专利名称：一种具有祛斑功效的含谷胱甘肽转移酶添加剂的护肤品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种护肤品，具体涉及一种含酶组合物为添加剂的护肤品。
背景技术：
随着人们物质生活水平的提高，在生活中对化妆品的需求发展很快，各种化妆品层出不穷，其中祛斑类化妆品很受用户的关注。目前，市场上的祛斑类化妆品主要是抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素的产生，从而抑制色斑形成。申请人经多年研究和实验发现，胶原交联、色素产生还有一个更重要的生化机制(Yin，D.，Biochemical basis oflipofuscin，ceroid，and age pigment-like fluorophores.Free Radic.Biol.Med.1996，21871-888.和龚萍，李国林，印大中.老年色素类荧光物质形成的生化机理.生命科学研究，2001，519-24.)，老年色素(色斑)荧光物质是人体基本生命过程中多种生化副反应的终产物，主要有与脂过氧化相关的通过羰基与蛋白质氨基交联而形成的荧光物质；以及不需氧而与糖类有联系的糖基化或美拉德反应而形成的荧光糖基化产物等(图1)。生物体内老年色素的形成是动态的连续变化过程。因而在不同生物个体的不同年龄阶段、不同组织部位与不同生理条件下都可能形成具有不同生物特性的老年色素，如脂褐素、腊黄素；例如在病理条件下，人体内也会形成一些非永久性的黄棕色的聚合物和荧光物，称为腊黄素，即脂褐素的前体(脂褐素为棕黄色非专一色素颗粒)。腊黄素是含有脂类、蛋白和水不溶性残余物，及少量碳水化合物成分的生物垃圾；是由于氧自由基造成的脂质过氧化、蛋白氧化、碳水化合物即氨化交联(又叫美拉德反应)后的产物与氨基酸进一步交联反应形成的。各个生化过程产生的棕黄色老年色素物质或游离存在、或结合到蛋白等其他生物分子上。
随着年龄的增长、肌肤的弹性和透明质酸降低、新陈代谢减慢而产生的生物垃圾，在水质、空气的污染、过度的阳光曝晒等自然界中存在的许多氧自由基诱导因子以及饮食不均、食物污染及压力指数增加等因素诱导下加速了色素的囤积。大量的色素囤积在皮肤上，使人的肌肤明显出现皱纹，胶原蛋白交联老化，肤色变暗，没有光泽，出现或大或小的色斑，这些色素一般呈棕黄色或棕色，甚至黑色。采用一般护肤品可抑制黑色素的产生，但难以达到标本兼治的目的。如专利号ZL03118183.X的发明专利可有效地抑制黑色素的产生，但尚未解决色素类物质的沉积问题，因此研制一种不仅能抑制黑色素产生，而且能防止和清除黑色素类物质的沉积则是护肤品发展的一个方向。
发明内容
本发明通过对老年色素色斑形成机理的研究，研制一种含酶组合物作为添加剂的护肤品，以解决当前护肤品存在的上述问题。
实现上述发明目的的技术方案是本发明含祛斑添加剂的护肤品，包括油相和水相原料组成的护肤基料，还包括一种含酶组合物的祛斑添加剂，该添加剂有谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽与甲壳素多糖组成，上述组分在护肤品中的重量百分比为谷胱甘肽转移酶0.01～1.0；谷胱甘肽0.4～4.0；甲壳素多糖1～10。
下面进一步详述本发明。
；图1为老年色素类荧光物质的形成的示意图。
本发明中的谷胱甘肽转移酶(GST)不但能催化谷胱甘肽(GSH)的巯基(～SH)攻击亲电子性物质的亲电中心，产生一种硫醚连接的谷胱甘肽结合物；GST同工酶催化GSH硫原子与亲电子底物的亲核加成反应。组织损伤产生的毒性产物，如脂质过氧化产生的共轭烯烃、环氧化物、氢过氧化物以及醛等是参与此类反应的最重要的亲电子底物，从而清除产生老年色素的脂质过氧化产物。GST酶识别的底物谱很广，对多聚烯分子等都能识别结合。GST还具有类似于硒谷胱甘肽过氧化物酶的催化活性，可对脂质和核酸氢过氧化物进行无毒化处理。GST还可抑制微粒体过氧化物反应，在自由基引起的损伤中起修复作用，也参与DNA辐射损伤后的残基修复过程。
甲壳素多糖对肌肤具有生理调节功能，具有较强的生物活性和亲水性，其中含有的葡萄糖氨基也具有羰基捕获因子的功能，能捕获各种生化副反应产生的羰基因子。而甲壳素多糖又具有许多粘多糖共有的性质，具有引湿性。它的疏松的、膨胀的分子形状使它在溶液中占据较大的空间，能结合大量的水，具有保湿滋润的功效。甲壳素多糖可在皮肤表面形成一种透气的仿生膜，防止皮肤水份的散失，加强了皮肤的屏障，有效地保护再生细胞以抑制基发生老化改变。
谷胱甘肽是属于含有巯基的、小分子肽类物质，具有重要的整合解毒作用。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，故谷胱甘肽常简写为GSH，易于参与生物转化作用，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。
谷胱甘肽的另一主要作用是一种重要的抗氧化剂，它能够清除掉人体内的自由基，清洁和净化人体内环境污染，从而增进了人的身心健康。
上述几种组分经过合理的配方，加入到护肤基料中，既能有效地由表及里，由里及表来切断黑色素及老年色素的形成及清除可逆性的色素源，并对辐射损伤的DNA进行修复，而对顽固性的、不可修复的色素具有淡化～修复～深层淡化～更新的功效。这样从根本上有效地完成皮肤的深层护理，完成角质层的更新，加速皮肤的新陈代谢，修复受损和角质化的皮肤，恢复并保持皮肤的弹性，达到深层祛斑、防斑的特效功效。
谷胱甘肽转移酶可以从龟肝、小鼠肝等动物组织中提取。本发明的GST是从龟肝里提取的。龟肝里含有大量的GST，在同条件下检测比较龟肝里的GST比大鼠的高三倍，所以从龟肝里提取GST很有前景。GST的提取方法是采用经典的提取方法，即1、实验前样品化冻称重50g，加入200ml提取液，然后用捣碎机捣碎，将捣碎液过滤，得到250ml左右匀浆液，在4℃，15000g条件下离心25min，得到上清液166ml。
2、取离心所得上清液，边搅拌边慢慢加入硫酸铵粉末，使达30％饱和度，4℃、6400g条件下离心30min，收集沉淀，取出上清液，在第1次盐析所得上清液中加硫酸铵至80％饱和度，4℃、6400g离心30min，收集沉淀，将沉淀物用10ml提取液溶解。
3、脱盐所用凝胶型号为Sephadex G-25，体积为25ml，用10mmol/L pH＝7.0的磷酸盐缓冲液平衡后，加样品5ml，然后用10mmol/L pH＝7.0的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液。
4、A-25柱层析先用1.0mol/L的HCl处理使A-25转型，然后用无离子水洗至中性，再用pH＝7.0的磷酸盐缓冲液平衡，加入脱盐后的酶液(为0.8饱和度盐析的酶液)用磷酸缓冲液+0.2mol/L NaCl溶液洗脱。
5、丙酮沉淀收集过A-25柱后用0.2mol/L NaCl洗脱下来的活性较高的酶液60ml加入6个50ml的离心管中，每管8ml，然后以1∶4的比例在各离心管中分别加入32ml丙酮，使沉淀析出，将离心管在12000g，4℃离心30min，弃上清液，用4ml 10mmol/L，pH＝7.0磷酸盐缓冲液溶解。
6、G-200柱层析先用10mmol/L pH＝7.0的磷酸盐缓冲液平衡，加2ml丙酮沉淀处理的10mmol/L磷酸盐缓冲洗脱液。
7、样品浓缩将过6-200柱后洗脱下来的缓冲液再次离心，条件为12000g，4℃离心30min，弃上清液，将沉淀溶于2ml磷酸缓冲液中，测蛋白浓度保存备用。
甲壳素多糖从日化原料市场如北京昂立达公司购得。
谷胱甘肽原料从化妆品及药品原料市场买得。
作为本发明中所用典型的基料，包括油相原料和水相原料，其中油相原料有动植物油，矿物油，脂油，蜡，高级醇，脂肪醇，硅油，磷脂，脂肪醇醚，多元醇脂等，水相原料有水溶性聚合物，粘土矿物质和净化水，季胺等。还可根据需要加入pH调节剂，表面活性剂，抗氧化剂，螯合剂，防腐剂，防霉剂，颜料物和香料底子等。另外，也可以与具有增白美容作用或皮肤化妆作用的其他活性成分，如血液循环促进剂，消毒剂，消炎剂，细胞活化剂，维生素类，氨基酸类，润湿剂和角质层分离剂等结合使用。
本发明可按需要配制成霜剂、乳剂、膏剂、面膜、乳状洗液等。
本发明的含酶祛斑添加剂的护肤品，经省日化检测站质量检测，铅、砷、汞、细菌含量都符合规定标准，细菌不含粪大肠菌群、金黄色葡萄球菌；检测方法为检GB7917-87《化妆品卫生化学标准检测方法》，GB7918-87《化妆品微生物标准检测方法》。
为观察受试动物大白鼠涂布该产品后，对大白鼠皮肤的刺激反应，本发明产品进行了动物实验，实验结果为受试大白鼠均无红肿异常发生，大白鼠正常存活。实验方法大白鼠6只雌雄各半剪去背部鼠毛面积5cm2，用0.1克该产品涂于无毛皮肤每日二次，每次0.1克连续7天，观察有无刺激反应。
按实施例二制备的含祛斑添加剂和不含添加剂的膏剂各一份，作为实验用，前者为样品，后者为对照品。按上述动物受试方法检测自由基引起的脂质过氧化水平，以丙二醛表示。受试大白鼠12只，分为两组，一组涂样品，一组涂对照品，一直涂6周，死后，取所涂部位的皮肤，去除脂肪组织，均浆，离心，用硫代巴比妥酸法测丙二醛的含量，求平均值。所得结果见表1表1 含祛斑添加剂护肤品对大白鼠皮肤中丙二醛含量的影响(n＝6)
从表1的结果看，丙二醛的含量明显降低。本产品明显具有抑制脂质过氧化，清除脂质过氧化产物的功效。本发明以含酶组合物为祛斑添加剂的护肤品，既能抑制黑色素的产生，又能防止和清除老年色素物质的沉积，且对皮肤无刺激反应，因此是一种具祛斑、防斑功效的护肤品。
具体实施例方式
生产工艺将油相原料加热至90℃，熔化搅拌均匀；水相原料放入容器加热至85℃，搅拌溶解。然后将油相原料加入水相原料中搅拌，得到乳化均质后，冷至30～40℃，再加入添加剂和香精、防腐剂，搅拌均匀，即可得到本发明产品。
权利要求
1.一种含祛斑添加剂的护肤品，包括油相和水相原料组成的护肤基料，本发明的特征在于包括一种含酶祛斑添加剂，该添加剂主要由谷胱甘肽转移酶、甲壳素多糖与谷胱甘肽组成，上述组分在护肤品中的重量百分比如下谷胱甘肽转移酶 0.01％～1.0％谷胱甘肽 0.4％～4.0％甲壳素多糖 1.0％～10％。
全文摘要
本发明涉及一种含酶组合物为添加剂的护肤品。本发明的祛斑添加剂由谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽与甲壳素多糖组成，上述组分在护肤品中的重量百分比依次为0.01～1.0、0.4～4.0与1.0～10。本发明研制的护肤品经检测符合化妆品卫生化学标准和微生物标准；经动物试验，本发明产品对大白鼠皮肤无刺激反应，并且具明显抑制脂质过氧化物的功效；因此是一种具有祛斑、防斑功能的护肤品。
文档编号A61Q19/00GK1785156SQ200510032350
公开日2006年6月14日 申请日期2005年11月8日 优先权日2005年11月8日
发明者邓燕, 廖艳阳, 印大中 申请人:湖南师范大学