⁶⁰Coγ射线辐照微生物制备微生物油脂的方法

专利名称：⁶⁰Coγ射线辐照微生物制备微生物油脂的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种6()0^射线辐照微生物制备 微生物油脂的方法。
背景技术：
生物柴油是近年来基于环境恶化和能源危机发展起来的一种可替代化石燃 料的可再生清洁能源。目前国内外对于生物柴油制备的研究主要集中于植物油或 餐饮废弃油脂方面，但利用植物油为原料成本高，其成本占到总生产成本的 70% 85%，以餐饮废弃油为原料，也存在原料难以收集和运输的困难，这些都 严重地制约了生物柴油的产业化进程，因此寻找一种廉价的原料成为了生物柴油 产业化的关键。
微生物油脂(microbialoil)又称单细胞油脂(singlecelloil)，是由酵母、霉菌、 细菌和藻类等微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂 作为碳源，在菌体内产生的大量油脂。生物柴油由各种动、植物油脂经酯化或转 酯化工艺而得，而大部分微生物油的脂肪酸组成和一般植物油相近，因此微生物 油脂可替代植物油脂生产生物柴油(李小松，余扬帆.微生物油脂.食品科 技,1997,(5):8-9.Das UN. Essential fatty acid metabolism in patients with essential hypertension, diabetes mellitus and coronary heart disease. Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids， 1995, 52(6): 387 -391.)
在产油菌株中，酵母和霉菌被认为是良好的产脂微生物。随着现代生物技术 的发展，将可能获得更多的微生物资源，如通过对野生菌进行诱变、原生质体技 术和定向进化等手段都可能获得具有更高产油能力的突变株，从而提高产油微 生物的应用效率。1995年，罗玉萍等(罗玉萍，杨荣英，李思光，等.产棕榈油酸酵 母菌的分离和鉴定.微生物学报,1995,35 (6):400-403.)分离到一株高产棕榈油酸的 酵母，总脂中棕榈油酸含量高达50.14%;1998年菌物系统报道，以拉曼被孢霉 SM541为原始菌株，经过紫外线复合氯化锂诱变处理，得到突变株SM541-9， 其生物量由12.6g/L提高到28.8g/L，油脂含量由5.8g/L提高到15.7g/L，花生四 烯酸含量由321mg/L增加到623mg/L (薛照辉，吴谋成.微生物油脂进展.山西 食品工业,2002,(2): 10-11.)。清华大学吴庆余、繆晓玲通过异养转化细胞工程 技术获得了脂类含量高达细胞干重55%的异养藻细胞(繆晓玲，藻类可再生能源 的利用及藻细胞抗环境胁迫的研究[D]，北京:清华大学,2004.)。曲威等以斯达氏 油脂酵母为出发菌株，经紫外线诱变选育出了一株高产油脂的优良酵母菌株，生
物量可达24.2 g/L ;油脂量14.6 g/L (曲威，刘波,吕建州,等.高产油脂斯达氏酵母菌 株的选育及摇瓶发酵条件的初步研究.辽宁师范大学学报(自然科学版),2006，29 (1) :88-92.)。
6(>0>丫射线作为物理诱变剂中电离射线的一种，可引发生物基因突变和染色 体畸变，是一种得到高产目标菌株的有效手段。而用原生质体直接诱变育种，简 单可行，又可以提高正变株的变异幅度。目前，还没有用6()0)7射线輻照微生物 生产微生物油脂的报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种6QCoY射线辐照微生物制备微生物油脂的方法。 采用^Co7射线辐照产油微生物菌体或其原生质体，获得油脂生产高产菌株，制 备微生物油脂的方法。 其具体的工艺步骤如下
1、 将斜面培养的粘红酵母，斯达凯依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等产油微 生物用无菌水洗下菌体，显微镜计数调节细胞浓度为5—7xl06个/mL，制备菌悬 液。或将斜面培养的粘红酵母，斯达凯依酵母，被孢霉，拉曼被孢霉等产油l^i 物接入液体培养基中，振荡培养14一16h， 3000—5000r/min离心，弃去上清液， 用高渗缓冲液洗涤，将离心后的菌体用0.1—0.3%0-巯基乙醇和0.1—0.5%的 EDTA预处理菌体；然后再用1—2%蜗牛酶和0.1-0.5%溶菌酶及0.1-0.5%纤维素 水解酶混合酶液处理菌悬液10-20h制备原生质体,原生质体形成率大于90X时，离 心去酶液，用高渗缓冲液洗涤，悬浮原生质体。
2、 将制备的细胞悬液或原生质体悬浮于高渗缓冲液中，用^CoY射线辐照， 辐照剂量100—1000Gy，剂量率3 —5Gy/min，诱变后稀释10'3 — 10—6涂布于完全 培养基上，于30—35'C黑暗条件下避光培养2—3d。
3、 将培养好的菌落进行初筛，从致死率大于90%的照射剂量下再生的菌落 里挑选大于3mm的突变株。
4、 将初筛得到的菌落接入种子培养基30—35。C， 100—250r/min培养18 — 24h，以5% — 10%的(体积百分数)接种量接入发酵培养基。在30—35。C、 100 -25001^下振荡培养48—7211,发酵结束后，发酵液3000—5000r/min离心收集 菌体，并提取微生物油脂，筛选高产菌株。
本发明所述产油微生物包括粘红酵母，斯达凯依酵母、被孢霉或拉曼被孢霉。 本发明所述高渗缓冲液其成份为0.1 mol/LpH6.0磷酸缓冲液，0.8 mol/L 甘露醇。
本发明的有益效果
采用^CoY射线辐照产油微生物菌体或其原生质体，获得油脂生产高产菌株， 并制备微生物油脂，其工艺操作简单，辐照菌体及原生质体正变率高，可显著提 高产油微生物的油脂生产能力，从而降低微生物油脂生产成本。
具体实施例方式
本发明提供了一种6()0^射线辐照微生物制备微生物油脂的方法。采用6QCoY 射线辐照产油微生物菌体或其原生质体，获得油脂生产髙产菌株，制备微生物油 脂的方法。
下面再举具体实施例对本发明予以进一步说明。 实例1-
(1) 菌种黏红酵母(RhodotorulagutiniAs2.107)，购自中国科学研究院微生 物研究所。
(2) 培养基
① 固体斜面培养基(完全培养基)
酵母粉10g/L;蛋白胨20 g/L;葡萄糖20 g/L;琼脂20 g/L; PH=5。
② 种子培养基
葡萄糖15 g/L; (NH4)2S04: 2 g/L;酵母粉1 g/L; KH2P04: 7 g/L; Na2HP04: 2g/L; MgS04: 1.5g/L; pH=5.5。
③ 发酵培养基
葡萄糖50 g/L; KN03: 0.38 g/L;酵母粉4 g/L; KH2P04: 6 g/L; Na2HP04: 2 g/L; MgS04: 2 g/L; CaCl2: 0.1 g/L; FeCl3: 0.07 g/L; pH-5.5; 115。C灭菌20min。
(3) 酵母菌悬液的制备 将保存的黏红酵母转接到斜面培养基上进行活化,用10ml无菌水尽量洗下菌
体，显微镜计数调节细胞浓度为7xl()S个/mL。
(4) 6。Or/射线辐照
将制备好的菌悬液移入无菌试管。用^CoY射线进行辐照，辐照剂量分别为 0GY， 200GY, 500GY， 800GY， IOOOGY。辐照后稀释10-3 — 10-6倍涂布于完全 培养基上，于30'C黑暗条件下避光培养3d。
(5) 高产株的筛选
选择大而光滑的菌落接入种子培养基，在3(TC、 180r/min下振荡培养24h， 用苏丹黑染色镜检，挑选脂肪粒大，密度高的菌株进行复筛。将初筛的菌落接入 种子培养基3(TC， 180r/min培养24h，以5%的接种量接种于发酵培养基中，在3(TC、 180r/min下振荡培养72h ，发酵结束后5000r/min离心收集菌体，采用酸热法提取 油脂。经过反复筛选，最终获得一株变异菌株i /wcfotora/ag^/m'『/ 。
(6) 筛选结果
将筛选获得的高产株接入种子培养基3(TC， 180r/min培养24h，以5%的接种 量接种于发酵培养基中，在3(TC、 180r/min下振荡培养72h与对照组相比较，其 油脂含量和产量分别比对照提高50%和42.2%。 实例2: (1)菌种同实例1。
(2) 培养基
① 固体斜面培养基(完全培养基)同实例一。
② 种子培养基同实例一。
③ 发酵培养基同实例一。
④ 完全培养基(g/L):酵母浸粉3.0，牛肉膏10.0，胰蛋白胨10.0，可溶性淀粉
1.0，葡萄糖5.0, L-半胱氨酸0.50, NaCI5.0， NaAc3.0，琼脂粉15, pH8.5。
⑤ 再生完全培养基
在完全培养基中加入0.5 mol/L蔗糖(或0.8 mol/L甘露醇或1 mol/L山梨醇)。
⑥ 双层再生完全培养基
上层需在完全培养基中加入0.6%琼脂；底层即为完全培养基.
(3) 原生质体的制备
将保存的出发菌株活化，接入液体培养基中，振荡培养16h,离心，弃去上 清液，用高渗缓冲液洗涤，加入0.2%卩一巯基乙醇和0.5%的￡0丁八对菌悬液进行 预处理30min;并用l %蜗牛酶+0.5%溶菌酶+0.5%纤维素水解酶混合酶液进行酶 解处理10h，原生质体的形成率达93.3%
(4) 6()0^射线辐照
将制备好的原生质体液加入无菌高渗液悬浮，镜检计数，用高渗液稀释至106 个/mL，移入无菌试管，用s。CoY射线进行辐照，辐照剂量分别为0GY， 50GY ， 100GY， 200GY， 500GY， 800GY。辐照后，稀释到10^—10'6涂布于完全培养基 和再生培养基上，于3(TC黑暗条件下避光培养3d。
(5) 高产株的筛选
选择大而光滑的菌落接入种子培养基，在30'C、 180r/min下振荡培养24h， 用苏丹黑染色镜检，挑选脂肪粒大，密度高的菌株进行复筛。将初筛的菌落接入 种子培养基3(TC, 180r/min培养24h,以5%的接种量接种于发酵培养基中，在30"、 180r/min下振荡培养72h ,发酵结束后5000r/min离心收集菌体，采用酸热法提取 油脂。最终获得一株变异菌株及^tfoton^ gw"m'『2。
(6) 微生物油脂的制备
将筛得的油脂高产株将初筛的菌落接入种子培养基3(TC， 180r/min培养24h， 以5%的接种量接种于发酵培养基中，在30'C、 180r/min下振荡培养60h。与对照 组相比较，其油脂含量和产量分别比对照提高40%和34%。
权利要求
1、一种60Coγ射线辐照微生物制备微生物油脂的方法，其特征在于，工艺步骤包括(1)将产油微生物用无菌水洗下菌体，显微镜计数调节细胞浓度为5-7×106个/mL，制备菌悬液；或将斜面培养的产油微生物接入液体培养基中，振荡培养14-16h，3000-5000r/min离心，弃去上清液，用高渗缓冲液洗涤，将离心后的菌体用0.1-0.3％β-巯基乙醇和0.1-0.5％的EDTA预处理菌体；然后再用1-2％蜗牛酶和0.1-0.5％溶菌酶及0.1-0.5％纤维素水解酶混合酶液处理菌悬液10-20h制备原生质体，原生质体形成率大于90％时，离心去酶液，用高渗缓冲液洗涤，悬浮原生质体；(2)将制备的细胞悬液或原生质体悬浮于高渗缓冲液中，用60Coγ射线辐照，辐照剂量100-1000Gy，剂量率3-5Gy/min，诱变后稀释10-3-10-6涂布于完全培养基上，于30-35℃黑暗条件下避光培养2-3d；(3)将培养好的菌落进行初筛，从致死率大于90％的照射剂量下再生的菌落里挑选大于3mm的突变株进行复筛。(4)将初筛得到的菌落接入种子培养基30-35℃，100-250r/min培养18-24h，以5％-10％体积接种量接入发酵培养基；在30-35℃、100-250rmp下振荡培养48-72h，发酵结束后，发酵液3000-5000r/min离心收集菌体，并提取微生物油脂，筛选高产菌株。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述产油微生物包括粘红酵母， 斯达凯依酵母、被孢霉或拉曼被孢霉。
3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述高渗缓冲液其成份为0.1 mol/LpH6.0磷酸缓冲液，0.8mol/L甘露醇。
全文摘要
一种⁶⁰Coγ射线辐照微生物制备微生物油脂的方法，属于生物化工技术领域。采用⁶⁰Coγ射线辐照产油微生物菌体或其原生质体，获得油脂生产高产菌株，制备微生物油脂。优点在于，工艺操作简单，辐照菌体及原生质体正变率高，可显著提高产油微生物的油脂生产能力，从而降低微生物油脂生产成本。
文档编号C11B1/00GK101353610SQ200810223079
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者刘宏娟, 周玉杰, 张建安, 武敏敏, 程可可 申请人:清华大学