一种脂质体制剂及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种脂质体制剂及其制备与应用，具体涉及脂质体?二甲双胍?二氢卟吩e6及其制备与应用，尤其是其在肿瘤光动力治疗和放疗中的应用。本发明提供的脂质体制剂(脂质体?二甲双胍?二氢卟吩e6制剂)由脂质体，二甲双胍，二氢卟吩e6组成，粒径均一，在水中分散良好，在水中粒径主要集中在110nm左右，可以同时装载光敏分子以及二甲双胍，是理想的药物载体，具有良好的稳定性。实验表明本发明所述脂质体?二甲双胍?二氢卟吩e6制剂能够在肿瘤的部位具有很高的富集，对降低肿瘤细胞耗氧量有持续作用，能明显的改善肿瘤部位的乏氧状况，产生良好的光动力治疗以及放射治疗效果。
【专利说明】
一种脂质体制剂及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，涉及一种脂质体制剂及其制备与应用，具体涉及 脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6及其制备与应用，尤其是其在肿瘤光动力治疗和放疗中的应 用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生 物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。根据新生 物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症 即为恶性肿瘤的总称。与良性肿瘤相比，恶性肿瘤生长速度快，呈浸润性生长，易发生出血、 坏死、溃疡等，并常有远处转移，造成人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器 功能受损等，最终造成患者死亡。由于人口老龄化等原因，当前我国癌症发病率、死亡率呈 持续增长趋势。世界癌症报告估计，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病人 数的五分之一;癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。今后20年，我 国癌症的发病数和死亡数还将持续上升:根据国际癌症研究署预测，如不采取有效措施，我 国癌症发病数和死亡数到2020年将上升至400万人和300万人；2030年将上升至500万人和 350万人。
[0003] 由于恶性肿瘤生长迅速，肿瘤细胞凋亡的速度明显低于其所对应的正常组织，故 导致肿瘤对氧及其他能量物质如葡萄糖等的需求增加，而肿瘤组织内的血液供应则相对不 足。而且肿瘤体积的高速膨胀，在肿瘤中的一部分肿瘤组织由于离最近的血管的距离越来 越远故导致了肿瘤血液供应的不足，最终导致了这一部分肿瘤组织的缺氧。因此在临床上 大部分恶性肿瘤在它的生长、发展过程中都有内部的缺氧区域存在，并且这些缺氧区域最 终常常出现坏死，这些原因将进一步导致临床上治疗肿瘤的方法如放射治疗，光动力治疗 等治疗疗效受到一定的限制。因此降低肿瘤细胞消耗氧气的速率，改善肿瘤的乏氧状况将 是提高肿瘤治疗效果最重要的手段之一。
[0004] 二甲双胍(metformin，Met)(式1)广泛应用于Π 型糖尿病、肥胖症和多囊卵巢综合 症的治疗，有较好的耐受性，研究发现使用Met治疗糖尿病可以有效降低患者患癌的风险。 有报道表明二甲双胍可以通过降低肿瘤细胞消耗氧气的速率从而有效改善肿瘤的乏氧状 况。通过这一途径也可大大提高放射治疗对恶性肿瘤的治疗效果。然而现在已经使用的二 甲双胍改善肿瘤乏氧并且提高放射治疗的途径是通过腹腔注射二甲双胍溶液，这种方法通 常作用时效短，注射剂量大，改善肿瘤乏氧状况效率有限。
[0005]
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种脂质体制剂及其制备方法与应 用。本发明提供的脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6的脂质体制剂具有良好改善肿瘤乏氧的效 果，能够产生良好的光动力治疗以及放射治疗效果。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
[0008] -种脂质体制剂即脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂，由脂质体，二甲双胍，二氢 卟吩e6组成。
[0009] 本发明所述脂质体制剂中的二甲双胍包裹于脂质体中心的亲水区，疏水的二氢卟 吩e6装载在脂质体的疏水区域。
[0010] 本发明所述脂质体制剂可以有效的在肿瘤部位富集并缓慢释放二甲双胍，从而在 较低的注射剂量下达到长时并且有效改善肿瘤的乏氧状况的目的。此外，光敏分子二氢卟 吩e6(式2)的存在使得所述脂质体制剂可以有效地应用于光动力治疗中。因此，这种脂质 体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂可以有效应用于提高肿瘤的光动力治疗以及放射治疗疗效 中。
[0011
[0012] 按照本发明，在一些实施方案中，所述脂质体制剂中，所述脂质体由二棕榈酰磷脂 酰胆碱(DPPC)，胆固醇(CH)，磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)组成。
[0013] 在一些实施方案中，本发明所述的脂质体制剂，其粒径为100~160nm。在一些实施 例中，其粒径为100~160nm〇
[0014] 本发明还提供的脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂的制备方法，将二棕榈酰磷脂 酰胆碱(DPPC)、胆固醇(CH)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)和二氢卟吩e6溶解于三氯 甲烷溶液中，氮气吹干，加入二甲双胍溶液搅拌后进行脂质体挤膜。
[0015] 其中，所述二甲双胍溶液由二甲双胍溶于磷酸盐缓冲液中制得。
[0016] 优选的，所述二甲双胍溶液中二甲双胍的浓度为10mg/mL。
[0017] 在一些实施方案中，本发明所述脂质体制剂的制备方法中所述二棕榈酰磷脂酰胆 碱、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、二氢卟吩e6的摩尔比为6:0.5:4:1。
[0018] 按照本发明，在一些实施方案中，所述脂质体制剂的制备方法中制得的所述脂质 体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂得粒径为100~160nm。
[0019]实验表明，利用本发明制备的脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂，对小鼠通过尾 静脉注射，并由荧光成像技术对其进行监测。发现脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂能够 在肿瘤的部位具有很高的富集。注射24h后由于二甲双胍的缓慢释放，对降低肿瘤细胞耗氧 量有持续作用，采用光声成像以及免疫荧光染色的方法发现肿瘤部位的乏氧状况得到明显 的改善。改善后的小鼠肿瘤在放射治疗的作用下其生长速率得到有效的控制。同时，由于其 载有光动力治疗用的光敏分子二氢卟吩e6,在661nm波长激光照射下能产生单线态氧从而 破坏肿瘤细胞，该制剂还可以有效的应用于光动力治疗中。二甲双胍有效改善肿瘤的乏氧 后，光动力治疗的效果显著增强。
[0020] 因此本发明还提供了所述脂质体制剂(脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂)在制 备降低肿瘤细胞耗氧量、提高肿瘤含氧量的药物中的应用。
[0021] 进一步的，还提供了所述脂质体制剂(脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂)在制备 肿瘤光动力治疗和放疗中药物中的应用。
[0022] 与现有技术相比，本发明提供了一种脂质体制剂及其制备方法与应用。本发明提 供的脂质体制剂(脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂）由脂质体，二甲双胍，二氢卟吩e6组 成，粒径均一，在水中分散良好，在水中粒径主要集中在IlOnm左右，可以同时装载光敏分子 以及二甲双胍，是理想的药物载体，具有良好的稳定性。实验表明本发明所述脂质体-二甲 双胍-二氢卟吩e6制剂能够在肿瘤的部位具有很高的富集，对降低肿瘤细胞耗氧量有持续 作用，能明显的改善肿瘤部位的乏氧状况，产生良好的光动力治疗以及放射治疗效果。
【附图说明】
[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0024] 图1示实施例2脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂的透射电镜图；
[0025] 图2示实施例2脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂在水中的粒径分布；其中， 表示脂质体-二氢卟吩e6(Ce6-Lip〇S〇me)制剂在水中的粒径;_表示脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6(Met-Ce6_Liposome)制剂在水中的粒径；
[0026] 图3示实施例2脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂的紫外吸收效果图；其中，^表 示脂质体-二氢卟吩66(〇66-1^口0801116)制剂的紫外吸收 ;〃〃表示脂质体-二甲双胍-二氢卟 吩e6(Met-Ce6_Liposome)制剂的紫外吸收；
[0027] 图4不实施例3不同溶液经661nm的激光照射后单线态氧的含量;其中，其中，表 示二氢卟吩e6 (Free-Liposome)经66 Inm的激光照射后产生单线态氧的量;示脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6(Met-Ce6_Liposome)制剂经661nm的激光照射后产生单线态氧的量； .**^_示脂质体-二氢卟吩e6 (Ce6-Liposome)经661nm的激光照射后产生单线态氧的量; 示水(Water)经661nm的激光照射后产生单线态氧的量；示二甲双胍(Free Met)经66Inm 的激光照射后产生单线态氧的量；
[0028] 图5示实施例4小鼠注射脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂后的血液循环；
[0029] 图6示实施例4小鼠注射脂质体-二甲双胍-二氢扑吩e6制剂后，不同时间点在肿瘤 部位的富集情况；
[0030]图7不实施例4小鼠主要器官中焚光的分布；
[0031] 图8示实施例5小鼠注射脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂后，不同时间点用光声 成像测得的肿瘤部位的血氧饱和度的变化；
[0032] 图9示对图8中肿瘤部位血氧饱和度信号值的定量分析；
[0033] 图10示实施例6免疫荧光染色的方法对小鼠肿瘤部位乏氧状况改善的检测；
[0034] 图11示实施例7不同分组的小鼠肿瘤在光动力治疗后肿瘤的生长曲线；其中包括 对照组(没有进行光动力治疗）（Control)，注射二甲双胍和二氢卟吩e6 2小时后进行光动 力治疗组(Free Ce6+Met 2h);注射二甲双胍和二氢卟吩e6 24小时后进行光动力治疗组 (Free Ce6+Met 24h);注射脂质体-二氢卟吩进行光动力治疗组(Ce6_Liposome);注射脂质 体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂后进行光动力治疗组(Met-Ce6_Liposome);
[0035] 图12示不同分组的小鼠肿瘤在放射治疗后肿瘤的生长曲线；其中包括对照组(没 有进行放射治疗）（C〇ntr 〇l);只进行放射治疗组(RT);注射脂质体-二甲双胍制剂后进行放 射治疗组（Met-Ce6-Liposome+RT);
【具体实施方式】
[0036] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0037] 为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例
[0038] 实施例1、脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂的制备
[0039] 将DPPC、DSPE-PEG、CH、Ce6按照摩尔比为6:0.5:4:1的比例称取后，溶于三氯甲烷 溶液中，用氮气将三氯甲烷溶液吹干。称取二甲双胍溶于磷酸盐缓冲液中制备lOmg/mL的二 甲双胍溶液并将制备的溶液加入脂质体-二氢卟吩e6中，在65°C水浴中搅拌30分钟后，将制 备的脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂挤膜。
[0040] 实施例2、脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂的性质检测
[0041] 对实施例1制得的脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂进行定性检测，分别进行透 射电镜检测，动态光散射、紫外吸收。
[0042]其中，对透射电镜检测的结果如图1所示，结果显示，实施例1制得的脂质体-二甲 双胍-二氢卟吩e6制剂在水中呈单分散状态分布，表明本发明制得的脂质体-二甲双胍-二 氢卟吩e 6制剂的粒径均一，在水中分散良好。
[0043]对动态光散射检测的结果如图2所示，结果显示，实施例1制得的脂质体-二甲双 胍-二氢卟吩e6制剂在水中粒径主要集中在IlOnm左右。
[0044]紫外吸收检测结果如图3所示，结果显示，实施例1制得的脂质体-二甲双胍-二氢 卟吩e6制剂在232纳米处有二甲双胍的特征吸收峰，在404nm和660nm处有二氢卟吩e6的特 征吸收峰。
[0045] 实施例3、脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂的光动力活性检测
[0046] 配制脂质体-二甲双胍-二氢扑吩e6制剂水溶液，经661nm的激光照射，检测单线态 氧含量，分别设立对照组:Ce6水溶液、脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6水溶液、水、脂质体-二 氢卟吩e6水溶液、二甲双胍水溶液。结果见图4。
[0047]图4结果显示，含有光敏分子二氢卟吩e6的溶液在激光照射后皆产生了单线态氧， 可以作为光动力治疗剂。
[0048] 实施例4、脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂注射进小鼠后在小鼠的体内行为
[0049] 将脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂通过尾静脉注射到小鼠体内，在不同时间点 取小鼠血液20yL，加入细胞裂解液溶解后测荧光，根据荧光的值定量分析出脂质体-二甲双 胍-二氢卟吩e6在不同时间点在小鼠血液中的含量，结果如图5显示。
[0050] 图5结果显示脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂具有较长的血液循环时间。
[0051 ]将脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂通过尾静脉注射到小鼠体内，在小动物成像 系统(CRI)上进行在不同的时间点进行实时采集图片，观察脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6 制剂在肿瘤部位的富集量，结果见图6和图7。选用的激发光源是661nm，曝光时间是100ms。
[0052]图6和图7结果显示随着时间的推移，肿瘤区域脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂 的荧光信号逐渐增强，其在肿瘤部位的富集随时间增加。24小时后将小鼠主要器官取出后 分析器官的荧光强度，发现肿瘤部位的荧光强度明显高于其他主要器官，表明脂质体-二甲 双胍-二氢卟吩e6制剂在肿瘤部位的富集可以达到较高的水平。
[0053]实施例5、小鼠肿瘤乏氧改善的检测
[0054] 将含有相同二甲双胍浓度的二氢卟吩e6,二甲双胍水溶液通过尾静脉注射到小鼠 体内，通过光声成像检测不同时间点肿瘤含氧血红蛋白与血红蛋白在850nm和750nm处的吸 收来检测肿瘤内部乏氧状况的改善，结果见图8和图9。
[0055] 图8和图9结果显示，相比较于注射单纯的二甲双胍溶液，注射脂质体-二甲双胍制 剂的小鼠肿瘤部位的光声信号增强表明肿瘤的乏氧状况改善明显，脂质体-二甲双胍制剂 中的二甲双胍具有缓释性质因而可以长时有效的改善肿瘤的乏氧状况。
[0056] 实施例6、免疫荧光染色检测肿瘤乏氧状况的改善
[0057]将含有相同二甲双胍浓度的脂质体-二甲双胍制剂，二甲双胍水溶液通过尾静脉 注射到小鼠体内，2小时以及24小时后分别向两组小鼠腹腔注射0.Smg/只乏氧荧光探针 Hypoxyprobe?(pimonidazoIe hydrochloride)，90分钟后将小鼠肿瘤切下后冷冻切片染 色，结果见图10。
[0058]图10共聚焦显微镜的图片表明，相比较于对照组，只注射单纯二甲双胍的小鼠肿 瘤切片存在明显的乏氧区（绿色信号)表明其乏氧状况改善并不显著。相反的，注射脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂的小鼠肿瘤切片中绿色信号值明显减少表明其乏氧区明显减 少，肿瘤乏氧状况有较为可观的改善。
[0059]实施例7、肿瘤的光动力治疗
[0060]将带有乳腺癌肿瘤的小鼠分为五组，其中包括第一组对照组(没有进行光动力治 疗），第二组注射二甲双胍和二氢卟吩e6 2小时后进行光动力治疗组;第三组注射二甲双胍 和二氢卟吩e6 24小时后进行光动力治疗组;第四组注射脂质体-二氢卟吩进行光动力治疗 组;第五组注射脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂后进行光动力治疗组;对小鼠进行相应 的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见图7。
[0061]结果表明，相比较对照组，第二组和第三组的肿瘤生长没有得到抑制，第四组肿瘤 的生长得到了部分抑制，而第五组的肿瘤生长则得到了有效的抑制。表明脂质体-二甲双 胍-二氢卟吩e6制剂中二甲双胍的缓释有效改善了肿瘤的乏氧状况从而有效提高光动力治 疗效果。
[0062]实施例8、肿瘤的放射治疗
[0063] 将带有乳腺癌肿瘤的小鼠分为3组，其中包括第一组对照组(没有进行放射治疗）， 第二组只接受放射治疗组，第三组注射脂质体-二甲双胍-二氢卟吩e6制剂后进行放射治疗 组。对小鼠进行相应的治疗后，测量其肿瘤的生长，结果见图12。
[0064] 结果表明，相比较对照组，进行放射治疗后小鼠肿瘤都有一定的抑制，但是由于肿 瘤乏氧的存在，第二组小鼠的治疗效果受到一定的限制。第三组小鼠肿瘤的治疗由于肿瘤 的乏氧状况得到了明显的改善，因而其治疗效果得到了显著的提升。
【主权项】
1. 一种脂质体制剂，由脂质体，二甲双胍，二氢卟吩e6组成。2. 根据权利要求1所述的脂质体制剂，其特征在于，所述脂质体由二棕榈酰磷脂酰胆 碱，胆固醇，磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇组成。3. 根据权利要求1或2所述的脂质体制剂，其特征在于，粒径为100~160nm。4. 权利要求1-3任意一项所述脂质体制剂的制备方法，其特征在于，将二棕榈酰磷脂酰 胆碱(DPPC)、胆固醇(CH)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)和二氢卟吩e6溶解于三氯甲 烷溶液中，氮气吹干，加入二甲双胍溶液搅拌后进行脂质体挤膜。5. 根据权利要求4所述脂质体制剂的制备方法，其特征在于，所述二甲双胍溶液由二甲 双胍溶于磷酸盐缓冲液中制得。6. 根据权利要求4或5所述脂质体制剂的制备方法，其特征在于，所述二甲双胍溶液中 二甲双胍的浓度为10mg/mL。7. 根据权利要求4-6任意一项所述脂质体制剂的制备方法，其特征在于，所述二棕榈酰 磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、胆固醇、二氢卟吩e6的摩尔比为6:0.5:4:1。8. 根据权利要求4-7任意一项所述脂质体制剂的制备方法，其特征在于，粒径为100~ 160nm〇9. 权利要求1-3任意一项所述的脂质体制剂在制备降低肿瘤细胞耗氧量、提高肿瘤含 氧量的药物中的应用。10. 权利要求1-3任意一项所述的脂质体制剂在制备肿瘤光动力治疗和放疗中药物中 的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106075444SQ201610564739
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】刘庄, 宋雪娇
【申请人】苏州大学