包含枯草杆菌果胶酸裂解酶的洗涤剂组合物的制作方法

专利名称：包含枯草杆菌果胶酸裂解酶的洗涤剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种包含果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)或它的稳定化变体的洗涤剂组合物，所述的果胶酸裂解酶分离自枯草杆菌(Bacillus subtilis)菌株，优选克隆自枯草杆菌菌株；本发明还涉及存在于枯草杆菌DSM14218菌株的质粒中的DNA序列编码的果胶酸裂解酶，还提供了一种芽孢杆菌(Bacillus)表达载体和一种在芽孢杆菌宿主细胞中产生果胶酸裂解酶的方法。
背景技术：
果胶聚合物是植物细胞壁的重要组成成分。果胶是一种主链由交替的同聚半乳糖醛酸聚糖(平滑区)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(毛状区)组成的杂多糖，所述平滑区是1，4连接的α-D-半乳糖醛酸的直链聚合物。半乳糖醛酸残基可以在羧基基团上被不同程度地甲酯化，通常是以非随机方式将聚半乳糖醛酸嵌段完全甲酯化。
可以将果胶酶根据其优选底物(高度甲酯化的果胶或低甲酯化的果胶和聚半乳糖醛酸(果胶酸))以及反应机制(β-消除或水解)进行分类。果胶酶可以主要是内切作用，即在链内随机位置切割聚合物产生寡聚物混合物，或者它们可以是外切作用，从聚合物的一端进行攻击并产生单体或二聚体。酶命名法(1992)给出的酶分类中包括了几种作用于果胶平滑区的果胶酶活性，例如果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外切多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)和外切多聚α-半乳糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.82)。
WO99/27083公开了一种克隆自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的果胶酸裂解酶。WO99/27084公开了克隆自粘琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradhaerens)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodarans)和其它芽孢杆菌的果胶酸裂解酶。
已克隆了来自枯草杆菌的一种果胶酸裂解酶(Nasser等(1993)FEBS335319-326)。所述的果胶酸裂解酶需要二价阳离子以达到最大活性，钙离子是最具激活作用的。
JP2000-262292A公开了一种编码芽孢杆菌属原果胶酶的基因、一种包含所述基因的转化体和使用该转化体对纤维的精制。
US6,172,030公开了一种含有芽孢杆菌原果胶酶的洗涤剂组合物，所述的原果胶酶对原果胶和聚半乳糖醛酸底物具有7或更高的反应最适pH。
本发明的目的是提供一种在洗涤剂组合物中具有高性能的果胶酸裂解酶。
发明概述本发明人发现了一种新的具有果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)活性的多肽并在芽孢杆菌宿主中成功地克隆和表达出该果胶酸裂解酶。
相应地，本发明第一个方面涉及一种洗涤剂组合物，该组合物包含有表面活性剂和由枯草杆菌菌株的内源DNA序列编码的果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)或其稳定化变体，优选由获得自枯草杆菌DSM 14218的DNA序列编码的果胶酸裂解酶或其定点稳定化变体，例如由包含SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列编码的多肽或由包含SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列编码的果胶酸裂解酶的定点稳定化变体。
本发明第二个方面涉及用本发明所提供的洗涤剂组合物来清洁织物、碗盘或硬表面以获得优良的清洁性能的方法。
本发明第三个方面涉及本发明所提供的洗涤剂组合物在织物清洁和/或织物去污和/或织物白度保持和/或织物软化和/或织物颜色显现和/或清洁硬表面如地板、墙壁、浴室瓷砖和类似物和/或手洗和机洗碗盘和/或口腔和/或牙齿应用中的用途。
再一个方面，本发明涉及具有果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)活性的多肽，该多肽选自下列之一(a)由SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列编码的多肽；(b)通过将包含SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列的细胞在可表达该序列的条件下培养而产生的多肽；和(c)(a)或(b)的定点变体，该变体通过改变一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基为其它氨基酸残基已获得稳定化。
再一方面，本发明涉及一种包含本发明果胶酸裂解酶的酶制品、一种分离的编码本发明果胶酸裂解酶的多核苷酸分子、一种表达载体、一种能表达本发明果胶酸裂解酶的培养细胞和一种生产本发明果胶酸裂解酶的方法。
发明详述为了达到本发明的目的，本文使用的术语“获得自”或“可获得自”与一个特定的来源有关时指酶由此特定的来源产生，或由已插入此来源的基因的细胞产生或能由它们产生。
术语“野生型酶”表示一种酶，所述的酶是天然存在的微生物，如在自然界发现的真菌或细菌的内源酶。
本文使用的术语“亲本酶”表示一种经修饰可以产生本发明的酶变体的酶。亲本酶可以是一种分离自天然来源的酶，或一种已被预先修饰但仍保持了所讨论的酶的特征活性的酶。本发明的亲本果胶酸裂解酶可以是野生型的果胶酸裂解酶。
术语“酶变体”表示氨基酸序列与亲本酶的氨基酸序列相比包含着差异的酶。与亲本酶相比，该差异包括替换、缺失和/或插入。
本发明的果胶酸裂解酶可以获得自枯草杆菌菌株。
在一个优选实施方案中，本发明的果胶酸裂解酶获得自枯草杆菌。本发明人根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约于2001年4月5日，在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，联邦德国)保藏了此枯草杆菌菌株，保藏号为DSM 14218。
在本发明文中，术语“酶制品”意味着常规的酶发酵产物，其可能分离并纯化自一个微生物种，这样的制品通常包含若干种不同酶活性；或者意味着单组分酶，优选通过使用常规重组技术来源于细菌或真菌菌种的酶的混合物，这些酶已独立地进行了发酵并且可能地进行了分离和纯化并且它们可以来自不同的菌种，优选真菌或细菌菌种；或者意味着作为宿主细胞表达重组果胶酸裂解酶的微生物的发酵产物，但是此微生物同时会产生其它酶，例如木葡聚糖酶、蛋白酶或纤维素酶，它们是该微生物天然的发酵产物，这样该术语将意味着由此相应天然微生物常规产生的酶复合物。
在本发明文中，术语“表达载体”表示线性或环状DNA分子，其中包含编码目的多肽的片段及与其可操作地连接在一起用于其转录的附加片段。所述附加片段可包括启动子和终止子序列，还可任选包括一或多个复制起点，一或多个选择标记，增强子，多聚腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可含有这两者的元件。本发明的表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于该载体将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。可选择地，载体可以是这样一种载体，当其被导入宿主细胞中时，能整合到宿主细胞的基因组中并与所整合的染色体一起复制。
用于本文与多肽或蛋白质的表达相关的术语“重组表达”或“重组表达的”是根据本领域的标准定义来限定的。蛋白质的重组表达通常使用上面刚刚描述的表达载体来进行。
术语“分离的”，用于多核苷酸分子时，表示该多核苷酸分子已被移离其天然遗传环境，因此不含其它外源或不需要的编码序列，并且该分子以一种适合用于基因工程化蛋白质生产系统的形式存在。这种分离的分子是与它们的天然环境相分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含在通常情况下与之相关联的其它基因，但是可包括天然存在的5′和3非翻译区，如启动子和终止子。相关联区域的鉴定对本领域技术人员是显而易见的(参见例如，Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”也可以称为“克隆的多核苷酸”。
当用于蛋白质/多肽时，术语“分离的”表示该蛋白质存在于非其天然环境的情况下。在优选形式下，分离的蛋白质实质上不含其它蛋白质，尤其是其它同源蛋白质(即“同源的杂质”，见下文)。优选以纯度在40％以上的形式，更优选纯度在60％以上的形式提供蛋白质。
甚至更优选的是以高度纯化形式提供所述的蛋白质，即通过SDS-PAGE测定该蛋白质的纯度在80％以上，更优选95％以上，甚至更优选99％以上。
术语“分离的蛋白质/多肽”也可以称为“纯化的蛋白质/多肽”。
术语“同源杂质”意味着任何来源于最初获得本发明多肽的细胞的同源细胞的杂质(如非本发明多肽的其它多肽)。
本文所用与特定的微生物源相关的术语“获得自”意指该多核苷酸和/或多肽是由此特定来源或由如下细胞产生，其中所述细胞中已插入来自于该来源的基因。
当涉及DNA片段时，术语“可操作地连接”表示这些片段被排列成能协同地发挥其预期目的的形式，如在启动子内开始转录并通过编码片段到达终止子。
术语“多核苷酸”表示脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的从5′向3′阅读的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并可从天然来源分离得到或体外合成得到、或由天然和合成分子的组合来制备。
术语“多核苷酸分子的互补物”表示与参照序列相比，具有互补碱基序列并方向相反的多核苷酸分子。例如，序列5 ATGCACGGG3与序列5 CCCGTGCAT3互补。
术语“简并核苷酸序列”表示包括一或多个简并密码子的核苷酸序列(与编码多肽的多核苷酸参照序列相比)。简并密码子包含不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体都编码Asp)。
术语“启动子”表示基因的一部分，所述的部分含有提供RNA聚合酶结合和起始转录的DNA序列。启动子序列通常，但并不总是，位于基因的5非编码区。
术语“分泌信号序列”表示编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，其中所述多肽作为一更大多肽的一个组成成分将引导所述更大多肽通过细胞——合成此多肽的细胞——的分泌途径。通常更大的多肽在通过此分泌途径转运的过程中被切割以去除分泌肽。
术语“同一性”表示两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同源性。在本发明中，两个氨基酸序列之间的同一性程度是通过Needleman-Wunsch序列比对(align)法来测定的，该法适用于蛋白和DNA序列比对。对于蛋白序列对比，所用默认得分矩阵为BLOSUM50，缺口中第一个残基的罚分为-12，而缺口中其它残基的罚分为-2。所述的序列比对可用来自FASTA软件包(版本号v20u6)的Align软件来执行(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“改进的生物学序列分析工具”，美国国家科学院院报(PNAS)852444-2448；和W.R.Pearson(1990)“用FASTP和FASTA进行快速和灵敏的序列比较”，酶学方法(Methods in Enzymology)，18363-98)。
两个核苷酸序列之间的同一性程度可通过以同一性矩阵作为默认得分矩阵利用上述同样的算法和软件包来确定。缺口(gap)的第一个残基的罚分为-16，而缺口中的其它残基的罚分为-4。
酶变体在本发明上下文中，术语“酶变体”表示一种酶，该酶包含与标准酶的氨基酸序列不同的氨基酸序列。所述的不同包括与标准酶相比的替换、缺失和/或插入。
在本发明的上下文中，采用细胞壁降解酶，特别是果胶酸裂解酶中的氨基酸残基位置的特定编号。例如，通过与已知的果胶酸裂解酶的氨基酸序列比对，可以明确地将氨基酸位置编号分配给任何果胶酸裂解酶中的任何氨基酸残基，只要该果胶酸裂解酶的氨基酸序列是已知的。
使用来源于枯草杆菌菌株DSM 14218的质粒中存在的多核苷酸序列编码的果胶酸裂解酶的氨基酸序列(公开于SEQ ID NO2)的编码系统，通过比对来自许多其它的果胶酸裂解酶的氨基酸序列，可明确地揭示一个氨基酸残基在一个果胶酸裂解酶中的位置。
在描述本发明产生或考虑的多种果胶酸裂解酶变体时，采用以下的命名法以易于参照替换[原始的氨基酸；位置；替换的氨基酸]
相应地，符号S72I意指72位的丝氨酸被异亮氨酸替换。
多重突变通过加号标记(“+”)来分隔，如M169I+F198V，代表在169和198位分别用异亮氨酸(I)替换甲硫氨酸(M)及用缬氨酸(V)替换苯丙氨酸(F)的突变。
缺失195位的甘氨酸的缺失表示为Gly195*或G195*相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示为Gly195*+Leu196*或G195*+L196*插入额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸表示为Gly195GlyLys或G195GK；或者，当插入一个以上的氨基酸残基，如在G195后插入Lys和Ala时，这种插入表示为Gly195GlyLysAla或G195GKA在这些情况下，通过将小写字母加到插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置号中来对插入氨基酸残基进行编号。在以上的实例中，序列194-196因此将从194 195 196A-G-L变化到194 195 195a 195b 196A-G-K-A-L当插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基时，显然在命名法中出现了简并性。例如，如果在以上的实例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则这将表示为G195GG。对从194 195 196A-G-L到194 195 195a 196A-G-G-L或194 194a 195 196的事实上同样的变化还可以表示为A194AG。
这些例子对本领域技术人员来说是显而易见的，因此表示法G195GG和用于此类插入的相应表示法意在包含这些等价的简并表示法。
除非另有规定，通过果胶酸裂解酶编号系统在本文中提及的所有位置均指上述编号，并相对于枯草杆菌DSM 14218的质粒中存在的多核苷酸序列编码的果胶酸裂解酶的氨基酸序列(公开于SEQ ID NO2)而确定。
术语“洗涤剂稳定性”或“贮藏稳定性”意指蛋白在包含洗涤剂(如阴离子表面活性剂)的制剂中的稳定性。阴离子表面活性剂的特征是阴离子基团和疏水尾部的结合。当与蛋白结合时，带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸或精氨酸)和疏水区域因此可能成为相互作用点。相似地，特别柔性的区域按动力学方式打开以使通常埋在蛋白内部的氨基酸可被接近。这些所述的氨基酸残基典型地是疏水的，因此对该表面活性剂的尾部具吸引力。酶和表面活性剂之间的化学相互作用极为肯定地将使酶失活。因此提高洗涤剂或贮藏稳定性意味着在某个洗涤剂浓度和温度下，经过一段时间后较高的酶活性将被保留(较高的残留活性)。相应地，热稳定性和洗涤剂稳定性是蛋白或酶的两个相互独立的特征。
多核苷酸在本发明优选实施方案中，本发明的分离的多核苷酸在至少中度严格条件下可与SEQ ID NO1中相似大小的区域或其互补序列杂交。
具体地说，本发明的多核苷酸在至少中度严格条件下，优选高度严格条件(见下述)下可与下述探针杂交，所述探针为包含SEQ ID NO1所示的全长序列或SEQ ID NO1第1-1197位所示序列的变性双链DNA探针或为含SEQ ID NO1中至少长大约100个碱基对的亚序列的任何探针。用于在中度或高度严格条件下确定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交的合适实验条件包括将含有需杂交的DNA片段或RNA的滤膜预浸泡于5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)中10分钟，并于具有5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理的鲑鱼精子DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交该滤膜，然后在含10ng/ml随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)1326-13)、32P-dCTP标记的(比活性高于1×109cpm/μg)探针的同样溶液中约45℃杂交12小时。滤膜随后在2×SSC、0.5％SDS中洗两次，30分钟，洗涤温度至少60℃(中度严格条件)，更优选至少65℃(中度/高度严格条件)，甚至更优选至少70℃(高度严格条件)，甚至更优选至少75℃(极高严格条件)。
用X-射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交上的分子。
如前面所提到的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。可用本领域已知的方法从Gene Bank或DNA文库中克隆编码目的基因的DNA和RNA。
随后用例如杂交或PCR方法鉴定和分离编码具有本发明果胶酸裂解酶活性的多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供了来自不同细菌菌株的多肽和多核苷酸对应物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。特别感兴趣的是来自枯草杆菌菌株，例如菌株DSM 14218的果胶酸裂解酶多肽。
将本发明提供的信息和组合物与常规克隆技术相结合可克隆具有本发明果胶酸裂解酶活性的多肽的物种同系物。例如，本发明的DNA序列可用来自表达该蛋白质的细胞类型的染色体DNA进行克隆。可用按此处公开的序列设计的探针通过探测RNA印迹鉴别DNA的合适来源。随后从阳性细胞系的染色体DNA制备文库。编码具有果胶酸裂解酶活性的多肽的本发明DNA序列可随后用各种方法分离，诸如用按本说明书和权利要求书中公开的序列设计的探针进行探测，或用基于公开序列的一或多套简并探针进行探测。本发明的DNA序列也可采用聚合酶链式反应或PCR(Mullis，美国专利号4,683,202)，用基于本文公开序列设计的引物进行克隆。在另外的方法中，可用DNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对果胶酸裂解酶的抗体(单克隆或多克隆抗体)检测目的DNA的表达，所述酶按材料和方法及实施例中所述方法克隆自枯草杆菌，如DSM 14218、并表达和纯化；或者可通过与具有果胶酸裂解酶活性的多肽有关的活性测定法检测目的DNA的表达。
多肽SEQ ID NO2中氨基酸第1-399位的序列是包含本发明酶的催化活性结构域的成熟果胶酸裂解酶序列。
本发明还提供了与SEQ ID NO2中氨基酸第1-399位的多肽及其物种同系物(直向同系物或共生同系物)基本同源的果胶酸裂解酶多肽。此处所用的术语“基本同源”表示多肽与SEQ ID NO2中氨基酸第1-399位的序列或它的直向同系物或共生同系物具有98.5％，优选至少99％，更优选至少99.5％的序列同一性。序列同一性百分率是通过如上所述的Needleman-Wunsch序列比对法来测定的。
对于基本同源的蛋白质和多肽，其特征在于具有一或多个氨基酸替换、缺失或插入。这些改变优选为性质较小的那种，即保守氨基酸替换(见表2)和其它不会显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的替换；小的缺失，通常是1至约30个氨基酸的小缺失；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基、长度不超过约20-25个残基的小连接肽或利于纯化的小延伸(亲和标记物)，如多聚组氨酸、蛋白A(Nilsson等，EMBO J，41075，1985；Nilsson等，酶学方法，1983，1991)。通常参阅，Ford等，蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)295-107，1991，该文献在此引用作为参考。编码亲和标记物的DNA可从产品供应商(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New EnglandBiolabs，Beverly，MA)处购买到。
然而，即便上述的变化优选是性质较小的改变，这些改变也可以是性质较大的改变，如将长达300个氨基酸或更长的较大多肽作为氨基或羧基末端延伸融合到本发明的具有果胶酸裂解酶活性的多肽上。
表1保守氨基酸替换碱性 精氨酸赖氨酸组氨酸酸性 谷氨酸天冬氨酸极性 谷氨酰胺天冬酰胺疏水性 亮氨酸异亮氨酸缬氨酸芳香族 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸除了20种标准氨基酸之外，也可用非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)替换本发明多肽的氨基酸残基。也可用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸及非天然氨基酸替换氨基酸残基。“非天然氨基酸”已在蛋白质合成后被修饰，和/或在它们侧链上有不同于标准氨基酸侧链的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或优选地购买得到，包括六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3，3-二甲基脯氨酸。
本发明的果胶酸裂解酶多肽中的必需氨基酸可按本领域已知方法进行鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学(Science)2441081-1085，1989)。在后一技术中，在分子的每个残基位置处导入单个丙氨酸突变，检测所产生的突变分子的生物学活性(即果胶酸裂解酶活性)以鉴别对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可参阅，Hilton等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)2714699-4708，1996。酶或其它生物学相互作用的活性位点也可通过对用诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术测定进行结构的物理分析以及对推定的接触位点氨基酸进行突变而确定，参阅，例如，de Vos等，科学255306-312，1992；Smith等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224899-904，1992；Wlodaver等，FEBSLett.30959-64，1992。必需氨基酸的身份也可通过分析与本发明多肽相关的多肽的同源性来推断。
可用已知的突变、重组和/或改组方法及随后的相关筛选方法进行多个氨基酸替换和检测，这些方法例如有Reidhaar-Olson和Saner(科学24153-57，1988)、Bowie和Sauer(美国国家科学院院报862152-2156，1989)、WO95/17413或WO95/22625所公开的技术。简单地说，这些作者公开了使多肽中两个或多个位置同时随机发生不同突变或进行不同突变的重组/改组(WO95/17413，WO95/22625)、随后选择功能多肽、然后将诱变多肽确序以测定每个位置可允许的替换谱的方法。其它可用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学3010832-10837，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
上面公开的诱变/改组方法可与高通量、自动化筛选方法结合，以测定宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收，并用现代化设备快速测序。这些方法可快速确定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并可用于未知结构的多肽。
在优选的实施方案中，本发明提供了枯草杆菌DSM14218或其它枯草杆菌菌株的内源果胶酸裂解酶的变体，该变体是定点变体，在其中有一、二、三、四或五个氨基酸残基被改变成其它氨基酸残基，因此所获得的酶变体在洗涤剂组合物中具有增加的稳定性。
SEQ ID NO2的果胶酸裂解酶的变体的实例包括，但不局限于，那些在如下实施例6和洗涤性能实施例C中所公开的变体。
免疫交叉反应性用于测定免疫交叉反应性的多克隆抗体，特别是单特异性多克隆抗体可以利用提纯的具有果胶酸裂解酶活性的酶制备。更具体地说，可以参照N.Axelsen等，定量免疫电泳指南(A manual of Quantitative Immunoelectrophoresis)，Blackwell科学出版社，1973，第23章；或A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学(Immunochemistry in Practice)，Blackwell科学出版社，1982(具体是27-31页)所述的方法，通过免疫兔子(或其它啮齿类动物)，得到针对本发明果胶酸裂解酶的抗血清。纯化的免疫球蛋白可以从抗血清获得，例如通过盐沉((NH4)2SO4)，然后透析并在如DEAE-Sephadex上进行离子交换层析。蛋白质的免疫化学鉴定可以利用Outcherlony双向扩散分析(O.Ouchterlony，实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)(D.M.Weir编)，Blackwell科学出版社，1967，655-706页)，交叉免疫电泳(N.Axelsen等，出处同前，第3和4章)或火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)进行。
载体如以下进一步的描述，可以用包含编码果胶酸裂解酶的DNA序列的载体转化本发明的宿主。优选地，此载体被整合入宿主基因组，更优选地该载体已在宿主基因组上扩增。
本发明另一优选的实施方案中，此载体以表达质粒，优选以多拷贝质粒形式存在。
本发明的芽孢杆菌表达载体携带插入的编码果胶酸裂解酶的DNA序列。优选地，此载体的表达序列盒包含来自芽孢杆菌的调控区，更优选地，此调控区为宿主的内源调控区。
表达果胶酸裂解酶重组表达载体包含编码本发明酶的DNA构建体的重组载体可以是能够方便地进行重组DNA操作的任何载体。载体的选择常取决于它将被导入的宿主细胞。将载体导入宿主细胞常称作转化的宿主细胞。该转化是指使用如原生质体、天然感受态细胞、转染、接合、电穿孔或任何其它等效的方法将DNA导入宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体而存在、复制独立于染色体的复制的载体，如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当它被导入宿主细胞中时，将会部分或全部整合到宿主细胞基因组中并与其所整合的染色体一起复制。
所述载体优选为这样的表达载体，其中编码本发明的果胶酸裂解酶的DNA序列可操作地与该DNA转录所需的其它片段相连接。一般来说，表达载体来自质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。术语“可操作地连接”指将诸片段以使其能按它们的预期目的协同发挥功能的方式排列，如转录在启动子中引发并持续通过编码CBD的DNA序列。
启动子可以是任何在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的DNA序列，并可以来自编码宿主细胞的同源或异源蛋白质的基因。
适用于细菌宿主细胞的启动子的例子包括以下基因的启动子嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或λ噬菌体的PR或PL启动子或大肠杆菌的lac、trp或tac启动子。可选择地，可以设计整合型载体，以便只有在其适当地整合入宿主基因组中(如常驻(resident)启动子的下游)时，编码果胶酸裂解酶的DNA才能得以功能性表达。
如果需要，编码本发明果胶酸裂解酶的DNA序列还可以可操作地连接到适当的终止子上。
本发明的重组载体还可包含能够使载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
所述载体还可包含可选择标记，例如其产物可弥补宿主细胞缺陷的基因，或编码如对抗生素像卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等的抗性或对重金属或除草剂的抗性的基因。
为了指导本发明的果胶酸裂解酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。可以将分泌信号序列在正确阅读框中连接编码果胶酸裂解酶的DNA序列。分泌信号序列一般位于编码此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信号序列可以是通常与该果胶酸裂解酶相关的或可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。
分别用于连接编码本发明的果胶酸裂解酶的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列，或通过适宜的PCR扩增方案组装这些序列和将它们插入含有复制或整合所需信息的适宜载体的方法对本领域技术人员来说是众所周知的(参见例如，Sambrook等人，前引书)。
宿主细胞导入到宿主细胞中的克隆DNA分子可以与所讨论的宿主同源或异源。如果与所述宿主细胞同源，即由该宿主细胞天然产生，则该DNA序列一般可操作地与非其天然环境中存在的另一启动子序列相连接，或者适当时与另一分泌信号序列和/或终止序列相连接。术语“同源的”旨在包括编码天然存在于所讨论的宿主生物体中的酶的DNA序列。术语“异源的”旨在包括所述宿主细胞本身不表达的DNA序列。因此DNA序列可以来源于另一生物体或者是合成的序列。
导入了本发明的克隆DNA分子或重组载体的宿主细胞可以是任何能够产生所期望酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
通过培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌菌株，如嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(B.brevis)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，乳杆菌属(lactobacillus)菌珠，链球菌属菌株(Streptococcus)，或链霉菌菌株(Streptomyces)，尤其是变铅青链霉菌(S.lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)；该宿主细胞可以是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(Echerichiacoli)。
细菌的转化可以通过已知的方式用原生质体转化、电穿孔、接合或使用感受态细胞进行(参见Sambrook等人，见上)。
当在细菌如大肠杆菌中表达酶时，该酶一般以不可溶性颗粒驻留于细胞质中(称作包涵体)，或可以由细菌分泌序列引导到周质间隙。在前一种情况下，将细胞裂解，回收所述颗粒，变性，其后通过稀释变性剂使酶重新折叠。后一种情况下，该酶可以通过以下操作从周质间隙中回收如超声或渗透压休克破坏细胞，使所述的周质间隙的内容物释放，再回收该酶。
当在革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达该酶时，该酶可以驻留于细胞质中，或由细菌分泌序列引导到胞外培养基中。
通过培养能够产生本发明的酶的真菌宿主细胞的实例是如曲霉属(Aspergillus)或镰刀菌属(Fusarium)菌株，尤其是泡盛曲霉(A.awamori)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、和尖镰孢(F.oxysporum)，和木霉菌属菌株(Trichoderm)，优选哈茨木霉(T.harzianum)、里氏木霉(T.reesei)和绿色木霉(T.viride)。
真菌细胞可通过以下过程转化，所述过程包括原生质体形成和原生质体转化以及随后以实质上已知的方式再生细胞壁。曲霉属菌株作为宿主细胞的用途可见于EP238023(Novo Nordisk A/S)，其内容在此一并引用作为参考。
通过培养能够产生本发明的酶的酵母来源宿主细胞的实例是如汉逊酵母属菌株(Hansenula sp.)；克鲁维酵母属菌株(Kluyveromyces sp.)，尤其是乳酸克鲁维酵母(K.lactis)和马克斯克鲁维酵母(K.marcianus)；毕赤酵母属菌株(Pichia sp)；酵母属菌株(Saccharomyces)，尤其是卡尔酵母(S.carlsbergensis)、酿酒酵母(S.cerevisae)、克鲁弗酵母(S.kluyveri)和葡萄汗酵母(S.uvarum)；裂殖酵母属菌株(Schizosaccharomyces sp.)，尤其是栗酒裂殖酵母(S.pombe)；和耶氏酵母属菌株(Yarrowia sp.)，尤其是解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)。
通过培养能够产生本发明的酶的植物来源宿主细胞的实例是如来自马铃薯(Solanum tuberosum)或烟草(Nicotiana tabacum)的植物细胞。
生产果胶酸裂解酶的方法另一方面，本发明也涉及一种生产本发明的酶制品的方法，该方法包括在允许该酶产生的条件下，培养能产生该果胶酸裂解酶的微生物，并从培养物中回收该酶。培养可以采用常规的发酵方法进行，如在摇瓶或发酵罐中于确保足够通气的搅拌条件下在生长培养基上培养，从而诱导产生该果胶酸裂解酶。生长培养基可包含常规的氮源，如蛋白胨、酵母抽提物或水解酪蛋白氨基酸；减少量的常规碳源如葡萄糖或蔗糖；和诱导物如果胶酶或复合植物底物如谷糠(如麦麸或米壳)。回收可以采用常规技术，例如可通过离心或过滤分离生物质和上清液，回收上清液或如果目的酶在细胞内裂解细胞，之后可以按EP 0406314所述方法进一步纯化或按WO97/15660所述方法结晶。
更进一步地，本发明提供了一种生产本发明的分离酶的方法，其中在允许该酶产生的条件下，培养已转化了编码该酶的DNA序列的合适宿主细胞，并从培养物中回收得到的酶。
如本文中的定义，分离的多肽(如酶)是基本不含有其它多肽的多肽，如按SDS-PAGE测定，至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，再最优选约95％纯。
术语“分离的多肽”也可称为“纯化的多肽”。
当将含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞中时，就有可能异源重组生产本发明的酶。
由此，有可能制备出高纯度的或单组分的果胶酸裂解酶组合物，其特征在于不含同源杂质。
本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明的酶的同源细胞的任何杂质(例如除本发明的酶之外的其它多肽)。
本发明中，同源宿主细胞可以是枯草杆菌的菌株。
用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的果胶酸裂解酶可方便地分泌到培养基中，然后可以通过众所周知的方法回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，再利用盐如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质成分，接下来进行层析，如离子交换层析、亲和层析等。
本发明也涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，所述的转基因植物、植物部分或植物细胞已被编码本发明的果胶酸裂解酶的DNA序列所转化，以致可以表达和产生可回收量的该酶。该酶可从植物或植物部分中回收。
所述转基因植物可以是双子叶植物或单子叶植物，简称双子叶或单子叶。单子叶植物的例子是牧草，如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属(Poa))，饲料草如羊茅、黑麦草，温带牧草如剪谷颖属(Agrostis)；以及谷类植物，如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉米。
双子叶植物的例子是烟草、豆科植物如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花科(Brassicaceae)的植物，如花椰菜、油籽油菜和近亲模式生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的例子是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。在本发明文中，特殊的植物组织，如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。而且，任何植物细胞，无论何种组织来源，也被认为是植物部分。
在本发明的范围之内的还包括这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
可以用本领域已知的方法来构建表达本发明的酶的转基因植物或植物细胞。简而言之，所述植物或植物细胞通过将一或多个编码本发明酶的表达构建体引入植物宿主基因组中，并使所得的改变的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞来构建。
方便地，表达构建体是DNA构建体，其中包含编码本发明酶的基因以及与之可操作地连接在一起的为在所选的植物或植物部分中表达该基因所需要的合适的调控序列。此外，该表达构建体可包含用于鉴定其中已整合入表达构建体的宿主细胞的选择标记和将构建体导入被讨论的植物所必要的DNA序列(后者取决于所用的DNA导入方法)。
调控序列如启动子、终止序列和任选的信号或转运序列的选择是根据如希望何时、何处和如何表达酶来确定的。例如，编码本发明的酶的基因的表达可以是组成型或诱导型的、或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可定向到特定组织或植物部分，如种子或叶子。如Tague等，植物生理学(Plant Phys.)，86，506，1988描述了这样的调控序列。
对于组成型表达，可使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980.细胞(cell)21285-294)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏壑(sink)组织如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards和Coruzzi，1990，遗传学年度评论(Annu.Rev.Genet.).24275-303)或代谢壑组织如分生组织(Ito等，1994.植物分子生物学(Plant Mol.Biol.).24863-878)的启动子，种子特异性启动子如来自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等.，植物和细胞生理学(Plant and Cell Physiology)Vol.39，No.8pp.885-889(1998))，来自于豆球蛋白B4和蚕豆的未知种子蛋白质基因(Conrad U.等，植物生理学杂志(Journal of Pplant Physiology)Vol.152，No.6pp.708-711(1998))的蚕豆启动子，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等。植物和细胞生理学vol.39，No.9 pp.935-941(1998))，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本领域所知的其它任何种子特异性启动子，如WO91/14772中所描述的。此外，所述启动子也可以是叶特异性启动子如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等.，植物生理学(Plant Physiology)Vol.102，No.3 pp.991-1000(1993))、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra，A.和Higgins，DW，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)Vol.26，No.1pp.85-93(1994))或来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等.，分子与普通遗传学(Molecular and GeneralGenetis)Vol.248，No.6pp.668-674(1995))或创伤诱导的启动子如马铃薯pin2启动子(Xu等，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)Vol.22，No.4pp.573-588(1993))。
可以利用启动子增强元件在植物中获得更高的酶表达量。例如，启动子增强元件可以是插在启动子和编码该酶的核苷酸序列之间的内含子。如Xu等，前引文章，公开了使用水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子来增强表达。
选择标记基因和表达构建体的任何其它部分可从本领域现有的进行选择。
可以根据本领域所知的常规技术，包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、微粒轰击、生物轰击转化和电穿孔(Gasser等，科学，244，1293；Potrykus，生物/技术(Bio/Techn.).8,535，1990；Shimamoto等，自然(Natare)，338，274，1989)，将DNA构建体引入植物基因组中。
目前，根瘤农杆菌(Agrobacterium tamefaciens)介导的基因转移(综述见Hooykas和Schilperoort，1992.植物分子生物学.1915-38)是产生转基因双子叶植物的首选方法，但也可以利用它转化单子叶植物，尽管对这些单子叶植物通常优选其它转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的首选方法是微粒轰击(包被了转化DNA的微小金颗粒或钨颗粒)胚性愈伤组织或发育的胚(Christou，1992.植物杂志(Plant J.).2275-281；Shimamoto，1994.当前生物技术观点(Carr.Opin.Biotechnol.).5158-162；Vasil等，1992.生物/技术(Bio/Technology)10667-674)。另外可替代的转化单子叶植物的方法是基于原生质体转化的方法，该法描述于Omirulleh S，等，植物分子生物学Vol.21，No.3pp.415-428(1993)。
在转化后，挑选出引入了表达构建体的转化体并根据本领域众所周知的方法再生出完整植株。
酶组合物在再一方面，本发明涉及包含具有如上所述的果胶酸裂解酶活性的酶的酶组合物。
本发明的酶组合物除了包含本发明的果胶酸裂解酶之外，还可以包含一或多种其它类型的酶，例如半纤维素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶、纤维素酶或内切-β-1，4-葡聚糖酶组分、几丁质酶、脂肪酶、酯酶、果胶酶、木葡聚糖酶、角质酶、肌醇六磷酸酶、氧化还原酶(过氧化物酶、卤素过氧化物酶、氧化酶、漆酶)、蛋白酶、淀粉酶、还原酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、或它们的混合物。
酶组合物可以依照本领域已知的方法制备，可以是液态或干燥组合物。例如，该酶组合物可以是粒状或微粒状。包含在组合物中的酶可以用本领域已知的方法来稳定化。
用途果胶酸裂解酶在许多的工业和应用领域具有潜在的用途。然而，本发明的果胶酸裂解酶特别适用作洗涤剂组合物的成分。如下给出的例子是本发明的酶组合物的优选用途。基于本领域的已知技术，本发明的酶组合物的用量和使用该组合物的其它条件可以被确定。
本发明的果胶酸裂解酶是本发明的洗涤剂组合物的基本成分，以纯酶在组合物中的重量计算，优选该酶占0.0001％到2％，更优选占0.0005％到0.1％，最优选占0.001％到0.02％。
除了包含催化结构域的酶核心外，本发明的果胶酸裂解酶还可包含纤维素结合结构域(CBD)，该纤维素结合结构域和该酶的酶核心(催化活性结构域)可操作地连接。纤维素结合结构域(CBD)可作为该编码酶的组成部分，或可将另一来源的CBD导入到该果胶酸裂解酶中，从而产生酶杂合体。在本文中，术语“纤维素结合结构域”应按Peter Tomme等(《不溶性碳水化合物的酶促降解》(Enzymatic Degradation of InsolubleCarbohydrates)一书中，“纤维素结合结构域分类和特性”，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACS Symposium Series，No.618，1996)的定义理解。这一定义将120多种纤维素结合结构域归为10个家族(I-X)，并证实在诸如纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和几丁质酶等多种酶中有CBD。在藻类如红藻Porphyra purpurea中也已找到以非水解性多糖结合蛋白质形式存在的CBD，参阅Tomme等，出处同前。然而，大部分的CBD是来自纤维素酶和木聚糖酶，CBD可存在于蛋白质的N和C末端或在其内部。酶杂合体是本领域已知的，参阅WO90/00609和WO95/16782，通过将含有纤维素结合结构域的编码DNA的至少一个片段及通过或不通过接头与之相连的果胶酸裂解酶编码DNA序列的DNA构建体转化至宿主细胞中，并培养此宿主细胞以表达融合基因，可制备酶杂合体。酶杂合体可用如下公式描述CBD-MR-X其中CBD是相应于至少纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区域；MR是中间区域(接头)，可以是键或短的连接基团，优选约2-100个碳原子长，更优选2-40个碳原子长；MR或者优选具有约2-100个氨基酸，更优选2-40个氨基酸；而X是本发明的果胶酸裂解酶的N-末端或C-末端区域。
在洗涤剂工业中的用途在洗涤和穿着过程中，染色的织物或服装上的染料通常会从织物上渗出，这使得织物看起来陈旧和褪色。除去织物表面上的纤维可部分恢复织物的原色和外观。本文所用的术语“颜色澄清”是指通过多次洗涤循环而部分恢复织物或服装的原色。
术语“去起球”是指除去织物表面上的纤维绒球。
术语“浸泡液”是指可在进行常规洗涤过程之前浸泡衣物的水溶液。浸泡液可含有洗涤或洗衣过程中常规使用的一种或多种成分。
术语“洗涤液”是指在其中洗涤衣物的水溶液，这种衣物洗涤通常是手工进行或在洗衣机中进行的化学和机械的混合作用。洗涤液通常是粉末状或液态洗涤剂组合物的水溶液。
术语“漂洗液”是指通常在衣物洗涤之后立即用于浸泡或处理衣服以漂洗衣物(即基本上除去衣物上的洗涤剂溶液)的水溶液。漂洗液中可含有织物调理或软化组合物。
可用本发明方法处理的衣物可以是常规的可洗涤的衣物。优选衣物的主要部分是由棉花、混绵或者天然或人工纤维素(如来源于含木聚糖的纤维素纤维，如来自纸浆)或其混合物制成的纺织的或无纺的织物，包括针织物、机织物、粗斜棉布、纱线和毛巾布。混合物的例子是棉或人造纤维/粘胶纤维与一种或多种伴随材料的混合物，所述的伴随材料例如是羊毛、合成纤维(如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚偏氯乙烯纤维、聚氨基甲酸酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含纤维素的纤维(如人造纤维/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻纱线、黄麻、醋酸纤维素纤维、lyocell)。
令人惊奇地发现本发明的洗涤剂组合物通过果胶酸裂解酶水解来自织物纤维的半纤维素组分确实可提供颜色澄清、去起球和去除泥土污渍的功能。
去除来自于植物、木材、基于霉污物的污渍、泥浆和水果的污渍是当今最困难的清洗任务之一，特别是在低温洗涤中更有此趋势。这些污渍通常含有主要基于碳水化合物和它们的衍生物(纤维和细胞壁成分)的纤维材料的复杂混合物。食物污迹常常很难从被污染物上被有效地去除。去除来自水果和/或蔬菜汁中的高着色的或“干的”污渍特别具有挑战性。这样的污渍的详细例子包括橙汁、番茄汁、香蕉、芒果或花椰菜污渍。事实上，果胶聚合物是植物细胞壁的重要成分。在织物、碗盘和硬表面上通常能发现含有果胶的污渍物。
在包括衣物、碗盘和硬表面的清洁中已发现本发明的洗涤剂组合物可提供优良的清洁和去污能力。尽管希望不受理论的限制，但据认为包含在本发明洗涤剂组合物中的果胶酸裂解酶将十分有效地水解污渍中的果胶和果胶酸，从而对污渍的去除起作用。如上所述，事实上在来自植物和/或水果的污渍(如苹果、香蕉、番茄、橙、芒果、鳄梨和草污渍)的植物细胞壁成分中均存在该果胶和果胶酸成分。果胶和果胶酸成分也广泛地应用于食物和美容护理工业中，如冰淇淋、果酱、洗发香波和唇膏。
此外，还发现当本发明的洗涤剂组合物配制成洗衣组合物时，能提供织物软化的功能。尽管希望不受理论的限制，但据认为在织物污渍中存在的果胶和果胶酸成分由于它们的酸性性质将牢固地结合钙离子和阳离子，使得织物粗糙。除去这些果胶和果胶酸成分被认为可以阻止那些钙离子和阳离子的结合，因此可提供一定的软化效果。
洗涤剂的公开和实施例表面活性剂体系本发明的洗涤剂组合物包含表面活性剂体系，其中表面活性剂可选自非离子的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性的和/或两性离子的和/或半极性的表面活性剂。
表面活性剂通常以0.1％至60％重量的量存在。
表面活性剂优选配制成与组合物中存在的酶成分相容的形式。在液体或凝胶组合物中表面活性剂最优选配制成可促进或至少不降低组合物中的任何酶的稳定性的形式。
根据本发明所用的优选体系包含作为表面活性剂的一种或多种本文所述的非离子和/或阴离子表面活性剂。更优选地，本发明的组合物包含高水平的阴离子表面活性剂，即以游离酸计多达30％，优选10-25％重量。其中所用的优选阴离子表面活性剂是如下所述的酸形式的烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐和烷基乙氧基硫酸盐。在再一优选的实施方案中，本发明的高阴离子表面活性剂组合物还含有胺氧化物表面活性剂和/或酰氨基胺如酰氨基丙基二乙胺。已发现，在包括洗衣、洗碗和硬表面的清洗中，本发明洗涤剂组合物(还包括高水平的阴离子表面活性剂)可以提供优良的清洗和去污能力。尽管不希望受到理论的限制，但认为阴离子表面活性剂能够帮助增溶本发明的酶所要水解的小果胶碎片并且阻止它们在清洗过的表面上再沉积。
可使用的适当的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，其包括C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直链酯类，该表面活性剂是由气态SO3磺化而成的，参见“美国石油化学家协会杂志”(″The Journal of the American OilChemists Society″)，52(1975)，pp.323-329。适当的原料包括衍生自动物脂、棕榈油等的天然脂肪物质。
优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂，尤其在洗衣应用中，包括以下结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂 其中R3是C8-C20烃基，优选烷基或其组合；R4是C1-C6烃基，优选烷基或其组合；M为阳离子，其与烷基酯磺酸形成水溶性盐。适当的形成盐的阳离子包括金属诸如钠、钾和锂以及取代或未取代的铵阳离子，诸如一乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。优选R3是C10-C16烷基，且R4是甲基、乙基或异丙基。尤其优选的是甲基酯磺酸盐，其中R3是C10-C16烷基。
其它适当的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐表面活性剂，该表面活性剂是通式ROSO3M的水溶性盐或酸，其中R优选是C10-C24的烃基，优选烷基或含有C10-C20烷基成分的羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，且M为H或阳离子，例如碱金属阳离子(例如钠、钾、锂)或铵或取代的铵(例如甲基-、二甲基-和三甲基铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子以及衍生自烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺及其混合物的季铵阳离子等)。通常C12-C16烷基链优选用于低温洗涤(例如低于约50℃)，而C16-C18烷基链优选用于高温洗涤(例如高于约50℃)。
其它可用于清洁目的的阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的洗衣洗涤剂组合物中。它们可包括皂盐(包括例如钠、钾、铵和取代的铵盐如单-、二-和三乙醇胺盐)、C8-C22伯型或仲型链烷磺酸盐、C8-C24烯属磺酸盐、由碱土金属柠檬酸盐的热解产物通过磺化反应制备的磺化多羧酸(例如，英国专利说明书1,082,179所公开的)、C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸盐(其含有最多10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘油磺酸盐、脂肪油基甘油硫酸盐、烷基酚环氧乙烷醚硫酸盐、链烷磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙基磺酸盐如酰基羟乙基磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸酯的单酯类(尤其是饱和和不饱和C12-C18单酯)和磺基琥珀酸酯的二酯类(尤其是饱和和不饱和C6-C12二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖的硫酸盐如烷基多葡萄糖苷(非离子非硫酸化的化合物，见下述)的硫酸盐、支链伯烷基硫酸盐和烷基聚乙氧基羧酸盐诸如通式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的盐(其中R是C8-C22烷基，k是从1到10的整数，M是形成可溶性盐的阳离子。树脂酸和氢化树脂酸如松香、氢化松香和在松浆油内的或衍生自松浆油的树脂酸和氢化树脂酸也是适当的。
烷基苯磺酸盐是非常优选的。尤其优选的是直链(线性)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基基团优选包含10到18个碳原子。
其它实例在“表面活性剂和洗涤剂”(Surface Active Agents andDetergents)(Vol.I和II，Schwartz，Perrry和Berch)中描述。多种此类表面活性剂也一般性地公开于US 3,929,678(23栏，58行到29栏，23行，在本文中将其引入作为参考)。
其它优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化硫酸盐表面活性剂。有关例子是通式RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基成分的羟基烷基，优选C12-C20烷基或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单元，m大于0，通常在约0.5至约6之间，更优选在约0.5至约3之间，M是H或阳离子并可以是例如金属阳离子(例如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代的铵阳离子。烷基乙氧基化硫酸盐和烷基丙氧基化硫酸盐也包括在本发明中。取代的铵阳离子的具体例子包括甲基-、二甲基-、三甲基-铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和衍生自烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺及其混合物的那些物质等等。示范性的表面活性剂是C12-C18烷基聚乙氧基化(1.0)硫酸盐(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化(2.25)硫酸盐(C12-C18(2.25)M)和C12-C18烷基聚乙氧基化(3.0)硫酸盐(C12-C18E(3.0)M)和C12-C18烷基聚乙氧基化(4.0)硫酸盐(C12-C18E(4.0)M)，其中M适宜地选自钠和钾。当此类阴离子表面活性剂被包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物通常包含约1％至约40％、优选约3％至约20％重量的此类阴离子表面活性剂。
烷基酚的聚环氧乙烷、聚环氧丙烷和聚环氧丁烷缩合物适合用作本发明表面活性剂体系中的非离子表面活性剂，优选聚环氧乙烷缩合物。这些化合物包括烷基酚与环氧烷的缩合产物，其中烷基酚的烷基在直链或支链构型中具有约6至14个碳原子，优选约8至14个碳原子。在优选的实施方案中，环氧乙烷相对于每摩尔烷基酚以约2至约25摩尔、更优选约3至约15摩尔的量存在。这种类型的可购买的非离子表面活性剂包括IgepalTMCO-630，由GAF Corporation销售；和TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102，都由Rohm & Haas Company销售。通常将这些表面活性剂称作烷基酚烷氧基化物(例如烷基酚乙氧基化物)。
伯型和仲型脂肪族醇与约1至约25摩尔环氧乙烷的缩合产物适合用作本发明的表面活性剂体系中的非离子表面活性剂。脂肪醇的烷基链可以是直链或支链、伯型或仲型的，并且通常包含约8至约22个碳原子。优选的是其烷基基团含有约8至约20个碳原子、更优选约10至约18个碳原子的醇类按每摩尔与约2至约10摩尔的环氧乙烷的缩合产物。相对于每摩尔的醇，约2至约7摩尔的环氧乙烷、最优选2至5摩尔的环氧乙烷存在于所述的缩合产物中。可购买的该类非离子型表面活性剂的例子包括TergitolTM15-S-9(C11-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、TergitolTM24-L-6NMW(C12-C14伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)，两者都由Union Carbide Corporation销售；NeodolTM45-9(C14-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM23-3(C12-C13直链醇和3.0摩尔的环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM45-7(C14-C15直链醇和7摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM45-5(C14-C15直链醇和5摩尔环氧乙烷的缩合产物)，其由Shell Chemical Company销售；KyroTMEOB(C13-C15醇和9摩尔环氧乙烷的缩合产物)，由The Procter & Gamble Company销售；和Genapol LA 050(C12-C14醇和5摩尔环氧乙烷的缩合产物)，由Hoechst销售。上述产物的优选HLB范围为8-11，最优选8-10。
也可用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂的是US4,565,647中公开的烷基多糖，其具有包含约6至约30个碳原子、优选约10至约16个碳原子的疏水基团和含有约1.3至约10个、优选约1.3至约3个、最优选约1.3至约2.7个糖单元的多糖，例如聚苷亲水基团。任何包含5或6个碳原子的还原糖都可使用，例如，葡萄糖、半乳糖，并且半乳糖基部分可被替代为葡糖基部分(疏水基团任选地连接在2-、3-、4-等位置上，由此相对于葡糖苷或半乳糖苷产生葡萄糖或半乳糖)。糖间键可以例如在附加糖单元的1个位置和之前糖单元的2-、3-、4-和/或6-位之间。
优选的烷基聚苷具有以下通式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2选自烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基及其混合物，其中烷基包括约10至约18，优选约12至约14个碳原子；n是2或3，优选2；t是0至约10，优选0；且x是约1.3至约10，优选约1.3至约3，最优选约1.3至约2.7。糖基优选衍生自葡萄糖。为了制备这些化合物，首先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应形成葡糖苷(连接在1位上)。附加糖基单元可在其1位和之前述糖基单元的2-、3-、4-和/或6-位，优选主要2-位之间形成连接。
环氧乙烷与由环氧丙烷和丙二醇的缩合物形成的疏水碱性化合物的缩合产物也适宜用作本发明的另外的非离子表面活性剂体系。这些化合物的疏水部分优选具有约1500至约1800的分子量并且不溶于水。向该疏水部分中加入聚氧乙烯部分趋于提高分子的整体水溶性，并且将产物的液体特征维持在聚氧乙烯含量最多占缩合产物总重的约50％的水平，即相当于与不超过约40摩尔的环氧乙烷缩合。这类化合物的例子包括由BASF销售的某些可购买的PluronicTM表面活性剂。
还适宜用作本发明非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂的是环氧乙烷与环氧丙烷和乙二胺的反应产物的缩合产物。这些产物的疏水部分由乙二胺和过量环氧丙烷的反应产物组成，通常分子量为约2500至约3000。此疏水部分与环氧乙烷缩合的程度使得缩合产物含有约40％至约80％重量的聚氧乙烯、并且分子量约为5,000至约11,000。这类非离子表面活性剂的例子包括由BASF销售的某些可购买的TetronicTM化合物。
优选用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是烷基酚的聚环氧乙烷缩合物、伯型和仲型脂肪醇与约1至约25摩尔环氧乙烷的缩合物、烷基多糖及其混合物。最优选的是具有3到15个乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧化物以及具有2到10个乙氧基的C8-C18(优选平均为C10)醇乙氧化物及其混合物。
非常优选的非离子表面活性剂是下式的多羟基脂肪酰胺表面活性剂 其中R1是H或R1是C1-4烃基、2-羟乙基、2-羟丙基或其混合物，R2是C5-31烃基，Z是多羟基烃基(具有至少3个直接连接到链上的羟基的直链烃基链)或其烷氧基化衍生物。优选，在还原性胺化反应中，R1是甲基，R2是直链C11-15烷基或C16-18烷基或链烯基如椰油烷基或其混合物，Z衍生自还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖或乳糖。
本发明的洗衣洗涤剂组合物也可包含阳离子、两性、两性离子、半极性的表面活性剂和/或辅助表面活性剂，以及那些没有在前文中描述的非离子和/或阴离子表面活性剂。当被包括在其中时，本发明的洗涤剂组合物通常包含0.2％至约25％、优选约1％至约8％重量的此类阳离子表面活性剂、两性、两性离子和/或半极性的表面活性剂。
适合用于本发明的洗衣洗涤剂组合物的阳离子清洁表面活性剂具有一个长链烃基。此阳离子表面活性剂的例子包括铵表面活性剂如烷基三甲基铵卤化物和通式[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-的表面活性剂，其中R2是在烷基链中含有约8至约18个碳原子的烷基或烷基苄基基团，每个R3选自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-及其混合物；每个R4选自C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基、通过连接两个R4基团形成的苄基环结构、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是分子量小于约1000的任何己糖或己糖聚合物)和氢(当y非零时)；R5与R4相同或是烷基链，其中总碳原子个数或R2加R5不超过约18；每个y从0至约10，并且y值总和为0至约15；且X是任何相容的阴离子。
非常优选的阳离子表面活性剂是用于该组合物中的水溶性季铵化合物，该化合物具有通式R1R2R3R4N+X-(i)，其中R1是C8-C16烷基，R2、R3和R4各独立地是C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基、苄基和-(C2H40)xH，其中x的值为2到5，且X是阴离子。R2、R3和R4中最多一个为苄基。
优选的R1烷基链长度为C12-C15，尤其是当该烷基基团衍生自椰子或棕榈核脂肪并具有混合链长度时，或当该烷基基团通过烯烃聚合或羰基合成醇合成而衍生得到时。
优选的R2、R3和R4基团是甲基和羟乙基，且阴离子X可选自卤离子、甲基硫酸根离子、醋酸根离子和磷酸根离子。
适用于这里的通式(i)的季铵化合物的实例有椰油三甲基铵氯化物或溴化物；椰油甲基二羟乙基铵氯化物或溴化物；癸基三乙基铵氯化物；癸基二甲基羟乙基铵氯化物或溴化物；C12-15二甲基羟乙基铵氯化物或溴化物；椰油二甲基羟乙基铵氯化物或溴化物；肉豆蔻基三甲基铵甲基硫酸盐；月桂基二甲基苄基铵氯化物或溴化物；月桂基二甲基(氧乙烯基)4铵氯化物或溴化物；胆碱酯(通式(i)的化合物，其中R1是 烷基，且R2、R3、R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[通式(i)的化合物]。
可用于本文的其它阳离子表面活性剂也记载于US 4,228,044和EP 000224中。
两性表面活性剂也适合用于本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些表面活性剂可宽泛地描述为仲或叔胺的脂族衍生物或杂环伸和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链或支链。其中一个脂族取代基包含至少约8个碳原子，通常约8至约18个碳原子，而至少一个包含阴离子水溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。两性表面活性剂的实例见US 3,929,678(19栏，18-35行)。
两性离子表面活性剂也适合用于洗衣洗涤剂组合物中。可以将这些表面活性剂宽泛地描述为仲胺和叔胺的衍生物、杂环仲胺和叔胺的衍生物或季铵、季鏻或叔硫鎓化合物的衍生物。关于两性离子表面活性剂的例子可以参见US 3,929,678(第19栏，第38行至第22栏第48行)。
半极性非离子表面活性剂是非离子表面活性剂的特殊类型，其包括含有1个具有约10至约18个碳原子的烷基部分和2个选自含有约1至约3个碳原子的烷基和羟基烷基的部分的水溶性胺氧化物；含有1个具有约10至约18个碳原子的烷基部分和2个选自含有约1至约3个碳原子的烷基和羟基烷基的的水溶性氧化膦；和含有1个具有约10至约18个碳原子的烷基部分和选自含有约1至约3个碳原子的烷基和羟基烷基的部分的水溶性亚砜。
半极性非离子洗涤剂表面活性剂包括具下式的胺氧化物表面活性剂 其中R3是含有约8至约22个碳原子的烷基、羟基烷基或烷基苯基或其混合物；R4是含有约2至约3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其混合物；x为0至约3每个R5各是含有约1至约3个碳原子的烷基或羟基烷基或含有约1至约3个环氧乙烷的聚环氧乙烷基团。R5可以相互连接，例如通过氧或氮原子连接成环结构。
这些胺氧化物表面活性剂尤其包括C10-C18烷基二甲基胺氧化物和C8-C12烷氧基乙基二羟基乙基胺氧化物。
适当的辅助表面活性剂选自伯胺和叔胺。
用于这里的适当的伯胺包括通式R1NH2的胺，其中R1是C6-C12，优选C6-C10烷基链或通式R4X(CH2)n，X是-O-、-C(O)NH-或-NH-、R4是C6-C12烷基链，n为1到5，优选3。R1烷基链可以是直链或支链并以可以用不超过12个，优选小于5的环氧乙烷部分断开。
优选的根据上述通式的胺是正烷基胺。这里适用的胺可选自1-己胺，1-辛胺，1-癸胺和月桂胺。其它优选的伯胺包括C8-C10氧基丙基胺，辛氧基丙基胺，2-乙基己基氧基丙基胺，月桂基酰氨基丙胺和酰氨基丙胺。
用于这里的适当的叔胺包括具有通式R1R2R3N的叔胺，其中R1和R2是C1-C8烷基链或 R3是C6-C12，优选C6-C10烷基链，或R3是R4X(CH2)n，其中X是-O-、-C(O)NH-或-NH-，R4是C4-C12，n是1到5，优选2-3。R5是H或C1-C2烷基且x是1到6。
R3和R4可以是直链或支链；R3烷基链可以用不超过12个，优选少于5个的环氧乙烷部分断开。优选的叔胺是R1R2R3N，其中R1是C6-C12烷基链，R2和R3是C1-C3烷基或 其中R5是H或CH3，且x＝1-2。
还优选下式的酰胺胺 其中R1是C6-C12烷基；n是2-4，优选n是3；R2和R3是C1-C4。
最优选的胺包括1-辛胺、1-己胺、1-癸胺、1-十二烷基胺、C8-10氧基丙胺、N-椰油1，3-二氨基丙烷、椰油烷基二甲胺、月桂基二甲胺、月桂基二(羟乙基)胺、椰油二(羟乙基)胺、2摩尔丙氧基化的月桂胺、2摩尔丙氧基化的辛胺、月桂基酰氨基丙基二甲胺、C8-10酰氨基丙基二甲胺和C10酰氨基丙基二甲胺。
最优选的用在本发明组合物中的胺是1-己胺、1-辛胺、1-癸胺、1-十二烷基胺。尤其期望的是正十二烷基二甲基胺和二羟基乙基椰油烷基胺和油胺的7倍乙氧基化物、月桂基酰氨基丙胺和椰油酰氨基丙胺。
助洗剂体系根据本发明的组合物可以进一步包含助洗剂体系。任何常规的助洗剂体系都适合用于这里，包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸酯和脂肪酸、如乙二胺四乙酸盐等材料、金属离子螯合剂如氨基多膦酸酯，尤其是二乙胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。尽管由于环境原因较不优选磷酸盐助洗剂，但其仍可以用在此处。
适当的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合硅铝酸盐材料，更特别的是水合的合成沸石，如水合沸石A、X、B、HS或MAP。
另一适合的无机助洗剂材料为层状硅酸盐，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na2Si2O5)组成的晶体层状硅酸盐。
适宜的含有一个羧基基团的多羧酸酯包括其乳酸、甘醇酸和醚衍生物，公开在比利时专利Nos.831，368，821，369和821，370中。包含两个羧基基团的多羧酸酯包括丁二酸、丙二酸、(亚乙二氧基)双乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐，以及在德国Offenle-enschrift 2,446,686和2,446,487、US 3,935,257中公开的醚羧酸酯和在比利时专利No.840,623中公开的亚硫酰基羧酸酯。含有三个羧酸基团的多羧酸酯包括尤其是水溶性柠檬酸酯、乌头酸酯和柠康酸酯以及丁二酸酯衍生物如英国专利No.1,379,241中公开的羧甲基氧基丁二酸酯，在荷兰申请7205873中公开的2-羟基丙氧基丁二酸酯(lactoxysuccinates)和在英国专利No.1,387,447中公开的氧化多羧酸酯材料如2-氧杂-1，1，3-丙烷三羧酸酯。
包含四个羧基基团的多羧酸酯包括在英国专利No.1,261,829中公开的氧联二丁二酸酯、含有磺基取代基的1，1，2，2，-乙烷四羧酸酯、1，1，3，3-丙烷四羧酸酯，包括在英国专利Nos.1,398,421和1,398,422以及US 3,936,448中公开的磺基琥珀酸酯衍生物，和在英国专利No.1,082,179中公开的磺化热解柠檬酸酯，而英国专利No.1,439,000公开了包含膦基取代基的多羧酸酯。
脂环族的和杂环的多羧酸酯包括环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸酯、环戊二烯五羧酸酯、2，3，4，5-四氢呋喃顺，顺，顺-四羧酸酯、2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸酯、2，2，5，5，-四氢呋喃四羧酸酯、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸酯和多元醇如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。芳族多羧酸酯包括在英国专利No.1,425,343中公开的苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和邻苯二甲酸衍生物。
上述中优选的多羧酸酯是每个分子包含多达3个羧基基团的羟基-羧酸酯，更优选的是柠檬酸酯。
优选的用于本发明组合物中的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂如沸石A或层状硅酸盐(SKS-6)和水溶性羧酸酯螯合剂如柠檬酸的混合物。
适合包含在本发明洗涤剂组合物中的螯合剂是乙二胺-N，N′-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐，或它们的混合物。优选的EDDS化合物是游离酸形式和其钠或镁盐。这些优选的EDDS钠盐的实例包括Na2EDDS和Na4EDDS。优选的EDDS镁盐的实例包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐最优选包含在本发明组合物中。
优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂如沸石A和水溶性羧酸酯螯合剂如柠檬酸的混合物。
其它可以形成用于粒状组合物中的助洗剂体系的一部分的助洗剂材料包括无机材料如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，和有机材料如有机膦酸酯、氨基聚亚烷基膦酸酯和氨基多羧酸酯。
其它适宜的水溶性有机盐是均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中聚羧酸包含至少两个被不多于两个碳原子相分隔的羧基基团。
GB-A-1,596,756公开了此类聚合物。此类盐的实例是MW 2000-5000的聚丙烯酸酯和它们与马来酸酐的共聚物，该共聚物的分子量是20,000到70,000，尤其约40,000。
组合物中通常包括5％到80％重量的洗涤助洗剂盐。液体洗涤剂中优选包括5％到30％的助洗剂。
酶优选的洗涤剂组合物，除了包含本发明的酶制品外，还包含其它可提供清洁性能和/或织物养护益处的酶。
这些酶包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶，淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)蛋白酶任何适合用于碱性溶液的蛋白酶都可以使用。合适的蛋白酶包括来自动物、植物或微生物的蛋白酶。来源于微生物的蛋白酶是优选的。也包括经化学或遗传修饰的突变体。所述的蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO89/06270所公开的镰刀菌属蛋白酶。
优选的可购买的蛋白酶包括商品名为Alcalase，Savinase，Primase，Durazym，Esperase(Novozymes A/S，丹麦出售)；Maxatase，Maxacal，Maxapem，Properase，Purafect，Purafect OxP，(Genencor InternationalInc.出售)；Opticlean和Optimase(Solvay Enzymes出售的那些)。以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的蛋白酶可以占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
脂肪酶适用于碱性溶液的任何脂肪酶均可以使用。合适的脂肪酶包括那些来源于细菌或真菌的脂肪酶。也包括经化学或遗传修饰的突变体。
有用的脂肪酶的实例包括来自Humicola lanuginosa的脂肪酶，如EP 258 068和EP 305 216中所述，来自Rhizomucor miehei的脂肪酶，如EP238 023所述，来自假丝酵母菌属(Candida)的脂肪酶，例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶，如EP214 761中所述的南极假丝酵母脂肪酶A或B，来自假单胞菌属(Pseudomonas)的脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(见例如EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(见例如EP 331376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)的脂肪酶，来自芽孢杆菌属的脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993)，生物化学与生物物理学学报(Biochemica et Biophysica acta)，1131，253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
此外，一些克隆的脂肪酶也可以使用，包括在Yamaguchi等，(1991)，基因(Gene)103，61-67中公开的沙门柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)脂肪酶，白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(Schimada，Y.等.，(1989)，生物化学杂志(J.Biochem.).，106，383-388)，和各种根霉菌属(Rhizopus)脂肪酶如R.delemar脂肪酶(Hass，M.J等.，(1991)，基因109，117-113)，雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya etal.，(1992)，生物化学生物技术生物科学(Biosci.Biotech.Biochem.)56，716-719)和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
其它类型的脂解酶如角质酶也可以使用，例如，在WO 88/09367中公开的衍生自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶，或衍生自腐皮镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(例如在WO 90/09446中公开的)。
特别适合的脂肪酶是脂肪酶如M1 LipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor)、LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NovozymesA/S)，和脂肪酶P″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的脂肪酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
淀粉酶适用于碱性溶液的任何淀粉酶(a和/或b)均可使用。合适的淀粉酶包括那些来源于细菌或真菌的淀粉酶。也包括经化学或遗传修饰的突变体。淀粉酶包括例如，例如来自地衣芽孢杆菌的特定菌株的α-淀粉酶，详细内容参见GB 1,296,839。可购买的淀粉酶是DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM和BANTM(可来自Novozymes A/S)，RapidaseTM和MaxamylTM(可来自Genencor)。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的淀粉酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
纤维素酶任何适合用于碱性溶液的纤维素酶都可使用。合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的纤维素酶。也包括经化学或遗传修饰或的突变体。合适纤维素酶公开在如下文献中在US 4,435,307和WO91/17243中公开了产生自Humicola insolens的真菌纤维素酶，在WO96/34108和WO 96/34092中公开了来自芽孢杆菌属的细菌嗜碱纤维素酶(BCE 103)，在WO 94/21801、US 5,475,101和US 5,419,778中公开了来自木霉菌属(Trichoderma)的EG III纤维素酶。特别适合的纤维素酶是有利于颜色养护的纤维素酶。这种纤维素酶实例是公开在欧洲专利申请No.0 495 257中的纤维素酶。可购买的纤维素酶包括由Humicola insolens菌株产生的CelluzymeTM和CarezymeTM(Novozymes A/S)，KAC-500(B)TM(Kao Corporation)和PuradaxTM(Genencor International)。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的纤维素酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
过氧化物酶/氧化酶过氧化物酶与过氧化氢或过氧化氢源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)结合使用。氧化酶与氧气结合使用。两种类型的酶都用于“溶液漂白”，即防止当两种织物在洗涤液(优选含有如在WO94/12621和WO 95/01426中公开的增强剂)中一起洗涤的时候染色织物上的纺织品染料转移到另一织物上。合适的过氧化物酶/氧化酶包括来源于植物、细菌或真菌的过氧化物酶/氧化酶。也包括经化学或遗传修饰的突变体。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的过氧化物酶和/或氧化酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
以上提到的酶的混合物都包括在本文中，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纤维素酶的混合物。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在洗涤剂组合物中的本发明的酶或其它任何酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
漂白剂另外可选择的可包括在本发明洗涤剂组合物中的洗涤剂组分包括漂白剂。这些漂白剂成分可以包括一种或多种氧漂白剂和根据选择的漂白剂而不同的一种或多种漂白活化剂。如果存在，氧漂白化合物通常以约1％至约25％的水平存在。优选用于本发明组合物中的漂白剂是以下所述的大多环刚性配体的过渡金属络合物，特别是二氯二甲基亚乙基桥接的Cyclam合锰和/或二氯二乙基亚乙基桥接的Cyclam合锰；以及过氧化氢释放剂与漂白活化剂4-[N-(壬酰基)氨基己酰基氧基]-苯磺酸钠(NACA-OBS)的组合。
现已发现还包括漂白剂的本发明洗涤剂组合物在包括洗衣、洗碗和硬表面的清洗中可以提供出色的清洁和去污性能。不希望受到理论的限制，但认为漂白剂可以进一步氧化果胶/果胶酸成分中的羟基基团，使它们更加可溶和更易于去除。
已惊奇地发现漂白体系能够使果胶酸裂解酶的清洁效率最大化。此外，还惊奇地发现包含本发明果胶酸裂解酶和漂白体系的洗涤剂组合物由于漂白体系与果胶酸裂解酶的协同作用而提供了优良的清洁作用，其中漂白体系提供出众的清洗能力、去污能力及衣物的白度保持能力，而果胶酸裂解酶降解污物的果胶成分和/或在衣物中能结合污物的织物上的果胶成分。这些漂白体系-酶混合体系提供出色的清洗效果，特别是对食物的有色污渍和身体污物。此外，当配制成衣物和/或织物养护组合物，本发明的组合物提供了协同的白度保持能力。
不希望受到理论的限制，但认为存在于许多通常的水果和蔬菜基污物以及棉织物的初生壁中的天然果胶会吸引并留住污物残渣，特别是高着色的污物成分。通过果胶酸裂解酶除去果胶成分可以将这些有色体暴露于漂白体系。这种协同作用的原因被认为是这些漂白体系通过漂白强硬有色成分以去除食物污渍和身体污物，而果胶酸裂解酶降解污物的果胶成分和/或在衣物中存在于织物上的果胶成分，织物上的果胶成分可与这些污物结合或相互作用从而使所述污物难以去除。
用于这里的漂白剂组分可以是任何可以用于洗涤剂组合物的漂白剂，包括氧漂白剂以及其它本领域已知的漂白剂如粒径为400-800微米的一水合或四水合过硼酸盐和过碳酸盐。
适用于本发明的漂白剂可以是活化的或未活化的漂白剂。
一种可用的氧漂白剂包括过羧酸漂白剂和其盐。此类漂白剂的适当实例包括单过氧邻苯二甲酸镁六水合物、间氯过苯甲酸镁，4-壬氨基-4-氧代过氧丁酸和二过氧十二烷二酸。US 4,483,781、US 740,446、EP 0 133 354和US 4,412,934中公开了这些漂白剂。非常优选的漂白剂也包括在US4,634,551中公开的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。
可使用的其它种类漂白剂包括卤素漂白剂。次卤酸盐漂白剂的实例包括例如三氯异氰脲酸，二氯异氰脲酸钠和钾及N-氯和N-溴烷烃磺酰胺。这些材料通常占成品的0.5-10％重量，优选1-5％重量。
过氧化氢释放剂可与漂白活化剂结合使用，漂白活化剂如四乙酰基乙二胺(TAED)，壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS，在US 4,412,934中公开)，3，5-三甲基-hexsanol氧基苯磺酸盐(ISONOBS，在EP 120 591中公开)或五乙酰基葡萄糖(PAG)，它们在过水解后形成作为活性漂白物的过酸，从而使漂白效果得到提高。另外，非常适合的漂白活化剂是C8(6-辛酰氨基-己酰基)氧基苯磺酸盐，C9(6-壬酰氨基己酰基)氧基苯磺酸盐和C10(6-癸酰氨基己酰基)氧基苯磺酸盐或及其混合物。其它疏水性漂白活化剂包括，但并不局限于，4-[N-(壬酰基)氨基己酰氧基]-苯磺酸钠(NACA-OBS)(其一个实例在美国专利No.5,523,434中公开)、十二碳酰基氧基苯磺酸盐(LOBS或C12-OBS)、10-十一碳烯酰氧基苯磺酸盐(UDOBS或在位置10处不饱和的C11-OBS)和癸酰氧基苯甲酸(DOBA)。同样适当的活化剂是酰化柠檬酸酯，如在EP 624 154中公开的酰化柠檬酸酯。
在本发明的洗涤剂组合物中有用的漂白剂(包括过氧酸)和漂白体系(包含漂白活化剂和过氧漂白化合物)在WO95/10592中公开。
过氧化氢也可在开始或在洗涤和/或漂洗过程中通过添加能够产生过氧化氢的酶体系(即酶及其底物)而存在。这种酶体系公开于欧洲专利申请EP 0 537 381中。
非氧漂白剂的其它漂白剂也是本领域已知的并可在此利用。一种特别有意义的非氧漂白剂包括光活化漂白剂如磺化酞菁锌和/或铝。这些材料在洗涤过程中可以沉积到底物上。在光的辐射下，在氧气中，如在白天通过悬挂衣物干燥，此磺化酞菁锌将被活化，导致底物被漂白。
优选的酞菁锌和光活化漂白方法公开于US 4,033,718。通常，洗涤剂组合物包含约0.025％至约1.25％重量的磺化酞菁锌。漂白剂也可包含锰和钴催化剂，例如锰基催化剂公开于美国专利Nos.5,576,282、5,246,621、5,244,594、5,194,416、5,114,606和欧洲专利申请公开文本Nos.549,271 A1、549,272 A1、544,440 A2和544,490 A1；例如钴漂白催化剂公开于例如美国专利Nos.5,597,936、5,595,967、5,703,030和M.L.Tobe，“过渡金属络合物的碱水解”(″Base Hydrolysis of Transition-Metal Complexes″)，Adv.Inorg.Bioinorg.Mech.，(1983)，2，1-94页。
这里的组合物还可适当包括大多环刚性配体的过渡金属络合物作为漂白催化剂。使用量是催化有效量，适当地约1ppb或更多，例如多达至约99.9％，更通常地约0.001ppm或更多，优选约0.05ppm至约500ppm。
适用于本发明组合物中的具有大环刚性配体的过渡金属漂白催化剂可以通过如下非限制性例子说明二氯-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)二氯-4，11-二甲基-1，4，8，11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)二氯-5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)二氯-4，11-二乙基-1，4，8，11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)二水-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)-六氟磷酸盐一水-羟基-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(III)-六氟磷酸盐二水-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(III)-四氟硼酸盐二氯-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)-六氟磷酸盐二氯-5，12-二正丁基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)二氯-5，12-二苄基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)二氯-5-正丁基-12-甲基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)二氯-5-正辛基-12-甲基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)二氯-5-正丁基-12-甲基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷合锰(II)。
泡沫抑制剂另一可选组分是泡沫抑制剂，例如硅氧烷和二氧化硅-硅氧烷混合物。硅氧烷通常可以由烷基化聚硅氧烷材料代表，而二氧化硅通常以细碎形式使用，例如各种类型的二氧化硅气凝胶和干凝胶及疏水二氧化硅。这些材料可以以微粒的形式掺入，在其中泡沫抑制剂可有利地释放混合到水溶性的或水可分散的、实质上不可透过非表面活性洗涤剂的载体中。
备选地，泡沫抑制剂可以溶解或分散在液体载体中并通过喷涂到一种或多种其它成分上而使用。
优选的硅氧烷泡沫控制剂公开于US 3,933,672。其它特别有用的泡沫抑制剂有自乳化硅氧烷泡沫抑制剂，在德国专利申请DTOS 2,646,126中公开。这种化合物的一个实例是DC-544，为硅氧烷-乙二醇共聚物，可从DowCorning购买。
特别优选的泡沫控制剂为包含硅氧烷油和2-烷基-链烷醇的混合物的泡沫抑制剂体系。适合的2-烷基-链烷醇为2-丁基-辛醇，其可购买得到，商业名是Isofol 12R。
此泡沫抑制剂体系在欧洲专利申请EP 0 593 841中公开。
特别优选的硅氧烷泡沫控制剂在欧洲专利申请No.92201649.8中公开。所述组合物可以包含硅氧烷/二氧化硅混合物与火成无孔二氧化硅如AerosilR。
上述泡沫抑制剂通常为组合物的0.001％到2％重量，优选0.01％到1％重量。
其它成分其它可用于洗涤剂组合物中的成分是如污物悬浮剂、污物释放剂、荧光增白剂、磨料、杀细菌剂、晦暗抑制剂、着色剂和/或包囊化或未包囊化的香料。
特别适合的包囊化材料是水溶性胶囊，该胶囊由多糖和多羟基化合物组成，如GB1,464,616中的公开。
其它适合的水溶性包囊化材料包含糊精，如在US 3,455,838中的公开，其衍生自取代的二羧酸的未胶化淀粉酯。这些酸-酯糊精优选制备自淀粉如蜡质种玉米、蜡质种高梁、西米、木薯和马铃薯的淀粉。所述包囊化材料的适当实例包括National Starch生产的N-Lok。N-Lok包囊化材料由改性玉米淀粉和葡萄糖组成。淀粉通过添加单官能取代基团如辛烯基丁二酸酐改性。
在这里适合的抗再沉淀剂和污物悬浮剂包括纤维素衍生物如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟基乙基纤维素和均-或共-聚多羧酸或它们的盐。这类聚合物包括在前作为助洗剂描述的聚丙烯酸酯和马来酸酐-丙烯酸共聚物，以及乙烯马来酸酐与乙烯、甲基乙烯基醚或甲基丙烯酸的共聚物，马来酸酐占共聚物的至少20摩尔％。这些材料通常以组合物的0.5％到10％重量，更优选0.75％到8％，最优选1％到6％重量使用。
优选的荧光增白剂在性质上是阴离子的，其例子是4，4′-二-(2-二乙醇氨基-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′二磺酸二钠、4，4′-二-(2-吗啉代-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)-二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、4，4′-二-(2，4-二苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、4′，4″-二-(2，4-二苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2-磺酸钠、4，4′-二-(2-苯氨基-4-(N-甲基-N-2-羟基乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、4，4′-二-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)-二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、4，4′-二-(2-苯氨基-4-(1-甲基-2-羟基乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、2-(二苯乙烯基-4″-(萘并-1′，2′4，5)-1，2，3-三唑-2″-磺酸钠和4，4′-二-(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它可用的聚合材料有聚乙二醇，特别是分子量1000-10000，更优选2000到8000且最优选约4000的聚乙二醇。这些材料以0.20％到5％，更优选0.25％到2.5％重量使用。这些聚合物和在前提到的均聚-或共聚-多羧酸盐对于在过渡金属杂质存在时粘性、蛋白质性和可氧化的污物上白度维护、织物灰沉积和清洁性能的提高是有价值的。
本发明组合物中可用的污物释放剂通常是具有不同排列的乙二醇和/或丙二醇单元与对苯二酸的共聚物或三元共聚物。此聚合物的实例公开于US 4,116,885和4,711,730和EP 0 272 033。根据EP 0 272 033的特别优选的聚合物具有以下通式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)且T是(pOOC6H4CO)。
另外非常有用的是作为对苯二甲酸二甲酯、磺基间苯二甲酸二甲酯、乙二醇和1，2-丙二醇的随机共聚物的改性聚酯，端基主要由磺基苯甲酸酯以及其次由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯构成。目标是得到一种两端都被磺基苯甲酸酯基团封端的聚合物，在本上下文中，“主要”是指大部分所述共聚物被磺基苯甲酸酯基团封端。然而，有些共聚物未被完全封端，因此它们的端基可由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯构成，即“其次”由该类物质构成。
这里选择的聚酯包含约46％重量的二甲基对苯二甲酸、约16％重量的1，2-丙二醇，约10％重量的乙二醇，约13％重量的二甲基磺基苯甲酸和约15％重量的磺基间苯二甲酸，并且其分子量为约3,000。聚酯和它们的制备方法参见EP 311 342中的公开。
软化剂织物软化剂也可混合到本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些软化剂可以是无机或有机类型。无机软化剂可举例的有如在GB-A-1 400898和US5,019,292中公开的绿土粘土(smectite clay)。有机织物软化剂包括在GB-A1514 276和EP 0 011 340中公开的水不溶性叔胺和在EP-B-0 026 528中公开的它们同单C12-C14季铵盐的联合和在EP 0 242 919中公开的双长链酰胺。其它可用的织物软化体系的有机成分包括在EP 0 299 575和0 313146中公开的高分子量聚环氧乙烷材料。
绿土粘土的水平通常是5％到15％，更优选8％到12％重量，该材料以干燥混合成分加入到制剂的剩余组分中。有机织物软化剂如水不溶性叔胺或双长链酰胺材料的掺入水平为0.5％到5％重量，通常为1％到3％重量，而高分子量聚环氧乙烷材料和水溶性阳离子材料的加入水平为0.1％到2％，通常为0.15％到1.5％重量。这些材料通常加入到组合物的喷雾干燥部分中，尽管在一些情况下可能更适合将它们以干燥混合颗粒形式添加到其中，或将它们以熔化溶液形式喷到组合物的其它固体组分上。
聚合染料转移抑制剂本发明的洗涤剂组合物也可包含0.001％到10％，优选0.01％到2％，更优选0.05％到1％重量的聚合染料转移抑制剂。所述聚合染料转移抑制剂通常混合到洗涤剂组合物中用以抑制染料从有色织物转移到同时洗涤的其它织物上。这些聚合物能够在从染色织物洗出的易褪色染料有机会接触洗涤中的其它织物之前结合或吸收该染料。
特别适合的聚合染料转移抑制剂是多胺N-氧化化物聚合物、N-乙烯基-吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物，聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑或它们的混合物。
添加这些聚合物也可提高本发明酶的性能。
本发明的洗涤剂组合物可为液体、浆状、凝胶、棒状或颗粒形式。
无尘颗粒可采用例如在US 4,106,991和4,661,452(两者都是NovoIndustri A/S的)公开的方法生产，并可任择性地通过本领域已知方法加包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1000到20000聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)的；具有16到50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；具有15到80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12到20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于流化床技术的膜形成包衣材料的实例在GB 1483591中给出。
本发明颗粒组合物也可以采取“致密形式”，即，它们可以具有比通常的颗粒洗涤剂更高的密度，即550到950g/l；在此情况下，本发明的颗粒洗涤剂组合物可包括较通常的颗粒洗涤剂较小量的“无机填料盐”；典型的填料盐是碱土金属的硫酸盐和氯化物，典型地为硫酸钠；“致密”洗涤剂通常包含至多10％的填料盐。本发明的液体组合物也可是“致密形式”，在此情况下，本发明的液体洗涤剂组合物可包括较通常的液体洗涤剂较小量的水。通常，浓缩的液体洗涤剂的水含量占洗涤剂组合物重量的不到30％，更优选不到20％，最优选不到10％。
本发明的组合物可以例如配制成手洗和机洗洗衣洗涤剂组合物(其中包括洗衣添加剂组合物和适合用于污染织物的预处理的组合物)，漂洗时添加的织物柔软组合物，和用于普通家庭清洗硬表面和洗碗操作的组合物。
下述实施例旨在举例说明本发明组合物，而非旨在对本发明范围进行限定或定义。在洗涤剂组合物中，简写的成分标识符的意义如下LAS 直链C12烷基苯磺酸钠TAS 牛油烷基硫酸钠XYASC1x-C1y烷基硫酸钠ABEY与平均Y摩尔的环氧乙烷缩合的主要为C1A-C1B的直链伯醇XYEZS每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C1x-C1y烷基硫酸钠非离子表面活剂平均乙氧基化程度为3.8而平均丙氧基化程度为4.5的C13-C15混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由BASFGmbH售出，商品名为PlurafaxLF404CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAAC16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
QAS R2.N+(CH3)2(C2H4OH)，其中R2＝C12-C14DTPA亚乙基三胺五乙酸SADS式2-R.C4H7.-1，4-(SO4)2-(其中R＝C10-18)的C14-22烷基二硫酸钠MESx-磺基C18脂肪酸甲酯皂衍生自牛油和椰子油脂肪酸的80/20混合物的直链烷基羧酸钠硅酸盐无定型硅酸钠(SiO2∶Na2O比率＝2.0)NaSKS-6式d-Na2Si2O5的晶状多层硅酸盐碳酸盐无水碳酸钠MA/AA1∶4马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约为80,000沸石A基本颗粒大小在1-10微米范围内的式Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅铝酸钠柠檬酸盐二水合柠檬酸三钠PB1无水过硼酸钠一水合物漂白剂过碳酸盐 经验式为2Na2CO3·3H2O2的无水过碳酸钠漂白剂TAED乙酰基乙二胺NACA-OBS4-[N-(壬酰基)氨基己酰氧基]-苯磺酸钠NOBS壬酰氧基苯磺酸钠盐CMC羧甲基纤维素钠HEDP羟基乙烷二亚甲基膦酸DETPMP二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto售出，商品名为Dequest2060TEPAE亚乙基五胺乙氧基化物PVP聚乙烯吡咯烷酮聚合物PVPVI聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物PVNO平均分子量为50,000的聚乙烯基吡啶-N-氧化物增白剂4，4′-二(2-磺基苯乙烯基)联苯二钠和/或4，4′-二(4-苯氨基-6-吗啉代-1，3，5-三嗪-2-基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠EDDS钠盐形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]异构体泡沫抑制剂MPT(熔点)为50℃的25％石蜡，17％疏水二氧化硅，58％石蜡油颗粒泡沫抑制剂12％硅氧烷/二氧化硅、18％十八烷醇、70％颗粒形式的淀粉硫酸盐无水硫酸钠HMWPEO高分子量的聚环氧乙烷酶说明书中以上所述的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶金属催化剂二氯二乙基亚乙基桥接的Cyclam合锰胺C8-10酰氨基丙基二乙胺SRP阴离子封端的聚酯STPP三磷酸钠碳酸氢盐碳酸氢钠PAAC五氨合醋酸钴(III)盐石蜡石蜡油，由Wintershall售出，商品名为Winog70BTA苯并三唑三乙酸盐三水合乙酸钠PEGX分子量约为X的聚乙二醇SKTP三磷酸钠钾SLF18购自Olin Corporation的低泡沫型表面活性剂ACNI式C9/11H19/23EO8-环己基缩醛的烷基封端的非离子表面活性剂PA30购自BASF的分子量约为8,000的聚丙烯酸酯均聚物聚凝胶预混物购自3V Inc.的5％活性聚凝胶DKP的水溶液BTA苯并三唑
MEA单乙醇胺酶组分以纯酶占总组合物重量的百分数包含在实施例中。
下列非限制性实施例用来对本发明进行举例说明。
材料和方法菌株和供体生物枯草杆菌DSM 14218包含含有编码本发明果胶酸裂解酶的DNA(SEQID NO1)的质粒。该基因也可克隆自菌株ATCC 23857(枯草杆菌PL2306)或该DNA可来自于同样的菌株ATCC 23857D(两者都可以获得自ATCC，LGC Promochem AB，PO Box 1737，SE-501 17 Boras，瑞典)。
枯草杆菌PL 1801。该菌株是具有被破坏的apr和npr基因的枯草杆菌DN 1885(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjфholm，C.(1990)，编码来自于短芽孢杆菌的胞外酶α-乙酰乳酸脱羧酶的aldB的克隆，细菌杂志(J.Bacteriol.)，172，4315-4321)，这种破坏发生于已知枯草杆菌纤维素基因的转录单元内，导致产生纤维素酶阴性细胞。基本上如(Eds.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick(1993)枯草杆菌和其它革兰氏阳性细菌(Bacillus substillis and other Gram-PositiveBacteria)，美国微生物学会，p.618)所述进行这种基因破坏。
按Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F.E.(1975)枯草杆菌溶原性菌株的转化和转染证明感受态细胞中原噬菌体的选择性诱导.细菌学杂志，(J.Bacteriol.)121296-304)所述的方法制备和转化感受态细胞。
常规分子生物学方法除非另作说明，所有的DNA操作和转化都采用标准的分子生物学方法(Sambrook等.(1989)分子克隆实验指南，(Molecular cloningAlaboratory manual)冷泉港实验室，冷泉港，NY；Ausubel，F.M.等.(编)“最新分子生物学手册”(Current Botocots in Molecular Biology).John Wileyand Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编)“芽孢杆菌分子生物学方法”(Molecular Biological Methods for Bacillus).John Wiley和Sons，1990)。
按制造商说明书使用用于DNA操作的酶(如可从New England Biolabs，Inc获得限制性内切酶、连接酶等)。
基因组DNA制备按ATCC(美国典型培养物保藏中心，USA)的详细说明，在液体培养基3中进行用作供体生物的枯草杆菌菌株的增殖。37℃以300rpm温育18小时后，回收细胞，按Pitcher等[Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J；用硫氰酸胍快速抽提细菌基因组DNA；应用微生物学通讯(lett ApplMicrobiol)1989，8151-156]的方法分离基因组DNA。
质粒pMOL995该质粒是pUB110的衍生物，基本上包含使该质粒能在枯草杆菌内增殖的元件、卡那霉素抗性基因，并有克隆自解淀粉芽孢杆菌amyQ基因的强启动子和信号肽。该信号肽包含一个Sac II位点，这便于克隆与信号肽融合的蛋白质成熟部分的编码DNA。这就导致前蛋白的表达，该蛋白质被导向细胞外部。
该质粒用普通的基因工程方法构建而成，简述如下。
质粒DMOL995的描述以质粒pUB110(McKenzie，T.等.，1986，质粒(Plasmid)1593-103)为基础，构建pMOL995。在几个克隆步骤中将不同的特征导入pUB110的限制酶切位点NciI。
pMOL995(SEQ ID NO3)的特征是碱基4076-6661和1-1962编码质粒pUB110。
碱基1963-2305编码来自地衣芽孢杆菌ATCC 14580的amyL基因的转录终止子和一些导入的单限制性酶切位点(EagI、SalI等)。
碱基2306-3766(反向)编码来自WO95/26397(公开于WO95/26397的SEQ ID NO4)的α-淀粉酶成熟部分。
碱基3767-4705(反向)编码克隆自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的启动子和信号肽(见于WO95/10603并用作启动子)和在碱基4075位附近导入的单SacI和XmaI位点及在碱基3769位附近导入的单Sac II位点，所述位点用于随后在符合读框中克隆信号肽。
pMOL944该质粒是pUB110的衍生物，基本上包含使该质粒能在枯草杆菌内增殖的元件、卡那霉素抗性基因，并具有克隆自地衣芽孢杆菌ATCC14580的amyL基因的强启动子和信号肽。该信号肽包含一个Sac II位点，这便于克隆与信号肽融合的蛋白质成熟部分的编码DNA。这就导致前蛋白的表达，该蛋白质被导向细胞外部。
该质粒用普通的基因工程方法构建而成，简述如下。
pMOL944的构建用单限制性内切酶NciI消化pUB110质粒(McKenzie，T等，1986，质粒1593-103)。将扩增自质粒pDN1981(P.L.Jorgensen等.，1990，基因，96，p37-41.)上之amyL启动子的PCR片段用NciI消化，并插入NciI消化的pUB110中，产生质粒pSJ2624。
所用的两个PCR引物具有如下序列引物C(SEQ ID NO8)5′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACIGTATCTCAGC-3引物D(SEQ ID NO9)5′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCIGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′引物C向质粒中插入一个NotI位点。
质粒pSJ2624随后用SacI和NotI消化，且用SacI和NotI消化扩增自pDN1981上的amyL启动子的新PCR片段(所述片段用引物E和F合成)，将该DNA片段插入SacI-NotI消化的pSJ2624，从而产生质粒
pSJ2670。
该克隆步骤将第一次克隆的amyL启动子替换为方向相反的同一启动子。用于PCR扩增的两个引物具有如下序列引物E(SEQ ID NO10)5′-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′引物F(SEQ ID NO11)5′-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′质粒pSJ2670用限制性内切酶PstI和BclI消化，将用两个引物G和H扩增自编码碱性淀粉酶SP772(见WO9526397A1)的克隆DNA序列的PCR片段用PstI和BclI消化后插入上述质粒，从而产生质粒pMOL944。用于PCR扩增的两个引物具有如下序列引物G(SEQ ID NO12)5′-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′引物H(SEQ ID NO13)5′-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′引物H向质粒中插入一个SacII位点。
培养基TY(如Ausubel，F.M.等.(编.)″最新分子生物学手册″.John Wiley和Sons，1995中所述)。
LB琼脂(如Ausubel，F.M.等.(编.)″最新分子生物学手册″.JohnWiley和Sons，1995中所述)。
LBPG是补充有0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾，pH7.0的LB琼脂。
BPX培养基描述于EP 0 506 780(WO 91/09129)中。
终点裂解酶试验(于235nm)，果胶酸活力单位为了测定β-消除，用溶解在0.1M EPPS缓冲液(pH8)中的1.0％多聚半乳糖醛酸钠盐(Sigma P-1879)作为底物测量235nm处吸光值的增加。70℃温育20分钟。添加5倍体积的0.02M H3PO4停止反应。计算催化速率时，每分钟235nm处吸光值增加5.2相应于形成1μmol不饱和产物(Nasuna和Starr(1966)生物化学杂志(J.Biol.Chem.).Vol 241 5298-5306页；以及Bartling，Wegener和Olsen(1995)微生物学(Microbiology)Vol 141873-881页)。
一个果胶酸活力单位定义为在pH8.0和70℃下，每分钟导致一微摩尔量切割产物形成所需要的酶量。
实施例1克隆枯草杆菌果胶酸裂解酶基因在枯草杆菌中亚克隆和表达成熟果胶酸裂解酶用以下两个寡核苷酸组成的PCR引物组对编码本发明的果胶酸裂解酶的DNA序列做PCR扩增SEQ ID NO4(引物A)5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG-3’SEQ ID NO5(引物B)5’-GTA CCT CGC GAG TCG ACT TCT TAA TTT AAT TTA CCC GCA CCC GC-3’限制性位点Sac II和Sal I加有下划线。
上述寡核苷酸用于PCR反应，该反应于补充有dNTP各200μM、2.6单位的HiFidelityTMExpand酶混合物及引物各200pmol的HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中进行。将分离自枯草杆菌菌株的基因组DNA作为模板添加入该PCR反应。基因组DNA按如上所述分离。
用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。94℃温育1分钟进行1个循环；然后进行10个循环，每个循环为94℃变性15秒，60℃退火60秒，72℃延伸120秒；然后进行20个循环，每个循环为94℃变性15秒，60℃退火60秒及70℃延伸120秒(在此延伸步骤，每个循环增加20秒)。在0.7％琼脂糖凝胶(Nusieve，FMC)上电泳分析5μl扩增产物。大小为1.2kb的DNA片段的出现表明基因片段得到正确扩增。
亚克隆PCR片段按制造商说明书用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen，USA)纯化上述产生的PCR产物的45μl等分试样。纯化的DNA洗脱于50μl、pH8.5的10mM Tris-HCl中。用Sac II和Sal I消化5μg pMOL995和25μl纯化的PCR片段，在0.7％琼脂糖凝胶(Nusieve，FMC)上电泳，将相关片段从胶上切下，按制造商说明书用QIA快速凝胶抽提试剂盒(Qiagen，USA)进行纯化。随后将分离的PCR DNA片段连接到经Sac II-Sal I消化并纯化的pMOL995上。用各0.5μg的每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)16℃过夜完成连接。
连接混合物被用于转化感受态枯草杆菌PL2306。将转化细胞铺于含10μg/ml卡那霉素的LBPG琼脂平板上。37℃温育18小时后，菌落出现于平板上。几个克隆通过从过夜肉汤培养液分离质粒DNA来分析。
一个这样的阳性克隆重划线几次于如上所用的琼脂平板上，该克隆被称为MB331。MB331克隆在含10μg/ml卡那霉素的TY中，37℃培养过夜，第二天按制造商为枯草杆菌质粒制备推荐的方法，用Qiaprep Spin质粒小量制备试剂盒#27106从1ml细胞中分离质粒。质粒DNA进行测序并揭示和SEQ ID NO1中编码成熟果胶酸裂解酶的果胶酸裂解酶基因的一部分具有同一性的DNA序列。
实施例2表达、纯化和鉴定枯草杆菌果胶酸裂解酶在500ml带挡板的锥形瓶里将如实施例1所述获得的MB331克隆(保藏为DSM 14218)在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中37℃，300rpm培养5天，得到4550ml肉汤培养液。用醋酸将培养液的pH调节到6.1，然后，在搅拌中加入25ml的阳离子试剂(C521 10％)和60ml阴离子试剂(A130 0.1％)用于产生絮凝。利用Sorval RC 3B离心机，在6℃，10000rpm离心30分钟分离絮凝的物质。产生的上清液总体积为3750ml。
利用Whatman GF/D和C号玻璃滤器澄清上清液，最后在截留分子量为10kDa的Filtron UF膜上浓缩，总体积为1500ml，将pH调至6.0。
为了获得高纯度的果胶酸裂解酶，最后一步进行S-Sepharose阳离子交换层析。将1500ml溶液上样于用50mmol pH6.0的醋酸钠缓冲液平衡好的800ml含S-Sepharose(Pharmacia)的柱中。果胶酸裂解酶发生结合，之后用0.5M NaCl梯度洗脱。
鉴定纯酶在SDS-PAGE上为44kDa的单一条带，等电点约为7.6。
测定蛋白质的浓度时使用摩尔消光系数71950(基于推断自该序列的氨基酸组成)。
果胶酸裂解酶的活性可被EDTA抑制。
差示扫描量热法(DSC)显示纯酶在pH8的0.1M Tris缓冲液中的熔解温度为58.8℃。
实施例3克隆枯草杆菌168果胶酸裂解酶基因在枯草杆菌中亚克隆和表达成熟果胶酸裂解酶用以下两个寡核苷酸组成的PCR引物组对编码本发明的果胶酸裂解酶的DNA序列做PCR扩增SEQ ID NO14(引物J)5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG-3′
SEQ ID NO15(引物K)5′-GTA CCT CGC GAG CGG CCG CTT CTT AAT TTA ATT TAC CCG CAC CCG C-3′限制性位点Sac II和Not I加有下划线。
上述寡核苷酸用于PCR反应，该反应于补充有dNTP各200μM、2.6单位的HiFidelityTMExpan酶混合物及引物各200pmol的HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中进行。如上所述方法分离自枯草杆菌菌株的基因组DNA作为模板添加入该PCR反应。
用DNA热循环仪(Landgraf，德国)进行PCR反应。94℃温育1分钟进行1个循环；然后进行10个循环，每个循环为94℃变性15秒，60℃退火60秒，72℃延伸120秒；之后进行20个循环，各为94℃变性15秒、60℃退火60秒及70℃延伸120秒(在此延伸步骤，每个循环增加20秒)。在0.7％琼脂糖凝胶(Agarose，SIGMA)上电泳分析5μl扩增产物。大小为1.2kb的DNA片段的出现表明基因片段得到正确扩增。
亚克隆PCR片段按制造商说明书用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen，USA)纯化上述产生的PCR产物的45μl等分试样。纯化的DNA洗脱于50μl、pH8.5的10mM Tris-HCl中。用Sac II和Sal I消化5μg pMOL944和25μl纯化的PCR片段，在0.7％琼脂糖凝胶(NuSieve，FMC)上电泳，将相关片段从胶上切下，按制造商说明书用QIA快速凝胶抽提试剂盒(Qiagen，USA)进行纯化。随后将分离的PCR DNA片段连接到经Sac II-Sal I消化并纯化的pMOL944上。用各0.5μg的每种DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)16℃过夜完成连接。
连接混合物被用于转化感受态枯草杆菌PL1801。将转化细胞铺于含10μg/ml卡那霉素的LBPG琼脂平板上。37℃温育18小时后，菌落出现于平板上。几个克隆通过从过夜肉汤培养液分离质粒DNA来分析。
一个这样的阳性克隆重划线几次于如上所用的琼脂平板上，该克隆被称为MB1306。MB1306克隆在含10μg/ml卡那霉素的TY中，37℃培养过夜，第二天按制造商为枯草杆菌质粒制备推荐的方法，用Qiaprep Spin质粒小量制备试剂盒#27106从1ml细胞中分离质粒。质粒DNA进行测序并揭示了和SEQ ID NOxx中编码成熟果胶酸裂解酶的果胶酸裂解酶基因的一部分具有同一性的DNA序列。
实施例4表达枯草杆菌168的果胶酸裂解酶在500ml带挡板的锥形瓶里将如实施例3所述获得的MB1306克隆在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培养基中37℃，300rpm培养5天，得到4550ml肉汤培养液。
实施例5克隆枯草杆菌DSM 14979的果胶酸裂解酶基因用如下寡核苷酸组成的PCR引物组对编码果胶酸裂解酶的来自枯草杆菌DSM 14979的DNA序列做PCR扩增SEQ ID NO16(引物L)5 ′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG-3’SEQ ID NO17(引物M)5’-GTA CCT CGC GAG CGG CCG CTT CTT AAT TTA ATT TAC CCG CAC CCG C-3’限制性位点Sac II和Not I加有下划线。
寡核苷酸各50pmol用于PCR反应，该反应于含有dNTP各200μM、3.5mM MgCl2、2.5单位的AmpliTaq GoldTM(Perkin-Elmer)的PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl)中进行，大约100到200ng按如上所述方法分离的基因组DNA作为PCR扩增反应的模板。总体积为50μl。该PCR反应在Perkin-Elmer GeneAmp PCR系统2400中进行。
该PCR反应的循环方案为94℃-10分钟；1个循环
94℃-1分钟，55℃-30秒，72℃-1分30秒；25个循环72℃-7分钟；1个循环。
在1.0％琼脂糖凝胶(Agarose，SIGMA)上电泳分析5μl扩增产物。大小为1.2kb的DNA片段的出现表明基因片段得到正确扩增。片段测序结果揭示了编码来自枯草杆菌DSM 14979的成熟果胶酸裂解酶(显示于SEQ IDNO19中)的DNA序列(显示于SEQ ID NO18中)。
实施例6测定果胶酸裂解酶在液体洗涤剂中的稳定性本发明的果胶酸裂解酶变体的洗涤剂稳定性是通过按如下所述方法在温育酶和洗涤剂混合物后测定变体的活性来确定的。
残留活性测定在两个样品管中分别装入30微升酶溶液(培养物上清液或纯酶)与1ml典型的欧洲或美国强效型液体洗涤剂的混合物。其中一管贮藏在冰上，另一管于40℃温育90分钟。将30微升的水与1ml的洗涤剂混合并在冰上温育，作为参照物。
温育后，9ml的冰冷的水加入样品中，剧烈混合并贮藏在冰上待进一步的分析。
对于酶活性的测定，首先混合50微升酶-洗涤剂混合物和5ml检测缓冲液(100mM Tris-HCl，0.68mM CaCl2，pH8.0)，其次从该溶液中取出75微升与75微升新鲜制备的底物溶液(含1％多聚半乳糖醛酸的检测缓冲液)混合并于40℃温育10分钟。再后，将100微升的温育混合物加入在UV-透明微量滴定板中的100微升终止缓冲液(50mM H3PO4)内，并用分光光度计测量235nm处的吸光值。水-洗涤剂样品用来调节分光光度计的零点。
此时，通过计算在40℃温育90分钟的样品的活性(A235吸收值)与贮藏在冰上的样品的活性的相对值，得到残留活性值残留活性(RA)＝吸收值[温育在40℃的样品]/吸收值[温育在0℃的样品]因此，残留活性等价于酶的洗涤剂稳定性。

图1列出了温育在典型的欧洲强效型液体洗涤剂中的MB331果胶酸裂解酶的一些替代变体的提高的残留活性。相对于亲本果胶酸裂解酶，大多数替代变体的洗涤剂稳定性提高了50％以上。等同地，在图2中列出的MB331果胶酸裂解酶的替代变体当温育于典型的美国强效型液体洗涤剂中时也明显地提高了酶的稳定性。
图1.导致在欧洲强效型液体洗涤剂中温育后残留活性增加的SEQ ID NO2果胶酸裂解酶中的替代。



图2.导致在美国强效型液体洗涤剂中温育后残留活性增加的SEQ ID NO2果胶酸裂解酶中的替代。


洗涤性能实施例洗涤性能实施例A以全规模(fullscale)测试本发明果胶酸裂解酶。
来自克隆MB331的果胶酸裂解酶(SEQ ID NO2)(以下表示为MB331酶)在欧洲强效型液体洗涤剂中使用一系列不同测试样品于全规模洗涤中进行行评价。所使用的酶水平是0.05mg MB331酶/每升洗涤水。在许多不同的水果或蔬菜基污渍上以此剂量水平发现非常高的洗涤性能，见下表所示。


方法描述使用下列设备和洗涤条件。
洗涤器AEG kolavamat 86820(最新式)洗涤程序40℃短洗涤洗涤剂5g/l欧洲强效型液体洗涤剂水硬度15°dH(4∶1 Ca/Mg；2.14mM CaCl2和0.54mM MgCl2)酶每升洗涤水0.05mg MB331果胶酸裂解酶蛋白样品来自Equest的预制备食物污渍评估用Elrepho 2000反射率分光光度计在460nm处测定反射率。
Δ反射率根据如下计算R酶-R无酶，其中R是在460nm处的反射率。
洗涤性能实施例B在小规模洗涤中果胶酶对香蕉样品的洗涤性能。
在使用耐洗牢度试验仪(Laundermeter)和香蕉样品在小规模洗涤试验中，于欧洲强效型液体洗涤剂中将来自克隆MB331的果胶酸裂解酶(SEQID NO2)与其它果胶酸裂解酶作比较。结果见下表，其中将MB331的洗涤性能效果调到100％。
来自枯草杆菌DSM14218的果胶酸裂解酶(SEQ ID NO2，来自克隆MB331)和来自枯草杆菌A168的果胶酸裂解酶(SEQ ID NO7，来自克隆MB1306)观察到具有最佳的洗涤性能，然而来自地衣芽孢杆菌(SP958)和B.agaradherens(SP956)的果胶酸裂解酶显示出低于50％的洗涤性能。

方法描述制备香蕉样品将三个香蕉捣碎并在搅拌机内加入70ml去离子水匀浆3-4分钟。悬浮液被倒入盘中并放置约2小时。清洁的棉布样品(来自Testfabrics Inc.，型号400)浸泡在该悬浮液中，在两个轧辊之间挤压并干燥过夜。
洗涤性能测定香蕉样品用耐洗牢度试验仪(Laundermeter)在欧洲强效型液体洗涤剂和15°dH水(4∶1Ca/Mg)中洗涤。水的硬度通过添加CaCl2(2.14mM)和MgCl2(0.54mM)调节。每个烧杯(500ml)加入20个钢球，200ml洗涤剂溶液，0.05mg/l果胶酶和3个香蕉样品(5cm×5cm)。洗涤程序是从25℃到40℃加热10分钟，随后在40℃洗涤20分钟。样品在自来水中漂洗并在室温中干燥过夜。
评估样品的反射率用MacBeth ColorEye 7000反射率分光光度计在440nm处测定。
洗涤性能实施例C在液体洗涤剂中具有提高的稳定性的MB331变体已制造出在强效型液体洗涤剂中具有改善稳定性的MB331果胶酸裂解酶变体。通过在液体洗涤剂中35℃下储藏果胶酸裂解酶7天来测定其稳定性，随后使用香蕉样品在耐洗牢度试验仪(Laundermeter)测试中评估洗涤性能。下表显示4种不同的MB331变体在储藏稳定性上具有强的改善。MB331-varl47和168的洗涤性能没有改变，然而MB331-varl 35和137的洗涤性能比MB331的洗涤性能略低。

方法描述果胶酶在欧洲强效型液体洗涤剂内在35℃水浴中温育7天。储藏的样品和新鲜的酶用购买自Equest的香蕉污渍样品和0.01mg/l果胶酶在耐洗牢度试验仪(Laundermeter)，洗涤性能分析(见洗涤性能实施例B中所述)中测试。新鲜的MB331的洗涤性能调节到100％。储藏七天后，酶的储藏稳定性用与新鲜的酶相比残留的洗涤性能％来计算。
洗涤剂实施例洗涤剂实施例I本发明颗粒织物洗涤剂组合物可如下制备A BCLAS 6.5 8.0 8.0硫酸钠 15.020.0 20.0沸石A 26.020.0 25.0次氮基三乙酸钠 5.0 -2.0本发明的酶 0.010.0010.05PVP 0.5 -0.5TAED3.0 -2.0硼酸4.0 --PB1 18.015.0015.00NACA-OBS- -1.0金属催化剂 0.02--酚磺酸盐0.1 --微量物质(其它酶、增白剂、香料、染料...)达到100
洗涤剂实施例II本发明致密颗粒织物洗涤剂组合物(密度800g/l)可如下制备A B45AS 8.0 8.025E3S 2.0 2.025E5 3.0 3.025E3 3.0 3.0TFAA 2.5 2.5沸石A 17.017.0NaSKS-6 12.012.0柠檬酸3.0 3.0碳酸盐7.0 7.0MA/AA 5.0 5.0CMC 0.4 0.4酶0.050.05本发明的酶0.010.001TAED 6.0 6.0过碳酸盐 22.022.0EDDS 0.3 0.3颗粒泡沫抑制剂3.5 3.5水/微量物质(增白剂、香料、染料...)达到100％洗涤剂实施例III尤其可用于洗涤有色织物的本发明的颗粒织物洗涤剂组合物，制备如下A BLAS 10.7 -TAS 2.4 -TFAA - 4.0
45AS 3.110.045E7 4.0-25E3S - 3.068E11 1.8-25E5 - 8.0柠檬酸盐 15.0 7.0碳酸盐 - 10柠檬酸 2.53.0沸石A 32.1 25.0Na-SKS-6 - 9.0MA/AA 5.05.0DETPMP 0.20.8本发明的酶 0.10 0.05硅酸盐 2.5-硫酸盐 5.23.0PVP0.5-PVPVI - 0.2PB11.0-酚磺酸盐 0.2-水/微量物质 达到100％洗涤剂实施例IV可在洗涤过程中提供软化能力的本发明颗粒织物洗涤剂组合物可如下制备A B45AS- 10.0LAS 7.6-68AS1.3-45E74.0-
25E3 - 5.0椰油烷基-二甲基羟乙基 1.4 1.0铵氯化物柠檬酸盐 5.0 3.0Na-SKS-6 - 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP0.4 0.4PB1 15.0 -过碳酸盐 - 15.0TAED 5.0 5.0绿土粘土 10.0 10.0HMWPEO- 0.1本发明的酶0.10 0.05硅酸盐3.0 5.0碳酸盐10.0 10.0颗粒泡沫抑制剂1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/微量物质达到100％洗涤剂实施例V以下洗衣组合物可以是颗粒状或片状，其根据本发明制备。
A B C D E基础产物C45AS/TAS 8.05.03.03.03.0LAS 8.0- 8.0- 7.0C25AE3S 0.52.01.0- -C25AE5/AF32.0- 5.02.02.0
QAS -- - 1.01.0沸石A20.0 18.0 11.0- 10.0SKS-6(I)(干燥加入) -- 9.0 - -MA/AA2.0 2.02.0 - 4.0柠檬酸盐 -2.0- - -柠檬酸 2.0 - 1.5 2.0-DTPA 0.2 0.2- - -EDDS -- 0.5 0.1-HEDP -- 0.2 0.1-PB1 3.0 5.010.0- 4.0过碳酸盐 -- - 18.0 -NOBS 3.0 4.0 - - 4.0NACAOBS -- 2.0- -TAED -- 2.05.0-金属催化剂 -0.02- - -碳酸盐 15.0 18.08.015.0 15.0硫酸盐 5.0 12.02.017.0 3.0硅酸盐 -1.0 - - 8.0本发明酶 0.0010.002 0.02 0.05 0.005水分和杂质 达到100％洗涤剂实施例VI以下颗粒洗涤剂根据本发明制备A B C D E F G H基础颗粒STPP - 22.0 - 15.0 - 22.0- 15.0沸石A 30.0- 24.0 5.030.0 - 24.0 5.0硫酸盐5.5 5.07.07.05.55.0 7.07.0MA/AA3.0 12 - 6.0- 3.012.02.06.0LAS 14.010.0 9.020.0 14.0 10.09.020.0
C45AS 8.07.09.07.08.07.09.07.0C45AE11S - 1.0- 1.0- 1.0- 1.0MES0.54.06.0- 0.54.06.0-SADS 2.5- - 1.02.5- - 1.0硅酸盐 - 1.00.510.0 - 1.00.510.0皂 - 2.0- - - 2.0- -增白剂 0.20.20.20.20.20.20.20.2碳酸盐 6.09.08.010.0 6.09.08.010.0PEG4000- 1.01.5- - 1.01.5-DTPA - 0.4- - - 0.4- -喷涂到C25E9 - - - 5.0- - - 5.0C45E7 1.01.0- - 1.01.0- -C23E9 - 1.02.5- - 1.02.5-香料 0.20.30.3- 0.20.30.3-干燥添加剂碳酸盐 5.010.0 13.0 8.05.010.0 13.0 8.0PVPVI/PVO 0.5- 0.3- 0.5- 0.3-酶 0.04 0.03 0.03 .040.04 0.03 0.03 0.01本发明的酶 0.001 0.02 0.03 0.015 0.001 0.02 0.03 0.015DTPA 0.50.30.51.00.50.30.51.0PB15 3.010 4.05 3.010 4.0NOBS/TAED 0.50.30.50.60.50.30.50.6硫酸盐 4.05.0- 5.04.05.0- 5.0SRP- 0.4- - - 0.4- -颗粒泡沫抑制剂 - 0.5- - - 0.5- -染斑(speckle) 0.9- 2.71.20.9- 2.71.2水分和杂质 达到100％
洗涤剂实施例VII以下液体洗涤剂制剂根据本发明制备A B C D ELAS 11.59.0- 4.0-C25E2.5S - 3.018.0- 16.0C45E2.25S11.53.0- 16.0 -C23E9- 3.02.0 2.01.0C23E73.2 - - - -CFAA - - 5.0 - 3.0TopPalmKernel脂肪酸 2.0 - 2.0 0.52.0柠檬酸(50％) 6.5 1.02.5 4.02.5Ca和/或Ca甲酸盐 0.6 0.70.2 0.05 0.05SCS 4.0 1.03.0 1.2-硼酸盐 0.6 - 3.0 2.03.0氢氧化钠 6.0 2.03.5 4.03.0乙醇 2.0 1.04.0 4.03.01，2-丙二醇 3.0 2.08.0 8.05.0一乙醇胺 3.0 1.51.0 2.51.0TEPAE2.0 - 1.0 1.01.0本发明的酶 0.001 0.002 0.010.01 0.005酶 0.030.01 0.030.02 0.02SRP 0.2 - 0.1 - -DTPA - - 0.3 - -PVNO - - 0.3 - 0.2增白剂 0.2 0.07 0.1 - -泡沫抑制剂 0.040.02 0.1 0.10.1杂质和水洗涤剂实施例VIII本发明强效液体织物洗涤剂组合物可如下制备A B酸形式的LAS - 25.0柠檬酸 5.02.0酸形式的25AS8.0-酸形式的25AE2S 3.0-25AE7 8.0-CFAA5 -DETPMP 1.01.0脂肪酸 8 -油酸- 1.0乙醇4.06.0丙二醇 2.06.0本发明的酶 0.10 0.05椰油烷基二甲基羟乙基铵氯化物- 3.0绿土粘土- 5.0PVP 2.0-水/微量物质 达到100％洗涤剂实施例IX本发明强效液体织物洗涤剂组合物可如下制备A B CC25AES18.0 15.014.0LAS 5.85.0 4.0C810胺1.42.0 -NI24-72.82.0 3.0柠檬酸2.53.0 3.0
脂肪酸8.5 3.0 3.0酶0.020.020.006硼酸 2.0 2.0 2.0乙氧基化四亚乙基五胺0.9 1.0 1.0聚乙烯亚胺乙氧基化物0.7 - 1.0DETPMP0.3 - -HEDP 0.35- -乙醇 1.0 3.0 3.01，2-丙二醇 8.0 4.0 5.0MEA 9.8 2.0 2.0NaCS 2.0 - -泡沫抑制剂0.250.010.01微量物质(香料、增白剂等)和水 达到100％洗涤剂实施例X以下举例说明适合用于洗碗机的本发明片状洗涤剂。
A B C D E F第一相STPP 5.09.6 10.07.106.011.5硅酸盐1.70.671.6 1.0 1.02.4SKS-6 2.51.5 - 2.3 2.25碳酸盐5.00 2.743.5 3.594.10 5.25HEDP 0.25 0.180.180.280.28 0.28PB1 3.52.452.453.683.68 3.68PAAC 0.002 0.002 0.002 0.003 0.004 0.004柠檬酸- 0.5 - 0.2 - -
纤维素 - - 0.65 0.8 - -酶 0.010.008 0.008 0.020.010.01非离子表面活性剂 0.900.800.80 1.201.201.20PEG4000 0.4 0.360.26 0.380.390.39BTA 0.010.040.04 - 0.060.06石蜡 0.160.170.10 0.150.150.15香料 0.020.020.02 0.013 0.013 0.013硫酸盐 - - - 0.502 0.052.838总量19.65g 19.7g 19.77g 21.54g 19.43g 28.0g第二相酶 0.030.030.03 0.030.030.03本发明的酶 0.010.020.005 0.001 0.003 0.005柠檬酸和/或柠檬酸盐 0.3 0.200.30.3 0.200.3氨基磺酸 - 0.30- - 0.30-二碳酸盐 0.920.250.45 1.090.300.45碳酸氢盐 - 0.55- - 0.55-硅酸盐 - - 0.64 - - 0.64CaCl2- 0.07- - 0.07-PEG400 0.15- - - - -PEG4000 0.080.060.06 0.060.060.06总量2.0g2.0g2.0g 2.0g2.0g2.0g
洗涤剂实施例XI以下举例说明适合用于洗碗机的本发明液体洗涤剂组合物




序列表序列表<110>诺和酶股份有限公司<120>包含枯草杆菌果胶酸裂解酶的洗涤剂组合物<130>10171.204-WO<160>19<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1200<212>DNA<213>枯草杆菌(Bacillus subtilis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1200)<223>
<400>1gct gat tta ggc cac cag acg tta gaa tca aat gat ggc tgg ggc gcg 48Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Glu Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala1 5 10 15tac tcg acc ggc aca aca ggc gga tca aaa gct tcg tca tcc cac gtg 96Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser His Val20 25 30tat acc gtc agc aac aga aac cag ctt gtc tcg gca tta ggc aag gac144Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Asp35 40 45acc aac aca acg cca aaa atc att tat att aag gga acg att gac atg192Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met50 55 60aac gtc gat gac aat ctg aag ccg ctt ggt cta aat gat tat aaa gat240Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp65 70 75 80cca gag tac gat ttg gac aaa tat ttg aaa gcc tat gac cct agc aca288Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr85 90 95tgg ggc aaa aag gag ccg tcg ggg aca cta gaa gag gcg aga gca cga336Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Leu Glu Glu Ala Arg Ala Arg100 105 110tct cag aaa aat caa aaa gca cga gtc atg gtg gat att ccg gca aac384Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn115 120 125acg acg atc gtc ggt tca ggg aca aat gcc aaa atc gtg ggc gga aat432Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ile Val Gly Gly Asn130 135 140
ttc cag atc aag agt gat aat gtc atc atc cgc aac atc gaa ttc cag480Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln145 150 155 160gat gct tat gat tat ttt ccg caa tgg gat ccg act gac ggc agc tca528Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser165 170 175gga aac tgg aac tca caa tac gac aac atc aca ata aac ggc ggc acg576Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr180 185 190cat ata tgg att gat cat tgt aca ttt aat gac ggt tcc cgt ccg gac624His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp195 200 205agc aca tcg cca aag tat ttc ggc aga aaa tat cag cac cat gac ggc672Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly210 215 220caa acc gat gct tct aac ggc gct aac tat atc acg atg tct tac aac720Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn225 230 235 240tat tat cac gat cat gat aaa agc tcc att ttc gga tca agc gac agc768Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser245 250 255aaa aca tct gat gac ggc aaa tta aaa atc acg ctc cat cat aac cgc816Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg260 265 270tat aaa aat atc gtc cag cgc gca ccg aga gtc cgc ttc ggg cag gtg864Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val275 280 285cac gtt tac aac aac tat tat gaa ggc agc aca agc tcc tcg gat tat912His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asp Tyr290 295 300gcc ttc agc tat gcg tgg gga atc gga aaa tca tct aaa atc tac gct960Ala Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala305 310 315 320caa aac aat gtc att gac gtg cct gga ctg tca gcc gct aaa acg atc 1008Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile325 330 335agc gta ttc agc ggg gga acg gct tta tat gac tca ggc aca ttg ctg 1056Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu340 345 350aat ggc acg cag atc aac gca tcg gct gca aac ggg ctg agt tct tct 1104Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser355 360 365gtc ggc tgg aca ccg tct ctg cac ggc aca atc gat gct tcc gcg cat 1152Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ala His
370 375 380gta aaa tcg aat gtt ata tct caa gcg ggt gcg ggt aaa tta aat taa 1200Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn385 390 395<210>2<211>399<212>PRT<213>枯草杆菌<400>2Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Glu Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala1 5 10 15Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser His Val20 25 30Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Asp35 40 45Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met50 55 60Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp65 70 75 80Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr85 90 95Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Leu Glu Glu Ala Arg Ala Arg100 105 110Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn115 120 125Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ile Val Gly Gly Asn130 135 140Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln145 150 155 160Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser165 170 175Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr180 185 190His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp195 200 205Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly210 215 220Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn225 230 235 240
Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser245 250 255Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg260 265 270Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val275 280 285His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asp Tyr290 295 300Ala Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala305 310 315 320Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile325 330 335Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu340 345 350Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser355 360 365Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ala His370 375 380Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn385 390 395<210>3<211>6661<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>质粒pMOL995<400>3gaattcctta gtgctttcat agattaaact cacatcacgc tttaaatcgc ttattttaga 60ctttaaagac ttgttttctt caagcaactc attataatca tttacatttt cattaaatcg 120ctctacaaga ccactatatt tttctttaac ttgcccatgt tctttactta attttttata 180ttctctcgcc atatcagtac tcatgagatt tctaacatgc tgttttaacc tatcgttatc 240tctcgcagca gtcactaagt ttttataatc acgctccgat ataacaacat ttttggttgg 300tttcttttct gttttcatta tttcttttcc caaaccaaac atggactttt cacccgttgg 360cacttcaaca cttttcatgt gtcgtttcgc tggtacttct aaatctgatt taactttatc 420gctataagca gtccattcat cttttttaac tgctaaattt ttttctagaa aatcaatctc 480tttttccaaa gtttgttttt taaatttagc tgtctcaata tgtttacggt cagagccacg 540ttcaccacgc ttcaactcaa aaccctgttt tttcatatgc tcggggaatt tatcttgtag 600
ccataacagt tcttgacgat taaacacatt ttttccttgc agttttccat cacgcatagg 660cacaacacct aaatgcatgt gaggggtttg ctcatcatta tgaactgttg cataagcaat 720attttgcttg ccatatcgtt cggaaaataa tttataactt tcctcaaaaa atcgtttttg 780ttctcctgga tccagttgct caaaaaaatc tcggtcagat gttactagca actcatttac 840aagaacagca tctttcctcg tttttcttgt acctgttttt tgtgattcaa taatttcttt 900gacacgttcg ttgtaatcaa tatttttatc atttttcaaa tcataatttt cacgtgttcg 960ctcatggtca atatcatcat tcgttctact ttttcgctct ctttgattat gaaattgcat1020gccttttagt ccagctgatt tcactttttg cattctacaa actgcataac tcatatgtaa1080atcgctcctt tttaggtggc acaaatgtga ggcattttcg ctctttccgg caaccacttc1140caagtaaagt ataacacact atactttata ttcataaagt gtgtgctctg cgaggctgtc1200ggcagtgccg accaaaacca taaaaccttt aagacctttc ttttttttac gagaaaaaag1260aaacaaaaaa acctgccctc tgccacctca gcaaaggggg gttttgctct cgtgctcgtt1320taaaaatcag caagggacag gtagtatttt ttgagaagat cactcaaaaa atctccacct1380ttaaaccctt gccaattttt attttgtccg ttttgtctag cttaccgaaa gccagactca1440gcaagaataa aatttttatt gtctttcggt tttctagtgt aacggacaaa accactcaaa1500ataaaaaaga tacaagagag gtctctcgta tcttttattc agcaatcgcg cccgattgct1560gaacagatta ataatagatt ttagcttttt atttgttgaa aaaagctaat caaattgttg1620tcgggatcaa ttactgcaaa gtctcgttca tcccaccact gatcttttaa tgatgtattg1680gggtgcaaaa tgcccaaagg cttaatatgt tgatataatt catcaattcc ctctacttca1740atgcggcaac tagcagtacc agcaataaac gactccgcac ctgtacaaac cggtgaatca1800ttactacgag agcgccagcc ttcatcactt gcctcccata gatgaatccg aacctcatta1860cacattagaa ctgcgaatcc atcttcatgg tgaaccaaag tgaaacctag tttatcgcaa1920taaaaaccta tactcttttt aatatccccg actggcaatg ccggggcggc cgacatacat1980tcgctttgcc ccaccgggtc cgtctgttat taatgccgcc aaacctgaat ttgcaaccga2040gctgtcgcct tcccttgtcc agccgacaat gtcatggtgg tcgaaataat catgctgtgc2100tccgtacgca tactgttttc tcgcttttaa gatcggttca attttgtgtt tcaaggcagg2160aatttcgcgc tgggagtctc ctttcgtccc gtacatatcc ccgtagaaaa cctgagggta2220tccagattcc cttgtgagaa taaaagcgta agcaagcggc ttaaaccatg tttggacagt2280cgaccccttc cctcttatcc aacctttatt gcttcaccca aaccgaaacg gaccctccat2340
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1.一种洗涤剂组合物，其包含表面活性剂和果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)或它的稳定化变体，其中所述果胶酸裂解酶由枯草杆菌菌株的内源DNA序列编码。
2.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽由获得自枯草杆菌DSM 14218的DNA序列编码。
3.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽由包含SEQ IDNO1的1-1197位的DNA序列编码。
4.如权利要求1所述的洗涤剂组合物，其中所述多肽是包含SEQ IDNO1的1-1197位的DNA序列编码的果胶酸裂解酶的稳定化变体。
5.如前述权利要求任意一项的洗涤剂组合物，其中果胶酸裂解酶按纯酶占整个组合物的重量百分数计算，以0.0001％到2％，优选0.0005％到0.5％，更优选0.001％到0.02％的水平存在。
6.如前述权利要求任意一项的洗涤剂组合物，其还包含一种或多种选自以下的酶蛋白酶、纤维素酶(内切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶、其它甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、和它们的混合物。
7.如前述权利要求任意一项的洗涤剂组合物，其还包含漂白剂，优选大多环刚性配体的过渡金属络合物、过氧化氢释放剂与4-[N-(壬酰基)氨基己酰氧基]-苯磺酸钠的组合和/或它们的混合物。
8.如前述权利要求任意一项的洗涤剂组合物，其中表面活性剂是阴离子表面活性剂，其含量不超过洗涤剂组合物总重量的30％，优选10％到25％。
9.用如前述权利要求任意一项的洗涤剂组合物清洁织物、碗盘或硬表面以获得优良的清洁性能的方法。
10.如前述权利要求任意一项的洗涤剂组合物在织物清洁和/或织物去污和/或织物白度保持和/或织物软化和/或织物颜色显现和/或织物染料转移抑制中的用途。
11.如权利要求1-8任意一项的洗涤剂组合物在清洁硬表面如地板、墙壁、浴室瓷砖和类似物中的用途。
12.如权利要求1-8任意一项的洗涤剂组合物在手洗和机洗碗盘中的用途。
13.如权利要求1-8任意一项的洗涤剂组合物在口腔和/或牙齿应用中的用途。
14.具有果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)活性的多肽，该多肽选自以下之一(a)由SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列编码的多肽；(b)通过将含有SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列的细胞在可表达该DNA序列的条件下进行培养而产生的多肽；(c)(a)或(b)的多肽的定点变体，该变体通过改变一、二、三、四或五个氨基酸残基为其它氨基酸残基已获得稳定化。
15.如权利要求14的多肽，该多肽获得自或可获得自细菌，优选属于枯草杆菌种的菌株，优选枯草杆菌DSM 14218。
16.如权利要求14的多肽，该多肽是分离的且不含有同源杂质。
17.一种酶制品，其包含如权利要求14-16任意一项的酶和常规的填充剂或稳定剂。
18.如权利要求17的制品，其还包含一种或多种选自以下的酶蛋白酶、纤维素酶(内切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶、其它甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、和它们的混合物。
19.编码具有果胶酸裂解酶活性的多肽的分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子在中度严格条件下与变性的双链DNA探针杂交，其中该探针选自包含SEQ ID NO1的1-1197位所示序列的DNA探针和包含SEQ IDNO1的1-1197位的子序列的DNA探针，该子序列具有至少约100个碱基对的长度。
20.表达载体，其包含如下可操作地连接的元件转录启动子；选自(a)包含SEQ ID NO1第1-1197位核苷酸所示的核苷酸序列的编码具有果胶酸裂解酶活性的多肽的多核苷酸分子和(b)(a)的简并核苷酸序列的DNA片段；和转录终止子。
21.已导入权利要求20的表达载体的培养细胞，其中所述细胞表达该DNA片段编码的多肽。
22.生产具有果胶酸裂解酶活性的多肽的方法，该方法包括培养已导入权利要求20的表达载体的细胞，由此所述细胞表达该DNA片段编码的多肽；和回收该多肽。
全文摘要
本发明涉及洗涤剂组合物，该组合物包含表面活性剂和果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)或它的稳定化变体，所述果胶酸裂解酶由枯草杆菌菌株的内源DNA序列编码，该洗涤剂组合物提供优良的清洁和去污性能。
文档编号C11D3/386GK1527877SQ02809936
公开日2004年9月8日 申请日期2002年5月14日 优先权日2001年5月14日
发明者M·B·埃斯克隆, M·许莱因, V·S·尼尔森, J·斯梅茨, M B 埃斯克隆, 反, 尼尔森, 骋 申请人:诺和酶股份有限公司