胖大海单一多糖spa及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：胖大海单一多糖spa及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物多糖，特别涉及一种胖大海单一多糖SPA及其制备方法和应用。
背景技术：
：胖大海(SemenSterculiaeLychnophem)为梧桐科苹婆属植物的干燥成熟种子，是传统的清咽润喉的中药材。中医认为它有清热润肺、利咽解毒、润肠通便之功效，临床上应用较普遍，主要用于治疗肺闭郁、肺热咳嗽、咽喉肿痛、慢性咽炎、头痛目赤、声嘶音哑及热结便秘等症。胖大海多糖是胖大海中的一种主要成分。陈建民等人(陈建民，曹培让，宋洪涛.胖大海多糖PPIII的纯化及性质的研究[J].中国中药杂志，1996，21(1):39-41)分离出的PPIII为一碱性多糖，吴艳等(吴艳，顾小红，SteveW.Cui，汤坚.胖大海酸性多糖的分离纯化及初步结构研究[J].食品研究与开发，2006，27(7):95-98)分离出了一种胖大海单一酸性多糖，其由中性糖和糖醛酸组成，其中中性糖中按含量大小含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖，但未提及其药理活性。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种具有较佳抗炎活性的胖大海单一多糖SPA及其制备方法。本发明人在现有胖大海水提、醇沉提取粗多糖的工艺基础上，研究发现在水提前采用超声处理，即先对按常规脱脂和乙醇预处理的胖大海原料进行小功率、短时间的超声处理破坏其细胞结构，然后在温度不高的热水中不断搅拌提取，再按常规将提取液浓縮、醇沉和纯化制备水溶性多糖，这种把超声波处理和水浴提取相结合的方法获得的粗多糖得率和纯度都较高，而且粗多糖具有较佳的抗炎活性。这部分具体内容请参见本申请人于2007年8月21日递交的申请号为CN200710045091.0的专利申请。本发明人进一步对得到的胖大海粗多糖进行分离纯化，得到一种抗炎活性更佳的单一多糖。本发明对该单组分进行了进一步的结构分析及理化性质测定，发现其是一种主要由中性糖和糖醛酸组成的酸性多糖，其中中性糖主要包括阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)和葡萄糖(Glc)等单糖，而糖醛酸则主要包括半乳糖醛酸(GalA)和葡萄糖醛酸(GlcA)。故本发明提供的一种胖大海单一多糖SPA，其主要由质量百分比约为17~18%的阿拉伯糖、11~12%的鼠李糖、1516%的半乳糖、0.5~1°/。的木糖、0.10.5%的葡萄糖、39~40%的半乳糖醛酸和1~2%的葡萄糖醛酸组成，其中采用离子色谱法分析得到一具体结果显示SPA主要由质量百分比约为17.46%的阿拉伯糖、11.36%的鼠李糖、15.70%的半乳糖、0.63%木糖、0.35%的葡萄糖、39.30%的半乳糖醛酸和1.26%的葡萄糖醛酸组成，通过高效体积排阻色谱分析其重均分子量(Mw)为1.125xl06Da(道尔顿)左右。另外，通过常规分析方法，显示SPA中除上述各中性糖及糖醛酸等主要成分外，还含有质量百分比约为7.01%的水分，3.98%的灰分，2.95%的蛋白质等其他成分。通过1D(—维)和2D(二维)NMR谱图分析结果，结合单糖组成、糖醛酸的酯化度、羧基还原及甲基化等分析，所述的胖大海单一多糖SPA，可能具有如下述结构式I所示的主要结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中A是指部分GalA的(9-2或(9-3位被乙酰基(-OAc)取代，部分(约68mol%)GalA的羧基甲酯化(-COOCH3);而Rhap的4位上可分别连接侧链B，C和D，其中侧链B为T普Z-Ara/，侧链C为T-々-D-Gal/，侧链D为—5)-cc-Z-Ara/-(l—5)-a-丄-Ara/-(1—，侧链B和C占糖苷键总摩尔百分比分别约为20.01%和11.16%，侧链D的含量很少，约为1.81mol%。本发明提供的上述胖大海单一多糖SPA的制备方法，包括将采用超声波处理和水浴提取相结合的方法制得的粗多糖，通过十六垸基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀法进一步分离纯化。该制备方法可以包括以下步骤①将经脱脂、乙醇预处理的胖大海原料加水先经超声波处理，再加热至5565"C进行提取，然后按常规将提取液浓縮、醇沉及初步纯化制得胖大海粗多糖；将胖大海粗多糖配成0.20.6%(w/v)水溶液，离心除去不溶物，上清液中加入l/5l/4多糖液体积的3%十六烷基三甲基溴化铵溶液，至完全沉淀，静置过夜后离心，取沉淀加入盐溶液解离多糖和十六烷基三甲基溴化铵的复合物，并加入3.54倍体积95%乙醇，得沉淀为单一多糖SPA。根据本发明，步骤①的具体方法可参照现有技术和本申请人CN200710045091.0的专利申请，此专利申请中说明书的全文为本说明书所引用。其中，所述的步骤①中所加的水为经预处理的胖大海原料的7080重量倍；超声波的功率为50~60W，处理的时间为10~15分钟。所述的步骤①中提取次数为2~3次，每次提取时间为1~2小时，每次提取完毕后将提取液离心过滤，并进一步将过滤液中悬浮的溶涨胶类物质去除，例如用200目左右的尼龙布抽滤。所述的步骤①中预处理的胖大海原料可由下列方法制得胖大海粉在306(TC的石油醚中冷凝回流23小时，重复2次进行脱脂；然后将脱脂后的干燥物料在80~85%(v/v)乙醇中冷凝回流23小时，重复2次，挥干原料上的溶剂。所述的步骤①中按常规将提取液浓縮、醇沉及纯化包括下列步骤在5055"C将提取液减压浓縮至原体积的1/6;冷却后加入3~4倍体积的95%乙醇，48'C静置过夜，离心；取沉淀采用Sevag法去除蛋白质，该去除蛋白质后的物质再用95%乙醇沉淀，离心所得沉淀先后用无水乙醚、丙酮洗涤，然后干燥。根据本发明，步骤②中所述的盐溶液选用常用的2mol/L的NaCl溶液。同现有多糖的分离纯化类似，更佳地，本发明将步骤②得到的沉淀复水、透析、减压浓縮并冷冻干燥。经过动物试验急性炎症模型——二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验，慢性炎症模型一一植入棉球致大鼠肉芽组织增生法证明本发明胖大海单一多糖SPA均具有明显的抗炎活性，可用于制备具有抗炎功效的药物或饮食品。图1为本发明胖大海单一多糖SPA的高效体积排阻色谱图。图2为本发明胖大海单一多糖SPA单糖组成的离子色谱图。图3为本发明胖大海单一多糖SPA糖醛酸组成的离子色谱图。图4为果胶标样和本发明胖大海单一多糖SPA多糖的红外图谱。图5为FT-IR测定果胶多糖酯化度(DE)的标准曲线图。图6为本发明胖大海单一多糖SPA的谱图。图7为本发明胖大海单一多糖SPA的13C谱图。图8为本发明胖大海单一多糖SPA的COSY-45谱图。图9为本发明胖大海单一多糖SPA的TOCSY谱图。图10为本发明胖大海单一多糖SPA的HMQC谱图。图11为本发明胖大海单一多糖SPA的HMBC谱图。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例l胖大海粗多糖的制备将无霉变、干燥的胖大海(产于越南，购于无锡山禾药业股份有限公司)破碎成4050目大小的粉末；在50'C的石油醚中冷凝回流2.5h，重复2次进行脱脂，将物料晾干；将脱脂后的干燥物料在80%乙醇中冷凝回流2.5h，重复2次以除去单糖、多酚、低聚糖和甙类等小分子物质和钝化内源性酶，挥干原料上的溶剂;加入75倍重量的水浸泡预处理的原料，选取功率为60W超声波(SK5210HP超声波发生器，上海科导超声仪器有限公司)，对物料进行超声处理15min;将上述料液加热至65'C，不断搅拌提取1.5h，通过离心机在3500转/分的条件下离心10min，上清液中悬浮的溶涨胶类用200目的尼龙布抽滤，沉渣和不溶物再加入25倍原料重量的水，在65'C水浴中提取1.0h，进行类似第一次的离心过滤和尼龙布抽滤，合并两次抽滤液；在55"C对收集的抽滤液进行减压浓縮，浓縮至体积的约1/6，倒入洁净容器中冷却至室温；在冷却后的浓縮液中加入4倍体积的95%乙醇，充分搅拌混合，在4-C静置过夜，由于多糖不溶于乙醇形成沉淀，离心15min，收集多糖沉淀；采用Sevag法除去蛋白质将多糖沉淀溶解于水配成1.5%(w/v)的溶液，加入1/4体积的氯仿和正丁醇(体积比4:1)的混合液，剧烈震摇30min，静置除去乳白色的蛋白层，重复操作5次；将除蛋白之后的溶液浓縮，95%乙醇沉淀，离心得多糖沉淀，先后用无水乙醚、丙酮洗涤沉淀，最后将沉淀放在真空干燥箱中，在6(TC下真空干燥，即得胖大海水溶性粗多糖。实施例2本发明胖大海单一多糖SPA的分离纯化将胖大海粗多糖溶于水配成0.5w/v^溶液，离心除去不溶物，上清液中加入约l/5多糖液体积的3w/v^十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，不断地搅拌至完全沉淀，静置过夜后并离心(3000rpm、15min)，离心后的沉淀中加入2mol/LNaCl溶液解离多糖和CTAB的复合物，并加入4倍体积95v/v^乙醇沉淀得多糖SPA，多糖SPA被复水、透析(透析袋截留分子量10,000Da，用蒸馏水透析)、减压浓縮并冷冻干燥。一、本发明胖大海单一多糖SPA的分子特征和结构分析1.SPA的分子特征SPA分子的重均分子量Mw、相对粘度[ri]、回旋半径Rg和Mark-Houwink-Sakurada方程指数a由高效体积排阻色谱法(HPSEC)分析得到。高效体积排阻色谱系统包括ShimadzuSCL-10Avp泵和Shimadzu自动进样器，Viscotek三个检测器(示差折光检测器、粘度计和右角激光光散射检测器)，二根串联色谱柱(ShodexOhpakKB-806M和Ultrahydrogellinear)。流动相为0.1mol/L的NaN03，流速为0.6mL/min，进样量100^L。SPA溶解在0.1mol/L的NaN03溶液中，55°C搅拌溶解1h，冷却，用0.45|im尼龙膜过滤后进样，以已知分子量、固有粘度和dn/dc(比折光指数增量)的三种普鲁兰多糖为标样进行测定。由Viscotek公司提供的TriSEC软件计算多糖的重均分子量、固有粘度、回旋半径和Mark-Houwink-Sakurada方程指数。SPA的HPSEC色谱图见图1，其分子特征见表l。表1SPA多糖分子特征多重均分子量固有粘度回旋半径Mark-Houwink-Sakurada方糖Mw(Da)["](dL/g)Rg(nm)程指数aSPA1，125，0002.24242.460.586SPA高效体积排阻色谱图(图l)显示SPA为均匀对称峰，即为单一多糖分子，图中LS、RI和DP三线分别为激光光散射、示差折光和粘度信号响应值。SPA的重均分子量(Mw)、固有粘度([ti])、回旋半径(Rg)和Mark-Houwink-Sakurada方程指数(a)测定结果见表1:SPA的重均分子量为1.125xl06Da，SPA多糖的固有粘度为2.242dL/g，回旋半径又称回转半径，是单个高分子分子链在空间伸展程度的一种尺度，适于对高分子聚合物分子尺寸的表征，测得SPA回旋半径为42.46nm。当Mark-Houwink-Sakurada方程指数a为0.5-0.8时表明聚合物分子是一种无规巻曲的构型，a<0.5时分子构型接近球形，而aX).8时分子构型是杆状，HPSEC测得a为0.586，故SPA分子在0.1mol/LNaN03溶液中呈紧凑的无规巻曲构型。2.SPA的中性单糖组成分析采用离子色谱法测定单糖组成。准确称取SPA样品10.0025.00mg，溶于1mL1mol/L的硫酸溶液，IOO'C甘油浴中水解2h，水解液稀释20倍，通过HPAEC-PAD，分析其单糖组成。离子色谱测定条件为，色谱柱CarbopacePffl.PGI;流速1.0mL/min;进样量20pL;检测器脉冲安培检测器，金电极。采用NaOH溶液线性梯度洗脱(NaOH浓度100mmol/L~300mmol/L)。SPA单糖组成的HPAEC-PAD色谱图见图2，结果显示SPA主要由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、木糖和葡萄糖组成，其占SPA质量百分比见表2。表2SPA的中性单糖组成<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.SPA中糖醛酸的含量采用酸水解和酶水解之后，用离子色谱法测得其糖醛酸的组成。SPA首先在0.5mol/L三氟乙酸(TFA)中IO(TC水解1h，然后调至中性，由酶Driselase(Sigma-Aldrich)在35。C避光作用48h，过滤，滤液在HAEC-PAD中进行检测。离子色谱法测得其糖醛酸的色谱见图3，结果显示SPA主要是由半乳糖醛酸组成，含有少量的葡萄糖醛酸，其占SPA质量百分比分别为39.30%和1.26%。故而SPA是一种酸性多糖。4.SPA其它成分分析经常规方法分析减压干燥方法分析水分质量百分比约为7.01%，灰分(经马弗炉灰化方法分析)质量百分比约为3.98%，蛋白质(经凯氏定氮方法分析)质量百分比约为2.95%。5.SPA的糖醛酸的酯化度(DE，发生酯化的糖醛酸占总糖醛酸的含量)分析果胶标样的制备将3种己知DE摩尔百分比分别为26n/。、59%、94%的果胶标样(Sigma-Aldrich)按比例配制成DE摩尔百分比为42.5%和76.5%的果胶。将果胶标样和SPA多糖真空干燥，'放入真空干燥器中过夜。标准曲线的制作分别取DE为26。/。、42.5%、59%、76.5%、94%的果胶标样采用FTS7000FT-IR在4000~400cm"范围内进行扫描。采用单次衰减全反射分析(ATR)，DTGS检测器(DIGILAB，Randolph,MA)。扫描128次，分辨率为4cm"，每个样品测3次，取平均值。以DE(%)为纵坐标，」173(/C4l730+A61Q)为横坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程。对于高DE的果胶多糖样品，1730cm"和1610cm"的吸收峰分别归属于羧酸酯(-COOR)和羧酸盐(-COO—)的。=0伸縮振动。由图4可以看出，当DE为26。/。时，1730cm"处酯键(-COOR)C=O的吸收峰很小，趋于直线，随着DE的升高，吸收峰强度和峰面积随之增加，而1610cm"处游离羧酸盐(-COCT)C=0的吸收峰强度和峰面积逐渐降低，当DE为94%时，吸收峰趋于直线，二者之间此消彼长。由于DE表示酯化的羧基占全部羧基的摩尔百分数，因此，DE可通过与爿n3o/(^n3o+^6K))":峰面积)建立线性回归方程求得。图5为FT-IR测定果胶多糖DE的标准曲线，图中显示DE与^173()/04173()+」1610)之间呈现良好的线性关系(R2=0.9862)。经计算，SPA多糖的DE摩尔百分比值为68%。6.SPA的部分酸水解分析称取约20mgSPA于具塞瓶，分别溶于5mL0.05、0.2和0.5mol/LTFA溶液，100。C甘油浴水解1h。水解液对水透析(截留Mw3500Da)，得到低分子量透过液(SPA-XPL，X代表0.05、0.2和0.5，分别表示TFA的浓度)和高分子量截留液(SPA-XPH)。用N2除去多余的TFA后，加水复溶，冷冻干燥，得到SPA部分酸水解产物。部分酸水解产物被完全水解用离子色谱测得其单糖组成见表3。部分酸水解结果显示1)SPA经0.05mol/LTFA水解后，绝大部分Ara、Xyl和Glc被水解，Gal只水解了一小部分；2)0.2mol/LTFA水解后，透过液SPA-0.2PL中的Ara和Glc被完全水解，同时Rha和Gal发生水解；3)0.5mol/LTFA水解基本与0.2mol/LTFA水解的产物的单糖组成类似，只是程度更高一些；4)可初步得出，Ara、Xyl、Glc及Gal位于SPA多糖分子的支链上，Gal的水解速度较慢，表明以较高的聚合度与主链相连，而Ara水解速度快，0.05mol/LTFA水解后即被大部分水解，表明Ara以还原性末端或低聚寡糖的形式与主链相连或与半乳聚糖相连形成阿拉伯半乳聚糖；5)截留液组分随着酸水解程度的增加，GalA和Rha的含量逐渐增加，表明GalA和Rha位于主链上,表3部分酸水解产物的单糖组成水解产物糖醛酸质量百分含量(％)中性糖的摩尔百分含量(%)总糖醛酸鼠李糖阿拉伯糖半乳糖木糖葡萄糖SPA40.5624.8341.7331.251.510.68SPA-0.05PL痕量痕量90.738.510.860.60SPA-0.05PH50.6545.489.3543.270.460.60SPA-0.2PL5.3216.4864.8917.461.130.79SPA國0.2PH62.7851.53n.d.48.170.30n.d.SPA-0.5PL10.1220.3156.8421,201.450.69SPA-0.5PH73.8150.78n.d.48.90n.d.n.d,n.d.:未检测到。7.SPA的羧基还原和甲基化分析称取干燥的SPA约5.0mg溶解于重水中，加入催化剂(l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carboiimidemethyl-p-toluenesulfonate)并用0.1mol/LHCl(D20)调pH至4.75，搅拌1h后加入5mL含800mgNaBD04的重水溶液，并用2.0mol/LHCl(D20)不断调pH至7.0，反应结束，再将pH调至4.0。反应溶液在室温下透析(透析袋3500Da)过夜，冻干。将还原的多糖溶解，用乙酸甲醇液在氮气流下反复多次除去硼酸。经过充分干燥的上述样品，经无水DMSO充分溶解后，分别加入NaOH干燥粉末和碘甲烷进行甲基化反应，反应液用二氯甲烷萃取，过Na2S04柱，收集滤液，N2挥发至干。甲基化反应产物用TFA溶液水解，反应产物冷却后用N2挥发至干，再用NaBD4进行还原；将还原产物反复用乙酸/甲醇液以及甲醇除去硼酸根;加入0.5mL乙酸酐于10(TC进行衍生化，反应结束后用N2挥发至干，即为部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAA)。用二氯甲烷萃取，过Na2S04柱，收集滤液，采用GC-MS分析，结果如表4。GC-MS分析条件OV1701毛细管柱(00.25mmX30m，膜厚0.25mm)，程序升温起始温度15(TC，以3-C/min升温至250。C，停留10min，载气为氦气。EI+源，电子能量70eV，接口温度250。C，离子源温度20(TC，检测器电压350V。表4SPA还原后的甲基化分析(mol.%)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>甲基化分析结果表明1)SPA主要由1,4-D-Gal;A(p代表吡喃糖环，GalpA表示吡喃半乳糖醛酸)，T-(末端连接)，1，2-，1,2,4-Z-Rhap，T-，1,3-1,5-L-Ara/(/代表呋喃糖环)，禾QT-,1,3,6-,1，4-D-Gal/糖残基组成。2)1，4-Z)-Gal/A是主要的糖残基，Rha残基主要以1—2连接方式存在，其中8.28。/。的Rha/发生0-4位取代成为1,2，4-Rha;。3)T-、1,3-、1,5-Ara/的摩尔比为20:13.8:1.8，20%的Ara/残基位于非还原性末端，其含量之高表明并非所有的T-Am/残基都连接于阿拉伯聚糖，也可能位于半乳聚糖侧链或直接与主链糖残基相连。4)T-、1，3，6-、1,4-Gal;的摩尔比为11.2:4.5:2.9，11.2%的Gal/7残基为非还原性末端，Galp残基主要为1，6-连接并在(9-3位有分支，还有2.9%的Galp残基以1—4连接。8.核磁共振(NMR)分析(1)'HNMR分析"HNMR可用于确定多糖中糖残基的糖苷键构型。通常"-型糖苷异头碳的质子信号位于356范围内，A型糖苷异头碳的质子信号则出现在34~5范围内。SPA的^NMR图谱见图6，结果显示1)高场区31.28禾卩(51.19处微弱的共振信号为Rha残基的甲基质子信号，此信号通常以两个分得很开的成对峰出现，表明Rha残基有2种不同的糖苷键连接方式，这与甲基化分析结果相符。2)32.05和32.14为(9-乙酰基的甲基质子信号，两重峰说明乙酰基取代位置发生在糖链中糖残基的不同位置。(2)13CNMR分析13CNMR可通过异头碳的共振区"90110)峰的个数确定糖残基的数量和相对含量。通常，"-型糖苷异头碳的化学位移在(595~101范围内，而多数/^型糖苷异头碳的化学位移位于3101~105。SPA的13CNMR图谱见图7，结果显示1)在高场区，(516.86为Rha单元的6位甲基碳信号，320.38为(9-乙酰基的特征信号，c560.90为甲酯化的GalA的甲基碳信号。2)在低场区，3173.3和172.5的强信号分别归属于未甲酯化和甲酯化的GalA的C-6。3)异头区。90110)所显示的信号峰化学位移分别为(598.4、99.1、100.5、101.4、103.4和108.9。(3)2DNMR分析COSY(化学位移相关谱，'H」HChemicalshiftcorrelationspectroscopy)能够提供糖环中相邻氢核之间的耦合关系，SPA的COSY图谱见图8。TOCSY(全相关谱，Totalcorrelationspectroscopy)能够提供同一自旋体系中所有氢核间的耦合关系，包括长程耦合和短程耦合，如H1/H2,H3,H4，H5等，SPA的TOCSY图谱见图9。HMQC(异核多量子相关谱，"C」HHeteronuclearmultiple-qauntumconnectivity)能够提供直接相连的13C和]H间的耦合关系，明确归属糖单元中所有直接相连的C-H连接信息，因此在对iH进行归属后，即可通过HMQC谱对13C进行归属。此外，HMQC还可作为一种序列分析的工具给出糖单元之间的连接位置，提供分子骨架的结构信息，SPA的HMQC图谱见图10。HMBC(异核多键相关谱，"C」HHeteronuclearmultiplebondcorrelation)能够灵敏地提供远程13C和&间的耦合关系，明确归属糖单元中不相连的C-H信息，SPA的HMBC图谱见图11。综合以上图谱分析，对SPA中糖残基的和l3CNMR的化学位移进行归属，结果如表5和表6所示。表5SPA中糖残基的&NMR的化学位移")<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表6SPA中糖残基的13CNMR的化学位移糖残基-<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>对SPA中多元单糖残基的&和"C化学位移进行归属后，可以看出U5.0~5.25归属为丄-Am/、D-GalpA和丄-Rhap残基的异头质子，而J4.54.7归属为Z)-Galp残基的异头质子。由异头质子的化学位移推出Ara/、Rha;和Gal;A残基为a-构型，Galp残基为々-构型。2.3103.4、102.8、103.1和102.4的信号归属T隱、1，6國、1,4-和1,3,6-y9-Galp残基的质子。(5109.1、108.6和108.9的弱信号对应于T-、1,5和1，3-cc-Am/残基的质子。SPA的结构表征综合以上，SPA的1D和2DNMR谱图分析结果，结合部分酸水解产物的单糖组成、羧基还原和甲基化分析，推测SPA可能具有以下结构特征1.SPA的主链由1,4-Z)-GalpA线性连接形成"光滑区"半乳糖醛酸聚糖、由1，4-D-GalpA通过CM位与1,2-、1,2,4-丄-Rhap的(9-2位交替连接形成含有较多分支的"毛发区"鼠李半乳糖醛酸聚糖。半乳糖醛酸聚糖是多糖链的主要组成部分，其中部分羧基被甲酯化，其酯化度大约在6770mol^范围，部分0-2或(9-3位被乙酰基取代。20.8mol。/。的Rhap残基为1—2连接，62.2moP/。的Rhap残基发生CM位取代为1—2,4连接。2.T-、1,3-、1，54-Ara/和T-、1,6-、1,3，6-、1，4-D-Gal/聚合形成的阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖以及阿拉伯聚糖是SPA侧链的主要组成，通过Rhap残基的0-4位与主链相连。55.8mol。/。的Ara/位于非还原性末端，T-Ara/除了与主链Rhap残基的0-4位相连外，还连接于1，3-Ara/的0-3位、1，5-Ara/的0-5位以及1,6-Galp的03位；38.4mol。/。的Ara/残基以1—3连接方式成为阿拉伯聚糖的主链；57.2mol。/。的Gal/残基位于非还原末端，23.95mol%的Galp残基是1，3，6-D-Gal/连接在0-3位有分支。根据以上结构特征，SPA可能的一种分子结构如上述式I所示。试验实施例1本发明胖大海单一多糖SPA的抗急性炎症作用急性炎症模型二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验。昆明种雄性小鼠，体重(25士2)g，随机分组，每组8只，分别灌服实施例2制得的SPA多糖、实施例1粗多糖、阿司匹林混悬液(剂量为100mg/kg，阳性对照组)和同体积的生理盐水(空白对照组)，灌胃量均为0,2mL/10g溶液。灌胃前充分混匀，每日灌胃给药一次，连续5d。末次给药后lh，均匀涂抹二甲苯30uL于各小鼠右耳廓两面以致炎。致炎后lh处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳耳片，对齐双耳用直径8mm的打孔器打下双耳耳片，迅速用分析天平称重，以右耳片重减去左耳片重之差值计算肿胀度(肿胀度=右耳质量—左耳质量)及肿胀率和抑制率，将实验组与对照组肿胀度进行统计学处理(t-检验法)，比较组间显著性差异，见表7。表7胖大海多糖各组分对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响剂量肿胀度组别_肿胀率(％)抑制率(％)(mg/kgd)(X士S，mg)正常对照组018.69±3.22106.12±4.730阿司匹林组10012.38±2.12**73.43±5.1330.80SPA实验组5015.32±3.52*91.51±5.6213.76SPA实验组10014.02±2.82*81.84±4.5522.88SPA实验组20013.96±3.32**78.22±6.0126.29粗多糖20014.55±3.52*88.13±4.3516.95注与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。由表7可见，阿司匹林和SPA各剂量组均能较好地抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀，其抑制率分别为30.80%、13.76%、22.88%和26.29%。与正常对照组比，阿司匹林组和酸性多糖的高剂量组差异高度显著(PO.Ol)，其它各组差异显著(P0.05)，并且酸性多糖SPA对抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀呈现一定的剂量依赖关系，当剂量接近200mg/kg时抑制率增长缓慢。故酸性多糖SPA具有急性抗炎活性，是胖大海粗多糖中的主要活性成分。试验实施例2本发明胖大海单一多糖SPA的抗慢性炎症作用慢性炎症筛选模型植入棉球致大鼠肉芽组织增生法。1)动物处理SD雄性大鼠，体重卯-120g，以40mg/kg戊比巴妥钠腹腔注射(注射量为2mL/kg)致全身麻醉，脱毛后，在无菌条件于左腹下剪开约lcm的小口，将已烘干至恒重20mg的棉球经高温灭菌，无菌操作植入大鼠左侧腹股沟皮下，缝合，局部涂以庆大霉素。手术后将30只大鼠随机分组，每组6只，分别为空白对照组、阳性对照组和胖大海酸性多糖3个剂量实验组。空白对照组给予同体积的生理盐水，阳性对照组给予阿司匹林混悬液(剂量为100mg/kg)、实验组灌服胖大海酸性多糖其高、中和低剂量分别为200、100和50mg/kg。手术第二天开始给药，灌胃量O.lmL/kg，每天定时定量给予、连续14d。(2)肉芽体比测定实验结束当天先称大鼠的体重，再给一次受试样品，1h后将大鼠断颈处死。剥离并取出大鼠体内腹下棉球肉芽组织，于8(TC烘箱内干燥lh后称质量。计算大鼠肉芽肿的肉芽体比和抑制率肉芽肿净质量(mg)=干燥后棉球肉芽肿质量一原棉球质量，将肉芽肿净质量与鼠体质量比即为肉芽体比，用mg/100g表示。将给药组与对照组肉芽体比进行统计学处理(t-检验法)，比较组间显著性差异，见表8。表8胖大海酸性多糖对大鼠肉芽肿的影响组别剂量(mg/kgd)肉芽体比(^士S，mg/100g)抑制率(％)正常对照组046.02±6.010阿司匹林组10030.20土5.825^34.38SPA实验组5039.39±8.02*14.42SPA实验组10034.03±5.66**26.06SPA实验组20032.96±6.58**28.38注与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01由表8可见，阿司匹林组和酸性多糖各剂量组均能显著抑制由植入棉球所致的大鼠慢性肉芽组织增生，其抑制率分别为34.38%、14.42%、26.06%和28.38%。与正常对照组比，阿司匹林组和酸性多糖的中、高剂量组差异均高度显著(PO.Ol)，并且酸性多糖SPA对抑制大鼠肉芽肿呈现一定的剂量依赖关系，当剂量接近200mg/kg时抑制率增长缓慢。因此酸性多糖SPA也具有慢性抗炎活性。权利要求1、一种胖大海单一多糖SPA，其主要由质量百分比为17～18％的阿拉伯糖、11～12％的鼠李糖、15～16％的半乳糖、0.5～1％的木糖、0.1～0.5％的葡萄糖、39～40％的半乳糖醛酸和1～2％的葡萄糖醛酸组成，其重均分子量为1.125×106Da。2、如权利要求1所述的胖大海单一多糖SPA，其特征在于其主要由质量百分比为17.46%的阿拉伯糖、11.36%的鼠李糖、15.70%的半乳糖、0.63%的木糖、0.35%的葡萄糖、39.30%的半乳糖醛酸和1.26%的葡萄糖醛酸组成，其主要结构如下述结构式I所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中A是指有部分GalA的0-2或0-3位被乙酰基取代，67~70mol%GalA的羧基甲酯化；侧链B为T-a4-Ara/，侧链C为T-々-D-Galp，侧链D为5)-a-Z-Ara/-(l—5)-a-￡-Ara/-(l—，其中侧链B和C占糖苷键总摩尔百分比分别约为20.01%和11.16%，侧链D约为1.81%。3、如权利要求1或2所述的胖大海单一多糖SPA的制备方法，其包括以下步骤①将经脱脂、乙醇预处理的胖大海原料加水先经超声波处理，再加热至5565"C进行提取，然后按常规将提取液浓縮、醇沉及初步纯化制得胖大海粗多糖；②将胖大海粗多糖配成0.20.6w/wX水溶液，离心除去不溶物，上清液中加入1/51/4多糖液体积的3%十六烷基三甲基溴化铵溶液，至完全沉淀，静置过夜后离心，取沉淀加入盐溶液解离多糖和十六垸基三甲基溴化铵的复合物，并加入3.54倍体积95%乙醇，得沉淀为单一多糖SPA。4、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤①中所加的水为经预处理的胖大海原料的7080重量倍；超声波的功率为50~60W，处理的时间为1015分钟。5、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤①中提取次数为23次，每次提取时间为1~2小时，每次提取完毕后将提取液离心过滤，并进一步将过滤液中悬浮的溶涨胶类物质去除。6、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤①中预处理的胖大海原料可由下列方法制得胖大海粉在306(TC的石油醚中冷凝回流23小时，重复2次进行脱脂；然后将脱脂后的干燥物料在8085%(v/v)乙醇中冷凝回流23小时，重复2次，挥干原料上的溶剂。7、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤①中按常规将提取液浓縮、醇沉及纯化包括下列步骤在5055'C将提取液减压浓縮至原体积的1/6;冷却后加入3~4倍体积的95%乙醇，48。C静置过夜，离心；取沉淀采用Sevag法去除蛋白质，该去除蛋白质后的物质再用95%乙醇沉淀，离心所得沉淀先后用无水乙醚、丙酮洗涤，然后干燥。8、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤②中所述的盐溶液为2mol/LNaCl溶液。9、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于该制备方法还包括将步骤②得到的沉淀复水、透析、减压浓縮并冷冻干燥的步骤。10、如权利要求1或2所述的胖大海单一多糖SPA在制备抗炎药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种胖大海单一多糖SPA及其制备方法。SPA主要由质量百分比为17～18％的阿拉伯糖、11～12％的鼠李糖、15～16％的半乳糖、0.5～1％的木糖、0.1～0.5％的葡萄糖、39～40％的半乳糖醛酸和1～2％的葡萄糖醛酸组成，其重均分子量为1.125×10⁶Da。该制备方法包括采用CTAB沉淀法从经超声处理后水提、醇沉及经除蛋白等初步纯化后的粗多糖中分离纯化出SPA。SPA对急性炎症、肿胀，以及慢性肉芽肿等急、慢性炎症均具有较佳的抑制活性。文档编号C08B37/00GK101381418SQ20071004560公开日2009年3月11日申请日期2007年9月5日优先权日2007年9月5日发明者艳吴,崔武卫,王荫榆,艾连中,郭本恒申请人:光明乳业股份有限公司