一种治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法及应用
【专利摘要】本发明涉及治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法及应用，可有效解决肾虚的治疗用药问题，将黄秋葵果清洗除杂后，切碎，用乙醇回流提取，提取液浓缩得黄秋葵总浸膏，黄秋葵总浸膏用水分散，分散液用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，合并萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位；收集乙酸乙酯部位和水溶性部位，混合得治疗肾虚的黄秋葵提取物；本发明生产工艺简单，节能环保，生产成本低，易于工业化生产，具有改善肾阳虚、提高免疫力的功能，疗效确切可靠，安全无副作用，对亚健康疲劳综合征人群的身体机能有显著效果，是治疗肾虚药物上的创新。
【专利说明】
一种治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药化工领域，特别是一种治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法及应 用。 技术背景
[0002] 慢性疲劳综合症(Chronic Fatigue Syndrome简称CFS)是一种长期处于高度紧 张、精神压力大、严重疲劳的状态所表现出来的全身性症候群，属于中医"虚劳"范畴，病机 多为脏腑不合、阴阳失调。在现代生活方式下以长期处于高度紧张、竞争压力大、过度疲劳 以及空气污染、环境污染等多因素共同作用下所表现出来的全身性亚健康状态。近几年的 发病率逐年上升，已成为全球社会关注的焦点之一。肾虚证是中医临床上常见并重要的证 候之一;主要表现为生殖机能低下和全身功能衰退。肾阳虚证的目前我国人群中发病率呈 明显上升趋势，影响了人们的身体健康和生活质量，从药食两用天然植物中探讨、研制改善 亚健康状态，缓解和治疗肾阳虚证人群的保健食品具有重要意义。
[0003]黄秋葵esct/_/e/3it/s (L·) Moench]，为锦葵科Malvaceae秋葵属 仙-年生草本植物，又名补肾草、秋葵和羊角豆等，英文名Okra。黄秋葵全草皆可 入药，其性寒味甘滑，入心、肺、肾、胃、肝及膀胱经。目前国内外对黄秋葵的研究逐年增加， 所涉及领域也越来越广，但是研究方向主要集中在农业种植、食品营养和化学成分研究方 面，关于黄秋葵抗疲劳、增强体力方面的已有专利申请和文献报道，但都是针对黄秋葵果实 整体对人体机能的调节作用，为提高黄秋葵对肾阳虚人群的机体功能改善强度，节约资源， 提高资源整体利用率，但对黄秋葵果进行提取，并明确其中乙酸乙酯部位和水部位是改善 肾功能、提高免疫力的有效物质群，却未见公开报道。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种治疗肾虚的 黄秋葵提取物的制备方法及应用，可有效解决肾虚的治疗用药问题。
[0005] 本发明的技术方案是:将黄秋葵果清洗除杂后，切碎，每次用药材重量的6~10倍的 质量浓度50~95%的乙醇回流提取3次，每次提取1~3h，过滤合并提取液，浓缩得黄秋葵总浸 霄；用黄秋葵总浸霄重量1~2倍的水进行分散，得分散液，再用分散液1~2倍体积的沸程60 ~90 °C的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂萃取3~5次，合并萃取液，浓 缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及 正丁醇萃取后余下的水溶性部位;收集乙酸乙酯部位和水溶性部位，混合得治疗肾虚的黄 秋葵提取物;所述的黄秋葵果为黄秋葵嫩果或黄秋葵成熟果实去除种子之后的干燥果荚。
[0006] 所述方法制备的黄秋葵提取物在制备治疗肾虚药物中的应用。
[0007] 所述方法制备的黄秋葵提取物在制备肾虚保健食品中的应用。
[0008] 所述方法制备的黄秋葵提取物在制备改善亚健康药物、食品和保健品中的应用。
[0009] 制备的黄秋葵提取物低温干燥成粉，制粒，即可作为原料用于胶囊、软胶囊、滴丸 等制剂。
[0010]本发明生产工艺简单，节能环保，生产成本低，易于工业化生产，具有改善肾阳虚、 提高免疫力的功能，疗效确切可靠，安全无副作用，对亚健康疲劳综合征人群的身体机能有 显著效果，是治疗肾虚药物上的创新，经济和社会效益巨大。
【具体实施方式】
[0011]以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0012]本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
[0013] 实施例1 本发明治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法，将30g黄秋葵嫩果清洗除杂后，切碎晾 干，依次用药材重量的I 〇倍、8倍、6倍量的质量浓度50%的乙醇回流提取3次，每次提取3h，过 滤合并提取液，浓缩得黄秋葵总浸膏1200g;用黄秋葵总浸膏重量2倍的水进行分散，得分散 液，再用分散液2倍体积的沸程60°C的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂 萃取3次，合并萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取的石油醚部位100g、乙酸 乙酯部位290g、正丁醇部位110g，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位670g;收集乙酸乙酯 部位和水溶性部位，混合得治疗肾虚的黄秋葵提取物。
[0014] 实施例2 本发明治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法，将黄秋葵干燥果荚4.7kg清洗除杂后，切 碎，依次用药材重量的8倍、7倍、6倍量的质量浓度95%的乙醇回流提取3次，每次提取2h，过 滤合并提取液，浓缩得黄秋葵总浸膏；用黄秋葵总浸膏重量1倍的水进行分散，得分散液，再 用分散液等体积的沸程90°C的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂萃取5 次，合并萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取的石油醚部位42.4g、乙酸乙酯 部位35g、正丁醇部位51g，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位161g;收集乙酸乙酯部位和 水溶性部位，混合得治疗肾虚的黄秋葵提取物。
[0015] 实施例3 本发明治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法，将黄秋葵嫩果清洗除杂后，切碎晾干，依 次用药材重量的9倍、8倍、6倍量的质量浓度85%的乙醇回流提取3次，每次提取Ih，过滤合并 提取液，浓缩得黄秋葵总浸膏；用黄秋葵总浸膏重量1.5倍的水进行分散，得分散液，再用分 散液1.5倍体积的沸程80°C的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种溶剂萃取4 次，合并萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取的石油醚部位、乙酸乙酯部位、 正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位;收集乙酸乙酯部位和水溶性部位，混合 得治疗肾虚的黄秋葵提取物。
[0016] 本发明所述方法，经多次反复实验均取得了相同的效果，相关实验资料如下： 1.肾阳虚模型动物的建立 将50只小鼠，分为四个不同的剂量组和一个空白对照组，每组8只。对于四个剂量组，分 别按照小鼠体重25 mg/kg，16.7 mg/kg，12.5 mg/kg和8.3 mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注 射氢化可的松。对于空白组，则腹腔注射适量的生理盐水。连续注射7天，观察各组小鼠的身 体状况和死亡情况。
[0017] 1.1阳虚模型的判定标准 一般情况的观察各组动物在造模阶段、给药阶段均需观察小鼠，根据畏寒喜暖1分、饮 食减少1分、活动减少1分、反应迟钝1分、拱背蜷缩1分、体毛枯疏1分、阴囊皱缩或(及)睾丸 回升1分、肛周污染1分、死亡扣2分，给各组小鼠打分。造模完成后以至少出现5项上述指证 为判断模型成功与否的标志。体重减轻是检验模型成功与否的一个重要指标，如果动物体 重持续增长，与正常组差别不大，常提示造模失败。如果体重减轻或变化不大，都可认为造 模成功。 「00181 券1 m EtM刑的坐Il佘说池
1.2结果 观察结果如表2。 「00191 耒2小鼠碧,仆可的柃槌型诰槌结里
为了探索合适用量，在排除种间及体质等因素的差别后，曾用每日4 mg/kg和6mg/ kg两个剂量，结果发现这两剂量都太小，在10 d内无法在小白鼠体上造出典型的阳虚 模型，经过探索，每日每只20mg/kg，连续用药4~5d后小白鼠才表现出典型的阳虚症状。 但是直接应用每日每只25mg/kg的剂量进行造模，5 d之内小鼠便全部死亡，这说明用每 日每只25mg/kg的剂量制造小鼠阳虚病模仍不合适。4〃组和第2组结果不同的原因很可 能是：先行小剂量的注射之后，小白鼠的内分泌活动被逐步改变，所以当改用较大剂量 后，使不致引起机体内分泌的突然严重紊乱而死亡，而只是表现出被毛粗乱、低温的阳 虚症状；相反直接用较大剂量的氢化可的松可导致小白鼠内分泌的突然严重紊乱而死亡。 [0020] 1.3通过反复变换用药剂量进行试验发现，用河南润弘制药股份有限公司生产 的含量为5mg/ml的氢化可的松在小白鼠体上制作阳虚模型的合适剂量为每日每只腹腔 注射17mg/kg, 1周左右便可造出典型的阳虚模型。
[0021] 2.黄秋葵不同提取部位对肾阳虚模型小鼠的药效学评价 2.1小鼠分组 将84只雄性昆明小鼠适应性喂养7天后，根据体重大小编号，通过随机数字表采用区组 随机的方法进行分组，以保证各组小鼠实验前体重均衡。将小鼠分为7组，每组12只，分别 为：1.肾阳虚模型组（简称模型组）、2.、正常对照组(简称正常组）、3.粗多糖组、4.黄秋 葵水部位组(简称水部位A组）、5.黄秋葵乙酸乙酯组(简称乙酸乙酯组）、6.黄秋葵水部位 组+黄秋葵乙酸乙酯组(7KA+乙A组）、7.黄秋葵正丁醇部位组(简称正丁醇组）。
[0022] 2.2给药方法及药量
2.3力竭游泳实验
在开始试验前，为减少实验误差各组小鼠于实验前3天各适应性游泳30min，把水擦干 后放回笼子中，正常饮食。第2天负重游泳，按照小鼠的体重，在小鼠尾根部负荷体重6%的 铅丝，放入50 cmX 40 cmX 40 cm水箱游泳，水温26±2 °C。参照MCARDLE推荐的力竭判断标 准，即小鼠头部沉入水中，经10 s仍不能返回水面视为力竭。记录游泳开始时间至力竭的时 间作为小鼠游泳时间。
[0023]小鼠肾虚模型建立成功的末次腹腔注射2 h后，和最后一次灌胃2 h后，称量体重， 分别对小鼠进行力竭游泳实验。记录游泳开始时间至力竭的时间作为小鼠游泳时间。
[0024] 3观测指标与方法 3.1动物的表征： 每日腹腔注射或灌胃前，观察小鼠一般指征，每日记录每只小鼠体重(g )、饮食、活动、 毛色等体征变化。
[0025] 3.2测量血清肌肝(Scr)、尿素氮(BUN)的含量。
[0026] 小鼠末次灌胃后，次日对小鼠进行眼眶取血。取出的血液，在离心机中4 °C 3500rPm离心15分钟后取血清，一20°C保存待测。
[0027] 血清肌肝测定采用苦味酸法和尿素氮测定采用脲酶法，均参照试剂盒说明书操 作，测定血清肌酐含量和尿素氮含量。
[0028] 3.3肾脏、睾丸及脾脏指数检测 给药治疗4周后，称体重，眼球取血后处死，迅速取出脾脏、双侧肾脏和双侧睾丸，置于 冰生理盐水中洗净血液，用滤纸吸干，称重后，计算脾指数、肾指数及睾丸指数(脏器指数= 脏器重量/体重X1000)，并把肾脏及睾丸迅速用4%的甲醛固定24小时，-20°C保存肾脏和睾 丸待用。组织苏木精一伊红染色步骤同上常规脱水、透明、包埋，石蜡包埋，HE染色，在光学 显微镜下观察其病理组织学改变。
[0029] 4统计方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，所有小鼠体重和脏器系数数据用均数土标准 差(X土S)表示. 数据资料进行多样本资料均数两两比较(SNK法和Dunnett法)的方差分析. 5实验结果 5.1黄秋葵提取物不同部位对小鼠体重的影响 实验前用电子天平称量小鼠体重(Ml);肾虚模型建立成功后再次称量小鼠体重(M2); 灌胃4周后第三次称量小鼠体重(M3)。结果如表1所示：四个部位组和模型组小鼠肾虚模型 建立成功后(M2)与实验前(Ml)相比较体重无显著性差异(P>0.05);由此可以说明氢化可的 松阻碍了小鼠体重的增加。灌胃治疗以后(M3)与模型成功后(M2)相比较，除了正丁醇部位 组外，其他三组小鼠体重有明显的升高(P〈〇. 05)，其中黄秋葵提取物水A+乙A部位组增加尤 为明显。
[0030] 表4黄秋葵各个部位对小鼠体重的影响(X土S)
Mi为实验前小鼠体重;M2为肾虚模型建立成功后小鼠体重;M3为最后一次灌胃后小鼠体 重。
[0031] 5.2黄秋葵提取物不同部位对小鼠力竭游泳时间的影响 灌胃给药15天后进行小鼠力竭游泳实验，结果如表2所示:各组模型建立成功后(t2)与 实验前(tl)相比较，小鼠力竭游泳时间明显缩短，具有统计学意义(P〈0.05);各组灌胃治疗 后与造模成功时相比，除了石油醚部位组外，其他三组小鼠的游泳时间明显延长，具有统计 学意义(P〈〇.05);模型组小鼠游泳时间增加不明显。说明黄秋葵除了石油醚部位组外，其他 三组对于小鼠力竭游泳时间有延长作用，其中以黄秋葵提取物水A+乙A部位组较为明显。 [0032]表5黄秋葵各个部位对小鼠力竭游泳时间的影响(X土S)
为实验前小鼠力竭游泳时间；t2为肾虚模型建立成功后小鼠游泳时间；t3为最后一次 灌胃后小鼠游泳时间。
[0033] 5.3黄秋葵提取物不同部位对小鼠血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)的影响 最后力竭游泳实验之后，次日对小鼠眼眶取血，测定小鼠的BUN和SCr水平，结果如表3。 与正常组比较，模型对照组BUN水平显著升高(P < 0.05)，SCr也呈现升高趋势。与模型对 照组比较，黄秋葵水部位和乙酸乙酯组BUN和SCr水平明显降低(P < 0.05)，其余各组有 升高BUN和SCr水平趋势。由此说明黄秋葵水部位组和乙酸乙酯组对于小鼠的血清尿素氮 和血清肌酐有降低作用，其中以水A+乙A部位组最为明显。
[0034] 表6黄秋葵各个部位对小鼠 BUN及SCr的影响(X±S)
5.4黄秋葵五组对小鼠脏器系数的影响 与正常对照组比较，模型对照组脾脏肿大，肾脏明显水肿，睾丸明显萎缩;结果如表4: 与阳性对照组相比，黄秋葵多糖组的脾脏系数无明显差异;与模型对照组比较，除了多糖组 之外，其他四组都具有改善肾阳虚小鼠肾功能，其中以黄秋葵水A+乙A部位组脾脏系数明显 降低，睾丸显著升高，肾脏系数明显降低(P〈 0.01)，效果最为明显。
[0035] 表7黄秋葵五组对小鼠双侧肾脏和双侧睾丸指数的影响(X±S)
5.5黄秋葵五组对小鼠肾脏及睪丸的组织学改变的影响 5.5.1小鼠肾组织的病理变化： 在光镜下可见，模型组小鼠肾脏体积明显增大、肿胀;镜检可见肾小管上皮细胞变性、 坏死，细胞脱落，肾小管管腔变窄，肾间质水肿、充血伴明显的炎性细胞浸润。与模型组相 比:黄秋葵乙酸乙酯B组病理变化有所减轻，但仍存在较多的肾小管上皮细胞变性、坏死，肾 间质水肿、充血现象;黄秋葵水部位B组肾病变明显减轻，肾小管及间质结构基本正常;其中 以黄秋葵水A+乙A部位组效果最为明显。
[0036] 5.5.2小鼠睾丸组织的病理变化： 在光镜下可见，阳性对照组小鼠睾丸管腔基本异常，间质无特殊。壁各级生精细胞略 有脱落现象。模型组小鼠睾丸萎缩，镜检可见曲细精管退化变性，生精细胞脱落现象严重。 与模型组相比：黄秋葵乙酸乙酯B组病理变化有所减轻，但仍存在较多的生精细胞脱落现 象;黄秋葵水部位B组睾丸病变明显减轻，生精细胞脱落现象较少;其中以黄秋葵水A+乙A 部位组效果最为明显。
[0037] 6实验结论 从实验结果可以看出，与模型组相比，黄秋葵醇提物水A+乙A部位组对小鼠氢化可的松 诱导的肾阳虚引起的体重下降、游泳时间缩短、脾脏肿大、肾脏水肿、睾丸萎缩以及血清尿 素氮水平和血清肌酐水平降低等抑制作用最为明显;小鼠肾脏和睾丸病理切片显示黄秋葵 醇提物水A+乙A部位组对小鼠氢化可的松诱导的肾阳虚引起的肾病理改变和睾丸病理改病 变有明显的改善。
[0038]本实验的结果表明黄秋葵醇提物中水A+乙A部位组所包含有效部位物质群对肾阳 虚小鼠的保护作用效果明显。
[0039]本发明生产工艺简单，节能环保，生产成本低，易于工业化生产，具有改善肾阳虚、 提高免疫力的功能，疗效确切可靠，安全无副作用，对亚健康疲劳综合征人群的身体机能有 显著效果，是治疗肾虚药物上的创新，经济和社会效益巨大。
【主权项】
1. 一种治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法，其特征在于，将黄秋葵果清洗除杂后，切 碎，每次用药材重量的6~10倍的质量浓度50~95%的乙醇回流提取3次，每次提取1~3h，过滤 合并提取液，浓缩得黄秋葵总浸膏；用黄秋葵总浸膏重量1~2倍的水进行分散，得分散液， 再用分散液1~2倍体积的沸程60~90°C的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取分散液，每种 溶剂萃取3~5次，合并萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取的石油醚部位、 乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位;收集乙酸乙酯部位和水 溶性部位，混合得治疗肾虚的黄秋葵提取物； 所述的黄秋葵果为黄秋葵嫩果或黄秋葵成熟果实去除种子之后的干燥果荚。2. 根据权利要求1所述的治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法，其特征在于，将黄秋葵 嫩果清洗除杂后，切碎晾干，依次用药材重量的10倍、8倍、6倍量的质量浓度50%的乙醇回流 提取3次，每次提取3h，过滤合并提取液，浓缩得黄秋葵总浸膏；用黄秋葵总浸膏重量2倍的 水进行分散，得分散液，再用分散液2倍体积的沸程60°C的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃 取分散液，每种溶剂萃取3次，合并萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取的石 油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位;收集乙酸乙 酯部位和水溶性部位，混合得治疗肾虚的黄秋葵提取物。3. 根据权利要求1所述的治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法，其特征在于，将黄秋葵 干燥果荚清洗除杂后，切碎，依次用药材重量的8倍、7倍、6倍量的质量浓度95%的乙醇回流 提取3次，每次提取2h，过滤合并提取液，浓缩得黄秋葵总浸膏；用黄秋葵总浸膏重量1倍的 水进行分散，得分散液，再用分散液等体积的沸程90°C的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃 取分散液，每种溶剂萃取5次，合并萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取的石 油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位;收集乙酸乙 酯部位和水溶性部位，混合得治疗肾虚的黄秋葵提取物。4. 根据权利要求1所述的治疗肾虚的黄秋葵提取物的制备方法，其特征在于，将黄秋葵 嫩果清洗除杂后，切碎晾干，依次用药材重量的9倍、8倍、6倍量的质量浓度85%的乙醇回流 提取3次，每次提取lh，过滤合并提取液，浓缩得黄秋葵总浸膏；用黄秋葵总浸膏重量1.5倍 的水进行分散，得分散液，再用分散液1.5倍体积的沸程80°C的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依 次萃取分散液，每种溶剂萃取4次，合并萃取液，浓缩回收溶剂，分别得到黄秋葵总浸膏萃取 的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，以及正丁醇萃取后余下的水溶性部位;收集乙 酸乙酯部位和水溶性部位，混合得治疗肾虚的黄秋葵提取物。5. 权利要求1或2-4任一项所述方法制备的黄秋葵提取物在制备治疗肾虚药物中的应 用。6. 权利要求1或2-4任一项所述方法制备的黄秋葵提取物在制备肾虚保健食品中的应 用。7. 权利要求1或2-4任一项所述方法制备的黄秋葵提取物在制备改善亚健康药物、食品 和保健品中的应用。
【文档编号】A61P13/12GK106074637SQ201610690110
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月19日 公开号201610690110.4, CN 106074637 A, CN 106074637A, CN 201610690110, CN-A-106074637, CN106074637 A, CN106074637A, CN201610690110, CN201610690110.4
【发明人】贾陆, 王晓燕, 王雯雯, 贾奥, 贾贝西, 郭勇
【申请人】贾陆