一种外用皮肤制剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种外用皮肤制剂及其应用。具体地，本发明提供了一种以蜂毒多肽为活性成分的外用制剂，所述制剂可以抑制表皮细胞的增殖，诱导表皮细胞凋亡，促进表皮颗粒层的形成，从而可以调控并治疗表皮增殖和/或分化异常的相关皮肤疾患。
【专利说明】一种外用皮肤制剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药领域，具体涉及一种外用皮肤制剂及其应用。
【背景技术】
[0002]表皮是人体的第一道防护屏障，其主要组成细胞为角朊细胞(keratinocyte，又称角质形成细胞，有时亦泛称表皮细胞)。为了完成表皮的屏障功能，表皮细胞必须进行复杂而且受到严密调控的分化过程，最终形成包括基底层、棘层、颗粒层、透明层及角质层的复层结构。
[0003]其中，颗粒层(stratum granulosum)位于棘细胞层的浅层，由2_3层细胞组成,其厚度随角化层的厚薄而变化。颗粒层的异常常导致表皮增殖异常和分化障碍，从而引起多种表皮增殖或分化异常相关的皮肤疾患。
[0004]表皮细胞生长调控异常可以导致多种疾病，银屑病是其中常见皮肤病之一，其病因就涉及表皮细胞自我平衡机制的失衡。
[0005]银屑病(psoriasis，PS)是一种常见的慢性复发性的红斑鳞屑性皮肤病。银屑病是以表皮角质形成细胞过度增殖和分化不全、颗粒层减少或消失、真皮浅层微血管扩张并伴有炎症反应为病理特征的表皮角化性皮肤病。银屑皮损出现一系列细胞生长紊乱的细胞生物学现象，除了与细胞 生长因子的诱导有关，而且与表皮细胞的凋亡及分化过程的调节异常密切相关。
[0006]目前仍缺乏满意的治疗方法，难于根治，容易复发。目前还没有一种十分有效的治疗银屑病的药物。
[0007]蜂毒是一种成分复杂的混合物，它除了含有大量水分外，还含有若干种蛋白质多肽类、酶类、组织胺、酸类、氨基酸及微量元素等。蜂毒中研究和应用最多的是蜂毒多肽，蜂毒多肽占蜂毒干重50%以上，是蜂毒中主要功能物质。现有技术中，蜂毒的临床应用主要有以下几种:(I)结缔组织疾病，如风湿性和类风湿性关节炎；(2)神经炎和神经痛，如治疗坐骨神经痛、三叉神经痛、枕神经痛、背神经根炎等；(3)心血管疾病，如高血压动脉粥样硬化症、静脉血栓形成、血栓闭塞性脉管炎和动脉内膜炎；(4)变应性疾病，如支气管哮喘。
[0008]目前还没有任何技术或研究揭示过可将蜂毒或其主要成分应用于治疗银屑病。
【发明内容】
[0009]本发明的目的之一是提供一种蜂毒多肽的新用途。
[0010]本发明的另一目的是提供一种以蜂毒多肽为活性成分的外用制剂及其制法和用途。
[0011]在本发明第一方面中，提供了一种蜂毒多肽的用途，它用于制备(a)调控表皮颗粒层的形成的组合物；(b)调控皮肤中成纤维细胞和/或黑色素细胞增生的组合物；和/或(C)除皱或美白的组合物。
[0012]在另一优选例中，所述组合物用于制备调控表皮颗粒层的形成的组合物。[0013]在另一优选例中，所述组合物用于制备调控皮肤中成纤维细胞和/或黑色素细胞增生的组合物。
[0014]在另一优选例中，所述组合物用于制备除皱或美白的组合物。
[0015]在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物和化妆品。
[0016]在另一优选例中，所述的化妆品包括:面膜、雪花膏、防皱霜、增白霜、去斑霜、乳膏、眼贴、乳液、爽肤水、肥皂、药皂、洗面奶、香水、浴液、或香波。[0017]在另一优选例中，所述的组合物是用于治疗银屑病的药物组合物。
[0018]在另一优选例中，所述的调控表皮颗粒层的形成是促进表皮颗粒层的形成。
[0019]在另一优选例中，所述的组合物还用于:抑制表皮细胞的增殖、促进表皮细胞凋亡、或治疗表皮增生异常的相关皮肤疾患。
[0020]在另一优选例中，所述的表皮细胞是正常的表皮细胞。
[0021]在另一优选例中，所述的成纤维细胞和黑色素细胞是正常细胞。
[0022]在另一优选例中，所述的组合物为经皮或透皮的外用制剂。
[0023]在另一优选例中，所述蜂毒多肽包括:蜂毒肽素(Melittin)、蜂毒明胶(Apamin)、肥大细胞脱细胞肽(MCDP)、安度拉平(Adolapin)、或其组合。
[0024]在本发明第二方面中，提供了一种外用制剂，它包含:(a)蜂毒多肽；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
[0025]在另一优选例中，所述制剂中，蜂毒多肽的含量为0.05 μ g-500mg/克，较佳地为0.1yg-1OOmg/克，更佳地为 1-1000 μ g/克，最佳地 10-100 μ g/克。
[0026]在另一优选例中，所述外用制剂为化妆品制剂或药物制剂；或
[0027]所述外用制剂为膏剂、乳霜、贴剂、涂剂、喷剂或微针剂。
[0028]在另一优选例中，所述药学上可接受的载体或赋形剂为选自下组的一种或多种:水、油脂、高分子聚合物和保湿柔润剂；和/或
[0029]所述的油脂为选自下组的一种或多种:植物油脂、动物油脂及蜡、矿物油脂及蜡和合成油脂及蜡；和/或
[0030]所述的高分子聚合物为天然高分子聚合物或人工合成聚合物。
[0031]在另一优选例中，所述的植物油脂选自下组:月桂酸油类、棕榈酸油类、油酸油类、亚油酸油类、亚麻酸油类、芥酸油类、共轭酸油类、羟基酸油类，或其组合。
[0032]在另一优选例中，所述的动物油脂及蜡选自下组:水貂油、鲨鱼肝油、牛脂等；动物蜡包括鲸蜡、蜂蜡、羊毛脂、或其组合。
[0033]在另一优选例中，所述的矿物油脂及蜡选自下组:液体石蜡、凡士林、石蜡、微晶蜡等；所述的合成油脂及蜡包括各种羊毛脂衍生物、角鲨烷、聚硅氧烷、或其组合。
[0034]在另一优选例中，所述的高分子聚合物选自下组:胶原蛋白、透明质酸、纤维素类聚合物、聚乙烯醇及其衍生物、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸及其衍生物、或其组合。
[0035]在另一优选例中，所述的保湿柔润剂选自下组:脂肪酸酯、多元醇脂肪酸酯、甘油三酸酯、脂肪酸、脂肪醇和脂肪醇聚氧乙烯醚、硅油、蜡酯、烃油和烃蜡、磷脂、或其组合。
[0036]在另一优选例中，所述的外用制剂具有以下一种或多种作用:
[0037](i)调控(如促进)表皮颗粒层的形成或治疗银屑病；[0038](ii)调控(如抑制)皮肤中成纤维细胞或黑色素细胞的增生；
[0039](iii)除皱或美白；
[0040](iv)抑制表皮细胞增殖，促进表皮细胞凋亡或治疗表皮增生异常的相关皮肤疾
[0041]在本发明第三方面中，提供了一种如本发明第二方面所述的外用制剂的制法，包括步骤:混合(a)蜂毒多肽和(b)药学上可接受的载体或赋形剂，从而制得本发明第二方面所述的外用制剂。
[0042]在本发明第四方面中，提供了一种治疗方法，包括步骤:将蜂毒多肽施用于需要治疗的对象。
[0043]在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物，包括人。
[0044]在另一优选例中，所述的方法达到以下一种或多种作用:
[0045](i)调控(如促进)表皮颗粒层的形成治疗银屑病；
[0046](ii)调控(如抑制)皮肤中成纤维细胞或黑色素细胞的增生；
[0047](iii)除皱或美白；
[0048](iv)抑制表皮细胞增殖，促进表皮细胞凋亡或治疗表皮增生异常的相关皮肤疾
[0049]在另一优选例中，所述方法达到以下作用:抑制其他组织细胞增殖或促进其他组织细胞的凋亡，所述的其他组织细胞为间充质细胞、或软骨细胞。
[0050]在另一优选例中，治疗时，蜂毒多肽的作用浓度为l-1000yg/mL，优选为10-200 μ g/mL。
[0051]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]图1显示了 Melittin对表皮细胞增殖的影响。
[0053]图2显示了蜂毒多肽对表皮细胞增殖的影响。
[0054]图3显示了 Melittin对表皮细胞凋亡的影响。
[0055]图4显示了蜂毒多肽对表皮细胞凋亡的影响。
[0056]图5显示了 Melittin对鼠尾上皮颗粒层形成的影响。
[0057]图6显示了蜂毒多肽对鼠尾上皮颗粒层形成的影响。
[0058]图7显示了含蜂毒多肽皮肤外用制剂对豚鼠表皮的色素沉着抑制作用。
【具体实施方式】
[0059]本发明人通过长期而深入的研究，意外地发现蜂毒多肽不仅可抑制表皮细胞的增殖和促进表皮细胞的凋亡，有效参与表皮细胞自身平衡机制，还可以促进表皮颗粒层形成，对抗角化层角化不完全、棘细胞层变厚、表皮厚度增加，从而可以调控并治疗表皮增殖和/或分化异常相关的皮肤疾患。试验表明，蜂毒多肽对银屑病发生、发展具有有效的干预作用。在此基础上，发明人完成了本发明。[0060]蜂毒多肽
[0061]蜂毒(bee venom)由多种化学成分组成，其中多肽类主要包括蜂毒肽素(Melittin)、蜂毒明胶(Apamin)、肥大细胞脱细胞肽(MCDP)、安度拉平(Adolapin)等；酶类包括透明质酸酶(Hyaluronidase)、磷脂酶A2 (Phospholipase A2)等；胺类(如组胺、多巴胺等)和其他物质。
[0062]蜂毒多肽是蜂毒中含有的若干种多肽类物质，是蜂毒中最重要的功能物质。蜂毒多肽中，其中含量最多的是Melittin，占蜂毒多肽总量的40-50%外，其他主要多肽成分还包括:MCDP约占2-3% ；Apamin约占2_3% ；Adolapin约占0.5-1%,还包括一些微量的多妝(如 Secapine、Pamine、Minimine、Procamine> Tertiapine 等)。
[0063]其中，Melittin是一种典型的阳离子多妝(cationic antimicrobialpeptide, CAP)，由26个氨基酸残基组成，分子量为2840D，一级结构序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (如 SEQ ID N0.:1 所示，CAS 号:20449-79-0)。二级结构主要为两亲性(amphiphilic) α-螺旋。Melittin具有很高的生物活性，研究表明它具有抗炎、镇痛、抑制血小板凝集及抗肿瘤等多种作用。
[0064]研究已发现Melittin可以抑制多种体外培养肿瘤细胞的增殖或诱导凋亡(如Toxicol Appl Pharmacol.2012:p72;J Clin Invest.2009:p2830;Life Sc1.2007:p364),有关Melittin对正常体细胞，特别是表皮角质形成细胞增殖及凋亡影响的研究未见报道。
[0065]外用制剂
[0066]本发明所述“活性成分”为蜂毒多肽。本发明所述的活性成分具有多种有益作用，例如，调控表皮颗粒层的形成(如促 进表皮颗粒层形成)，治疗银屑病，抑制表皮细胞的增殖，促进表皮细胞凋亡，治疗表皮增生异常的相关皮肤疾患，调控(如促进)皮肤中成纤维细胞的增生，调控(如抑制)皮肤中黑色素细胞的增生，或除皱和美白等作用。可用于制备治疗皮肤增生异常相关疾病的药物组合物(如外用制剂)。
[0067]本发明的外用制剂包含安全有效量范围内的蜂毒多肽及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是:活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，外用制剂含有0.05 μ g-500mg蜂毒多肽/剂，更佳地，含有0.1 μ g-1OOmg蜂毒多肽/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个贴剂。优选地，当所述外用制剂为液体制剂时，所述外用制剂中蜂毒多肽的浓度为0.05 μ g-500mg/mL,较佳地0.1 μ g-100mg/mL,更佳地l-lOOOyg/mL。当所述的外用制剂为固体制剂时，所述外用制剂中蜂毒多肽的含量为0.05 μ g-500mg/ 克，较佳地 0.1 μ g-1OOmg/ 克，更佳地 1-1000 μ g/ 克。
[0068]“药学上可以接受的载体”指的是:一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是制剂中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如叶.温⑩)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0069]本发明所述的药学上可接受的载体或赋形剂优选自下组的一种或多种:水、油脂、高分子聚合物和保湿柔润剂。
[0070]其中，所述的油脂包括(但不限于):植物油脂、动物油脂及蜡、矿物油脂及蜡和合成油脂及蜡。所述的植物油脂包括(但不限于):月桂酸油类、棕榈酸油类、油酸油类、亚油酸油类、亚麻酸油类、芥酸油类、共轭酸油类、羟基酸油类，或其组合。所述的动物油脂及蜡包括(但不限于):水貂油、鲨鱼肝油、牛脂等；动物蜡包括鲸蜡、蜂蜡、羊毛脂、或其组合。所述的矿物油脂及蜡包括(但不限于):液体石蜡、凡士林、石蜡、微晶蜡等；所述的合成油脂及蜡包括(但不限于):各种羊毛脂衍生物、角鲨烷、聚硅氧烷、或其组合。
[0071]其中，所述的高分子聚合物可以为天然高分子聚合物或人工合成聚合物，例如包括(但不限于):胶原蛋白、透明质酸、纤维素类聚合物、聚乙烯醇及其衍生物、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、丙烯酸及其衍生物、或其组合。
[0072]其中，所述的保湿柔润剂可为优选自下组的保湿柔润剂:脂肪酸酯、多元醇脂肪酸酯、甘油三酸酯、脂肪酸、脂肪醇和脂肪醇聚氧乙烯醚、硅油、蜡酯、烃油和烃蜡、磷脂、或其组合。
[0073]蜂毒多肽或外用制剂的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)为局部给药、透皮给药和经皮给药。用于上述给药方式的代表性蜂毒多肽的剂型包括膏剂、乳霜、贴剂、涂剂、喷剂、微针剂等。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
[0074]蜂毒多肽可以单独给药，或者与其他药学上可接受的药物联合给药。
[0075]使用外用制剂时，是将安全有效量的蜂毒多肽适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.05-lOOOmg，优选I-500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0076]本发明的主要优点:
[0077]1.第一次在体外试验中证实:一定浓度含量的蜂毒多肽抑制表皮细胞增殖，诱导过度增殖表皮细胞的凋亡。
[0078]2.体内试验发现:含一定浓度蜂毒多肽的外用制剂可以促进表皮颗粒层形成，可以对抗角化层角化不完全、棘细胞层变厚、表皮厚度增加。
[0079]3.首次发现蜂毒多肽对银屑病发生、发展具有有效的干预作用。
[0080]4.含蜂毒多肽的外用皮肤制剂具有减少皱纹的作用。
[0081]5.含蜂毒多肽的外用制剂具有抑制UVB造成的色素沉着作用。
[0082]可见，蜂毒多肽可以干预表皮细胞的增殖、分化及凋亡，有效参与表皮细胞自身平衡机制，调控并治疗相关表皮增殖和/或分化异常的皮肤疾患；并具有减少皱纹、美白功效。
[0083]下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等人，分子克隆:实`验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明所用试剂或仪器若无特别说明，均市售可得。
[0084]本发明实验中使用的Melittin (其序列同SEQ ID N0.:1)以及蜂毒(beevenom)购自Sigma公司，蜂毒多妝米用现有方法(Banks BE, Dempsey CE, PearceFL,Vernon CA, Wholley TE.New methods of isolating been venom peptides.AnalBiochem.1981;116(1):48-52)所报导的经典方法分离制得，该方法主要采用层析方法，分离得到的蜂毒多肽是一种混合物，其成分如该文献报道的一致，主要含有Melittin、MCDP、Apamin> Adolapin 等。
[0085]实施例1.表皮细胞的体外培养
[0086]材料和仪器
[0087]胰蛋白酶购自(GIBC0，USA)；
[0088]0.53mM EDTA 购自(GIBC0, USA)；
[0089]胰酶抑制剂购自(GIBC0，USA)；
[0090]台盼蓝购自(Sigma,USA)。
[0091]实验步骤:
[0092]1)取材
[0093]手术切除的小儿包皮，置入含抗生素的角质形成细胞培养液中，带入细胞培养室。
[0094]2)分离表皮
[0095]用剪刀仔细剪去皮下脂 肪组织及部分真皮，并修剪成宽约l_2mm的条状，用无钙镁PBS漂洗两次，表皮面朝上浸于0.24U/ml中性蛋白酶(Dispase II，Sigma, USA)中4°C过夜。
[0096]3)消化
[0097]18小时后，用两把眼科镊子将表皮从真皮上撕下，剪成碎片，再用0.05%胰蛋白酶-0.53mM EDTA在37°C消化15分钟，IOml胰酶抑制剂(10mg/ml)终止消化。经150目不锈钢滤网过滤，以1000r/min离心10分钟，弃去上清，加入角质形成细胞培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数，细胞活力> 85%。
[0098]4)原代培养
[0099]计数后制成单细胞悬液，按3X 106/75cm2密度接种培养，无血清角质形成细胞培养基(GIBC0，USA)，在37°C，5%C02,100%相对湿度的培养箱中培养，培养液3天换一次。
[0100]5)传代培养
[0101]当细胞融合到60%-75%密度时，用IOml无钙镁PBS冲洗，经0.05%胰酶-0.53mMEDTA 37°C消化5-10分钟，加入IOml胰酶抑制剂终止消化，移入离心管中，1000r/min离心10分钟。弃去上清液,加入角质形成细胞培养液10ml，混匀，计数，按1:3的比例传代培养。
[0102]2-3日换一次培养液，直到细胞融合至60%_75%密度时，再传代培养。
[0103]实施例2.Melittin对表皮细胞增殖的影响
[0104]材料和仪器
[0105]K-SFM 培养液购自 GIBC0，USA ；
[0106]MTS ([3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)_5_ (3_羧甲酯基)_2_ (4_磺苯基)_2H_四唑鎗内盐]，购自Promega ；
[0107]自动酶标仪购自BioRad，USA。
[0108]实验方法:
[0109](I)实验选用按照实施例1所述方法培养至第3代的表皮角质形成细胞(Epidermal Keratinocytes, ΕΚ),
[0110](2)每孔4000个细胞接种到96孔板中，37°C、5%C02，在K-SFM培养液中培养12小时。
[0111](3)12小时后，每孔更换培养液，重新加入含有不同浓度Melittin的培养液，Melittin在培养液中的最终浓度分别为1，5，10，20，50，200μ g/mL。继续孵育48小时。
[0112](4)48小时后，每孔加入20 μ I MTS，再继续孵育2小时。
[0113](5)用自动酶标仪测定每孔的吸光度(Absorbance)。
[0114]实验结果:
[0115]各组吸光度值见表I和图1。从结果中可以看出，各组均有不同程度抑制作用，当Melittin终浓度为10 μ g/mL时，对表皮细胞增殖抑制作用明显(P〈0.05);当Melittin终浓度为20，50，200μ g/mL时，对表皮角质形成细胞的增殖抑制作用同对照组比较差异非常显著(ρ〈0.01) ο
[0116]表IMelittin对表皮细胞增殖的影响
[0117]
【权利要求】
1.一种蜂毒多肽的用途，其特征在于，用于制备(a)调控表皮颗粒层的形成的组合物；(b)调控皮肤中成纤维细胞和/或黑色素细胞增生的组合物；和/或(C)除皱或美白的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物包括药物组合物和化妆品。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物是用于治疗银屑病的药物组合物。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于:抑制表皮细胞的增殖、促进表皮细胞凋亡、或治疗表皮增生异常的相关皮肤疾患。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物为经皮或透皮的外用制剂。
6.—种外用制剂,其特征在于,包含: (a)蜂毒多肽；以及 (b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的外用制剂，其特征在于，所述外用制剂为化妆品制剂或药物制剂；或 所述外用制剂为膏剂、乳霜、贴剂、涂剂、喷剂或微针剂。
8.如权利要求6所述的外用制剂，其特征在于，所述药学上可接受的载体或赋形剂为选自下组的一种或多种:水、油脂、高分子聚合物和保湿柔润剂；和/或 所述的油脂为选自下组的一种或多种:植物油脂、动物油脂及蜡、矿物油脂及蜡和合成油脂及蜡；和/或 所述的高分子聚合物为天然高分子聚合物或人工合成聚合物。
9.如权利要求6所述的外用制剂，其特征在于，所述的保湿柔润剂选自下组:脂肪酸酯、多元醇脂肪酸酯、甘油三酸酯、脂肪酸、脂肪醇和脂肪醇聚氧乙烯醚、硅油、蜡酯、烃油和烃蜡、磷脂、或其组合。
10.一种如权利要求6所述的外用制剂的制法，其特征在于，包括步骤:混合(a)蜂毒多肽和(b)药学上可接受的载体或赋形剂，从而制得权利要求6所述的外用制剂。
【文档编号】A61Q19/02GK103446030SQ201210172231
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月29日 优先权日:2012年5月29日
【发明者】杨光辉 申请人:上海瑞培生物科技有限公司