微藻的提取的制作方法

微藻的提取的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物的方法，所述方法包括：(i)用微波辐射处理包含微藻生物质的含水混合物，及(ii)从经过处理的微藻生物质回收含脂质产物。
【专利说明】微藻的提取
[0001] 优先权f件
[0002] 本申请要求2011年10月20日提交的题为"微藻的提取（MICR0ALGAL EXTRACTION) "的澳大利亚临时专利申请第2011904343号的优先权，该案内容以全文引用 的方式并入本文中。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及用于从微藻生物质提取材料的方法。

【背景技术】
[0004] 从长远来看，化石燃料不能作为一种运输用燃料。这一点结合化石燃料燃烧的负 面环境影响引起了对于可以提供不可再生化石燃料的替代选择的可再生能源的研究。生物 燃料是一种此类可再生能源。生物燃料是由可再生有机来源或原料制造的燃料。此术语一 般是指运输用燃料并且包括乙醇和生物柴油。截至目前，用于制造生物柴油的油的主要来 源是粮食作物。然而，使用粮食作物也会存在负面环境影响，并且其未必能够供应足够的运 输用燃料。生物质，例如草、来自谷类作物、林业产品或荒地的残留物等，可用于制造生物燃 料，但其一般被用于制造生物乙醇。然而，生物乙醇并非燃料来源的最佳选择。
[0005] 使用藻类作为再生有机原料当与使用其它可再生有机来源相比较时具有若干益 处，所述有机原料可用于制造适于生物柴油制造的油。一些藻类产生相当大量的油或脂质。 举例来说，一些藻类含有以重量计高达80%的油，并且因此，这些藻类可以提供丰富的油来 源用于制造生物柴油。此外，藻类生长迅速，并且在一年内产生的质量可为陆生植物的10 到100倍，并且其将在许多环境条件中生长。
[0006] 从藻类提取的油是三酸甘油酯与各种亲脂性颜料的混合物。油可以直接地或经由 转酯作用转化成生物柴油而间接地用作燃料。
[0007] 不幸的是，已经证实，在工业规模上，由藻类制造油是一个困难和/或昂贵的工 艺。通常，将微藻生物质从生长池、槽或容器中抽吸到离心机或倾析器中，在其中，将浆料的 体积降低到初始体积的约80%。接着，通常进行进一步干燥的步骤，随后是油提取步骤。干 燥步骤需要时间和大量的能量输入，并因此增加了所述工艺的总体成本。
[0008] 由藻类制造油需要从生物质中提取油，并且优选地，从其它有机污染物中纯化出 脂质部分。在一些工艺中，使用有机溶剂，通过溶剂提取来提取油。举例来说，美国专利第 6, 166, 231号描述了一种从生物质提取油的两阶段溶剂提取。美国专利第5, 458, 897号公 开了用于从植物材料、动物及土壤提取挥发性油的方法，所述方法是通过将植物材料、动物 及土壤与非水性溶剂混合并将混合物曝露于微波辐射来实现。
[0009] 干燥和/或溶剂提取步骤需要时间并增加了提取工艺的成本。
[0010] 需要用于从藻类提取油和其它产品并且克服了与现有技术工艺相关的一个或多 个问题的方法。
[0011] 本说明书中提到的所有出版物都以引用的方式并入本文中。有关本说明书中所包 括的文献、操作、材料、装置、物品等的任何论述仅仅出于提供本发明的上下文的目的。而不 能视为承认这些内容中的任一项或全部形成了现有技术基础的一部分或是与本发明相关 的领域中的一般常识，因为其在所述申请的每一权利要求项的 优先权日:期之前存在于澳大 利亚或者别处中。


【发明内容】

[0012] 本发明提供了一种经济上可行的由微藻制造油的新方法。具体地说，本发明源自 于有关从微藻生物质提取并分级分离商业产品的方法的研究，并且特别是发现使湿微藻生 物质曝露于微波辐射引起油产物的释放，所述油产物可以得到回收，无需中间干燥步骤。
[0013] 在一个方面，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物的方法，所述方法包 括：（i)用微波辐射处理包含微藻生物质的含水混合物，及（ii)从经过处理的微藻生物质 回收含脂质产物。
[0014] 有利的是，所述微藻生物质可以是"湿"生物质。所述微藻生物质可以包含高达 90%的水。从"湿"生物质提取含脂质产物意味着无需从微藻生物质去除任何水，并且此举 使得提取工艺相当高效，因为通常需要的单独干燥步骤是耗时并且耗能的。
[0015] 在一些实施例中，微藻生物质包含以重量计约10%到约90%的水。
[0016] 也已经发现，通过降低包含微藻生物质的含水混合物的pH值，可以从所述生物质 中选择性提取碳水化合物材料。因此，本发明还提供一种从微藻生物质提取含脂质产物 和含碳水化合物产物的方法，所述方法包括：（i)提供含有所述微藻生物质的含水混合物； (ii)将所述含水混合物的pH值调到pH〈7 加热含有所述微藻生物质的含水混合物； 及（iv)从所述生物质中分离出含脂质产物和含碳水化合物产物。
[0017] 此外，已经发现，通过增加包含微藻生物质的含水混合物的pH值，可以从所述生 物质中选择性提取蛋白质材料。因此，本发明还提供一种从微藻生物质提取含脂质产物和 含蛋白质产物的方法，所述方法包括：（i)提供含有所述微藻生物质的含水混合物；（ii)将 所述含水混合物的pH值调到pH>7 加热含有所述微藻生物质的含水混合物；及（iv) 从所述生物质中分离出含脂质产物和含蛋白质产物。
[0018] 本文所描述的方法可以依序进行。因此，本发明提供一种从微藻生物质选择性提 取含脂质产物、含碳水化合物产物及含蛋白质产物的方法。出于若干原因，这是有益的。首 先，所获得的含脂质产物实质上不含碳水化合物材料和蛋白质材料。其次，碳水化合物材料 和蛋白质材料是附加值产品，提供了额外的收益流。
[0019] 在一些实施例中，所述方法包括在pH〈7下进行第一次提取，随后在pH>7下进行一 次或多次提取，随后回收含脂质产物。因此，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产 物、含碳水化合物产物及含蛋白质产物的方法，所述方法包括：
[0020] (i)提供含有所述微藻生物质的初始含水混合物；
[0021] (ii)将所述初始含水混合物的pH值调到pH〈7 ;
[0022] (iii)加热含有所述微藻生物质的所述酸性初始含水混合物以提供第一经过处理 的混合物；
[0023] (iv)从所述第一经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第一固体和含碳水化 合物的液体；
[0024] (v)将所述第一固体与含水混合物组合以形成第二含有微藻生物质的含水混合 物；
[0025] (vi)将所述第二含水混合物的pH值调到pH>7 ;
[0026] (vii)加热含有所述微藻生物质的所述碱性第二含水混合物以提供第二经过处理 的混合物；
[0027] (viii)从所述第二经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第二固体和含蛋白 质的液体；
[0028] (ix)任选地，使用所述第二固体重复步骤（V)到（viii)，以提供第三固体和另外 的含蛋白质的液体；
[0029] (X)将所述第二固体或所述第三固体与含水混合物组合，以形成最终的含水混合 物；
[0030] (xi)用溶剂处理所述最终的含水混合物；
[0031] (xii)从所述最终含水混合物中分离所述溶剂，以提供含有脂质产物的溶剂。
[0032] 在一些实施例中，步骤（ii)中形成的混合物的pH值在约0. 5到约2的范围内。在 一些特定实施例中，步骤（ii)中形成的混合物的pH值为约1。
[0033] 在一些实施例中，步骤（vi)中形成的混合物的pH值在约11到约14的范围内。在 一些特定实施例中，步骤（vi)中形成的混合物的pH值为约13。
[0034] 加热含有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤可以使用任何适合的 加热源进行。加热步骤可以在大气压下或在高于大气压下进行。在一些实施例中，加热含 有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤是通过用微波辐射处理所述混合物来 进行的。
[0035] 用溶剂处理所述最终的含水混合物的步骤中使用的溶剂可以是任何非水性溶剂。
[0036] 在另一方面，本发明提供一种由本文所描述的方法制造的产物。

【专利附图】

【附图说明】
[0037] 图1是绘示在酸性和碱性条件下通过不同微波照射时间得到的碳水化合物提取 产率的比较的图。
[0038] 图2是绘示在酸性和碱性条件下通过不同微波照射时间得到的蛋白质提取产率 的比较的图。
[0039] 图3是绘示仅在酸性条件下六次重复微波提取的碳水化合物提取产率的图。
[0040] 图4是绘示仅在酸性条件下六次重复微波提取的蛋白质提取产率的图。
[0041] 图5是绘示仅在碱性条件下六次重复微波提取的碳水化合物提取产率的图。
[0042] 图6是绘示仅在碱性条件下六次重复微波提取的蛋白质提取产率的图。
[0043] 图7是绘示在碱性到酸性条件下六次重复微波提取的碳水化合物提取产率的图。
[0044] 图8是绘示在碱性到酸性条件下六次重复微波提取的蛋白质提取产率的图。
[0045] 图9是绘示在酸性到碱性条件下六次重复微波提取的碳水化合物提取产率的图。
[0046] 图10是绘示在酸性到碱性条件下六次重复微波提取的蛋白质提取产率的图。
[0047] 图11是绘示通过外加葡萄糖进行的提取的碳水化合物回收率测试的图。
[0048] 图12是绘示通过外加 BSA进行的提取的碳水化合物回收率测试的图。
[0049] 图13是提取的微藻脂质漂浮在提取缓冲液的表面上的照片。
[0050] 图14是绘示在酸性到碱性条件下从2. 5g生物质和25g生物质六次重复微波提取 所提取的碳水化合物产率的比较的图。
[0051] 图15是绘示在酸性到碱性条件下从2. 5g生物质和25g生物质六次重复微波提取 所提取的碳水化合物产率的比较的图。
[0052] 图16是绘示通过微量劳里法（micro-lowry method)六次重复微波提取的蛋白质 提取效率的图。
[0053] 图17是绘示通过微量劳里法六次重复微波提取的蛋白质提取效率的图。
[0054] 图18是绘示以1:10的生物质与缓冲液比率和1:5的生物质与缓冲液比率进行的 提取工艺之间的蛋白质提取产率的比较的图。
[0055] 图19是绘示使用湿生物质进行的七次重复微波提取的蛋白质提取效率的图。
[0056] 图20是绘示使用湿生物质进行的七次重复微波提取的碳水化合物提取效率的 图。
[0057] 图21是绘示湿生物质、冷冻干燥的生物质及烘箱干燥的生物质的脂质含量分析 的图。
[0058] 图22是绘示藻类生物质的化学特征的图。
[0059] 图23是绘示用于优化湿藻类生物质的微波提取条件的实验设计的流程图。
[0060] 图24是绘示使用湿藻类生物质的无灰分蛋白质提取效率的比较的图。
[0061] 图25是绘示使用湿藻类生物质的无灰分还原糖提取效率的比较的图。
[0062] 图26是绘示使用湿藻类生物质的无灰分碳水化合物提取效率的比较的图。
[0063] 图27是绘示利用三次微波提取的无灰分蛋白质提取效率的比较的图。
[0064] 图28是绘示利用三次微波提取的无灰分碳水化合物提取效率的比较的图。
[0065] 图29是绘示利用三次微波提取的蛋白质和碳水化合物回收率的比较的图。
[0066] 图30是绘示微波提取工艺的材料质量平衡的图。
[0067] 图31是绘示微波提取工艺的脂质回收率和损失率的图。
[0068] 图32是绘示在不同pH值下利用微波提取的无灰分碳水化合物提取效率的图。
[0069] 图33是绘示在不同pH值下利用微波提取的无灰分蛋白质提取效率的图。
[0070] 图34是绘示在不同pH值下利用微波提取的无灰分还原糖提取效率的图。
[0071] 图35是绘示在不同pH值下利用微波提取的总碳水化合物和蛋白质回收率的图。
[0072] 图36是绘示使用不同加热方法的无灰分蛋白质提取效率的图。
[0073] 图37是绘示使用不同加热方法的无灰分碳水化合物提取效率的图。
[0074] 图38是绘示总碳水化合物、蛋白质、脂质及灰分含量的图。
[0075] 图39是绘示在不同微波提取温度和时间下无灰分蛋白质提取效率的比较的图。
[0076] 图40是绘示在不同微波提取温度和时间下无灰分总碳水化合物提取效率的比较 的图。
[0077] 图41是绘示在不同提取温度和时间下基于微波提取的功率消耗得到的总蛋白质 和碳水化合物生产率的比较的图。
[0078] 图42是绘示不同提取条件的总功率消耗的比较的图。
[0079] 图43是绘示在25mL样品规模下基于利用不同提取条件的功率消耗得到的总蛋白 质和碳水化合物生产率的比较的图。
[0080] 图44是绘示在不同样品规模下基于微波提取的功率消耗得到的总蛋白质和碳水 化合物生产率的比较的图。

【具体实施方式】
[0081] 在第一方面，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物的方法，所述方法包 括：（i)用微波辐射处理包含微藻生物质的含水混合物，及（ii)从经过处理的微藻生物质 回收含脂质产物。
[0082] 如本文中所使用，术语"微藻"、"微藻的"和相关术语意思指任何单细胞的光合微 生物。微藻又称为浮游植物、微植物或浮游藻类。典型的微藻包括绿藻（绿藻门）和蓝绿 藻（蓝绿藻门）。
[0083] 如本文中所使用，术语"生物质"意思指来自活生物体或目前存活的生物体的生物 材料。
[0084] 如本文中所使用，术语"脂质"意思指不可溶于水中但可溶于非极性有机溶剂中并 且有油滑触感的任何有机化合物，例如脂肪、油、蜡、固醇或三酸甘油酯。
[0085] 如本文中所使用，术语"碳水化合物"意思指用作动物饮食中的主要能量来源的任 何有机化合物，例如糖、淀粉、纤维素或胶质。
[0086] 如本文中所使用，术语"蛋白质"意思指含有碳、氢、氧、氮并且通常含有硫，并且由 一条或多条氨基酸链构成的任何复杂有机大分子。
[0087] 用于提取含脂质产物以及任选地含碳水化合物产物和/或含蛋白质产物的微藻 生物质是一种含水悬浮液。含水悬浮液可以通过使干燥的生物质发生水合作用来制备。水 合作用可以通过使干燥的微藻生物质与水在足以使生物质再水合的温度下和时间内接触 来进行。举例来说，可以将干燥的生物质浸入水中，保持约60分钟，来提供微藻生物质的含 水悬浮液。
[0088] 或者，微藻生物质的含水悬浮液可以是先前未经历干燥步骤的"湿"生物质。如先 前所提到的，在从微藻提取脂质时通常使用的干燥步骤是耗时并且耗能的，并且出于这一 原因，从"湿"生物质直接提取含脂质产物可能特别有益。
[0089] 或者，微藻生物质的含水悬浮液可以是先前经历过部分干燥步骤的浓缩的藻类糊 浆。
[0090] 微藻生物质的含水悬浮液包含以重量计约10%到约90%的水。
[0091] 微藻生物质可以源自于任何适合的微藻种类。特定微藻种类可以基于将源自 于生物质的特定产物进行选择。举例来说，生物燃料可以源自于海洋微藻微拟球藻属 (Nanochloropsis sp.)。微藻可以使用已知适合于特定种类的条件培养。举例来说，微拟 球藻属（一种海洋藻类种类）可以在补充有适合培养基的海水池中培养。微藻还可以在光 生物反应器系统中培养，其中包括温度和光强度在内的许多参数可以在无菌条件下进行控 制。
[0092] 含脂质产物一旦从生物质释放，就会在含水悬浮液的顶部上形成油层。接着，可以 通过物理方式从含水悬浮液分离这些脂质。任选地，可以在微波照射后对含水悬浮液进行 离心，以帮助将悬浮液中的油层与水层和任何固体材料分离。任选地，可以在微波照射后用 溶剂提取含水悬浮液，以从悬浮液中的水层和任何固体材料中提取含脂质产物。当脂质产 物结合于生物质中时，溶剂提取可以是特别有用的。适合的溶剂包括非水性溶剂。适合的 非水性溶剂包括非极性有机液体。烃类，例如己烷或石油醚，是适合此目的的非极性有机液 体。其它适合的溶剂包括酯类、醚类、酮类以及硝化烃和氯化烃。
[0093] 除提取脂质外，还可以通过降低微藻生物质的含水悬浮液的pH值，从微藻生物质 中选择性提取碳水化合物材料。因此，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产物和含 碳水化合物产物的方法，所述方法包括：（i)提供微藻生物质的含水悬浮液；（ii)将所述含 水悬浮液的pH值调到pH〈7 加热微藻生物质的含水悬浮液；及（iv)从所述生物质中 分离出所述含脂质产物和所述含碳水化合物产物。
[0094] 含水悬浮液的pH值可以使用适合的酸来降低。酸可以是有机酸或无机酸。在一 些实施例中，酸是无机酸。无机酸可以选自由硫酸、硝酸、盐酸及氢氟酸组成的群组。在一 些特定实施例中，酸是硫酸。
[0095] 含水悬浮液的pH值可以降到低于pH6。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到 低于约PH5。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH4。在一些实施例中，含水 悬浮液的pH值降到低于约pH3。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH2。在 一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以降到介于约0. 5与约3之间。在一些实施例中，含 水悬浮液的pH值可以降到介于约0. 5与约2之间。
[0096] 加热微藻生物质的含水悬浮液的步骤可以使用任何适合的加热源进行。本领域技 术人员已知许多加热源并且都可以用于此目的。实例包括热浴、高压釜及微波烘箱。加热 步骤可以在大气压下或在高于大气压的压力下进行。在后一情形中，可以使用高压釜。 [0097] 已经发现，通过用微波辐射处理微藻生物质的含水悬浮液来进行加热步骤是特别 有益的。使用微波辐射的一个益处是缩短了此步骤所花费的时间。
[0098] 使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤可以包括将含有微藻生物质 的含水悬浮液的容器放到微波烘箱中。或者，可以使微藻生物质的含水悬浮液通过微波烘 箱，所述微波烘箱具有连续流管定位于其中。微藻生物质的含水悬浮液可以曝露于微波辐 射，持续使得从含水悬浮液中分离出含脂质产物的任何时间段。在一些实施例中，使微藻生 物质曝露于微波辐射一段约1分钟到约30分钟的时间。在一些实施例中，使微藻生物质曝 露于微波辐射一段约10分钟的时间。微藻生物质曝露于微波辐射的时间段将至少部分取 决于微波烘箱的输出功率。
[0099] 在一些实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括使用第 一微波功率照射所述悬浮液，直到温度升到介于约80°C与约11(TC之间，接着使用第二微 波功率使所述悬浮液在约80°C和约110°C下保持介于约1分钟与约30分钟之间的时间，所 述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝 露于微波辐射的步骤包括在约1000瓦特（Watt)的微波功率下照射所述悬浮液，直到悬浮 液的温度升到约100°c，接着使用约200瓦特的微波功率输入使悬浮液在约100°C下保持约 10分钟。
[0100] 在如先前所描述进行加热之后，可以在含水悬浮液顶部上的油层中发现含脂质产 物，而可以在水溶液中发现含碳水化合物产物。若情况就是如此，那么可以通过离心将油层 和含水液体与固体生物质分离。由此提供适合直接或间接用于燃料目的的油以及含碳水化 合物的水溶液。必要时，可以使用例如溶剂蒸发、结晶、色谱法等标准技术从水溶液中回收 碳水化合物。或者，可以在所述工艺的后续阶段（如下文更详细地描述）使用溶剂提取从 含水悬浮液中提取含脂质产物。
[0101] 通过增加微藻生物质的含水悬浮液的pH值，可以从微藻生物质选择性提取蛋白 质材料。因此，在第三个方面，本发明提供了一种从微藻生物质提取含脂质产物和含蛋白质 产物的方法，所述方法包括：（i)提供微藻生物质的含水悬浮液；（ii)将所述含水悬浮液的 pH值调到pH>7 加热微藻生物质；及（iv)从所述生物质中分离出所述含脂质产物和 所述含蛋白质产物。
[0102] 含水悬浮液的pH值可以使用适合的碱来增加。碱可以是有机碱或无机碱。在一 些实施例中，碱是无机碱。无机碱可以选自由氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵组成的群组。 在一些特定实施例中，碱是氢氧化钠。
[0103] 含水悬浮液的pH值可以增加到大于pH8。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可 以增加到大于pH9。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到大于pHIO。在一些实 施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到大于pHl 1。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可 以增加到大于PH12。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约10与约13. 5 之间。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约11与约13. 5之间。在一些 实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约12与约13. 5之间。
[0104] 加热微藻生物质的含水悬浮液的步骤可以使用任何适合的加热源进行。本领域技 术人员已知许多加热源并且都可以用于此目的。实例包括热浴、高压釜及微波烘箱。加热 步骤可以在大气压下或在高于大气压的压力下进行。在后一情形中，可以使用高压釜。
[0105] 使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤可以包括将含有微藻生物质 的含水悬浮液的容器放到微波烘箱中。或者，可以使微藻生物质的含水悬浮液通过微波烘 箱，所述微波烘箱具有连续流管定位于其中。微藻生物质的含水悬浮液可以曝露于微波辐 射，持续使得从含水悬浮液中分离出含脂质产物的任何时间段。在一些实施例中，使微藻生 物质曝露于微波辐射一段约1分钟到约30分钟的时间。在一些实施例中，使微藻生物质曝 露于微波辐射一段约10分钟的时间。微藻生物质曝露于微波辐射的时间段将至少部分取 决于微波烘箱的输出功率。
[0106] 在一些实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括使用第 一微波功率照射所述悬浮液，直到温度升到介于约80°c与约11(TC之间，接着使用第二微 波功率将所述悬浮液在约80°C和约110°C下保持介于约1分钟与约30分钟之间的时间，所 述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝 露于微波辐射的步骤包括在约1000瓦特的微波功率下照射所述悬浮液，直到悬浮液的温 度升到约KKTC，接着使用约200瓦特的微波功率输入使悬浮液在约10(TC下保持约10分 钟。
[0107] 在如先前所描述进行加热之后，可以在含水悬浮液顶部上的油层中发现含脂质产 物，而可以在含水液体中发现含蛋白质产物。若情况就是如此，那么可以通过离心将油层和 含水液体与固体生物质分离。由此提供适合直接或间接用于燃料目的的油以及含蛋白质的 水溶液。必要时，可以使用例如溶剂蒸发、结晶、色谱法等标准技术从水溶液中回收蛋白质。 或者，可以在所述工艺的后续阶段（如下文更详细地描述）使用溶剂提取从含水悬浮液中 提取含脂质广物。
[0108] 酸性和碱性提取可以依序进行。因此，可以降低含水悬浮液的pH值，加热悬浮液， 对混合物离心以提供油层和含碳水化合物的水层以及生物质团粒。接着，可以使生物质团 粒悬浮于pH>7的水溶液中，以形成第二含水悬浮液，可以对所述第二含水悬浮液进行加 热，接着对混合物离心，以提供含脂质层（如果存在的话）、含蛋白质的水层及生物质团粒。 必要时，可以重复所述工艺。
[0109] 在一些实施例中，所述方法包括在pH〈7下进行第一次提取，随后在pH>7下进行一 次或多次提取，随后回收含脂质产物。因此，本发明提供一种从微藻生物质提取含脂质产 物、含碳水化合物产物及含蛋白质产物的方法，所述方法包括：
[0110] Q)提供含有所述微藻生物质的初始含水混合物；
[0111] (ii)将所述初始含水混合物的pH值调到pH〈7 ;
[0112] (iii)加热含有所述微藻生物质的酸性初始含水混合物以提供第一经过处理的混 合物；
[0113] (iv)从所述第一经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第一固体和含碳水化 合物的液体；
[0114] (V)将所述第一固体与含水混合物组合以形成第二含有微藻生物质的含水混合 物；
[0115] (vi)将所述第二含水混合物的pH值调到pH>7 ;
[0116] (vii)加热含有所述微藻生物质的碱性第二含水混合物以提供第二经过处理的混 合物；
[0117] (viii)从所述第二经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第二固体和含蛋白 质的液体；
[0118] (ix)任选地，使用所述第二固体重复步骤（V)到（Viii)，以提供第三固体和另外 的含蛋白质的液体；
[0119] (X)将所述第二固体或所述第三固体与含水混合物组合，以形成最终的含水混合 物；
[0120] (xi)用溶剂处理所述最终的含水混合物；
[0121] (xii)从所述最终的含水混合物中分离所述溶剂，以提供含有脂质产物的溶剂。
[0122] 含水悬浮液的pH值可以降到低于pH6。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到 低于约PH5。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH4。在一些实施例中，含水 悬浮液的pH值降到低于约pH3。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值降到低于约pH2。在 一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以降到介于约0. 5与约3之间。在一些实施例中，含 水悬浮液的pH值可以降到介于约0.5与约2之间。在一些实施例中，步骤（ii)中形成的 混合物的pH值在约0. 5到约2的范围内。在一些特定实施例中，步骤（ii)中形成的混合 物的pH值为约1。
[0123] 含水悬浮液的pH值可以增加到大于pH8。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值 增加到大于pH9。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值增加到大于pHIO。在一些实施例 中，含水悬浮液的pH值增加到大于pHl 1。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值增加到大于 pH12。在一些实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约10与约13. 5之间。在一些 实施例中，含水悬浮液的pH值可以增加到介于约11与约13. 5之间。在一些实施例中，含 水悬浮液的pH值可以增加到介于约12与约13. 5之间。在一些实施例中，步骤（vi)中形 成的混合物的pH值在约11到约14的范围内。在一些特定实施例中，步骤（vi)中形成的 混合物的pH值为约13。
[0124] 加热含有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤可以使用任何适合的 加热源进行。加热步骤可以在大气压下或在高于大气压下进行。在一些实施例中，加热含 有所述微藻生物质的酸性或碱性含水混合物的步骤是通过用微波辐射处理所述混合物来 进行的。
[0125] 使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤可以包括将含有微藻生物质 的含水悬浮液的容器放到微波烘箱中。或者，可以使微藻生物质的含水悬浮液通过微波烘 箱，所述微波烘箱具有连续流管定位于其中。微藻生物质的含水悬浮液可以曝露于微波辐 射，持续使得从含水悬浮液中分离出含脂质产物的任何时间段。在一些实施例中，使微藻生 物质曝露于微波辐射一段约1分钟到约30分钟的时间。在一些实施例中，使微藻生物质曝 露于微波辐射一段约10分钟的时间。微藻生物质曝露于微波辐射的时间段将至少部分取 决于微波烘箱的输出功率。
[0126] 在一些实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝露于微波辐射的步骤包括使用第 一微波功率照射所述悬浮液，直到温度升到介于约80°C与约11(TC之间，接着使用第二微 波功率将所述悬浮液在约80°C和约110°C下保持介于约1分钟与约30分钟之间的时间，所 述第二微波功率低于第一微波功率。在一些特定实施例中，使微藻生物质的含水悬浮液曝 露于微波辐射的步骤包括在约1000瓦特的微波功率下照射所述悬浮液，直到悬浮液的温 度升到约KKTC，接着使用约200瓦特的微波功率输入使悬浮液在约10(TC下保持约10分 钟。
[0127] 用溶剂处理所述最终的含水混合物的步骤中使用的溶剂可以是任何非水性溶剂。
[0128] 源自于微藻生物质的含脂质产物（油）、碳水化合物及蛋白质可以用于许多应 用中。微藻油是由具有许多不同功能的不同类型的脂肪酸制成。中性脂质三酰基甘油 (triacylglycerol，TAG)可以用于生物柴油；多不饱和脂肪酸（例如-3-脂肪酸DHA和EPA) 可以用作保健食品；膜脂质可以用作生物表面活性剂和生物润滑剂。必要时，可以对含脂质 产物进行进一步分级分离和/或纯化以提供特定脂质用于进一步使用。
[0129] 微藻来源的蛋白质可以用作人类和动物的食品或饲料蛋白质补充。微藻蛋白质还 可以是用于生物催化和生物转化的新型酶的极为重要的来源。此外，这些蛋白质水解可以 提供功能性多肽和寡肽，其可以用于食品应用、保健食品产品及药品。
[0130] 微藻来源的碳水化合物可以用作生物聚合物、粗糖以用于发酵生产生物化学品， 例如生物乙醇、乳酸、抗生素。微藻碳水化合物可以被水解以产生功能性多糖或寡糖，其可 以用作人类营养和健康产品。
[0131] 下文将借助以下非限制性实例描述本发明。
[0132] 实例
[0133] 微藻生物质是从海洋微藻微拟球藻属获得。在装有20ppt海水并补充有F/2培养 基的3000L户外跑道池中培育微拟球藻属。pH值一般用1-5% C02控制在7. 9到8. 2。在 户外条件下，温度和照明未加控制。
[0134] 微藻还可以在光生物反应器系统中培养，其中包括温度和光强度在内的许多参数 可以在无菌条件下进行控制。
[0135] 实例1 一在酸性和碱性条件下微波提取干微藻生物质
[0136] 材料
[0137] 批号29的干微藻生物质是从南澳大利亚研发中心（South Australian Research and Development Institute, SARDI)获得。
[0138] 设备
[0139] 微波提取是在麦顿（Milestone)的Start Synth微波合成试验站进行。
[0140] 程序
[0141] 将干生物质（2. 5g)添加到50mL圆形平底烧瓶中。向样品添加25mL的0. 5M H2S04 溶液或25mL的0. 5M NaOH。接着，在室温下培育样品约1小时，然后在100°C下微波照射2、 5、10或30分钟。
[0142] 接着以10, 000g将样品离心10分钟，并分别收集顶（脂质）层和中间（碳水化合 物和蛋白质）层。
[0143] 通过重量分析法来分析脂质提取物，通过DNS法分析碳水化合物提取物，并通过 BCA法分析蛋白质提取物。
[0144] 结果
[0145] 脂质提取
[0146] 在酸性或碱性条件下通过微波提取所提取的脂质的量很难分析。通过收集2mL顶 层并通过重量分析法进行分析，从2. 5g干生物质提取的脂质的量低于10mg。然而，通过大 规模提取可以解决这一问题。
[0147] 优化碳水化合物和蛋白质提取的微波照射时间
[0148] 微波照射进行2分钟、5分钟、10分钟及30分钟时间，以便优化提取碳水化合物和 蛋白质所需的加工条件。
[0149] 结果显示于图1中。碱性条件不适于碳水化合物提取。基于2、5、10及30分钟提 取所计算的碳水化合物含量全部低于〇. 2%。另一方面，基于在酸性条件下的2、5、10及30 分钟提取所计算的碳水化合物含量为约4%到5%，并且最大值是在30分钟照射之后获得， 而最小值是在2分钟照射之后获得。在基于5分钟与10分钟照射所计算的碳水化合物含 量之间仅存在较小差异。
[0150] 如图2中可见，对于蛋白质提取，碱性条件优于酸性条件。基于在碱性条件下的2、 5、10及30分钟提取所计算的蛋白质含量为4%到6%，并且最大值是通过10分钟照射获 得。基于在酸性条件下的2、5、10及30分钟提取所计算的蛋白质含量为2%到3%。最大 值是在30分钟照射之后获得，并且第二最大值是在10分钟照射之后获得。
[0151] 此外，比较在不同照射时间之后所获得的碳水化合物和蛋白质含量值，差异较小。 然而，为了实现碳水化合物和蛋白质的高提取产率并且节省能量和时间，选择10分钟提取 进行进一步实验。
[0152] 在酸件备件下重复微波提取
[0153] 在酸性条件下重复进行微波提取六次，以测试从干微藻生物质提取碳水化合物和 蛋白质的效率。
[0154] 如图3中所示，在六次重复酸性提取之后，从2. 5g干微藻生物质提取的总碳水化 合物为约6. 5%。第一次提取从干微藻生物质回收到约4%的碳水化合物，占总提取的碳水 化合物的58. 35%，并且第二次提取回收到总提取的碳水化合物的23. 91%。因此，通过在 酸性条件下进行的第一次和第二次微波提取可以提取到约85%的碳水化合物。
[0155] 然而，在酸性条件下蛋白质提取的提取效率不同于碳水化合物提取。基于第一次 提取所计算的干微藻生物质的蛋白质含量为约2. 6%，占在6次重复提取之后所提取的总 蛋白质的33. 85%。从第二次到第六次提取获得的值是类似的。这表明，在酸性条件下进行 微波提取的效率可能不足以从干微藻生物质提取蛋白质。
[0156] 在碱件备件下重复微波提取
[0157] 在碱性条件下重复进行微波提取六次，以测试从干微藻生物质提取碳水化合物和 蛋白质的效率。
[0158] 在碱性条件下进行的微波提取不适于从干微藻生物质提取碳水化合物。在6次重 复提取之后，从干微藻生物质提取的总碳水化合物以重量计（g碳水化合物/g干生物质） 低于0.2%。然而，如在图6中所示，在六次连续碱性提取之后，从2. 5g干微藻生物质提取的 总蛋白质为约〇. 28g，占干生物质的11%。第一次提取回收到总提取蛋白质的约52. 72%， 并且第二次提取回收到总提取蛋白质的20. 93%。因此，通过在碱性条件下进行的第一次和 第二次微波提取可以提取到约74%的蛋白质。
[0159] 在碱件到酸件备件下重复微波提取
[0160] 在碱性到酸性条件下重复进行微波提取六次，以测试从干微藻生物质提取碳水化 合物和蛋白质的效率。第一次提取是在碱性条件下并且第二次和第三次提取变为酸性条 件。第四次和第五次提取又是在碱性条件下并且第六次提取变为酸性条件。
[0161] 结果显示于图7中。碳水化合物在碱性到酸性重复提取下的提取结果不同于仅 在酸性和碱性条件下的提取。在第一次碱性提取之后，从干生物质提取的碳水化合物低于 〇. 2%，与从仅碱性提取获得的结果相同。然而，在变为酸性条件之后，第二次和第三次提取 显示出低得多的碳水化合物提取效率。在仅酸性条件下，第一次和第二次提取提供约4%和 1. 5%的碳水化合物。在碱性变为酸性提取之后，第二次和第三次提取都是在酸性条件下， 并且从这两次提取获得的碳水化合物含量仅为约1. 5%和1%。此外，在六次重复酸性提取 之后计算的总碳水化合物含量为约6. 5%并且在六次重复碱性到酸性提取之后计算的总碳 水化合物含量为约3%。
[0162] 蛋白质提取结果显示于图8中。基于六次重复碱性到酸性提取所计算的总蛋白质 含量为约14%，高于从六次重复仅碱性提取所获得的结果。此外，第一碱性提取占干微藻生 物质的约6%并且占所提取的总蛋白质的42. 15%。第二次和第三次提取（酸性）总计占 干微藻生物质的约4%并且此类似于第一次和第二次仅酸性提取（图4)。与第二次和第三 次提取（酸性）相比较，通过第四次提取（碱性）提取到更多蛋白质。
[0163] 在酸件到碱件备件下重复微波提取
[0164] 在酸性到碱性条件下重复进行微波提取六次，以测试从干微藻生物质提取碳水化 合物和蛋白质的效率。第一次提取是在酸性条件下，第二次和第三次提取变为碱性条件，第 四次和第五次提取又是在酸性条件下，并且第六次提取变为碱性条件。
[0165] 结果显示于图9中。通过在酸性条件下重复提取从干生物质中提取碳水化合物的 性能类似于从仅碱性和酸性条件得到的结果（图6)。大部分碳水化合物都是通过第一次、 第四次及第五次提取（酸性）所提取，占通过六次提取所提取的总碳水化合物的约95%。 然而，即使第二次、第三次及第六次提取（碱性）仅占干生物质的约5%，由这三次提取所计 算的实际碳水化合物含量也比从仅碱性提取获得的结果高得多（图5)。
[0166] 然而，基于六次重复酸性到碱性提取所计算的总蛋白质含量为约10%，高于从六 次重复仅碱性提取所获得的结果（图6)并且类似于由碱性到酸性提取得到的结果（图8)。 此外，对于蛋白质来说，碱性提取显示的性能优于酸性提取。通过第二次、第三次及第六次 提取（碱性）获得约65%的提取蛋白质。
[0167] 通讨向干牛物质外加 R知量的脂质、碳水化合物和蛋白质来测试脂质、碳水化合 物和蛋白质的回收率
[0168] 向干微藻生物质外加4mg标准蛋白质BSA、125mg葡萄糖及0. 260g芥花油。接着 使用"酸性-碱性-碱性-酸性-酸性-碱性"方案进行多次提取。同时进行不添加蛋白 质、葡萄糖或油的对照提取。
[0169] 脂质回收率仍难以测量。甚至在外加 0. 26克油情况下，在处理之后所提取的脂质 量仍太少而无法分析。
[0170] 对于碳水化合物回收率，外加的材料的第一次酸性提取得到213. 64mg葡萄糖当 量。这比得到78. 08mg的对照提取高出135. 56mg (图11)。这一值与外加葡萄糖125mg相 当接近。此结果证实，在第一次酸性提取中回收到所有添加的葡萄糖。添加的BSA蛋白质 和芥花油可贡献从外加生物质回收的额外的l〇mg葡萄糖当量。
[0171] 应注意，在标准条件（如关于对照物所使用）下提取的总葡萄糖为107. 23mg，低于 先前数轮（图9)在相同条件下的平均值131. 05mg。
[0172] 对于蛋白质回收率，外加的材料的第一次酸性提取得到51. 5mg BSA当量。这比得 到38. 25mg的对照提取高出13. 25mg(图12)。然而，与在提取之间添加的BSA的量4mg相 比较，测试值高得多。此外，根据从六次提取回收的总蛋白质，外加的样品显示23. 5g的BSA 当量，高于对照样品。这可能是因为外加蛋白质的量太少而无法覆盖重复实验之间的差异。
[0173] 实例2-在选定条件下的提取的按比例放大
[0174] 为了在微波提取期间回收大部分的碳水化合物和蛋白质，选择酸性到碱性（酸 性-碱性-碱性-酸性-酸性-碱性）重复条件。根据图9和10,通过六次提取从干微藻 生物质提取的总碳水化合物含量为至多5%，并且通过六次提取从干微藻生物质提取的蛋 白质含量为至多10%。此外，根据图9,所提取的大多数碳水化合物能够通过第一次酸性提 取来提取，并且仅极少量的提取的碳水化合物是由第二次和第三次提取提供。对于蛋白质， 第一次酸性提取占总提取蛋白质的约25%，并且第二次和第三次提取分别占总提取蛋白质 的约30%和20%。因此，酸性到喊性条件不仅使碳水化合物和蛋白质提取效率最大化，而 且还实现了成品产物的分离。在第一次酸性提取之后，移出了大部分的提取的碳水化合物。 因此，来自第二次和第三次碱性提取的提取物几乎不含碳水化合物。
[0175] 材料
[0176] 批号29的干微藻生物质是从南澳大利亚研发中心（SARDI)获得。
[0177] 设备
[0178] 微波提取是在麦顿的Start Synth微波合成试验站进行。
[0179] 程序
[0180] 将干生物质（25g)添加到500mL平底烧瓶中。添加0. 5M H2S04 (250mL)，并且在室 温下培育样品约1小时。接着，在微波烘箱中于100°c下照射样品10分钟。
[0181] 接着以10, 000g将混合物离心10分钟，并分别收集顶（脂质）层和中间（碳水化 合物和蛋白质）层以提供第一次提取产物。
[0182] 将团粒再悬浮于250mL的0. 5M NaOH中并重复微波照射、离心和产物分离工艺，以 提供第二次提取产物。
[0183] 将团粒再次再悬浮于250mL的0. 5M NaOH中并重复微波照射、离心和产物分离工 艺，以提供第三次提取产物。
[0184] 将团粒再次再悬浮于250mL的0. 5M H2S04中并重复微波照射、离心和产物分离工 艺，以提供第四次提取产物。
[0185] 将团粒再次再悬浮于250mL的0. 5M H2S04中并重复微波照射、离心和产物分离工 艺，以提供第五次提取产物。
[0186] 最后，将团粒再次再悬浮于250mL的0. 5M NaOH中并重复微波照射、离心和产物分 离工艺，以提供第六次提取产物。
[0187] 通过重量分析法来分析脂质提取物，通过DNS法分析碳水化合物提取物，并通过 BCA法分析蛋白质提取物。
[0188] 结果
[0189] 脂质提取物
[0190] 在每次提取之后未观察到脂质层。因此，收集每次提取的上清液并合并在一起，由 此增加提取物中脂质的总量。然而，使样品在室温下静置过夜之后，未观察到脂质层。相当 大量的生物质漂浮在样品中，并且推测这使得不太可能观察到所提取的脂质。因此，从样品 的顶层收集100mL样品，并通过重量分析法对此物质进行脂质分析。
[0191] 所提取的脂质的不可见性也可能是由容器的形状所致。在常规烧杯中，很难在大 量水的顶部上辨识少量的油。因此，为了在不减少样品中的水量的情况下浓缩所提取的油， 使用了容量瓶。根据样品的体积，将可能含有脂质的提取物放入可观测的容量瓶中。静置 过夜之后，少量的油显示在瓶壁上（图13)。
[0192] 碳水化合物和蛋白质提取物
[0193] 较大规模的碳水化合物提取的结果与小规模提取相当（图14)。因此，碳水化合物 提取的按比例放大是成功的。然而，如图15中所示，在较大规模上蛋白质提取的效率类似 于小规模提取。
[0194] 实例3-不同批次干微藻生物质的提取
[0195] 材料
[0196] 微藻生物质是从南澳大利亚研发中心（SARDI)获得并且在60到80°C下烘箱干燥。
[0197] 设备
[0198] 微波提取是在麦顿的Start Synth微波合成试验站进行。
[0199] 程序
[0200] 将微藻粉（2. 5g)添加到50mL平底烧瓶中（一式两份）。添加0· 5M H2S04(25mL) 并混合样品，接着在室温下培育约1小时以使生物质再水合。测量样品的pH值，接着在微 波烘箱中，在以下条件下加工样品：
[0201] ?在1000瓦特微波功率下照射每一样品，直到样品温度升到100°C (对于25mL样 品体积，此通常花费约30秒）；
[0202] ?在200W微波功率输入下，使样品在100°C保持10分钟。
[0203] 接着，在水浴中冷却样品3到5分钟，之后将其转移到离心管中并以10, 000g离心 10分钟。
[0204] 接着将上清液转移到25mL量筒中以测量体积。将lmL上清液转移到1. 5mL离心 管中以进行碳水化合物和蛋白质分析。
[0205] 将第一次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0. 5M NaOH溶液中并且重复第一次 提取的工艺进行第二次提取。
[0206] 接着，将第二次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0. 5M NaOH溶液中并且重复第 一次提取的工艺进行第三次提取。
[0207] 接着，将第三次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0. 5M H2S04溶液中并且重复第 一次提取的工艺进行第四次提取。
[0208] 将第四次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0. 5M H2S04溶液中并且重复第一次 提取的工艺进行第五次提取。
[0209] 将第五次提取之后获得的团粒悬浮于25mL的0. 5M NaOH溶液中并且重复第一次 提取的工艺进行第六次提取。
[0210] 结果
[0211] 如表1中所示，pH值随在不同条件下进行的每一次提取而变化。第一次提取的pH 值为1.2。这是因为生物质是在强碱性条件下收集，并且所添加的酸部分被碱性生物质中 和。在第一次提取之后，通过添加0.5M NaOH溶液作为第二次和第三次提取缓冲液，pH值 升高到13。第四次和第五次提取是在酸性条件下，并且pH值降到约0. 7,显著低于第一次 提取的pH值。最后，通过添加0. 5M NaOH溶液将第六次提取的pH值增加到13. 6。
[0212] 每次提取之后所收集的上清液体积不同。在第一次提取之后，收集到22. 5mL上清 液。这比所添加的用于提取的提取缓冲液的体积少约2. 5mL。由于第一次提取是从干生物 质开始，故提取缓冲液的一部分将与团粒中的生物质整合。从第二次到第六次提取，上清液 的体积接近于所添加的体积。
[0213] 表1 一每一提取工艺的上清液的pH值和体积

【权利要求】
1. 一种用于从微藻生物质提取含脂质产物的方法，所述方法包括：（i)用微波辐射处 理包含微藻生物质的含水混合物，及（ii)从所述经过处理的微藻生物质回收含脂质产物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述微藻生物质是包含高达90 %的水的湿生物 质。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述微藻生物质包含以重量计约10%到约90%的 水。
4. 一种用于从微藻生物质提取含脂质产物和含碳水化合物产物的方法，所述方法 包括：（i)提供含有所述微藻生物质的含水混合物；（ii)将所述含水混合物的pH值调到 pH〈7 加热含有所述微藻生物质的所述含水混合物；及（iv)从所述生物质中分离出 所述含脂质产物和所述含碳水化合物产物。
5. -种用于从微藻生物质提取含脂质产物和含蛋白质产物的方法，所述方法包括： (i)提供含有所述微藻生物质的含水混合物；（ii)将所述含水混合物的pH值调到pH>7 ; (iii)加热含有所述微藻生物质的所述含水混合物；及（iv)从所述生物质中分离出所述含 脂质产物和所述含蛋白质产物。
6. -种用于从微藻生物质提取含脂质产物、含碳水化合物产物及含蛋白质产物的方 法，所述方法包括： (i) 提供含有所述微藻生物质的初始含水混合物； (ii) 将所述初始含水混合物的pH值调到pH〈7 ; (iii) 加热含有所述微藻生物质的所述酸性初始含水混合物以提供第一经过处理的混 合物； (iv) 从所述第一经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第一固体和含碳水化合物 的液体； (V)将所述第一固体与含水混合物组合以形成第二含有微藻生物质的含水混合物； (vi) 将所述第二含水混合物的pH值调到pH>7 ; (vii) 加热含有所述微藻生物质的所述碱性第二含水混合物以提供第二经过处理的混 合物； (viii) 从所述第二经过处理的混合物分离固体和液体，以提供第二固体和含蛋白质的 液体； (ix) 任选地，使用所述第二固体重复步骤（V)到（viii)，以提供第三固体和另外的含 蛋白质的液体； (X)将所述第二固体或所述第三固体与含水混合物组合，以形成最终的含水混合物； (xi) 用溶剂处理所述最终的含水混合物； (xii) 从所述最终含水混合物中分离所述溶剂，以提供含有脂质产物的溶剂。
7. 根据权利要求4或权利要求6所述的方法，其中在步骤（ii)中形成的所述混合物的 pH值在约0. 5到约2的范围内。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中在步骤（ii)中形成的所述混合物的pH值为约1。
9. 根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中在步骤（vi)中形成的所述混合物的 pH值在约11到约14的范围内。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中在步骤（iv)中形成的所述混合物的pH值为约 13。
11. 根据权利要求4到10中任一权利要求所述的方法，其中加热含有所述微藻生物质 的酸性或碱性含水混合物的步骤是通过用微波辐射处理所述混合物来进行。
12. 根据权利要求4到11中任一权利要求所述的方法，其中所述加热步骤中的任一个 或多个是在大气压下进行的。
13. 根据权利要求4到11中任一权利要求所述的方法，其中所述加热步骤中的任一个 或多个是在高于大气压的压力下进行的。
14. 一种由根据权利要求1到13中任一权利要求所述的方法制造的产物。
15. 根据权利要求1、权利要求4、权利要求5或权利要求6所述的方法，其实质上如前 文参考实例所描述。
【文档编号】C11B1/10GK104093823SQ201280062416
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年10月19日 优先权日:2011年10月20日
【发明者】张卫, 宿鹏 申请人:南澳佛林德斯大学