含有枯草芽孢杆菌脂肪酶的洗涤剂组合物及其使用方法

专利名称：含有枯草芽孢杆菌脂肪酶的洗涤剂组合物及其使用方法
技术领域：
本发明的组合物和方法涉及从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)克隆的脂肪酶、编码所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。
背景技术：
当前的衣物洗涤剂和/或织物护理组合物包括诸如表面活性剂、酶(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纤维素酶)、漂白剂、助洗剂系统(builder system)、抑泡剂、悬污剂、去污齐U、荧光增白剂、软化剂、分散剂、染料转移抑制化合物、研磨剂、杀细菌剂和芳香剂之类的活性成分的复杂组合。脂肪分解酶(包括脂肪酶和角质酶)已被用于洗涤剂清洁组合物中，以通过水解甘油三酸酯产生脂肪酸来去除油溃。然而，清洁组合物中存在的表面活性剂和其它组分常常会抑制这些酶，干扰其除去油溃的能力。因此，需要可在清洁组合物的苛刻环境中起作用的脂肪酶和角质酶。还需要有效进行转酯反应以便制造生物燃料、润滑剂以及其它合成和半合成烃的较为稳健且有效的脂肪酶和角质酶。优选地，这些酶将利用天然存在或常用的原料，而且在合成反应中不需要保护和去保护步骤，这些保护和去保护步骤会使合成变得复杂以及导致产生有毒废产物。

发明内容
本发明组合物和方法涉及从枯草芽孢杆菌克隆的脂肪酶A(LipA)。在一些实施方案中，LipA与细菌纤维素酶催化结构域的羧基末端融合。在一些实施方案中，细菌纤维素酶是源自在位于荷兰巴伦(Baam, The Netherland)的皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Central Bureau voor Schimme I cultures)以 CBS 670. 93 (称为 BCE103)保藏的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株。在一些实施方案中，LipA通过可裂解连接物连接至BCE103纤维素酶。因此，在一些实施方案中，LipA不是融合蛋白。在本发明的一个方面中，提供了重组枯草芽孢杆菌LipA多肽。在一些实施方案中，重组LipA多肽与SEQ ID NO :3的氨基酸序列具有80%至99%的同一性(例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同一性)。在另外的实施方案中，重组LipA多肽是包含BCE103纤维素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些实施方案中，重组LipA融合蛋白与SEQ ID NO :4的氨基酸序列具有至少80%的同一性(例如80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性)。除非具体说明，否则本文使用的术语LipA多肽涵盖LipA融合蛋白以及缺少融合搭配物的成熟LipA多肽二者。在一些实施方案中，LipA多肽是在枯草芽孢杆菌中表达。本发明还提供了表达载体，其包含以有效方式与启动子组合的编码LipA多肽的多核苷酸。在本发明的优选方面中，提供了洗涤剂组合物，其包含重组枯草芽孢杆菌LipA多肽。在一些实施方案中，重组LipA多肽与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少80%的同一性(例如 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一丨I"生)。在其它实施方案中，重组LipA多肽是包含BCE103纤维素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些实施方案中，重组LipA融合蛋白与SEQ ID NO :4的氨基酸序列具有至少80%的同一性(例如 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的同一性)。在一些优选的实施方案中，所述组合物包含表面活性剂(离子型或非离子型)。在一些实施方案中，表面活性剂包含选自如下的一者或多者十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4。在一些实施方案中，表面活性剂包含离子型表面活性剂。在一些优选的实施方案中，离子型表面活性剂选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂以及它们的组合。在一些实施方案中，洗涤剂是在8.0至10.0的pH值下配制。在一些实施方案中，洗涤剂选自衣物洗涤剂、餐具洗涤剂和硬质表面清洗剂。在一些实施方案中，洗涤剂是以选自液体、粉末、颗粒状固体和小片的形式。在特别优选的实施方案中，在30°C至40°C的温度下，LipA多肽在洗涤剂中具有酶活性。在相关的方面中，提供了洗涤剂组合物，其包含来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶和表面活性剂，其中所述洗涤剂组合物在去除待清洁表面的油溃方面比不含该脂肪酶的洗涤剂组合物更有效。在一些实施方案中，脂肪酶是LipA。在一些实施方案中，LipA多肽是包含BCE103纤维素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些实施方案中，脂肪酶包含与SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，脂肪酶包含与SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 4具有至少95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，脂肪酶是重组脂肪酶。在一些实施方案中，脂肪酶是在枯草芽孢杆菌中表达的重组脂肪酶。在一些实施方案中，表面活性剂是离子型或非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是一种或多种选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂以及它们的组合的表面活性剂。在一些实施方案中,表面活性剂包含一种或多种选自如下的表面活性剂十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠和C14-15链烷醇聚醚-4。在一些实施方案中，洗涤剂组合物是在约8. 0至约10. 0的pH值下配制。在一些实施方案中，洗涤剂组合物是在约8. 2至约10. 0的pH值下配制。在一些实施方案中，洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、餐具洗涤剂和硬质表面清洗 齐U。在一些实施方案中，所述洗涤剂组合物的形式选自液体、粉末、颗粒状固体和片。在一些实施方案中，洗涤剂组合物在约30°C至约40°C的温度下有效水解脂质。
在一些实施方案中，与包含代替枯草芽孢杆菌脂肪酶的类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)脂肪酶变体M21L (LIP0MAX )的洗漆剂组合物相比较，所述洗涤剂组合物在水解C4到C16底物方面更有效。在一些实施方案中，洗涤剂组合物还包含蛋白酶。在一些实施方案中，洗涤剂组合物还包含枯草杆菌蛋白酶。在另一个方面，提供了水解表面上的污垢或污溃中存在的脂质的方法，其包括使所述表面与包含重组LipA多肽和表面活性剂的洗涤剂组合物接触。前一段落具体实施方式
和实例中的洗涤剂组合物适用于此目的。在另一个方面，提供了进行转酯反应的方法，其包括使供体分子与包含重组LipA多肽的组合物接触。在一些实施方案中，供体分子具有C4-16碳链。在一个优选的实施方案中，供体分子具有CS碳链。根据如下描述LipA组合物和方法的这些及其它方面将显而易见。
具体实施例方式I.引言所描述的是涉及涉及从枯草芽孢杆菌克隆的脂肪酶A(LipA)的组合物和方法。这些组合物和方法部分基于以下观察结果克隆并表达的LipA在存在洗涤剂组合物的情况下具有羧酸酯水解酶活性。LipA的这一特征使其特别适用于多种清洁应用，在这些应用中所述酶可在存在于洗涤剂组合物中的表面活性剂和其它组分的存在下水解脂质。尽管LipA对多种天然和合成底物显示出活性，但这种酶已显示出对C4-C16底物的偏好，对CS底物具有峰值活性。这种特异性使得LipA特别适于水解短链甘油三酸酯以及适于进行涉及短链脂肪酸的转酯反应。II.定义在详细描述本发明组合物和方法之前，为清楚起见定义了以下术语。未定义的术语和缩写应符合其本领域所使用的通常含义如本文所用，“羧酸酯水解酶”(E. C. 3. I. I)是指作用于羧酸酯的酶。如本文所用，“脂肪酶”、“脂酶”、“脂肪分解酶”、“脂肪分解多肽”或“脂肪分解蛋白”是指展现具有降解脂质的能力(如降解甘油三酸酯或磷脂的能力)的酶、多肽或蛋白质。脂肪分解酶可为例如脂肪酶、磷脂酶、酯酶或角质酶。如本文所用，脂肪分解活性可根据本领域中已知的任何程序确定(例如参见古朴塔(Gupta)等人，生物技术与应用生物化学(Biotechnol Appl Biochem)，37 :63-71,2003 ;美国专利号 5，990，069 ;和国际公布号WO96/18729A1)。如本文所用，术语“脂肪酸”是指源自动物或植物脂肪或油或含于动物或植物脂肪或油中的羧酸。脂肪酸由通常含有4-22个碳原子的烷基的链构成，并以末端羧基(-C00H)为特征。脂肪酸可为饱和的或不饱和的，以及为固体、半固体或液体。如本文所用，术语“甘油三酸酯”是指脂肪酸与甘油形成的任何天然存在的酯。甘油三酸酯是脂肪和油的主要组分。其具有通式CH2 (OOCR1) CH(OOCR2) CH2 (OOCR3)，其中R1' R2和R3可具有不同链长度。如本文所用，“酰基”是有机酸基团(RC0-)的通用名，通常是通过移除羧酸的-OH基团获得。如本文所用，术语“酰化”是指通常在-OH基团侧将酰基置换/添加到分子中的化
学转化。如本文所用，“酰基链底物”是羧酸酯水解 酶(例如角质酶、脂肪酶、酰基转移酶、转酯酶等)的供体分子。这种底物可就其碳链长度进行描述。例如，C4底物/供体具有4个碳的链长度，CS底物/供体具有8个碳的链长度等等。如本文所用，术语“转移酶”是指催化分子或基团(例如酰基)转移至底物的酶。如本文所用，“离去基团”是指通过另一亲核物质取代时从酰基供体裂解的亲核物质。如本文所用，短语“洗涤剂稳定性”是指洗涤剂组合物混合物中指定洗涤剂组合物组分(如水解酶)的稳定性。如本文所用，“过水解酶”是能够催化会导致形成适于诸如清洁、漂白和消毒之类的应用的过酸的反应的酶。如本文所用，在短语“水性组合物”和“水性环境”中使用的术语“水性”是指由至少50 %的水构成的组合物。水性组合物可含有至少50 %的水、至少60 %的水、至少70 %的水、至少80%的水、至少90%的水、至少95%的水、至少97%的水、至少99%的水或甚至至少99%的水。如本文所用，术语“表面活性剂”是指本领域通常认识到的具有表面活性性质的任何化合物。表面活性剂一般包括阴离子型、阳离子型、非离子型和两性离子型化合物，本文中将进一步进行描述。如本文所用，“表面性质”用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性之类的性质。术语“氧化稳定性”是指本发明脂肪酶在本文中公开的脂肪分解、水解、清洁或其它处理期间(例如当暴露于漂白剂或氧化剂或者与漂白剂或氧化剂接触时)常见的条件下，在给定时间段内保留规定量的酶活性。在一些实施方案中，脂肪酶在与漂白剂或氧化剂接触指定时间段(例如至少约I分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟等)后保留至少约50 %、约60 %、约70 %、约75 %、约80 %、约85 %、约90 %、约92 %、约95 %、约96 %、约97 %、约98 %或约99 %的脂肪分解活性。术语“螯合剂稳定性”是指本发明脂肪酶在本文中公开的脂肪分解、水解、清洁或其它处理期间(例如当暴露于螯合剂或与螯合剂接触时)常见的条件下，在指定时间段内保留指定量的酶活性。在一些实施方案中，脂肪酶在与螯合剂接触指定时间段(例如至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等)后保留至少约50%、约60%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 92%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%或约99%的脂肪分解活性。术语“热稳定性”和“热稳定度”是指本发明脂肪酶在本文中公开的脂肪分解、水解、清洁或其它处理期间(例如当暴露于改变的温度时)常见的条件下暴露于标识温度指定时间段后保留指定量的酶活性。变化的温度包括增加或降低的温度。在一些实施方案中，脂肪酶在暴露于改变的温度指定时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保留至少约50 %、约60 %、约70 %、约75 %、约80 %、约85 %、约90 %、约92 %、约95 %、约96 %、约97 %、约98 %或约99 %的脂肪分解活性。术语“清洁活性”是指在本文中公开的脂肪水解、水解、清洁或其它处理期间的常见条件下由脂肪酶实现的清洁性能。在一些实施方案中，清洁性能是通过应用针对酶敏感性污溃(例如草、血、奶或蛋蛋白)的多种清洁测定法，在污溃经历标准洗涤条件后通过多种色谱法、分光光度法或其它定量方法测定。示例性的测定法包括(但不限于)WO99/34011和美国专利6，605，458 (将二者以引用的方式并入本文)中所述的测定法，以及实例中所包括的那些方法。术语脂肪酶的“清洁有效量”是指特定清洁组合物中实现所需水平酶活性的前文所述脂肪酶的量。这种有效量易于由本领域普通技术人员确定并且依据许多因素，如所用的特定脂肪酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成以及需要液体组合物还是干燥(例如颗粒状、条状)组合物等。如本文所用，术语“清洁辅助材料”意指针对所需清洁组合物的特定类型和产品的形式(例如液体、颗粒、粉末、条、糊状物、喷雾、片、凝胶；或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料还优选与组合物中使用的脂肪酶相容。在一些实施方案中，颗粒状组合物为“紧凑(compact) ”形式，而在其它实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。如本文所用，“清洁组合物”和“清洁制剂”是指可用于从待清洁物品如织物、器皿、隐形眼镜、其它固体表面、毛发、皮肤、牙齿等去除不期望的化合物(例如污垢或污溃)的化学成分的混合物。所述组合物或配方可视待清洁的表面、物品或织物以及组合物或制剂的所需形式而呈液体、凝胶、颗粒、粉末或喷雾形式。如本文所用，术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂制剂”是指拟用于供清洁染污物体的洗涤介质中的化学成分的混合物。洗涤剂组合物/制剂一般包含至少一种表面活性剂，并且可任选包含水解酶、氧化-还原酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。如本文所用，“餐具洗涤组合物”是指用于清洁餐具(包括刀叉餐具)的组合物的所有形式，包括(但不限于)颗粒和液体形式。在一些实施方案中，餐具洗涤组合物是可用于自动洗碗碟机中的“自动餐具洗涤”组合物。无意于使本发明局限于任何特定类型或餐具 洗涤组合物。实际上，本发明可用于清洁任何材料(包括(但不限于)陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃、丙烯酸树脂等)的餐具(例如器皿，包括(但不限于)盘子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀具(例如刀叉餐具，包括(但不限于)匙、刀、叉、服务用具等)。术语“餐具”在本文中用于指器皿和刀叉餐具二者。 如本文所用，术语“漂白”是指在适宜的pH和温度条件下处理材料(例如织物、衣物、浆料等)或表面足够长的时间以实现材料变亮(即，变白)和/或清洁。适于漂白的化学品的实例包括(但不限于)C102、H2O2、过酸、NO2等。如本文所用，变体脂肪酶的“洗涤性能”是指变体脂肪酶对洗涤的贡献，其为组合物中未添加变体脂肪酶的洗涤剂提供附加的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下比较。术语“相关的洗涤条件”在本文中用于指在家居中实际用于器皿或衣物洗涤剂市场部分中的条件，尤其是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。如本文所用，术语“消毒”是指去除表面的污染物以及抑制或杀死物品表面上的微生物。无意于本发明局限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。本文的清洁组合物的“紧凑”形式最佳由密度反映，就组成来说，由无机填料盐的量反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐是大量存在，通常为总组合物的约17重量％到约35重量％。相比之下，在紧凑组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15%的量存在。在一些实施方案中，填料盐以不超过所述组合物的约10重量％，或更优选不超过约5重量％的量存在。在一些实施方案中，无机填料盐选自碱金属和碱土金属硫酸盐和氯化物。在一些实施方案中，优选填料盐为硫酸钠。如本文所用，术语“纺织物”或“纺织材料”是指织造物，以及适于转变成或用作纱线、机织材料、针织材料和非织造物的人造短纤维和细丝。该术语涵盖由天然以及合成(例如制造的)纤维制成的纱线。如本文所用，术语“纯化”和“分离”是指以物理方式使对象分子(如LipA多肽)与其它分子(如蛋白质、核酸、脂质、培养基组分等)分离。一旦纯化或分离，对象分子可占样 品中材料总量的至少50 %，且甚至至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%或更高(重量比)。如本文所用，“多肽”是指包含多个通过肽键连接的氨基酸的分子。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用。蛋白质可任选经过修饰(例如糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊烯化、磺酸化等)以增加功能性。当这些氨基酸序列展现活性时，其可称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，其中氨基酸序列是以标准的氨基至羧基末端取向(即N — C)给出。术语“多核苷酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5'至3'取向提供。如本文所用，术语“野生型”和“天然的”是指自然界中存在的多肽或多核苷酸。关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。如本文所用，“变体多肽”是指通常利用重组DNA技术，通过一个或多个氨基酸的置换、添加或缺失而源于亲本(或参考)多肽的多肽。变体多肽与亲本多肽可能有少数氨基酸残基不同，并且可通过其与亲本多肽一级氨基酸序列的同源性/同一性水平来限定。优选地，变体多肽与亲本多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。序列同一性可使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之类的已知程序，使用标准参数测定。(参见例如沃兹查(Altschul)等人，(1990)分子生物学杂志(J. Mol. Biol. 215 403-410);赫尼科夫(Henikoff)等人，(1989)美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad.Sci.USA)89 :10915 ;卡林(Karin)等人，(1993)美国国家科学院院刊，90 :5873 ;和海金斯(Higgins)等人(1988)基因(Gene) 73 :237-244)。执行BLAST分析的软件可通过美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开可用。还可使用FASTA(皮尔森(Pearson)等人(1988)美国国家科学院院刊，85 =2444-2448)搜索数据库。两个多肽实质上一致的一个指示是第一多肽与第二多肽在免疫上交叉反应。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽具有免疫交叉反应性。因此，一种多肽与第二多肽实质上一致，例如，在此情况下两个多肽仅因保守置换而不同。如本文所用，“变体多核苷酸”编码变体多肽；与亲本多核苷酸具有指定程度的同源性/同一性；或在严格条件下与亲本多核苷酸或其互补序列杂交。优选地，变体多核苷酸与亲本多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或甚至至少99 %的核苷酸序列同一性。测定同一性百分比的方法是本领域已知的并且上文刚进行描述。术语“源自”涵盖术语“来源于”、“从获得”、“可由获得”、 “分离自”和“由产生”，并且通常是指一种指定材料来源于另一指定材料或者具有可参照另一指定材料描述的特征。如本文所用，术语“杂交”是指用于使一条核酸链通过本领域已知的碱基配对与互补链接合的方法。如本文所用，短语“杂交条件”是指进行杂交反应的条件。这些条件通常根据测量杂交的条件的“严格性”程度来分类。严格性程度可例如基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最高严格性”通常在约Tm-5°C (比探针的Tm低5°C )下发生；“高严格性”通常在比Tm低约5至10°下发生；“中等严格性”通常在比探针Tm低约10到20°下发生；且“低严格性”通常在比Tm低约20到25°下发生。作为另一种选择，或除此之外，杂交条件可基于杂交和/或一次或多次严格性洗涤的盐或离子强度条件，例如6XSSC =极低严格性；3XSSC =低至中等严格性；1XSSC =中等严格性；且0. 5XSSC =高严格性。在功能上，可以使用最高严格性条件来鉴别与杂交探针具有严格的同一性或接近严格的同一性的核酸序列；而高严格性条件用于鉴别与探针具有约80%或更高序列同一性的核酸序列。对于需要高选择性的应用，通常需要使用相对严格的条件来形成杂交物(例如，使用相对较低的盐和/或高温条件)。如本文所用，严格条件定义为50°C和0. 2 X SSC (I X SSC =0. 15M NaCUO. 015M 柠檬酸钠，pH7. 0)。在关于至少两条核酸或多肽的上下文中，短语“实质上相似和实质上相同”意指，多核苷酸或多肽包含与亲本或参考序列具有至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99%的同一性，或者不包括在不增加功能性的情况下仅为避开本描述所作的氨基酸置换、插入、缺失或修饰的序列。如本文所用，“表达载体”是指DNA构建体，其含有编码指定多肽且有效连接至能够实现该多肽在合适的宿主中表达的合适控制序列的DNA序列。这种控制序列包括实现转录的启动子、控制这种转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在基因组插入物。一旦转化进适合宿主中，载体就可独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在一些情况下可整合进基因组本身中。
术语“重组”是指例如通过使编码序列突变以产生该变的多肽、将编码序列与另一基因的编码序列融合、使基因处于不同启动子控制下、在异源生物体中表达基因、以降低或升高的水平表达基因、以不同于基因的天然表达谱的方式有条件地或组成地表达基因等，对遗传物质(即，核酸、核酸编码的多肽以及包含这些多核苷酸的载体和细胞)进行修饰以改变其序列或表达特征。一般说来，重组核酸、多肽和基于它们的细胞已通过人进行操纵使得其与自然界中存在的相关核酸、多肽和细胞不相同。“信号序列”是指结合至多肽的N端部分，并且促进成熟形式的蛋白质从细胞分泌的氨基酸序列。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。术语“选择标记”或“可选标记”是指能够在宿主细胞中表达使得易于选择含有所引入的核酸或载体的宿主的基因。可选标记的实例包括(但不限于)抗微生物物质(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。如本文所用，术语“调控元件”是指控制核酸序列表达的某一方面的遗传元件。举例来说，启动子是促进有效连接的编码区的转录起始的调控元件。另外的调控元件包括剪 接信号、聚腺苷酸化信号和终止信号。如本文所用，“宿主细胞”一般为以使用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核或真核宿主。转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或者表达所需的蛋白质变体。在载体编码蛋白质变体的前体蛋白或前原蛋白形式的情况下，这些变体在表达时通常由宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。在将核酸序列插入细胞的语境中，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化的手段包括本领域已知的原生质体转化法、氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法等等。(参见常(Chang)和克汗(Cohen) (1979)分子遗传学与普通遗传学(Mol. Gen. Genet.), 168 111-115 ;史密斯(Smith)等人(1986)应用与环境微生物学(Appl. Env. Microbiol. )，51 634 ;和法拉利(Ferrari)等人所著的综述文章,载于Harwood, Bacillus,派拉蒙出版公司(Plenum Publishing Corporation)，第 57-72 页，1989)。如本文所用，术语“可选标记”或“可选择基因产物”是指编码酶活性的基因的使用，该酶活性给表达该可选标记的细胞赋予抗生素或药物抗性。其它科技术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同(例如参见辛格立顿(Singleton)和萨斯布雷(Sainsbury),微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology),第 2 版，约翰威立出版公司(John Wiley and Sons),纽约(1994);以及哈利(Hale)和马哈姆(Marham),哈普柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology),哈普派尼尔(HarperPerennial),纽约(1991))。除非文中另外明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。提供的小标题是出于便利的目的，不应解释为限制。在一个小标题下包括的描述可适用于本说明书整体。III. LiDA多肽和多核苷酸A. LipA 多肽在一个方面，本发明组合物和方法提供了重组LipA多肽或其变体。示例性的LipA多肽是从枯草芽孢杆菌168分离的(GENBANK登录号P37957)。成熟LipA多肽具有SEQ IDNO 3的氨基酸序列。类似地，实质上一致的LipA多肽可存在于自然界中，例如存在于枯草芽孢杆菌的其它菌株或分离株中。所公开的LipA多肽也可与细菌纤维素酶催化结构域的羧基末端融合。例如，细菌纤维素酶可源自在位于荷兰巴伦的皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心以CBS 670.93(称作此￡103)保藏的芽孢杆菌属菌株。LipA多肽还可通过可裂解的连接物连接至BCE103纤维素酶。本发明组合物和方法涵盖这些和其它重组LipA多肽。在一些实施方案中，重组LipA多肽是与实例性LipA多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如与SEQ ID NO :3的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同源性的变体LipA多肽。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文中所述)，通过氨基酸序列比对来测定。在一些实施方案中，重组LipA多肽包括不会实质上影响多肽的结构和/或功能的置换。示例性的置换是保守置换，如表I中所概述的。
_5] 表I.氨基酸置换
初始残基代可接受的置换码
丙氨酸 A D-Ala, Giy, P-AlaTL-Cys, D-Cys
权利要求
1.一种洗涤剂组合物，其包含 来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的脂肪酶,和 表面活性剂， 其中所述洗涤剂组合物在去除待清洁表面的油溃方面比不存在所述脂肪酶的洗涤剂组合物更有效。
2.根据权利要求I所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶为LipA。
3.根据权利要求2所述的洗涤剂组合物，其中所述LipA多肽是包含BCE103纤维素酶氨基末端片段的融合蛋白。
4.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶包含与SEQIDNO :3或SEQ ID NO :4具有至少90%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶包含与SEQIDNO :3或SEQID NO :4具有至少95%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶是重组脂肪酶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述脂肪酶是在枯草芽孢杆菌中表达的重组脂肪酶。
8.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂是离子型或非离子型表面活性剂。
9.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂是一种或多种选自阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂以及它们的组合的表面活性剂。
10.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述表面活性剂包含一种或多种选自如下的表面活性剂十二烷基苯磺酸钠、氢化椰油酸钠、月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠和C14-15链烷醇聚醚-4。
11.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其是在约8.0至约10. 0的pH下配制。
12.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其是在约8.2至约10. 0的pH下配制。
13.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物选自衣物洗涤剂、餐具洗涤剂和硬质表面清洗剂。
14.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述组合物的形式选自液体、粉末、颗粒状固体和片。
15.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物在约30°C至约40°C的温度下有效水解脂质。
16.根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物在水解C4至C16底物方面比包含代替枯草芽孢杆菌脂肪酶的类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)脂肪酶变体M21L (LIP0MAX )的等同洗涤剂组合物更有效。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的洗涤剂组合物，其还包含蛋白酶。
18.根据权利要求17所述的洗涤剂组合物，其还包含枯草杆菌蛋白酶。
19.一种用于水解表面上的污垢或污溃中存在的脂质的方法，其包括使所述表面与根据前述权利要求中任一项所述的洗涤剂组合物接触。
20.一种用于进行转酯反应的方法，其包括使供体分子与根据权利要求1-18中任一项所述的洗漆剂组合物接触。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述供体分子包含C4-C16碳链。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述供体分子包含CS碳链。
全文摘要
本发明的组合物和方法涉及从枯草芽孢杆菌克隆的脂肪酶、编码所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。所述组合物和方法特别适用于洗涤剂清洁组合物和方法中。
文档编号C11D3/386GK102712878SQ201080058419
公开日2012年10月3日 申请日期2010年12月16日 优先权日2009年12月21日
发明者B·施密特, C·亚当斯 申请人:丹尼斯科美国公司