P〈0 · 01
[0238] 与模型组比较:斑蝥水提液、斑蝥转化液低、中、高剂量组对肿瘤有非常明显的抑 制作用(**P〈〇. 01)，但抑瘤效果不如5-Fu组。
[0239] ③胸腺系数和脾脏系数结果见表19
[0240] 表19各组小鼠胸腺和脾系数的测定(n = 10，〕i λ' )

[0243] 注：与模型组相比：#P〈〇 · 01、*P〈〇 · 05;与阳性组对比：##P〈0 · 01、#P〈0 · 05
[0244] 与斑蝥水提液相比:aaPW · 01、ΛΡ〈0 · 05
[0245] 与模型组相比，BMDX中剂量组的脾系数与模型组有非常显著性差异(#Ρ〈0.01)， 其胸腺系数与模型组相比也具有显著性差异(*Ρ〈〇. 05)。
[0246] 与5-Fu组对比，BMDX低剂量组、中剂量组的胸腺和脾系数均与其有非常显著性差 异(##Ρ〈0·01)。
[0247] 与斑蝥水提液相比，BMDX低剂量组、中剂量组的胸腺和脾系数均与其有非常显著 性差异(aaPW. 01)。
[0248] 在本实验研究中可知，斑蝥水提液与斑蝥转化液相同剂量对腹水的治疗效果与模 型模型组比具有非常显著的差异(**Ρ〈〇.01)，转化液随着药物浓度的增加，治疗效果反而 下降。
[0249] 与对照组相比，斑蝥转化液低剂量组、中剂量组均延长Η22腹水瘤小鼠的生存期， 提高了寿命时间，差异具有非常显著的意义。
[0250] 斑蝥转化液抑瘤率为18.11 %、25.98%、37.01 %，斑蝥水提液抑瘤率为26.7%、对 小鼠的Η22肿瘤具有抑制作用，较模型组有非常显著性的提高(Ρ〈0.01)，阳性药抑瘤率优于 斑蝥。而阳性药与斑蝥水提液对免疫功能的作用没有意义，斑蝥转化液却能非常显著增强 小鼠的免疫功能，从而能很好地发挥抗肿瘤作用。
[0251 ]实施例6斑蝥转化液对移植性肺癌Lewis的作用
[0252] 1.菌种与动物
[0253] 瘤株:小鼠肺癌细胞株Lewis，购自中国科学院细胞库。
[0254] 动物:C57小鼠，雌雄各半，6-8周龄，体重（18 ± 2)g，购自广东省动物中心，合格证 号：SCXK(粵）2015-0020。
[0255] 2.主要材料与仪器同上。
[0256] 3.方法与结果
[0257] (I)Lewis小鼠肺癌模型建立
[0258] 首先常规进行Lewis肿瘤细胞株的复苏和传代。将准备好的细胞液按每鼠 0.2mL接 种于小鼠右腋皮下，制备成实体瘤动物模型。
[0259] (2)实验分组和给药
[0260] 该步骤的操作方法同实施例5中肝癌的实验分组和给药方法。
[0261 ] (3)实体瘤观察指标及检测方法
[0262] ①一般状况的观察:精神状态情况、自主活动情况、饮食情况、粪便情况、体型外观 情况、体重检测及毛发情况等。
[0263] 体重增长率=((给药后体重一给药前体重)/给药前体重〕X 100%。
[0264] ②肿瘤重量测定。
[0265] ③胸腺系数和脾脏系数的测定:给药结束后，处死小鼠，取出胸腺和脾，计算脾指 数和胸腺指数。
[0266] (4)实体瘤各指标结果见表20:
[0267]表20各组小鼠胸腺、脾指标的测定(n = 10，X 土 i>)
[0270] 注：与模型组相比：#P〈0 · 01、*P〈0 · 05;与阳性组对比：##P〈0 · 01、#P〈0 · 05;与斑蝥 水提液组相比:^?〈〇.〇1、Λρ〈0.05
[0271] ①一般状况的观察
[0272] 与模型组相比，给药组的小鼠的体重增加率均有所减少;与5-Fu组相比，斑蝥水提 液与斑蝥转化液的体重增加率非常显著提高( ##P〈〇. 01);与斑蝥水提液相比，斑蝥转化液的 体重增加率非常显著提高(MP〈〇.01);斑蝥转化液组的小鼠随着小鼠给药剂量的增加，小 鼠的体重增加率逐渐降低。
[0273] ②肿瘤重量测定
[0274] 阳性药物5-Fu对肿瘤的抑制率大，斑蝥转化液抑制率随着给药剂量的增加，抑制 率增强，与斑蝥水提液组小鼠相比，具有非常显著差异性(Mp〈o. 01)。
[0275] 斑蝥转化液低、中、高剂量抑瘤率依次为21.47%、27.72%、33.39%，中、高剂量组 的小鼠对肿瘤的抑制率优于斑蝥水提液的25.33%，具有非常显著性的提高(P〈0.01)，阳性 药抑瘤率49.29%。
[0276] ③胸腺系数和脾脏系数
[0277] 与阳性药物5-Fu组对比，斑蝥水提液、BMDX低剂量组、中剂量组、高剂量组的胸腺 和脾系数均与其有非常显著性差异(##p〈0.01);与斑蝥水提液相比，斑蝥转化液对小鼠的脾 脏系数、胸腺系数均有非常显著性增加(M〈0.01)。
[0278] 综上结果表明：阳性药局部治疗肿瘤的效果好，但是对机体整体作用不佳;斑蝥转 化液治疗实体肿瘤的优势在于能非常显著地调节并增强机体免疫功能。胸腺和脾是重要的 免疫器官，胸腺系数在一定程度上反应了机体免疫细胞的数量和功能，脾系数也一定程度 反映了机体的免疫功能，机体免疫功能失调常导致肿瘤的发生，免疫功能受抑制导致肿瘤 细胞持续增生。在本实验中的实体瘤模型，小鼠的胸腺，脾系数较阳性药物5-Fu、斑蝥水提 液均有非常显著性增加，因此斑蝥转化液药物可能通过调节并增强免疫功能来发挥抗肿瘤 作用。
【主权项】
1. 光合细菌在斑蝥抗癌功效中的减毒增效的应用，所述光合细菌为紫色非硫菌群红细 菌属的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides) 〇2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，光合细菌在具有抗肺癌、肝癌、子宫癌功效的 斑蝥转化液中的应用。3. 根据权利要求2所述应用，其特征在于，光合细菌在肝癌细胞株HepG-2、BEL-7402、 SMCC-7211、QGY-7701中的应用；光合细菌在肺癌细胞株A549中的应用;光合细菌在子宫癌 细胞株Hela中的应用。4. 一种具有抗癌功效的斑蝥转化液的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括 如下步骤： S1:用提取液提取斑蝥粉得斑蝥提取液； S2:浓缩提取液并接种权利要求1所述光合细菌，然后加入PSB培养基进行生物转化； S3:生物转化结束后除去光合细菌菌体即得斑蝥转化液。5. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述光合细菌为处于对数期的光合细 菌，所述光合细菌的接种量为7~10%。6. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的生物转化的时间为8~ 12天。7. 根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S1中所述斑蝥提取液的质量浓度为 7~10mg/mL〇8. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1中的提取液为水;步骤S2中浓缩提取 液的体积至转化液总体积的5~8%;所述转化液体系的pH为6~9。9. 权利要求4~8所述方法制备得到的斑蝥转化液。10. -种具有抗癌功效的斑蝥生物制剂，其特征在于，所述斑蝥生物制剂含有权利要求 9所述的斑蝥转化液。
【文档编号】A61K35/64GK106074613SQ201610397313
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日 公开号201610397313.4, CN 106074613 A, CN 106074613A, CN 201610397313, CN-A-106074613, CN106074613 A, CN106074613A, CN201610397313, CN201610397313.4
【发明人】赵越
【申请人】赵越