专利名称：：高色氨酸大豆粕的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程、植物育种、籽粒(grain)加工和动物营养领域。本发明涉及一种新颖的高色氨酸大豆粕，其用作动物饲养操作的一个组成部分。技术背景肉用动物缺乏制造若干氨基酸的能力，因此需要从其饮食中获得这些氨基酸。必需从饮食中获得的氨基酸称作必需氨基酸。植物能够合成全部二十种必需氨基酸，因此对于动物，其作为这些氨基酸的主要来源，色氨酸是这些必需氨基酸中的一种，同时，其在许多伺料成分的氨基酸谱中是份额不足的。动物饲料中常使用经济的蛋白源(例如来自玉米碾磨厂和炼动物油厂的副产品)。这些副产品类型包括玉米面筋粉、含可溶物酒糟、肉骨粉、羽毛粉和家禽粉。不幸地，对于各种动物的需求而言，这些副产品中的色氨酸含量是不足的，从而限制了在某些饲料配方中可使用量，大豆粕是动物饲料中提供蛋白质和必需氨基酸的主要成分之一。当日粮中配制有大豆粕时，一般以满足最限制性的必需氨基酸为基础计算其含量比例(inclusionrate)。该限制性必需氨基酸典型为色氨酸，其导致其余的必需氨基酸的配制量超过日粮需要量。过量的氨基酸最终称为废弃物。因此对提供色氨酸含量较高的大豆粕存在着需求。
发明内容这里所述的本发明涉及高色氨酸含量的大豆粕，其由一种或多种具有高的总色氨酸含量的大豆加工得到。本发明包括高色氨酸含量的大豆粕在动物饲料工业中的用途。因此，第一方面，本发明涉及总色氨酸含量大于约0.78重量％(以干物质(重量％)为基础)的大豆粕，其中未添加外源色氨酸。本发明的一种实施方案中，所述大豆粕具有至少约0.10重量％游离色氨酸。另一种实施方案中，所述大豆粕具有至少约0.43重量％游离色氨酸。再一种实施方案中，所述大豆粕的蛋白质含量为至少约44重量％或更高，此外，所述大豆粕可进一步含有包含转基因修饰的蛋白质的蛋白结合的色氨酸内含物，其中所述转基因修饰的蛋白质含有至少8重量％色氨酸残基。本发明涉及制备具有至少约0.78重量％总色氨酸的大豆粕的方法，其包括将包含编码色氨酸生物合成途径中的酶的分离核酸分子的转基因导入大豆植林的可再生细胞中，以得到转化植林细胞，其中所述分离核酸分子可操作性连接于在植林细胞中有功能的启动子；由转化植林细胞再生植林，其中该植林的细胞表达由所述分离核酸分子编码的酶，相对于相同基因背景的未转化大豆植林的籽粒中的色氨酸含量，所述酶的表达量有效提高了大豆植林的籽粒中的色氨酸含量；以及由所述转化植林的籽粒制备大豆粕，本发明的一方面中，所述方法包括编码单体邻氨基苯甲酸合酶的转基因，所述单体邻氨基苯甲酸合酶包括邻氨基苯曱酸合酶ct-结构域和邻氨基苯甲酸合酶P-结构域。所述方法进一步包括编码反馈不敏感的玉米邻氨基苯甲酸合酶ct-亚基的转基因。所述方法进一步包括编码磷酸核糖基邻氨基苯甲酸转移酶、磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶、吲哚-3-磷酸合酶(indole-3-phosphatesyn他ase)或色氨酸合酶的任何转基因。另一方面，本发明涉及制备高色氨酸含量的大豆粕的方法，其包括a)挑选总色氨酸含量大于约0.65重量％的大豆籽粒；和b)从所述籽粒中提取油，以制备大豆粕。本发明的一种实施方案中，所述制备高色氨酸含量的大豆粕的方法还可以使用游离色氨酸含量大于约0.15重量％的大豆籽粒。再一方面，本发明涉及将大豆粕掺入动物伺料中，所述饲料包括动物生产用饲料、伴侣动物用祠料以及水产养殖用饲料。本发明的大豆粕还用作发酵飼料源。又一方面，本发明涉及用于动物饲料的高色氨酸含量、全脂大豆粕。所述高色氨酸含量、全脂大豆粕可任选被挤压。还一方面，本发明涉及高色氨酸含量的大豆分离物或大豆浓缩蛋白。具体实施方式本发明描述一种新的饲料成分一高色氨酸含量的大豆粕。本发明的大豆粕作为水产养殖饲料源，以及作为发酵媒介的组分，用于动物饲养操作。本文使用下列定义外源色氨酸不是制备大豆粕的大豆的内在部分的色氨酸。为了提高其浓度，可在豆粕或祠料中添加外源色氨酸。游离色氨酸游离酸形式的色氨酸，而不是寡肽、多肽或蛋白质的一部分。全脂大豆粕一种大豆产品，制法类似于大豆粕，除省略油提取步骤之外。蛋白质含量大豆籽或大豆粕中所含的蛋白质的重量百分比。大豆粕一种饲料成分，其为大豆籽粒的加工产品。本文中所使用的短语"大豆粕"指脱脂的、脱溶剂的、烘烤的和磨碎的大豆物质。大豆分离蛋白得自大豆軒粒的制品，通过去除大多数非蛋白成分而制得，以干基计，蛋白质含量不少于90%。大豆浓缩蛋白得自大豆軒粒的制品，通过去除大部分油及水溶性非蛋白成分制得，以干基计，蛋白质含量不少于约65%转基因通过基因剪接技术插入细胞基因组中的核酸分子，其包含至少一个启动子序列、一个编码区和一个转录终止序列。总色氨酸含量游离色氨酸和蛋白结合的色氨酸含量的总和。游离色氨酸含量大豆籽粒或大豆粕的游离色氨酸的重量百分比。蛋白结合的色氨酸含量被结合入大豆籽粒或大豆粕中的蛋白质或肽的色氨酸的重量百分比。本文中使用的短语"蛋白结合的色氨酸"与"肽结合的色氨酸"可互相交换。高色氨酸大豆品种本发明的高色氨酸含量的大豆粕涉及一种或多种高色氨酸大豆品种的用途。制备高色氨酸大豆品种的方法有多种。大豆籽粒中的色氨酸有两种不同的存在形式蛋白结合形式和游离形式。提高籽粒中的游离色氨酸浓度的技术途径包括l)增加合成；2)减少降解；或3)增加从合成部位向贮存部位的转运。此外，可使用以上途径的任何一种或全部的组合，以得到最佳的结果。可通过以下方法实现提高大豆植林中色氨酸的合成1)超量表达生物合成途径中的一种或多种关键酶；或者2)表达生物合成途径中的至少一种关键酶，与相应的内源酶相比，所述酶对反馈抑制较弱敏感或不敏感。公开号为2003/0097677和2003/0213010的美国专利中描述了这些方法的实例，这些专利并入本文作为参考。可通过以下方法来减少色氨酸的降解1)降低担负降解的一种或多种酶的数量；或者2)通过表达该酶的抑制剂来降低降解酶的效力；或者3)表达降解酶的突变型，所述突变型将竟争性抑制天然酶的活性。可通过基因抑制技术(例如反义抑制、有义共抑制、RNA干扰或本领域熟知的其它技术)降低酶的数量。植林具有众多氨基酸转运蛋白形式，根据其对个别氨基酸的专一性或亲和力进行表征。色氨酸转运蛋白的超量表达或更有效的色氨酸转运蛋白的表达将促进色氨酸从质体运输至其它区室，例如胞质腔、胞外腔或液泡。例如参见公开号为2003/0188332的美国专利。可通过超量表达含有高水平色氨酸的贮存蛋白质来增加蛋白结合的色氨酸。高色氨酸蛋白质可以是天然蛋白质或天然蛋白质的修饰型。PCT申请W098/45458、WO98/20133和W099/29882中公开了这些方法的实例。此外，通过增加大豆籽粒中的总蛋白浓度(相对于其它组分，例如碳水化合物和脂类)来提高蛋白结合的色氨酸的重量百分比。可通过筛选大豆的天然种质或大豆的突变群体得到高蛋白大豆。另一种增加蛋白结合的色氨酸的方法是抑制本身色氨酸含量低的天然贮存蛋白质的表达。在该方法中，相比于未抑制的亲本系，籽粒的氨基酸组成朝着有利于更高水平的色氨酸变化。美国专利6，326，527公开了这种方法的实例，其具体应用于玉米，但可适用于大豆。再一种增加大豆中蛋白结合的色氨酸的方法是用取代(substituting)色氨酸密码子代替编码其它氨基酸的那些密码子来设计编码主要贮存蛋白质的核酸序列。因此所得的表达蛋白具有更高的色氨酸水平，由此提高了植林中的总色氨酸水平。公开号为2003/0200558的美国专利公开了这种方法的实例。还一种方法中，可提高靶组织中的游离色氨酸水平，同时，可建立导致蛋白结合的色氨酸增加的互补蛋白库。美国专利6,080,913中记栽了这种方法的实例。本领域普通技术人员将意识到存在着其它方法以制备高色氨酸含量的大豆籽粒，且可用来产生本发明的高色氨酸含量的大豆粕。大豆加工及产品本发明的一方面，将高色氨酸大豆加工成高色氨酸含量的大豆粕。已知有许多方法用来将原料大豆加工成大豆粕。可使用这些加工高色氨酸大豆籽粒的方法来制备本发明的高色氨酸含量的大豆粕。制备大豆粕的说明性方法包括在美国专利4,992,294;5，225，230;5，773，051和5,866,192中教导的那些方法。典型地，商业性大豆加工的起始步骤是利用任何常规的运输手段接收来自田地的大豆。收到的大豆一般是肮脏的，且通常处于潮湿状态，可用振动筛使之清洁。在该步骤中，将大豆与非大豆物质(例如岩石、柴枝、树叶、茎、尘土、杂草籽和不需要的大豆碎片)分离。将清洁的大豆连同未被振动筛去除的松散豆皮(loosehulls)—起转移至吸气器，在吸气器中大部分残余的松散豆皮被空气脱除。然后将大豆转移至仓库，收集所移除的松散豆皮作为副产品用于进一步加工。在该加工点，大豆典型含有约12%水，但是大豆的实际水分含量可基于大量不同因素而变化。如果大豆的水分含量超过约12%，那么在放置于仓库之前，可对大豆进行干燥，以将水分含量降至约12%之下。水分含量的控制对于贮存期间防止霉菌和微生物污染是必要的。从该点向前的加工程序可根据希望的最终产品而变化。例如，可首先用常规设备(例如辊式破碎机或锤磨机)联合常规的吸气系统对大豆进行脱皮。或者，在进一步加工之前可不去除豆皮。例如参见美国专利5,225,230。为了使抗营养因子(例如胰岛素抑制剂)失活，可在破碎、磨碎或压碎之前，在设定的持续时段内对大豆进行加热。关于破碎工序，将清洁、干燥的整粒大豆投入粗瓦楞(coarselycormgated)辊式粉碎机或"破碎机"中。这些破碎机可具有一套或多套辊.形成大豆片(称为"裂片")。破碎步骤的目的在于使大小为原料大豆的1/4-1/8的大豆片最大化，使细片(直径小于lmm的大豆片)的形成最小化。将来自压碎机的整粒大豆的颗粒(裂片)传送至多级吸气脱皮系统，所述脱皮系统典型采用1~3级。每一级由吸气器和粒度筛选系统构成。在每一级，首先通过逆流气流和气旋将富含纤维的豆皮脱除。将较重的，纤维少的豆仁级分传送至筛选系统，所述筛选系统按粒度脱除至少一额外的级分，并得到一物料流(stream)用于进一步吸气。或者，筛选可在吸气之前进行。所述"皮"流典型地与其它大豆副产品混合，用作动物飼料成分。然后使用2步商业预浸提工艺对一次去皮的豆仁进行二次去皮，以使其粗纤维含量小于约3%(以脱脂、干基计，4.28%粗纤维)。但是，也可以使用单级系统来得到豆仁。然后在诸如旋转蒸煮器或蒸炒锅中对所得的豆仁进行热软化(heatconditioned)。裂片的停留时间典型为约20~约40分钟。出料温度典型为约120~180。F。如果可忍受轧胚机中产生较大细度，可采用较低的软化(conditioning)温度。然后将软化的豆仁投入光滑的辊式磨碎机(称为轧胚机)。典型施加在辊上的压力为大于约500千帕-标准规格(72.5psig)。为了在随后的油浸提步骤中回收到最大量的油，优选制备小于约0,75mm(0.030")的胚片厚度。任选地，破碎和去皮步骤省略，或在软化步骤之后进行。另一种选择是扩大轧胚大豆的百分比，以在油提取之前形成"collets"。其它的工序变化包括在破碎步骤之前进行软化，以及在油提取之前取消脱皮步骤。在取消脱皮步骤的工艺中所制备的本发明大豆粕将被认为是高色氨酸和高纤维大豆粕。该产品可以是猪生产操作中的特定词料成分。制备大豆粕工艺中的下一个步骤为提取油。典型使用亲脂溶剂实施该提取步骤，但也可以用机械提取来实施该步骤。在工序中，使大豆粕与适当溶剂(例如己烷)接触，以脱除油至其含量通常小于约1重量％。美国专利3，721，569中描述了常规溶剂浸提方法的一个实例，但是，如果想要"全脂"大豆粕，那么不对含油豆粕进行油(也称为脂肪或脂类)提取。在本发明的这种实施方案中，所得产品为高色氨酸含量的全脂大豆粕。在该阶段，溶剂浸提的脱脂大豆粕典型含有约30重量％溶剂。在用作动物饲料之前，典型通过粕蒸烘机(desolventizer-toaster，DT)加工大豆粕，以脱除残留的溶剂，并将蛋白质级分加热至足以使胰蛋白酶抑制剂和其它天然存在的毒物(拒食剂)失活。典型地，蒸汽接触大豆粕，从凝汽中释放的蒸发热使溶剂蒸发，随后回收和循环使用溶剂。作为溶剂浸提的替代方法，对大豆粕进行机械(例如使用螺旋压榨机)脱脂。这种机械提取或"螺旋压榨机"大豆粕典型含有约4~约8%的残余油。如果打算将该大豆粕用作反刍动物的饲料补充剂，那么在机械提取油之前，首先以特定方式(例如美国专利5,225,230所教导的方式)对该大豆粕进行加热和干燥。然后对脱脂大豆粕进行干燥以及典型的研磨或造粒，之后将其磨成适合用作食品补充剂或动物饲料的物理状态。可任选地进一步加工大豆或大豆粕以使所得的饲料对动物更加适口、易得和/或可消化。这些加工包括添加酶或营养素，以及对大豆粕进行热处理。另外，可对大豆粕做进一步的加工(例如造粒)以使其在分布中更加紧密和稠密。进一步加工大豆粕可制备具有食品、饲料和工业用途的大豆粉、大豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白。可将本发明高色氨酸含量的大豆粕进一步加工成任一种下述产品。通过磨碎和筛选脱脂大豆粕可简单地制备大豆粉。从脱脂大豆粕中脱除可溶性碳水化合物可制备含至少约65重量％蛋白质的大豆浓缩蛋白。脱除可溶性碳水化合物级分的最常用方法为含水乙醇(6080%乙醇水溶液)浸提法或蛋白质的等电pH4.5处的酸浸出法。已开发了大豆浓缩蛋白和大豆浓缩组织蛋白在加工食品、肉类、禽类、鱼类、谷类和奶类中的大量应用，这些应用中的任何一种均可以采用本发明高色氨酸含量的大豆粕。优选通过标准化学分离法制备大豆分离蛋白，通过增溶(pH710下碱提取)以及分离、然后等电沉淀将蛋白质从脱脂大豆胚片中提取出来。结果，分离物至少含约90重量％蛋白质。有时它们具有高含量的钠和矿物质(灰分含量)，这一性质会限制其应用。其主要应用于乳品替代，例如应用于婴儿配制食品和代乳品。大豆粉通常用于制备肉类增量品(meatextender)及仿肉类产品、宠物食品、焙烤食品配料和其它食品。由大豆粉和大豆分离物制备的食品包括婴儿食品、糖果、谷物制品、食品饮料、面条、酵母、啤酒、淡啤酒等等。本领域技术人员将认识到，可以对上述工序进行变化，而不违背本发明的精神。本发明高色氨酸含量的大豆粕可进一步加工成上述任何产品。饲料配方(formulations)本发明的高色氨酸含量的大豆粕用于各种饲料配方中。一种优选实施方案中，本发明的高色氨酸含量的大豆粕用于单胃动物(例如猪和家禽)用的祠料配方中。由于其色氨酸含量较高，相比于商品大豆粕，通常降低了本发明大豆粕的含量比例。在饲料配方中使用本发明大豆粕将减少或消除对添加外源色氨酸的需求。本择。本发明高色氨酸含量的大豆粕允许配方师在动物饲料中使用较便宜的成分，这降低了动物饲养者的饲料成本。下表显示了以下肉用仔鸡中雏日粮的比较使用本发明高色氨酸含量的大豆粕的配方(C)、无动物副产品的配方(A)以及有动物副产品的配方(B)。可以看出，将肉骨粉(MBM)和玉米面筋粉与本发明的高色氨酸含量的大豆粕(HT)—起使用，每吨饲料的成本降低4~6美元。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>下表列出了所选择的饲料成分及饲料配方，以及它们的粗蛋白(CP)、赖氨酸(Lys)和色氨酸(Trp)含量。可以看出，具有低色氨酸含量而高蛋白含量的某些成分可在含本发明高色氨酸含量的大豆粕的配方中使用。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>DDGS表示含可溶物酒粕.数据摘录自NRC家禽(1994)和NRC猪(1998)以下实施例对本发明做进一步详细说明，实施例以说明性方式提供，并无意以任何方式限制本发明。实施例1本实施例描述转基因高色氨酸大豆的产生，该大豆用于制备本发明的高色氨酸含量的大豆粕。按照Weaver等所述方法(公开号为2003/0213010的美国专利，已通过引用并入本文)产生高色氨酸大豆，称为GM—A15238:0015。简短地说，用载体pMON39325转化大豆植林，所述栽体含有由7Sot，启动子驱动的编码反馈不敏感的玉米邻氨基苯甲酸合酶(AS)oc亚基的序列。挑选含有高水平色氨酸的转化体(event)，并编号为GM—A15238.使来自该转化体的Rl种子在温室条件下生长，以产生Rl植林'使用InvaderAssay(ThirdWaveTechnologiesInc.,Madison,WI)对纯合植林和杂合植林进行筌定.选择一种基因阳性的纯合植林(GM_A15238:0015)和一种基因阴性的纯合植林(GM_A15238:0017)并使其产生进一步的世代。在用于可调型转基因物质的USDA规则(例如参见7CFR§340)的指导下产生用于高色氨酸含量的大豆粕制品的大豆籽粒。实施例2本实施例阐述大豆籽粒和大豆粕中游离色氨酸和总色氨酸以及总蛋白质的分析方法。游离色氨酸采用使用邻苯二甲醛(OPA)的柱前伯胺衍生法检测大豆粕中的氨基酸.所得到的氨基酸加合物(异吲哚)是疏水性的，且具有优异的荧光特性，该特性可随后在荧光检测器上被检测。使用反相色谱法，通过位于各氨基酸上的R基团的疏水性实现分离。为帮助稳定荧光团，加入硫醇，例如2-巯基乙醇或3-巯基丙酸。将种子和粕样品磨碎至lmm筛细度或更细。分析前，在5X:下贮存磨碎的样品。使样品处于室温，然后直接称重，置于锥形离心管(容量2.0ml)中以便分析。样品与萃取溶剂之比等于或小于30mg/ml。向每个样品中加入5%三氯乙酸(TCA)溶液(partno.VW3372-l，VWRScientific,WestChester,PA)，然后涡流混合约30分钟。将样品搁置过夜(16小时)以保证萃取完全。随后涡流混合样品约30分钟，以3000rpm离心30分钟，保留上清液，并在分析前贮存于-80x:下。用HPLC(型号1100，AgilentTechnologies,Inc.,PaloAIto，CA)分析氨基酸，所述HPLC配备荧光检测器(FLD)以及ZorbaxEclipse-AAAXDBC-18柱，ZorbaxEclipse-AAA保护柱，采用下列参数直至跑样的分析时间(analyticaltimetorunmethod):14.0分钟每次跑样的总耗用时间约17分钟典型样品规格及最小样品规格典型50mg最小30mg典型分析范围7.8800pmol/|iL,流动相为(A)40mM磷酸氢二钠緩冲液(pH==7.8，含0,001%叠氮化钠)和(B)乙腈甲醇:水(45:45:10v/v)。所有试剂为HPLC级，所有的溶剂为高纯度级(购自Honeywell,BurdickandJackson(Muskegon,Michigan))'下表显示所用的流动相的梯度和HPLC设置。时间(分)％B0.005.01.005.09.8035.012.00100.012.505,014.005.0温度40"C柱流量2.00mL/minFLD设置激发340nm发射450nm峰宽>0.2minPMT增益10焚光扫描激发范围220~380nm,步长5nm发射范围300~500nm,步长5nm按照AOAC官方方法990.03(2000)(AOACInternational,Gaitherburg，MD)分析粗蛋白；按照AOAC⑧官方方法982.30E(a，b，c)，CHP.45.3.05,(2000)分析氨基酸傳(profiles)。实施例3本实施例阐述以中试规模制备夫豆粕。通过溶剂浸提方法，以中试规模制备本发明大豆粕，在本文所述的饲养实验中^f吏用该大豆粕。使高色氨酸大豆GM一A15238:00159(实施例1中描述)以及亲本系A4922(AsgrowSeedCompany,DesMoines,IA)和阴性转基因同系(negativetransgenicisoline)GM—A15238:0017清洁，然后在BehlanWicks干燥器(BehlenManufacturingCompany,Columbus,NE)中干燥至水分含量为10~10.5%。然后在加盖的便携式料箱中贮存清洁干燥的大豆1~3天，以使豆仁从豆皮中松脱。随后将大豆投入单链Ferrell-Ross(A.T.FerrellCompanyInc.,Bluffton,IN)压碎机中。该辊式破碎机在室温下运行，辊缝设定为8，相当于1.9mm。各辊在1.5:1的差速比下运行，其中较慢的辊以700ppm运转。(KiceZigzagAspirator，Kicelndustries，Wichita，KS),以从豆仁中脱除豆皮。吸气器在1-2.4英寸水的绝对压力下操作。收集所得的豆皮，并投入锤磨机中.将得自锤磨机的产品送至重力分选台，在该处将富含豆仁的部分与豆皮分离，并进行收集。在轧胚之前，将这种方式收集的豆仁与吸气破碎的裂片级分混合(混合豆仁级分)。然后将混合豆仁级分以66188kg/小时传送至ScottTenderblend软化箱(conditioner)(型号SJC2，ScottEquipmentCompany,NewPrague,MN)中，加热以获得5567X:的出料温度，以及9.5%的水分含量。将软化的混合豆仁级分投入Roskamp辊式轧胚机(型号2862,28"直径x62"宽，CPMRoskampChampionWaterloo,IA)中，在该轧胚机中，在60"C下，使用0.010英寸的辊缝设定，将豆仁级分轧成0.230.36mm厚的胚片。随后将胚片投入CrownIronWorks2型滤过式浸出器(CrownIronWorksCo.，Roseville，MN)进行油浸提。该浸出器的操作条件为停留时间为约37分钟，己烷对大豆粕的重量比为1:1，物料通过量为约140kg/小时。然后通过CrownSchnecken预脱溶剂机将溶剂浸提的大豆粕传送至双层(deck)Crown粕蒸烘机(DT)。预脱溶剂机在0.2英寸水的压力下操作，以提供50"C的出料温度。DT在下列条件下操作顶层温度为91~1041C;底层温度为101~1031C;DT蒸汽温度为75土5"C。所得大豆粕的出料水分含量为16~19%，脲酶水平相当于升高pH0.15±0.5。然后将脱除溶剂的大豆粕干燥至水分含量为8.5~9.5%，之后将其锤磨至足以通过12/64英寸筛的粒度。所得的大豆粕用于下文所述的稳定性试验和肉用仔鸡饲养试验。实施例4本实施例对商品大豆粕、高色氨酸含量的大豆粕以及制备用来所述大豆粕的相应的大豆籽粒的蛋白质和色氨酸含量进行描述和比较。下表2显示本发明高色氨酸含量的大豆粕(HTSBM)、商品大豆粕、商品大豆和对照大豆粕的分析结果。按照实施例3所述，以中试规模制备对照大豆粕和高色氨酸含量的大豆粕。表2中还包括大豆分离物和大豆浓缩物的数值，用于比较。表2、大豆和大豆粕的比较分析<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>用来生成表2的分析方法如实施例2所述实施例5本实施例对本发明高色氨酸含量的大豆粕中的游离色氨酸在加工和贮存期间的稳定性测定进行描述。在这里所述的稳定性测定中，使用以上实施例3和4中描述的高色氨酸含量的大豆粕。如实施例2所述，在各阶段取得加工样品，并分析游离色氨酸。下表3概述了这些样品的分析结果。结果表明，游离色氨酸的浓度在高色氨酸含量的大豆粕的制备过程中未出现明显损失。基于标准化至脱脂、去皮及无水计，大豆粕成品保留了大豆籽粒中最初所含的游离色氨酸的约98%。作为比较，在DT步骤中遭受额外90分钟加热的大豆粕(过分蒸烘(overcooked)的大豆粕)的色氨酸浓度明显较低，这表明，在更剧烈的加热条件下有可能发生降解。表3、加工过程中游离色氨酸的稳定性和保留量样品游离色氨酸Y卯m)%保留量HT大豆(整粒)5032100%己烷浸提后的大豆粕475594%大豆粕成品492798%过分蒸烘的大豆粕**428485%*基于标准化至脱脂、去皮及无水计的数据，用于比较目的**通过将DT中的时间延长卯分钟所生成的过分蒸烘的大豆粕。进行稳定性实验以测定大豆粕贮存期间游离色氨酸和总色氨酸的稳定性，在环境模拟室(EnconairModelGC8-2H，EnconairEcologicalChambersInc.,Winnipeg,Mannitoba，Canada)中，使高色氨酸含量的大豆粕样品(如以上实施例3和4所述)在4X:、22"C和38"C下贮存6个月。约600克高色氨酸含量的大豆粕样品盛于Nalgene罐中在下表4和5规定的时间点分析子样品，每一时间点的分析重复两次。结果显示于表4和5。结果表明，经6个月，甚至在高温(38X:)下，本发明高色氨酸含量的大豆粕中的游离色氨酸和蛋白结合的色氨酸均稳定。表4、贮存期间高色氨酸大豆粕中的游离色氨酸的稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表5、贮存期间高色氨酸大豆粕中的总色氨酸的稳定性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在表4和5中，每一数据点代表2次重复的平均值。实施例6本实施例描述肉用仔鸡的饲养研究，该研究使用按实施例3所述方法制备的高色氨酸含量的大豆粕。饲养研究采用随机区组设计，该设计包括7种日粮处理，每种处理设10次重复。这些处理、两种大豆粕的分析以及研究中所用的詞料配方描述于表6-8中，将3个层架式鸡笼中的70只Petersime笼子(Zulte，Belgium)分成10个区组(重复)。区组的分布方式使每一层架式鸡笼内的笼子的位置和水平是块因子。在21天的试验中共使用560只雄性肉用仔鸡(鸟)(Ross308品系，WelpHatchery,Bancroft,IA)。当鸟为7日龄时，对它们进行称重，随机分配至畜圏，并开始实验。鸟在整个中雏期随意采食水和饲料。在所有日龄期使用粉料。表6、饲养实验用处理的描述<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>约在试验的第7、14、21和28天记录体重和采食量的测定值，以供计算平均曰增重、采食量以及第7~14、14~21、21~28天及整个试验期的饲料增重比。还记录整个试验期的死亡率。第1天的室温控制在卯土2。F，然后每天降低1。F直至试验结束，记录每曰高温和低温。整个试验期采用23小时光照，其中午夜l:00am为1小时黑暗期。每一畜團圈养6只鸟，在试验初始，生长密度为0.58平方英尺/鸟。表9显示对采用处理2~7的肉用仔鸡性能数据的因素分析。为了进行比较，还列出了对照组的平均性能。各个试验期之间的平均趋势十分相似。728日龄的结果表明，主效应大豆粕水平之间的饲料:增重比差异显著(P值〈0,0001)因为将饲粮配制成以色氨酸作为第一限制性营养素，所以，因提高SBM水平而引起的积极的性能反应可能归因于色氨酸含量的增加。主效应色氨酸来源的性能平均值证实了这种结论。亲本SBM加上游离色氨酸的处理组(P+T，处理4和5)与阳性色氨酸同系SBM的处理组(HT,处理6和7)具有等量的日粮色氨酸，且它们的性能十分相似(P+T和HT的第0~28天的饲料:增重比分别为1.611和1.624)。但是，饲喂色氨酸含量水平较低的亲本SBM饲粮(处理2和3)的鸟的性能明显较差(第028天的饲料:增重比为1.801)。试验结果进一步表明，就鸟的性能而言，转基因高色氨酸大豆粕(HT)中的色氨酸等同于外源提供的合成色氨酸(P+T)。表8、生物利用率试验中的成分及营养素组成(给出的数值以重量％计)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表9、主效应以及色氨酸来源与SBM水平对肉用仔鸡性能的相互作用处<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例7本实施例描述用于制备本发明高色氨酸含量的大豆粕的高色氨酸、高蛋白大豆品种的产生。使玉米邻氨基苯甲酸合酶a基因纯合的R3代大豆(记栽于公开号为2003/0213010的美国专利中)与高蛋白大豆品种EXP31032REN(记载于PCT申请PCT/US05/002503中)杂交，以产生F1种子。种植所得的Fl种子并使之生长至成熟，以产生F2种子。种植所得的F2种子，并就N-膦酰曱基甘氨酸耐受性和色氨酸含量方面对所得植林进行基因型分型。挑选被鉴定为N-膦酰甲基甘氨酸耐受性和高色氨酸基因的杂合植抹。在单林收获(singleplantharvest)中收集得到F2:3种子，分析其游离色氨酸含量(描述于以上实施例2)，用本领域熟知的方法分析其总蛋白含量和总油含量。F2:3选择的结果表明，在高蛋白种质中，以近似于预期的频率表达高色氨酸表型，同时保持可接受的油含量(表IO)。表10高蛋白水平对转基因大豆中的色氨酸含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>进一步对得自表10中所述的每一事件的单系(singleline)进行田间试验，以就种子组成、对N-膦酰甲基甘氨酸除草剂的耐受性以及一般农学方面进行评价。田间试验采用随机裂区设计，对以下3种N-膦酰甲基甘氨酸处理进行重复试验无N-膦酰甲基甘氨酸；在V3和R1阶段用1.5磅N-膦酰甲基甘氨酸酸当量(ae)/A处理；在V3阶段用1.5磅N-膦酰曱基甘氨酸ae/A处理，且在Rl阶段用3.0磅N-膦酰甲基甘氨酸ae/A处理，成熟时对所有的区块进行收获，对子样本进行色氨酸、油蛋白、萎黄病、坏死、植林高度、成熟度及产量分析.F2:4试验结果证实了较早的结果，即在高蛋白种质中表达了高色氨酸性状。另外，结果表明，高色氨酸性状的存在并不影响对N-膦酰甲基甘氨酸的耐受性.本实施例提供一种用来产生本发明高色氨酸含量的大豆粕的额外大豆来源。根据以上实施例3的描述，将这些大豆加工成高色氨酸含量的大豆粕。虽然在本发明申请中，通过参照本发明优选实施方案的细节公开了本发明，但应理解，该公开的意义旨在进行说明而非限制，因为考虑到在本发明的精神下和所附权利要求书的范围内，本领域技术人员将容易做出各种修改。权利要求1.一种大豆粕，其包含大于约0.78重量％总色氨酸，其中不添加外源色氨酸。2.权利要求l所述的大豆粕，其包含大于约0.8重量％总色氨酸。3.权利要求l所述的大豆粕，其包含大于约0.9重量％总色氨酸。4.权利要求l所述的大豆粕，其包含大于约1.0重量％总色氨酸。5.权利要求l所述的大豆粕，其包含大于约1.3重量％总色氨酸。6.权利要求l所述的大豆粕，其中所述大豆不是转基因大豆。7.权利要求l所述的大豆粕，其中所述大豆是转基因大豆。8.权利要求1所述的大豆粕，其中所述总色氨酸含量进一步包括至少0.10重量％的游离色氨酸浓度。9.权利要求l所述的大豆粕，其中所述总色氨酸含量进一步包括蛋白结合的色氨酸含量。10.权利要求9所述的大豆粕，其中所述蛋白结合的色氨酸含量包括转基因蛋白质。11.权利要求IO所述的大豆粕，其中所述转基因蛋白质含有至少约20%色氨酸残基。12.权利要求l所述的大豆粕，其中所述大豆由于超量表达至少一种编码色氨酸生物合成途径中的酶的基因而具有高色氨酸含量。13.权利要求12所述的大豆粕，其中所述酶选自邻氨基苯甲酸合酶、磷酸核色氨酸合酶。14、权利要求13所述的大豆粕，其中所述酶为邻氨基苯甲酸合酶。15、权利要求12所述的大豆粕，其中所述基因为转基因。16、权利要求15所述的大豆粕，其中所述转基因编码反馈不敏感的邻氨基苯甲酸合酶。17、权利要求15所述的大豆粕，其中所述转基因编码单体邻氨基苯甲酸合酶。18、权利要求12所述的大豆粕，其中由转基因转录因子引起超量表达所述基、磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶、吲哚-3-磷酸合酶和19、权利要求l所述的大豆粕，其中所述大豆表达编码催化色氨酸生物合成途径中的反应的酶的转基因，并且其中与催化相同反应的内源酶相比，所述酶对反馈抑制较弱敏感或不敏感。20、权利要求19所述的大豆粕，其中所述转基因编码邻氨基苯甲酸合酶。21、权利要求20所迷的大豆粕，其中所述邻氨基苯甲酸合酶是玉米C28变体。22、权利要求l所述的大豆粕，其中色氨酸降解途径中的一种或多种酶的活性被降低。23、权利要求22所述的大豆粕，其中所述降解途径中的酶包括分支酸变位酶、色氨酸酶和色氨酸氧化酶。24、权利要求22所述的大豆粕，其中由于编码色氨酸降解途径中的至少一种酶的基因的基因抑制而使所述活性降低。25、权利要求24所述的大豆粕，其中使用反义或有义共抑制技术实现所述抑制。26、一种动物飼料，其包含权利要求l所述的大豆粕。27、一种发酵飼料源，其包含权利要求l所述的大豆粕。28、由权利要求l所述大豆粕制备的大豆浓缩蛋白。29、一种水产养殖祠料，其包含权利要求1所述的大豆粕。30、一种制备具有至少约0.78重量％总色氨酸的大豆粕的方法，其包括a)将包含编码色氨酸生物合成途径中的酶的分离核酸分子的转基因导入大豆植林的可再生细胞中，以得到转化大豆植林细胞，其中所述分离核酸分子可操作性连接于在大豆细胞中有功能的启动子；b)由所迷转化大豆植林细胞再生大豆植林，其中所述植林的细胞表达由所述分离核酸分子编码的酶，相对于相同基因背景的未转化大豆植林的籽粒中的色氨酸含量，所述酶的表达量有效提高了植林籽粒中的色氨酸含量；以及e)由所述转化植林的籽粒制备大豆粕.31、权利要求30所述的方法，其中所述转基因编码包含邻氨基苯甲酸合酶cc-结构域和邻氨基苯甲酸合酶P-结构域的单体邻氨基苯甲酸合酶。32、权利要求30所述的方法，其中所述转基因编码反馈不敏感的玉米邻氨基苯甲酸合酶a-亚基。33、一种制备大豆粕的方法，其包括a)选择总色氨酸含量为约0.65重量％~约1.2重量％的大豆籽粒；和b)从所述籽粒中提取油，以制备大豆粕。34、权利要求33所述的方法，其中所述籽粒的游离色氨酸含量大于0.15重量％。全文摘要本发明提供高色氨酸含量的大豆粕。本发明进一步提供制备和使用该新颖大豆粕的方法。本发明还提供由该大豆粕进一步加工得到的产品。文档编号C11B1/10GK101253269SQ200680032153公开日2008年8月27日申请日期2006年7月6日优先权日2005年7月8日发明者F·池,J·梁申请人:雷尼森有限责任公司