生物膜的酶预防和控制的制作方法

专利名称：：生物膜的酶预防和控制的制作方法
技术领域：
：002本发明涉及用于防止和除去形成在表面上的生物膜的酶组合物和方法。
背景技术：
：003生物膜由包埋在粘液状胞外聚合物基质中的附着的微生物群组成，尽管尝试用传统方法——其被设计以杀死自由漂浮的微生物一一来控制，所述粘液状胞外聚合物基质继续存在。生物膜对抗生素、抗菌剂，甚至对氧化性生物杀虫剂的抗性已经被很好地证明。尽管与不想要的生物膜生长有关的问题存在，生物膜对于处理废水是有用的并且对于顽固性污染物、混合的废水流以及原位生物修复显示了特别的前景。004用于生物膜预防和/或减少的酶方法在本领域内是已知的，并且可以在下列公开中发现.'WO06/031554、WO01/98214、WO98/26807、WO04/04988、WO99/14312以及WO01/53010。005WO06/031554公开了源自细菌的a-淀粉酶用于防止、除去、减少或破坏存在于表面上的生物膜的用途。WO01/98214公开了降解由微生物产生的内酯以防止或除去生物膜的一种或多种酰基转移酶和载体。WO98/26807公开了使用来自真菌来源的一种或多种水解酶与氧化还原酶如氧化酶、过氧化酶或漆酶结合以杀死出现在生物膜中的细菌细胞。WO04/041988公开了蛋白酶、酯酶和/或淀粉酶的洗涤剂酶混合物。WO99/14312公开了用于生物膜降解的细菌酶混合物。WO01/53010公开了首先是糖酶然后是蛋白酶的顺序应用，用于生物膜去除。然而，文献中已知的公开没有有效地解决生物膜的预防和去除，并且仍没有被变成实践水平。006因此，本领域需要有效的产品，以消除、预防和/或减少工业、牙齿以及医疗保健设备中的生物膜。5发明简述007用于生物膜预防和控制的酶可应用于但不限于，工业用水管理如冷却塔、饮用水、废水；牙齿卫生、医学植入物和设备、血液透析系统；采油、生物修复井；纸和纸浆处理；船体；以及食物加工设备。008在本发明的第一个实施方式中，酶混合物被用于防止或减少生物膜形成。009在本发明的第二个实施方式中，在用酶混合物处理之后，40%以上的生物膜被除去。010在本发明的一个方面，所述酶混合物是一种或多种蛋白酶、一种或多种葡聚糖酶、以及一种或多种角质酶。011在本发明的另一方面，所述酶混合物是一种或多种蛋白酶、一种或多种葡聚糖酶，例如纤维素酶、一种或多种甘露聚糖酶和一种或多种角质酶。012仍在发明的另一方面，所述酶混合物是一种或多种蛋白酶、一种或多种葡聚糖酶、一种或多种甘露糖酶、和一种或多种脂肪酶。013在本发明另外的方面，所述酶混合物是一种或多种淀粉酶和葡聚糖酶。014仍在本发明的另一另外的方面，所述酶混合物是一种或多种淀粉酶和一种或多种蛋白酶。015仍在本发明的另一另外的方面，所述酶混合物是一种或多种纤维素酶和一种或多种蛋白酶。016本发明的酶混合物减少至少大约40%、至少大约50%、至少大约60%、至少大约70%、至少大约80%、至少大约90的生物膜。017在本发明中，所述酶混合物在不加入表面活性剂以及不使用漆酶的情况下防止或减少生物膜是有效的。018在本发明中，所述酶混合物在除去生物膜中至少如同10%的漂白剂处理一样有效。019酶混合物可以被用于在工业、牙齿和健康保健设备中除去和防止生物膜。这些生物膜的预防和去除应用包括但不限于工业用水管理如冷却塔、饮用水、废水；牙齿卫生、医学植入物和设备、血液透析水系统；采油、生物修复井；纸和纸浆处理；船体；以及食物加工设备。020从下列详细的描述中，本发明另外的目标、特征和益处将变得明了。然而，应该理解，详细的描述和具体的实例，虽然表明了本发明优选的实施方式，但仅仅通过举例说明的方式提供，因为从详细的描述中可以得出，在本发明的范围和精神之内的各种变化和改变对于本领域技术人员将变得明显。发明详述021现在本发明将仅仅应用下列的定义和实例通过引用的方式被详细地描述。所有的专利和出版物，包括在这样的专利和出版物之内公开的所有序列，在此涉及到的通过引用被清楚地并入。022除非本文中另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。例如，Singleton等,Z)/"/0"a;7o/Mcra6/o/ogy朋t/Mo/ecw/a/-2dEd.,JohnWileyandSons,NY(1994);以及Hale禾口Marham,//ar/7erCo〃/m1D/c//<9"a^y0/HarperPerennial,NY(1991)为本领域普通技术人员提供了在本文中使用的许多术语的一般性诠释。尽管和本文中描述的那些相似或等同的任何方法和材料在本发明的实践中可以使用，但是优选的方法和材料仍在本文中被描述。数字范围包括限定所述范围的数字在内。除非另外指出，分别地，核酸从左到右以5'到3'的方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基到羧基的方向书写。对于本领域的定义和术语，专业人员特别指Sambrook等人，1989和AusubelFM等人，1993。将会理解本发明不限于特定的所描述的方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。023数字范围包括限定所述范围的数字在内。024除非另外指出，分别而言，核酸从左到右以5'到3'的方向书写；氨基酸序列从左到右以氨基到羧基的方向书写。025本文所提供的标题并非是对本发明的各个方面或各种实施方式的限制，其可以通过整体参考说明书而被理解。因此，通过整体参考说明书，紧接下面被定义的术语被更加充分地定义。定义026"生物膜"表示被包埋在附到表面上的细胞外聚合物基质中的微生物群体。生物膜可以具有一种或多种微生物并且进一步包括水，并可以包括其它的俘获粒子。所述微生物可以是革兰氏阳性的或革兰氏阴性细菌(需氧的或厌氧的)；藻类、原生动物和/或酵母或丝状真菌。在一些实施方式中，生物膜是葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、李斯特氏菌属(Listeria)、链球菌属(Streptococcus)以及埃希氏菌属(Escherichia)的细菌属的活细胞。027"表面"表示具有足够的质量以允许生物膜粘附的任何结构。硬的表面包括但不限于，金属、玻璃、陶瓷、木材、矿物(岩石、石头、大理石、花岗岩)、集料如混凝土、塑料、复合材料、硬橡胶材料以及石膏。硬的材料可以用珐琅和油漆涂饰。硬表面存在于，例如，在水处理和储存设备和槽；乳品和食品加工设备和设施；医疗设备和设施，如外科器械和永久及临时植入物；工业制药设备和车间中。软的表面是，例如，毛发和所有类型的纺织品。多孔表面可以是生物表面，如皮肤、角蛋白或内部器官。多孔表面还可以在某些陶瓷中以及在被用于过滤的膜中被发现。其它的表面包括但不限于船体和游泳池。028"酶剂量"表示被用于处理生物膜的酶混合物的量，或用在酶混合物中的单一酶的量。影响酶剂量的因素包括但不限于，酶的类型、待处理的表面以及想要的结果。在一个实施方式中，酶剂量是减少至少40%的生物膜所需要的酶混合物的量。一般而言，实用的、经济可行的总的酶剂量水平为大约1%。本领域技术人员将会理解如果需要，较高水平的酶可以被使用。在酶混合物中相等剂量的每一种酶可以被使用但不是必需的。一般而言，酶混合物中的酶含量总计为大约1%或以下，2%或以下，3%或以下，4%或以下，5%或以下。029"生物膜去除"表示通过酶混合物的催化活性，在表面上至少40%的生物膜减少。如下面实施例2中所示出的，用结晶紫分析方法测量去除，其中所述分析方法将样品浸入结晶紫溶液(0.31%w/v)中十分钟，然后在PBS中洗样品三次以除去未结合的着色剂。使用95%乙醇从生物膜中提取结合的着色剂，并且在540nm读取结晶紫/乙醇溶液的吸光率。由[(1-剩余生物膜的分数)"100]来计算假单胞菌的去除百分比。如下计算剩余生物膜的分数，其通过从提取自酶处理生物膜的溶液的吸光率减去培养基+酶溶液的吸光率，除以未处理对照生物膜的吸光率减去仅仅生长培养基的吸光率之差额吸光率来计算。在本发明另外的实施方式中，去除为至少50%的生物膜减少，至少60%的生物膜减少，至少70%的生物膜减少，至少80%的生物膜减少，至少90%的生物膜减少，以及至少100%的生物膜减少。030用于处理生物膜的"酶混合物"表示至少两种酶。所述至少两种酶可以是下列酶的组合糖酶，如纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和卩葡糖苷酶；淀粉酶如a淀粉酶；蛋白酶如丝氨酸蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶、酯酶和角质酶；颗粒淀粉水解酶；脂酶，如磷脂酶，以及半纤维素酶如甘露聚糖酶。用于酶混合物的酶可以源自植物和动物来源、细菌、真菌或酵母，并且可以是野生型酶或变体酶。031"酸性条件"，"中性条件"和"碱性条件"对于本领域普通技术人员是熟知的。为了本公开的目的，酸性条件表示从大约4到6的pH。中性条件表示从大约6到8的pH。碱性条件表示从大约8到10的pH。032可以使用的水解酶(E.C.3.)包括，例如，蛋白酶、葡聚糖酶(糖基水解酶家族16)、纤维素酶、酯酶、甘露聚糖酶和阿拉伯聚糖酶。中性丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶可以被用于本发明。中性蛋白酶是在大约6至8的中性pH范围内具有最佳蛋白水解活性的蛋白酶。合适的中性蛋白酶是天冬氨酸和金属蛋白酶。商业上合适的金属蛋白酶是MULTIFECT、PURAFECTL、FNA、PROPERASEL、PURADAXEG7000L以及来自黑曲霉^wg/〃ram'gw)的GC106，其全部从8GenencorInternational,Inc.,PaloAlto,California可得，禾口Alcalase、Savinase、Esperase和Neutmse(NovoNordiskA/S,Denmark)。中性蛋白酶可以源自细菌、真菌或酵母来源，或植物或动物来源，并且可以是野生型酶或变体酶。变体酶在表达从亲本基因突变的基因的来源中产生。033可以被用于本发明的纤维素酶的例子可以是内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和P葡糖苷酶，包括在酸性至中性pH范围具有最佳活性的纤维素酶，例如，源自细菌来源的PURADAX、来自GenencorInternational,Inc的LAMINEX和rNDIAGE，两者都源自真菌来源。纤维素酶可以源自例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐殖霉(Humicola)、镰刀霉属(Fusarium)和青霉属(Penicillium)的真菌。034有用的颗粒淀粉水解酶的例子包括源自腐殖霉属、曲霉属和根霉属(Phizopus)的菌株的葡糖淀粉酶。颗粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH》酶表示水解颗粒形式的淀粉的酶。葡糖淀粉酶是指酶的淀粉葡糖苷酶类(例如，EC.3.2丄3葡糖淀粉酶、1,4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶(glucohyrolase))。这些是外切酶，其从淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖基残基。该酶还水解a-1,6和a-l,3-键。应用熟知的分析方法，基于葡糖淀粉酶将对硝基苯-a-D-吡喃型葡萄糖苷(p-ni加phenyl-alpha-D-glucopyranoside(PNPG))催化为葡萄糖和对硝基苯酚的能力，可以测量葡糖淀粉酶活性。在碱性pH，硝基苯酚形成黄色，所述黄色与葡糖淀粉酶活性成比例并且在400nm被监测，然后与测量为GAU的酶标准比较。GAU(glucoamylaseactivityunit(葡糖淀粉酶活性单位))被定义为将产生1克还原糖的酶量，计算为在pH4.2和6(TC下每小时由可溶性淀粉底物(4%ds)产生的葡萄糖。从GenencorInternationalInc商业上可得的合适的葡糖淀粉酶包括OPTIDEX、DISTILLASE和G-ZYME。035可被用于本发明的脂肪酶的例子可以是酸性、中性和碱性脂肪酶和磷脂酶。从GenencorInternationalInc.商业上可得的脂肪酶和磷脂酶包括LYSOMAX和CUTINASE。036可以被用于本发明的半纤维素酶、甘露聚糖酶的例子可以是来自缓慢芽孢杆菌(5a"7/w;y/eWw力的GC265、来自GenencorInternational,Inc的HEMICELL和PURABRITE，这两者都来源于缓慢芽孢杆菌，以及甘露聚糖酶，其在Stahlbrand等人J.Biotechnol.29(1993),229-242中被描述。037可以被用于本发明的酯酶和角质酶的例子可以从GenencorInternational,Inc.、从任何来源，包括例如细菌来源如门多萨假单胞菌(i^wctomo"asme"t/od"a)或真菌来源如腐殖霉属或镰刀霉属获得。038可以被用在本发明中的淀粉酶的例子包括a或p淀粉酶，其可以从细菌或真菌来源获得，如芽孢杆菌淀粉酶(淀粉液化芽孢杆菌(及"my/o/&we/ac/era)、地衣芽孢杆菌(5./,'ctew/om^)和嗜热脂肪芽孢杆菌(及Weara^e^o/7Mw力)和曲霉属、腐殖霉属以及木霉属淀粉酶，例如(黑曲霉(Aw扭r)、A^wocfe'和米曲霉(A0^加e))。淀粉酶可以从GenencorInternationalInc获得并且包括SPEZYMEFRED、SPEZYMEAA、CLARASE、AMYLEX以及淀粉酶SPEZYMEETHYL的混合物。从NovozymesA/S(Denmark)可得的淀粉酶包括BAN、AQUAZYM、AQUAZYMUitra和TERMAMYL。其它的淀粉酶是淀粉酶的混合物，如来自Biocon的Ml，和来自Sumizyme的CuConc，ArisSumizymeL(内切1,5a-L阿拉伯聚糖酶)，ACHSumizyme(J3甘露聚糖酶)，腐殖霉葡糖淀粉酶，葡聚糖酶，dextmmase，几丁质酶，ENDOH，以及OptimaxL1000(葡糖淀粉酶)。039在本发明中，超过375种不同的酶混合物的生物膜去除特性被检测。采用如实施例1所描述的高通量方法，经过筛选鉴定得到33种令人惊讶的酶混合物，所述酶混合物导致至少40%(69%至84%)的生物膜减少。33种酶混合物的17种在酸性条件下被使用并且减少生物膜71%至84%，所述酶混合物的5种在中性条件下被使用并且减少生物膜69%至88%,而所述酶混合物的11种在碱性条件下使用。040所述33种酶混合物包括下述酶的混合物a淀粉酶和甘露聚糖酶；淀粉酶和蛋白酶；淀粉酶和阿拉伯聚糖酶；至少一种a淀粉酶和至少两种其它的淀粉酶；蛋白酶、纤维素酶和葡聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶和三种葡聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶；蛋白酶、淀粉酶和葡聚糖酶；蛋白酶、甘露聚糖酶和淀粉酶；纤维素酶、阿拉伯聚糖酶和淀粉酶；蛋白酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和磷脂酶；蛋白酶、葡聚糖酶、淀粉酶和阿拉伯聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶和两种葡聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶和三种葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和磷脂酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和酯酶；三种蛋白酶、甘露聚糖酶、磷脂酶和酯酶；三种蛋白酶、纤维素酶和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶和葡聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；至少三种淀粉酶和纤维素酶；淀粉酶、阿拉伯聚糖酶和纤维素酶；淀粉酶、阿拉伯聚糖酶和蛋白酶；至少三种淀粉酶和蛋白酶；至少三种淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶；葡聚糖酶和淀粉酶混合物；纤维素酶和淀粉酶混合物。041优选的一组20种酶混合物包括蛋白酶、葡聚糖酶和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种或多种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；至少两种淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶。042四种特别优选的酶混合物是蛋白酶、葡聚糖酶和角质酶，并且可以应用商业上可得的酶MULTIFECTNEUTRAL、LAMINEXBG和角质酶来制备；蛋白酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶和角质酶，并可以应用商业上可得的酶MULTIFECTNEUTRAL、LAMINEXBG、甘露聚糖酶和角质酶来制备；蛋白酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶和磷脂酶并且可以应用商业上可得的酶MULTIFECTNEUTRAL、LAMINEXBG、甘露聚糖酶和LYSOMAX来制备；以及三种蛋白酶加上纤维素酶、甘露聚糖酶和角质酶的混合物，并且可以应用商业上可得的酶PROPERASEL、PURAFECTL、FNA、LAMINEXBG、甘露聚糖酶和角质酶来制备。043本发明的优选的实施方式包括下列从GenencorInternationalInc.商业可得的酶制剂MULTIFECTNEUTRAL;LAMINEX;LYSOMAX;PROPERASE;PURADAX、PURAFECT;禾BSPEZYME，其全部为GenencorInternational,Inc的注册商标。044MULTIFECTNEUTRAL包括淀粉液化芽孢杆菌蛋白酶(EC3.4.24.28);具有大约3200IU/克的活性水平的LAMINEXBG包括木霉属B葡聚糖酶(纤维素酶EC3.3丄6);具有大约400U/克的活性水平的LYSOMAX包括S^j^wnyc^v/o/ceora6w磷脂酶；具有大约1600PU/克的活性水平的PROPERASE包括嗜碱性芽孢杆菌0S"c/〃^"/ca/opM^)蛋白酶(EC3.4.21.62);具有大约42.000GSU/克的活性的PURAFECT包括枯草杆菌蛋白酶蛋白酶(EC3.4.21.62)，如在美国专利第5,624,829中描述的，该专利以其全部通过引用被并入本文；FNA包括枯草杆菌蛋白酶(Sad〃MHw6"fc)蛋白酶(EC3.4.21.62)，如在美国专利RE34,606中和在美国专利第5,310,675中描述的，所述专利以其全部通过引用被并入本文；具有大约32U/克的活性水平的PURADAX包括里氏木霉(7>/c/20^/7naw"e/)纤维素酶(EC3,2丄4)，如在美国专利第5,753,484号中描述的，该专利以其全部通过引用被并入此文；具有大约15,100LU/克的活性水平的SPEZYMEFRED包括来自地衣芽孢杆菌(EC3.2丄1)的a淀粉酶，如在美国专利第5,736,499;5,958,739和5,824,532号中描述的，它们通过引用被并入于此。045应用商业可得的酶的优选的酶混合物包括下列各种1.MULTIFECTNEUTRAL;LAMINEXBG和角质酶。2.MULTIFECTNEUTRAL;LAMINEXBG;甘露聚糖酶和角质酶。3.MULTIFECTNEUTRAL;LAMINEXBG;甘露聚糖酶和LYSOMAX。4.PROPERASEL;PURAFECTL;FNA;LAMINEXBG、甘露聚糖酶和角质酶。5.PROPERASEL;PURAFECTL;FNA;甘露聚糖酶、角质酶和YSOMAX。6.PROPERATEL;PURAFECTL、FNA、甘露聚糖酶、LAMINEXBG。7.MULTIFECTNEUTRAL;LAMINEXBG;和甘露聚糖酶。8.FNA;PURADAXEG7000L;LAMINEXBG和角质酶。9.PURAFECTL;FNA;LAMINEXBG;禾卩LYSOMAX。10.PROPERASEL;FNA;LAMINEXBG;禾卩LYSOMAX。11.PROPERASEL;PURAFECTL;FNA;LAMINEXBG;PURADAXEG7000L;禾卩LYSOMAX。12.PROPERASEL;PURAFECTL;FNA;LAMINEXBG;角质酶和LYSOMAX。13.MULTIFECTNEUTRAL;PURADAXEG7000L;LAMINEXBG;LYSOMAX;和角质酶。14.PROPERASEL;LAMINEXBG;LYSOMAX和角质酶。046更特别优选的酶混合物是上面列出的组合1、2、3和4。另外特别优选的酶组合包括SPEZYME，其包括从地衣芽孢杆菌获得的a淀粉酶；CuCONC，其是具有颗粒淀粉水解活性的雪白根酶(W//zc^MwVra力Koji菌株葡糖淀粉酶的商标名(ShinNihonChemicalCo.Ltd.Japan);AFPGC106,其是酸性的真菌蛋白酶(ShinHihonChemicalCo.Ltd.Japan);Ml，其从BioconIndia,Ltd.,Bangalore,India可得；ARISSUMIZYME(1,5-a阿拉伯聚糖酶)和ACHSUMIZYME。15.SPEZYMEFREDL;CuCON禾卩LAMINEXBG。16.SPEZYMEFLREDL;ArisSUMIZYME和LAMINEXBG。17.SPEZYMEFREDL和CuCONC。18.SPEZYMEFREDL;CuCONC禾卩GC106。19.SPEZYMEFREDL禾口GC106。20.SPEZYMEFREDL和Ml。21.SPEZYMEFREDL;ArisSUMIZYME和GC106。22.SPEZYMEFREDL;CuCONC;LAMINEXBG和GC106。23.SPEZYMEFREDL;ACHSUMIZYME禾卩GC106。24.SPEZYMEFREDL;ArisSUMIZYME;LAMINEXBG和GC106。25.CuCONC和LAMINEXBG。26.SPEZYMEFREDL和ArisSUMIZYME。27.Ml和LAMINEXBG。1228.SPEZYMEFREDL;LAMINEXBG和GC画。29.CuCONC;LAMINEXBG禾BGC106。方法学047本发明的酶混合物以有效除去生物膜的量被加入到生物膜中。精确的剂量对于本发明不是关键的并且可以发生很大的变化，取决待处理的表面的性质和处理条件如pH和温度。在实施例中，所使用的酶量可达大约1%的总量，并且在一些情况下，可达3%至6%。048本发明的方法优选地在所述酶混合物的酶有活性的pH范围内进行。一般地，生物膜去除组合物的pH在大约4至大约9的范围内。049本发明的方法优选地在包含混合物的酶有活性的温度进行，并且一般为大约2(TC至大约50°C。050在随后的实验公开中，使用下列縮写词eq(当量)；M(摩尔)；nM(微摩尔)；N(标准)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；nmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；pg(微克)；L(升);ml(毫升)；iil(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；pm(微米)；nm(纳米)；。C(摄氏度)；h(小时)；min(分钟)；sec(秒);msec(毫秒)；U(单位);IU(国际单位)。酶混合物的制备51基于重量，制备所有各种酶混合物的组合，用于生物膜去除和预防效力的筛选。在一些情况下，lwt。/。的每一种酶在期望的缓冲液中混合以获得期望的酶组合，产生剂量为3wt。/。、4wt%、5wt。/。和6wty。的酶混合物。所有的酶依次加入并且蛋白酶刚好在生物膜处理开始之前被最后加入。用于进一步研究的更经济的相关酶混合物被制造，其中混合物中所有酶的组合被设定为1%的最终总组合量。此外，所有酶依次加入并且蛋白酶刚好在生物膜处理开始之前被加入。混合物中的酶不需要依次加入并且可以在同一时间被加入。实施例052本发明在下列实施例中被更详细地描述，所述实施例不意图以任何方式限制本发明权利要求所要求的范围。附图意欲被视为本发明的说明书和描述的完整部分。所有引用的参考文献通过引用被特别并入本文，用于在那里描述的全部内容。下列实施例被提供以说明但不限制要求保护的发明。053通过检测每一种混合物除去铜绿假单胞菌生物膜的能力来筛选多种酶混合物。使用高通量96孔微孔板方法来完成筛选。13实施例1一般实验设置0054基于所设计的酶研究基质，高通量方法被用于筛选大量的酶的混合物。PBS和醋酸盐缓冲液被用于制备溶液(Tris缓冲液pH7.0或8.5和醋酸盐缓冲液pH5.0)。各种酶混合物组合按照酶的pH和温度说明由酶制造。包含所有375种不同的组合的表作为附录A被包括。96孔板的方法被用于筛选375种不同的酶组合，每一种重复4次。这种分析允许在96孔微孔板的孔中形成生物膜，其可以被用于提供可达96种不同的测试样品。细菌接种物培养物(铜绿假单胞菌，POl，生物膜形成)于2rC在摇瓶中的胰蛋白酶消化大豆肉汤(Trypticsoybroth(TSB))中生长过夜。20毫升的这种肉汤随后被加入到另一摇瓶中的另外180毫升的新鲜胰蛋白酶消化大豆肉汤中。使用96针式复制器(96pinreplicator)，200微升这种稀释的接种物随后被加入到96孔板的每一个孔中。在每隔8-10小时，营养物、浮游的细胞和培养基被吸出并且用新鲜的TSB培养基替换。生物膜在2'C在孔中生长24小时。生物膜形成之后，从96孔板除去所述培养基，并且各种酶和对照处理溶液被转到所述板的孔中。生物膜被允许浸透特定的一段时间(本研究用90分钟)。然后用去离子水冲洗孔两次，以除去任何残留的处理溶液并且悬浮来自所述系统的细胞。然后用结晶紫将生物膜染色10分钟。孔各自被冲洗4次，以除去任何来自系统的过多染液，并且随后用300微升乙醇洗脱。该洗脱步骤提高了分析期间染色的检测结果。然后所述板被立即用微孔板阅读器(J.microbiologicalmethods54(2003)269-276)读取。所有的处理进行至少4次重复。在筛选条件下，漂白剂对照在pH7.0具有75%的减少，在pH5.0具有75%的减少、在pH8具有93%的减少。在酸性pH条件下的生物膜去除055特定的酶如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和在酸性条件(pH5)下对它们的水解作用有效的其它糖酶被选择来筛选它们除去生物膜的效力。例如，GC106酸性蛋白酶与脂肪酶、纤维素酶和在酸性条件(pH5)下对它们的水解作用有效的其它糖酶组合被用于本研究。从本研究中所筛选的375种组合范围中的17种酶组合基质达到69-88%的生物膜去除。在中性pH条件下的生物膜的去除056特定的酶如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和在中性条件(pH7)下对它们的水解作用有效的糖酶被选择来筛选它们除去生物膜的效力。例如，中性蛋白酶与脂肪酶、纤维素酶和在中性条件下对它们的水解作用有效的其它糖酶组合被用于本研究。从本研究中筛选的5种酶组合基质达到71-84%的生物膜去除。在碱性pH条件下的生物膜去除057特定的酶如碱性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和在碱性条件(pH8.4)下对它们的水解作用有效的其它糖酶被选择来筛选它们除去生物膜的效力。例如，丝氨酸蛋白酶如FNA、Purafact、Proparase与脂肪酶、纤维素酶和在碱性条件下在它们的作用中有效的其它糖酶组合被用于本研究。从本研究中筛选的11种酶组合基质达到70-80%的生物膜去除。数据的统计学分析058数据的统计学意义被分析。方差分析确定下列三十三(33)种酶混合物与对照的统计学差异。族辨别误差率(family-wiseerrorrate)被设定在0.05，也就是说，在来自实施例4的一组143个检测结果中将没有假阳性结果的95%置信度。为完成该分析，设定每一比较错误率为Epc^.00036，因为0.05=1-(1-0.00036)143。源自该分析的单个结果是绝对显著的，即，在0.00036的Epc水平，统计学上显著大于零点。本统计分析方法的详细资料可以在下列网址中发现http:〃core.ecu,edu/psyc/wuenschk/docs30/multcom.p.doc，并且所述概念在网址http:〃www.brettscaife.net/statistics/introstat/08multiple/lecture.htmll皮很好地阐明。059至少40%生物膜的生物膜去除的有效酶混合物被列在表1中，对于不同组酶的每一种以它们的减少顺序列出。表1.各种酶组合的生物膜去除<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2.下面提供了区分表l中示出的混合物中的酶的索引注解<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>PAL2CU頂ASE酯酶PEP1PROPERASE蛋白酶PEP2PURAFECT蛋白酶PEP3MULTIFECTNEUTRAL蛋白酶PEP4FNA蛋白酶PEP5GC106蛋白酶060由高通量方法提供的数据对于筛选大量的混合物是有用的。接下去进行候选混合物的进一步研究，以确认它们对生物膜，包括铜绿假单胞菌、单核细胞增生性李斯特菌(丄/Wer/awo"o^ge"M)、金黄色葡萄球菌(5Va/7/^/ococcMi1awreM)的生物膜以及饮用水族群生物膜的效力。061三十种酶混合物对于假单胞菌生物膜的去除被评价，并且六种最高性能的酶混合物被用于评价如下描述的其它生物膜的去除。实施例2:用DCD生物膜反应器评价表1的酶混合物材料和方法062采用实验室模型系统，CDC生物膜反应器(CBR90型，BiosurfaceTechnologiesCorporation,Bozeman,MT)，评价表1中的酶混合物对生物膜的去除。该系统由美国疾病控制中心(CentersforDiseaseCon加l)开发并且已经被用于研究由各种细菌种类形成的生物膜。CDC生物膜反应器由1升的容器组成，所述容器具有从盖子悬挂下来的8个聚丙烯试片(coupon)固定器(holder)。每一个试片固定器能够容纳三个0.5英寸直径的样品试片。对于在这里报告的实验，样品试片由聚丙烯构造，以与使用聚苯乙烯微量板进行的高通量筛选分析一致。2个CDC生物膜反应器平行进行操作，每一实验提供总共48个样品试片。液体生长培养基通过容器的顶部进入并且经由侧臂流出口流出。整合入搅拌叶片的磁力搅拌棒提供流体混合和表面剪切。l.铜绿假单胞菌生物膜063具有大约400毫升工作体积的含有10%强度胰蛋白酶消化大豆肉汤培养基的CDC生物膜反应器容器被接种铜绿假单胞菌，并且在37'C以批量模式(没有注入的培养基)运行6小时。在建立批量培养之后，提供以600毫升/小时的速率流动的培养基额外的42小时以在聚苯乙烯样品试片上生成铜绿假单胞菌生物膜。在生物膜生长期的末期，6个对照试片从两个反应器的每一个移开，并且用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，以除去未附上的细菌。然后，采用下述的结晶紫染色方法，对来自每一反应器的三个试片的生物膜进行分析。来自每一反应器的剩余的三个对照试片在PBS中被声波处理，连续稀释，并且在胰蛋白酶消化大豆琼脂上铺板，以对生物膜内可培养细菌的数量进行计数。064剩下的30个测试试片和6个对照试片被转移到12孔组织培养板中，并且用所选择的高性能酶混合物处理，在45'C，在缓冲液中以1%wt总酶的酶剂量使用90分钟。以用于制备酶混合物的同样的缓冲液处理6个对照试片。处理之后，所述试片被用PBS冲洗三次并采用结晶紫染色方法分析生物膜。该方法包括将所述试片沉浸在结晶紫(0.31%w/v)的溶液中IO分钟，用PBS冲洗所述试片三次以除去未结合的染色剂。然后，使用95%的乙醇从生物膜中提取结合的染色剂并且在540nm读取结晶紫/乙醇溶液的吸光度。由[(l-剩余生物膜的分数"xlOO]来计算假单胞菌生物膜的去除百分比。如下计算剩余生物膜的分数，其通过从提取自酶处理生物膜的溶液的吸光率减去培养基+酶溶液的吸光率并且除以来自未处理的对照生物膜的吸光率减去仅仅生长培养基的吸光率之差额吸光率来计算。生物膜的平均厚度为0.2毫米。l.铜绿假单胞菌生物膜065使用生长在CDC-BR中的生物膜评定的生物膜去除百分数比以前使用高通量筛选分析(High-ThroughputScreeningAssay(HTA))测定的那些生物膜去除百分数低一些，如下面表3中所示出的。这可能由于生长在CDC-BR中的生物膜的更强韧性质。CDC-BR产生比用于HTA的96孔微量板方法更高的剪切环境，其可能造成生物膜更难以去除。但是，用一些酶组合可观测到可达77%的生物膜去除。"Pep1,2,4、Cel2、Carl、Pall"的组合在HTA测试中以80%的去除排在第九位，但是其对CDC-BR生物膜来说，比任何其它组合表现得更好，具有77%的去除率。在碱性缓冲液(50mMBis-Tris,pH8.5)中，所制备的酶混合物被观察到最高的生物膜去除百分比。表3.采用以CDC生物膜反应器生长的铜绿假单胞菌生物膜的生物膜去除测试的结果酶组合HTA%去除*CDC-BR%去除CDC-BR标准方差CDC-BRn漂白剂对照75-9375-93Pep3、Cel2、Pal28451154Pep3、Cel2、Carl、Pal28261194Pep3、Cel2、Car1、Pal18051174Pepl,2，4、Cel2、Carl、Pal1807753Pep1,2,4、Car1、Pal1、Pal2787313318<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>合物之中。实施例067下列酶混合物被测试，以了解它们对三种其它主要商业上相关的生物膜的效力，其基于对于假单胞菌的CDC数据和对于牙齿生物膜、四种模式的单独HTP研究。考虑到可用于清洁的实际时间和可能经济的剂量，与生物膜试片的清洁酶混合物接触时间被减少到40分钟，并且酶混合物中的所有酶成分的最终酶浓度被限制到总计1%。例如，PEP5+CAR2+CEL3酶混合物包含0.33+0.33+0.34%的每种酶，使用于测试的最终酶混合物的剂量为1%。068应用下面列出的六种酶混合物，在下面列出的三种pH下进行测试。所述测试在李斯特氏菌、葡萄球菌以及饮用水生物膜上进行。069pH5.51.PEP5+CAR2+CEU2.PEP5+CAR2+CEL2pH7.01.PEP6+PAL2+CEL32.PEP3+PAL2+CEL2pH8.51.PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAU2.PEP4+CEU+PAU+PAL2实施例4:单核细胞增生李斯特氏菌生物膜069具有不锈钢试片的CDC生物膜反应器容器具有大约400毫升工作体积并包含10%-强度脑心浸液(BHI)培养基，在37。C，用4毫升在10%-强度脑心浸液中的单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC19112)过夜培养物接种。CRD反应器以批量模式运行24小时，之后以7毫升/分钟持续给与流动的BHI培养基，再进行24小时。48小时之后(24小时批量+24小时持续)，反应器被停止并拆卸。使用无菌的镊子从棒上移去所有不锈钢试片，使试片的前端和后端尽可能少的接触，并且所述试片被放置在无菌的12孔板中，用于处理。每个反应器共有24个试片是可用的，并且在45°C，每三个试片用每一种酶混合物组合(六种组合，组合的全部酶成分总计1。/。的酶混合物浓度)处理45分钟。三个试片没有被处理并且被用作未处理对照。所有处理的试片从处理中移开，在PBS中冲洗3次并置于12孔板中的75%的结晶紫溶液(ProtocolCrystalViolet)中10分钟。染色后，所述试片在20PBS中冲洗三次并置于5.0毫升95%乙醇中，并于室温放置在震荡器上5分钟，以洗脱结晶紫。然后，洗脱的溶液被吸到小池中，并在分光光度计540nm处读数。从[(i-剩余生物膜的分数yxioo]来计算李斯特氏菌生物膜的去除百分比。如下计算剩余生物膜的分数，其通过从提取自酶处理生物膜的溶液的吸光率减去培养基+酶溶液的吸光率，并除以未处理对照生物膜的吸光率减去仅仅生长培养基的吸光率之差额吸光率来计算。表4:采用CDC反应器，由Genencor酶混合物去除李斯特氏菌生物膜的结果酶组合CDC匿BRCDC-BRCDC陽BRn%去除标准方差漂白剂对照(碱性)93漂白剂对照(中性)75漂白剂对照(酸性)75PEP5+CAR2+CEL3398PEP5+CAR2+CEL23035PEP3+PAL2+CEL2402PEP6+PAL2+CEU4110PEP4+CEL1+PAL1+PAL25121PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL1561370所有检测的六种酶混合物对于李斯特氏菌生物膜的去除显示出一些效力，并且四种碱性pH基酶组合提供了40%以上的生物膜去除，特别是酶混合物PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAU。实施例5:金黄色葡萄球菌生物膜071具有聚氨酯试片的CDC生物膜反应器容器具有大约400毫升工作体积的包含10%胰蛋白酶消化大豆肉汤(TSB)培养基，在37'C，4毫升的金黄色葡萄球菌(SRWC-10943)的过夜培养物被接种在10%TSB培养基中。CDC反应器以批量模式运行24小时，之后以7毫升/分钟持续地给予流动的TSB培养基，再持续24小时。48小时之后(24小时批量+24小时持续)，反应器被停止并拆卸。使用无菌的镊子以从棒上除去所有的聚氨酯试片，尽可能少接触试片的前端和后端，并且所述试片被放置在无菌的12孔板中，用于处理。每个反应器共有24个试片是可用的，并且每三个试片用每一种酶混合物组合(七种组合，组合的全部酶成分总计1%的酶混合物浓度，45°C，45分钟)处理。三个试片没有被处理并且被用作未处理对照。所有处理的试片从处理中移开，在PBS中冲洗3次并置于12孔板中的75%的结晶紫溶液(ProtocolCrystalViolet)中10分钟。染色后，所述试片21在PBS中冲洗三次并置于5.0毫升95%乙醇中，并于室温下放置在震荡器上5分钟，以洗脱结晶紫。然后，洗脱的溶液被吸到小池中，并在分光光度计540nm处读数。从[(1-剩余生物膜的分数)"100]来计算李斯特氏菌生物膜的去除百分比。如下计算剩余生物膜的分数，其通过从提取自酶处理生物膜的溶液的吸光率减去培养基+酶溶液的吸光率，并除以未处理对照生物膜的吸光率减去仅仅生长培养基的吸光率之差额吸光率来计算。表5:采用CDC反应器，由酶混合物去除金黄色葡萄球菌生物膜的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>072所有检测的六种酶混合物对于李斯特氏菌生物膜的去除显示出一些效力，并且一种碱性pH基酶组合提供至少40%的生物膜去除。实施例6饮用水族群生物膜073具有19升BAC/GAC饮用水(包含低CFU的混合饮用水族群)和1升下列成分的碳修正溶液(carbonamendmentsolution)的20L无菌坛子(carboy)被制备'以获得额外的碳浓度。L-谷氨酸....0.0047g/LL-天冬氨酸….0.0053g/LL-丝氨酸......0.0055g/LL-丙氨酸…0.0047g/LD+葡萄糖…0.0048g/LD+半乳糖…0.0048g/LD-阿拉伯糖…0.0048g/L074无菌CDC反应器被放置在层流罩(laminarflowhood)中，并且用BAC/GAC水充满至出口。在37°C的温育器中，所有管子与进口和出口的连接被建立并且CDC反应器被放置在搅拌盘上。反应器以批量运行24小时，之后以7毫升/分钟持续地流动碳补充的BAC/GAC水，在进行24小时。在48小时结束时(24小时批量+24小时持续)，流入的流体被关闭，培养基从反应器中倒出，进入到废物容器中，并且所述反应器被放置在层流罩中。0075使用无菌的镊子将所有的试片以从棒上移开，而不要触碰试片的前端和后端。包含饮用水族群生物膜的PVC试片被放置在无菌的12孔板中，用于处理。0076每个反应器共有24个试片是可用的，并且每三个试片用每一种酶混合物组合(七种组合，总计达1%的浓度，45°C，45分钟)处理。三个试片没有被处理并且被用作未处理对照。所有处理的试片从处理中移开，在PBS中冲洗3次并置于12孔板中的75%的结晶紫溶液(ProtocolCrystalViolet)中10分钟。染色后，所述试片在PBS中冲洗三次并置于5.0毫升95%乙醇中，于室温放置在震荡器上5分钟，以洗脱结晶紫。然后，洗脱的溶液被吸到小池中，并在分光光度计540nm处读数。从[(l-剩余生物膜的分数)+xlOO]来计算李斯特氏菌生物膜的去除百分比。如下计算剩余生物膜的分数，其通过从提取自酶处理生物膜的溶液的吸光率减去培养基+酶溶液的吸光率，并除以未处理对照生物膜的吸光率减去仅仅生长培养基的吸光率之差额吸光率来计算。表7:采用CDC反应器，由Genencor酶混合物去饮用水族群生物膜的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>0077所有检测的六种酶对于饮用水族群生物膜的去除显示出一些效力，并且四种碱性pH基酶组合提供了40%以上的生物膜去除，特别是酶混合物PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL1。078对于所有类型的生物膜去除最有效的酶混合物是在温和碱性条件下的FNA、PurafectL、ProperaseL、LaminexBG、甘露聚糖酶GC265和Lysomax的组合。对于中性到酸性pH条件，虽然不如上面提到的那些一样有效，该酶混合物由MultifectNeutral、LaminexBG禾卩Cutinase酶组成。079应理解，本文描述的实施例和实施方式只用于说明的目的，而鉴于其的各种更改和变化对于本领域普通技术人员将具有启示性并且将被包括在本申请的精神和范围以及附属权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请因此以其全部内容通过引用被并入本文，用于所有的目的。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>+PAL-2L-2L-1■PAL<<<CL++-CEL-1■CEL-2如PAL1如PAL2如PAL小+CEL-2+PAL-2+PAL1+PAL2+PAL-1卜PAL-2+CEL-2+CEL-2L-1L-2L-1+CEL-21,R-1L-1+PAL-2L-1+CEL-1L-1+CEL-2L-2+CEL-1L-2+CEL-2L-1+PAL-24L-1+PAL-2+L-1+CEL-2.L-1+CEL-2.L-1+CEL-2.-CAR-1+CEL-1R-1+CEL-2R-1+CEL-1R-1+PAL-1:-1+PAL-2R-1+PAL-1R-1+CEL-1R-1+CEL-1R-1+CEL-2hCAR-1+CEL-2-只-1+CEL-1只陽1+CEL-1,R隱1+CEL-1山山山<<<<<<<<c<<山山UJ<<<<<<<《<:OoStStStStStSt〇<〇o〇++++++++++++++++++++++++++寸寸IT)丄丄丄丄Q_CL山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山UJ山山寸Q_CLCLQ_CLCLCLCLCLCLCLCLCLCLCL++++++++++++++++++++++++++++++ih一CMCMCMCMCNJCNJCNJCMCMP-2oci丄□L5山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山山UJ山山山山CLCLCLCLCLCLCLCLCLCLQ_Q_CLCLofe:6s/9s城浮每Z.0S9S08Z00S<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>权利要求1.用于从表面除去生物膜的组合物，所述组合物包括具有至少两种不同的酶的酶混合物，所述酶选自蛋白酶、纤维素酶、酯酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、磷脂酶和淀粉酶。2.权利要求l所述的组合物，其中所述酶混合物选自蛋白酶、葡聚糖酶和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种或多种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；至少两种淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶。3.权利要求l所述的组合物，其中所述酶混合物选自蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种或多种淀粉酶和葡聚糖酶；以及至少三种淀粉酶。4.权利要求1所述的组合物，其中所述酶混合物选自三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；和三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和甘露聚糖酶。5.用于将生物膜从表面除去的组合物，其包括酶混合物，所述酶混合物由三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶组成。6.权利要求5所述的组合物，其中所述蛋白酶来自枯草芽孢杆菌(S"c///^raZ^/fc)EC3.3.2.6和嗜碱芽孢杆菌(Bad〃"sa/ca/opM^)EC3.4.2.6，所述葡聚糖酶来自木霉属(7h'ckwferma)的种EC3.3.1.6，所述磷脂酶来自链霉属(5^印towyc^)的种EC3丄1.4，而甘露聚糖酶来自迟缓芽孢杆菌(^ac说"s/e"&^。7.权利要求l所述的组合物，其中所述蛋白酶选自碱性、中性或酸性蛋白酶。8.权利要求1所述的组合物，其中所述蛋白酶选自下列商业上可得的蛋白酶PROPERASE、PURAFECT、MULTIFECTNEUTRAL、FNA禾卩GC106。9.权利要求1所述的组合物，其中所述纤维素酶是商业上可得的PURADAX。10.权利要求1所述的组合物，其中所述酯酶是商业上可得的CUTINASE。11.权利要求1所述的组合物，其中所述甘露聚糖酶是商业上可得的GC265或HEMICELL。12.权利要求l所述的组合物，其中所述葡聚糖酶是商业上可得的LAMINEXBG。13.用于在中性或碱性pH除去生物膜的组合物，其基本上由酶混合物组成，所述酶混合物选自蛋白酶、葡聚糖酶和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶和y露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种或多种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；至少两种淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶。14.权利要求13所述的组合物，进一步包括内切-阿拉伯聚糖酶。15.用于在酸性pH下清除生物膜的组合物，其包括基本上由酶混合物组成的混合物，所述酶混合物选自淀粉酶和葡聚糖酶；淀粉酶、阿拉伯聚糖酶和葡聚糖酶；淀粉酶和阿拉伯聚糖酶；以及淀粉酶混合物、葡聚糖酶和蛋白酶的混合物。16.减少表面上的生物膜的方法，其包括a)提供酶混合物，所述酶混合物选自蛋白酶、葡聚糖酶和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种或多种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；至少两种淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶；和b)应用所述混合物到表面上的生物膜一段时间，所述一段时间足以减少至少40%的生物膜。17.权利要求16所述的方法，其中a)进一步包括提供具有大约％至大约6%的酶的酶混合物。18.权利要求16所述的方法，其中所述生物膜是铜绿假单胞菌(户w"必附o"氾wrag/mwa)、单核细胞增生性李斯特氏菌("Wm'awo"cytoge"^)或金黄色葡糖球菌全文摘要本文描述的是用于从表面除去生物膜的组合物。所述组合物是具有至少三种酶并且导致从所述表面除去至少40％的生物膜的酶混合物。文档编号C11D3/386GK101490232SQ200780026850公开日2009年7月22日申请日期2007年7月20日优先权日2006年7月24日发明者M·库马尔申请人:金克克国际有限公司