专利名称：：用于人类美容有益效果的口服益生菌双歧杆菌的使用方法用于人类美容有益效果的口服益生菌双歧杆菌的使用方法发明领域本发明涉及益生菌双歧杆菌，更具体地讲涉及使用益生菌双歧杆菌来调节人的角质组织状况以获得美容有益效果的方法。发明背景哺乳动物保护其胃肠道不受细菌寄居的防御机制非常复杂。大多数哺乳动物的胃肠道寄居着原生微生物和侵入的病原微生物。健康状态下这些彼此竟争的微生物保持平衡状态。人类健康与饮食和胃肠道健康密切相关。维持人肠道微生物的平衡可使人更加健康。虽然年龄和饮食可改变肠道微生物的数量和組成，但其数量和组成仍趋于稳定。据信胃酸、胆汁、肠蠕动和局部免疫是调节人小肠内菌群的重要因素。通常，人的肠胃失调与细菌过度生长和病原菌产生肠毒素有关。这些因素破坏了肠菌群的平衡，会产生炎症和异常的免疫反应。因此，肠菌群平衡的改变可导致或预防多种肠胃失调。近来研究已经开始着重于一些有价值的菌林及其作为益生菌制剂的潜在用途。这些菌林可通过分离获取自哺乳动物如人的胃肠道。益生菌被认为是活的或死的细菌的制剂，其组分如蛋白质或碳水化合物或者细菌酵素的纯化片段能通过保存胃肠道中的天然菌群和增强对异常免疫反应的正常控制来增进哺乳动物健康。据信益生菌当衍生自旨在治疗的菌种或密切相关菌种时更加有效。虽然已经阐明了几种益生菌菌林，但这些菌抹的使用方法及其疗效很大程度上仅限于调节人的肠胃疾病。迄今对这些生物体对除胃肠道以外的生理系统的潜在有益效果仍无太多的研究。发明概述依照本发明，提供了益生菌双歧杆菌，尤其是分离自人的胃肠道的那些益生菌双歧杆菌的使用方法。所述方法包括预防性地或治疗性地调节人的角质组织，例如人的毛发、皮肤(例如头皮)和指/趾曱的外观。另一方面，本发明提供了营销包含益生菌双歧杆菌组合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(l)提供一种包含益生菌双歧杆菌的组合物用于销售；和(2)告知所述组合物的潜在消费者口服所述组合物能够调节人的角质组织的外观。通过阅读本公开内容，本发明的这些和其它特征、方面和优点将对于本领域的技术人员变得显而易见。发明详述除非另外指明，本文所有重量、量度和浓度均是在25'C用组合物整体测量的。除非另外指明，本发明涉及的所有组合物的百分数均为重量百分数且所有比率均为重量比率。除非另外指明，所有分子量均为重均分子量。除了提出的实际测量值的具体实施例之外，本文所参考的数值应被视为受单词"约"限制。在下文所述中，缩写CFU("菌落形成单位")是指在琼脂板上通过微生物计数显示的细菌细胞的数量，这是本领域普遍理解的概念。本文所用术语"突变抹"包括具有与参考菌林的聚核苷酸序列的16s至23s基因间隔区至少88%同源性，优选至少90%同源性，更优选95%同源性的衍生菌林，但另外在细菌基因组的其它DNA序列中包含DNA突变。本文所用术语"DNA突变，'包括天然的或诱导的突变，包括至少单个碱基突变包括缺失、插入、置换和其它本领域技术人员已知的DM改变包括遗传修饰，引入亲本核苷酸或氨基酸序列同时保持与亲本序列至少50%的同源性。优选地，所述包含DM单个突变或多个突变的序列具有与亲本序列至少60%,更优选至少75%,更优选85%的同源性。本文所用术语"同源性，，可使用本领域技术人员已知的标准技术进行测定。例如，同源性可使用在线同源性算法"BLAST"程序进行测定，此程序在公开网址http:〃雨.ncM.nlm.nih.gov/BLAST/上可用。本文所用术语"遗传修饰"包括将外源的和/或内源的DNA序列引入生物体基因组。引入方法包括插入所述生物体的基因组或使用包括质粒DNA或噬菌体的载体，这是本领域技术人员已知的方法。所述DM序列的长度为至少两个脱氧核糖核酸碱基。本文所用术语"益生菌"含义广泛，包括一种或多种益生菌、一种或多种其培养上清液和/或它们的混合物。细菌寄存号下表说明了能用于本发明的益生菌双歧杆菌菌林编号和寄存/保藏号。所述菌抹已被寄存在NationalCollectionsofIndustrial,FoodandMarine<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在特定实施方案中，实行本发明使用的益生菌双歧杆菌选自由具有以下保藏号的益生菌双歧杆菌组成的组NCIMB41050、NCIMB41051、NCIMB41052、NC濯41053、NC腿41099、NC腦41100、NC濕41003、它们的突变型、以及它们的混合物。这些益生菌双歧杆菌被更详细地描述于W000/42168和W003/010297。W000/42168描述了分离自人的胃肠道的益生菌双歧杆菌。这些细菌寄存于NCIMB，寄存号为41050、41051、41052、41053、41099和41100。W003/010297描述了分离自人的胃肠道的益生菌双歧杆菌的更多实施例。此细菌被寄存于NCIMB，寄存号为41003。已经发现，获取自胃肠道的双歧杆菌菌抹可随着活性细菌细胞的摄取粘附于胃肠道，并且以活性、非活性或片段形式摄取时也是显著地免疫调节的。不受理论的约束，据信获取自胃肠道的双歧杆菌与肠粘膜组织密切相关。不受理论的约束，据信这导致益生菌双歧杆菌产生选择性的宿主反应，此反应导致它的益生行为。已经发现，分离自胃肠道的益生菌通过直接作用于黏膜上皮和宿主的免疫细胞能调节宿主的免疫系统。这种免疫调节，与益生菌传统的作用机制相结合，例如通过闭合和竟争营养物质阻止病原菌粘附在肠上，导致双歧杆菌作为一种益生菌生物体是高度有效的。本发明使用的双歧杆菌通过从人的胃肠道中分离获得，并具有体外抗微生物活性，能抗多种病原菌菌林/菌种。不受理论的约束，据信这种体外抗微生物活性指示了潜在的人体外益生菌活性。不受理论的约束，据信双歧杆菌的抗微生物活性可能是双歧杆菌的多种不同作用的结果。本领域以前提出分离自排泄物样品的几种细菌菌林通过闭合作用阻止病原生物体附着在肠上，从而在口服后发挥其在胃肠道中的益生菌功效。为了能在肠中建立菌群，这需要口服"活的"或活性的细菌细胞。然而，据信本发明使用的由人的胃肠道分离获得的双歧杆菌，如提供其活性形式的话同时由于闭合作用发挥一些益生菌功效，可以活性或非活性的形式递送基本的益生菌功效，这是由于其在体外发酵过程中产生一种或多种能抑制病原微生物生长或杀死病原微生物和/或改变人类宿主的免疫能力的物质。此益生菌活性的形式是人们所期望的，因为本发明的细菌能以活性或非活性培养基或者纯化发酵产物的形式提供，这些形式仍递送有益效果给宿主。优选地，双歧杆菌在通过胃肠道后能保持活性。为了能口服细菌的活性培养基和细菌在通过食管与胃后能寄居在肠内，这是人们所期望的。为了长期递送益生菌有益效果给宿主，期望本发明的益生菌双歧杆菌能寄居在肠内。口服非活性细胞或其纯化分离物会产生暂时性的有益效果，但是因为细菌无活性，它们不能生长并就地持续递送益生菌效果。结果是需要宿主有规律的服用以保持健康有益效果。反之，活性细胞能以活性形式通过胃，随后附着在肠黏膜上增生扩散，从而能就地持续递送益生菌效果。因此，本发明的双歧杆菌优选在悬浮于pH2.5的介质中1小时后仍保持活性。本文所用术语"保持活性"是指至少25%的最初悬浮于测试介质的细菌当使用本领域技术人员已知的平板计数法计数时是活着的。优选地，"保持活性"是指至少50%的最初悬浮的细菌是活着的。本发明的双歧杆菌期望在暴露于低pH环境后保持活性，这种低pH环境模拟人口服后暴露于胃和小肠上部的胃液中的体内环境。此外，本发明的细菌优选当至少0.5%的猪胆汁盐类存在时有至少33%的增长。更优选地，本发明的细菌优选当至少1%的猪胆汁盐类存在时有至少33°/。的增长。不受理论的约束，据信本发明的能够在至少0，5%的猪胆汁盐类存在时保持活性的细菌，能在肠内条件下存活。这被认为是加入猪胆汁到培养基中模拟肠内条件的结果。此外，本发明使用的双歧杆菌优选地具有显著的粘附能力，能粘附于体外肠上皮细胞。本文所用术语"显著粘附"是指至少4%的总细菌粘附到上皮细胞上。所述细菌与体外上皮细胞共培养。更优选地，至少6%共培养的细菌细胞粘附到体外上皮细胞上。不受理论的约束，据信肠上皮细胞的体外粘附指示了细菌寄居在人体内胃肠道中的能力。本领域的技术人员已知16s至23s的基因间聚核苷酸序列是细菌基因组中能被用于鉴别不同细菌的菌种和菌林的DNA序列。此基因间聚核苷酸序列能通过以下详细方法测定。从琼脂板上的双歧杆菌菌落取样，再悬浮于IXPCR緩冲液中，96'C加热5分钟，-70°C冷冻5至10分钟，解冻，然后将等分试样加入PCR管。使用基因间隔区(IGS)引物进行PCR，IGSL:5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3'，IGSR:5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3'。循环条件为96°C1分钟(循环1),94。C30秒，53。C30秒，72匸30秒(28个循环)。PCR反应包舍5juLDNA，PCR緩沖液(Bioline，UK)，0.2mMdNTPs(Roche，UK)，0.4yMIGSL和R引物(150ng/50yL)(MWGBiotech,Germany)和BiolineTaq聚合酶(0.6单位)。PCR反应在HybaidPCR仪上进行。PCR产物(8|aL)与分子量标记(uX174HaeIII，Promega)—起在TAE中进行2%琼脂糖EtBr染色凝胶电泳以测定其IGS图谱。使用上述的相同引物，使用本领域技术人员已知的方法对基因间隔区(IGS)DNA进行测序以鉴别双歧杆菌菌林。测序后，获得的菌林序列能与在线序列数据库"BLAST"进行比较以确定其与其它寄存细菌的16s至23s序列的同源性，BLAST在网址http://www,ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/可用。使用方法依照本发明，提供了益生菌双歧杆菌，尤其是分离自人的胃肠道的那些益生菌双歧杆菌的使用方法。所述方法包括预防性的或治疗性的调节人的角质组织，例如人毛发、皮肤(例如头皮)和指/趾甲的外观。一方面，所述方法包括使用所述益生菌双歧杆菌以调节人的角质组织的外观。在一个特定的方面，所述方法包括人口服所述益生菌双歧杆菌用于调节所述人的角质组织的外观，其中所述人正在寻求调节所述人的角质组织外观的方法。在特定实施方案中，调节人的角质组织的状况可包括改善人的角质组织的外观。优选地，益生菌双歧杆菌以有效剂量口服。有效剂量是指足以调节人的角质组织外观的量。在特定实施方案中，益生菌双歧杆菌每日口服，优选每日口服至少或约三个月，更优选至少或约一年。另一方面，本发明提供了营销包含益生菌双歧杆菌组合物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(l)提供一种包含益生菌双歧杆菌的组合物用于销售；和(2)告知所述组合物的潜在消费者，口服所述组合物能调节人的角质组织的状况。在特定实施方案中，调节人的角质组织的状况包括改善所述人的角质组织的外观。本文所用术语"告知"是指提供信息，可包括但不限于印刷的(例如，包含组合物的容器直接地或非直接地附带的印刷品)、电子的或广播的信息。本文所用术语"潜在消费者"是指所述组合物实际的或潜在的购买者和/或实际的或潜在的使用者。本发明的益生菌双歧杆菌能被用于调节角质组织(例如毛发、皮肤[如头皮]或指/趾甲)状况。本文所用术语"调节，，是指保持或改善外观，包括调节角质组织视觉的、触觉的和动觉的性质，并且可包括预防性调节和/或治疗性调节。200680011346.5说明书第7/12页通常期望能调节角质组织状况，具体地讲人皮肤、毛发或指/趾曱的状况，因为状况可由身体的内部和/或外部因素诱导或引起。实例包括环境损伤、辐射暴露(包括紫外线辐射)、实龄、更年期状况(如更年期后皮肤、毛发或指/趾曱的变化)、压力、疾病、失调等。例如，"调节皮肤、毛发或指/趾甲状况，，包括预防性地调节和/或治疗性地调节皮肤、毛发或指/趾甲状况，并且可包括一种或多种以下有益效果增厚皮肤、毛发或指/趾曱(例如，构造皮肤的表皮和/或真皮和/或皮下[例如，皮下脂肪或肌肉]层，和在应用处构造指/趾曱和发干的角质层)以减少萎缩；增加真皮-表皮边界(也称为网缘)的巻曲；防止皮肤或毛发弹性的损失(例如功能性皮肤蛋白的损失、破坏和/或失活)例如弹性组织变性、松垂、皮肤损失或毛发变形的反沖；防止黑色素或非黑色素改变皮肤、毛发或指/趾曱的颜色，例如眼袋、渗斑(例如，由如红斑痤疮引起的不均匀红色)(以下称作为"红斑")、肤色灰黄(灰白色)、由毛细管扩张或蛛形血管引起的褪色、以及毛发变灰。调节也包括平滑、软化(例如软化皮肤)和减少皮肤和/或头皮的脱落。调节可包括延緩、最小化、防止、改善和/或消除非期望的角质组织状况，所述状况是视觉、感觉或其它途径可察觉的。例如，调节可包括调节老化迹象。本文所用术语"松垂"是指皮肤的松弛、下垂或类似状况，真皮弹性蛋白、肌肉和/或皮下脂肪的损失、破坏、改变和/或异常会引发所述状况。本文所用术语"光滑"和"软化"是指改变角质组织的表面以改进其触感和/或总体外观。术语"角质组织老化迹象"或"老化迹象"包括但不限于由角质组织效果。这些迹象可由内在因素或外在因素诱导或引起，例如实足年龄和/或环境侵害。引起这些迹象的过程包括但不限于组织不连续的发展例如皱紋和粗深皱紋、细紋、皮肤细紋、裂紋、肿块、粗大毛孔(例如，与附属组织相关的如汗腺导管、皮脂腺或毛嚢)、不平或粗糙、皮肤弹性丧失(功能性皮肤弹性蛋白的损失和/或失活)、松垂(包括眼周和面部浮肿)、皮肤紧致丧失、皮肤紧实丧失、皮肤变形后反沖丧失、变色(包括9眼袋)、渗斑、灰黄、皮肤区域色素沉着如老年斑和雀斑、角质化、异常分化、过度角质化、弹性组织变性、胶原破裂、以及其它在角质层、真皮、表皮、皮肤脉管系统(例如毛细管扩张或蛛形血管)和皮下组织(例如脂肪和/或肌肉)，尤其是那些最靠近皮肤的组织中的组织学变化。本发明的双歧杆菌使用方法典型地涉及人口服。口服可作为正常饮食摄取的一部分，或者作为它的一种补充。口服典型地至少一月一次，优选至少每周一次，更优选至少每天一次。双歧杆菌可以被人以有效剂量口服，优选以安全有效剂量口服以调节人的角质组织状况。本文所用术语关于双歧杆菌的"安全有效量"是指足以向需治疗的人提供所需功效或有益效果的细菌的量，但所述量又足够低，以避免不利影响如毒性、发炎或变应性反应，相当于以本发明的方法使用时提供合理的效/险比。具体的"安全有效量"将根据例如治疗的具体症状、使用者的身体状况、治疗持续时间、协同治疗的性能(如果存在)、欲使用的具体剂型、使用的载体、剂型的溶解度和具体的剂量疗程这些因素的不同而异。优选地，人施用双歧杆菌的剂量为每日1.0E+04至1.0E+14CFU，更优选地为每日1.OE+06至1.0E+12CFU。组合物优选地可包含至少0.001%的1.0E+04至1.0E+12CFU/g的从人的胃肠道中分离获取的双歧杆菌。双歧杆菌提供给人的形式可以是活性形式，或者灭活细胞的形式，或者馏出液的形式，或者本发明双歧杆菌的发酵产物的分离物或其它片段的形式，或者它们的任何混合物。优选地，双歧杆菌或其纯化的或分离的片段被用于制备旨在调节人的角质组织外观的组合物。如上文所述，组合物可作为正常饮食摄取的部分，或者作为一种补充。在组合物包含正常饮食摄取部分的情况下，所述组合物可以是片剂、胶嚢、食物、糖果、酸奶、粉末、饮料等形式。这些组合物可包含更多的组分。包含本发明的细菌的组合物也可以包含益生元。"益生元"包括人的肠菌落发酵产生的物质或化合物，因此促进人的胃肠道中的双歧杆菌的生长或发展，并抑制病原菌的生长。发酵的结果是释放脂脉酸，具体地讲结肠中的短链脂肪酸。这有降低结肠中的pH值的效果。合适的益生元的非限制性实施例包括低聚糖，例如菊粉及其水解产物，通常称为低聚杲糖、低聚半乳糖、低聚木糖或低聚淀粉衍生物。益生元可以任何合适的形式提供。例如，益生元可以以包含纤维的植物材料形式提供。合适的植物材料包括芦笋、朝鲜蓟、洋葱、小麦或菊苣、或这些植物材料的渣滓。可供选择地，益生元纤维可以以菊粉提取物形式提供，例如菊苣的提取物是合适的。合适的菊粉提取物可获取自0raftiSAofTirlemont3300，Belgium,商标"Raftiline"。例如，菊粉可以以Raftiline(g)ST形式提供，这是一种精炼白色粉末，包含按重量计约90%至约94%的菊粉，最多约4%的葡萄糖和果糖，和约4%至9%的蔗糖。可供选择地，纤维可以是低聚果糖的形式，例如获取自0raftiSAofTirlemont3300，Belgium,商标"Raftilose"的低聚果糖。例如，菊粉可以oRaftilose(g)P95形式提供。另外，低聚果糖可通过水解菊粉、酶法或使用微生物荻得。所述食物可包含其它活性剂如长链脂肪酸和锌。合适的长链脂肪酸包括a-亚油酸、y亚麻酸、亚油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。鱼油是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的合适来源。琉璃苣油、黑加仑种子油和月见草油是y亚麻酸的合适来源。红花油、向日葵油、玉米油和大豆油是亚油酸的合适来源。这些油也可被用在上文的包衣中。锌可以以多种合适的形式提供，例如硫酸锌或氧化锌。实施例以下实施例进一步描述和证明了本发明范围内的实施方案。所给出的这些实施例为了举例说明目的，并不可看作是对本发明的限制。这里可应用的成分以CTFA名称给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述实施例是依照以下程序制备的干细菌组合物。所有的生产在湿度控制的环境下进行，其中RH被保持在30%和36%之间。适量的冷冻干燥细菌(预浓缩到所需的CFU/g)与适量的稳定剂，如微晶纤维素、马铃薯淀粉等，一起被加到Pharmatech搅拌器的混和腔体中。细菌和稳定剂已经被选择为低水活性和低水含量，以及相似的粒度和密度以允许更有效率的混和。混和腔体内的顶部空间用干氮气沖刷以使最初顶部空间的气体被置换总共10次，或直到混和腔体内部的RH被减少至20%以下。混和腔体然后用密封封盖密封，粉末以6.3rad/s(60rpm)的转速混和20分钟。一旦混和完成，通过确保此粉末不被暴露于高RH(大于36%RH)或富含水的环境中，粉末共混物的稳定性能被保持。干混物粉末能在氮/低RH的环境下被包装进明胶胶嚢并储存在密封的容器中，或者以干粉末形式储存在小袋或容器中。所得胶嚢和其中包含的粉末具有在低温(4°C)和室温(25°C)下的改善的长期稳定性。在进一步的实施方案中，实施例1至8的干细菌组合物能在氮/低(〈36W相对湿度(RH)的环境下被包装进单位剂型中，如胶嚢或小袋。实施例9至11说明包装进胶嚢的单位剂量组合物的非限制性实施例。胶嚢被设计为以单剂服用，整个被吞下。实施例12至14是包装进小袋的单位剂量组合物的非限制性实施例，与胶嚢相比提供更高的每剂细菌数。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例15至17是酸奶补充组合物的实施例。所述组合物包含益生菌球双歧杆菌。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例18至20是营销包含益生菌双歧杆菌组合物的方法的实施例。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本文引用的所有公布均据此全文引入本文以供参考。任何文献的引用不可解释为对其作为本发明的现有技术的认可。当本书面文献中术语的任时，将以赋予本书面文献中术语的含义或定义为准。尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的那些技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下可作出许多其它的更改和修改。因此，有意识地在附加的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。权利要求1.口服益生菌双歧杆菌用于调节人的角质组织状况的用途。2.如权利要求1所述的口服益生菌双歧杆菌的用途，其中所述双歧杆菌分离自人的胃肠道。3.如前述任一项权利要求所述的口服益生菌双歧杆菌的用途，其中所述双歧杆菌选自由具有以下保藏号的双歧杆菌组成的组NCIMB41050、NCIMB41051、NCIMB41052、NCIMB41053、NCIMB41099、NCIMB41100、NCIMB41003、它们的突变型、以及它们的混合物。4.如前述任一项权利要求所述的口服益生菌双歧杆菌的用途，其中所述人的角质组织是人的皮肤。5.如权利要求1至3中任一项所述的口服益生菌双歧杆菌的用途，其中所述人的角质组织是人的头皮。6.如权利要求1至3中任一项所述的口服益生菌双歧杆菌的用途，其中所述人的角质组织是人的指/趾曱。7.如权利要求1至3中任一项所述的口服益生菌双歧杆菌的用途，其中所述人的角质组织是人的毛发。全文摘要调节人的角质组织的状况以达到美容有益效果。所述方法包括预防性地或治疗性地调节人的角质组织例如人的毛发、皮肤(例如头皮)和指/趾甲的外观。文档编号A61Q5/00GK101155616SQ200680011346公开日2008年4月2日申请日期2006年4月6日优先权日2005年4月8日发明者A·V·特里约,L·D·奥马霍尼申请人:宝洁公司;营养保健有限公司