皮肤活性因子类柔性纳米脂质体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种皮肤活性因子类柔性纳米脂质体及其制备方法和应用。本发明的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成：1-1000份中性磷脂、1-1000份胆固醇、0.5-500份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和0.5-500份皮肤活性因子类成分。本发明的皮肤活性因子类活性成分柔性纳米脂质体，可以显著提高皮肤活性因子类成分的稳定性，促进这些活性成分的透皮吸收并提高其作用效率，还能提高活性成分在皮肤表面和皮肤深层的滞留和作用时间；冻干粉末状态的皮肤活性因子类柔性纳米脂质体还利于使用、运输和贮存；本发明的柔性纳米脂质体的制备方法均可采用机械化方法，产品工艺和质量的稳定性好、重现性高。
【专利说明】皮肤活性因子类柔性纳米脂质体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种柔性纳米脂质体及其制备方法及用途，特别的涉及一种皮肤活性因子类柔性纳米脂质体及其制备方法，以及该柔性纳米脂质体在化妆品方面的应用。
【背景技术】
[0002]随着对于皮肤生理病理的认识越来越清楚，越来越多的具有生物活性的动植物成分和/或生物高分子成分应用到化妆品行业，取得了巨大的社会和经济效益。但是，将这些具有生物活性的物质应用到化妆品中，需要解决以下几个问题:
[0003]1、这些生物活性物质的稳定性如何解决，这类物质的稳定性除了由其结构和空间构象决定外，外界环境因素的影响也不容小视，例如表皮活性因子溶液，在外界环境中的活性持续时间仅有短短的数小时，在其被皮肤吸收发挥作用之前就基本失活了，根本不能发挥其应有的作用和效果；
[0004]2、如何使这些高分子成分能够被人体皮肤吸收，通常来说，活性物分子量越小，越容易透过皮肤，一旦分子量大于600，活性物就很难被皮肤吸收了，而近年来应用的具有特定皮肤活性功能的物质大多数是肽类等高分子物质，其分子量少则数千，多则数十万，这就决定了它们很难透过皮肤从而被有效吸收；
[0005]3、为了满足皮肤生理活动的多方面需求，通常的化妆品中活性成分的种类少则几种，多则达到数十种，活性成分之间的理化反应限制了化妆品处方筛选的范围。为了解决这些问题，新的药物制剂技术越来越多地被应用到化妆品行业，目前，解决活性物稳定性和相容性主要采取加入稳定剂、冷冻干燥、制备成乳剂、用环糊精、微囊(球)、脂质体进行包裹等方法；而促进皮肤吸收则采用了以下一些方法:将药物本身的颗粒制备成纳米级、加入Azone等透皮促进剂、采用离子导入或电致孔、制备成具有促透性能的纳米级包裹体等。
[0006]将脂质体制备工艺应用到化妆品行业已有数十年的历史，大量的研究结果证明，将化妆品活性成分包裹到脂质体中，可以极大提高这些活性成分的稳定性，这些活性成分从脂质体中释放具有缓释性能，同时，由于脂质体膜成分与人体细胞生物膜的成分极其接近，因此这类制剂生物相容性好，安全性高。特别是二十世纪六十年代出现的柔性纳米脂质体，可以通过其自身的柔性和变形性，高效地穿透比自身直径小数倍的皮肤孔道从而达到良好的透皮吸收效果，柔性纳米脂质体不仅可以包裹小分子活性物，对于分子量高达IO6的生物大分子活性物质亦具有比较优良的皮肤透过性能，是化妆品制备中极具潜力的制备方法。另外，化妆品活性成分分别用脂质体包裹，可以有效避免这些成分可能存在的相互作用和理化反应，进一步提高了其稳定性和使用的安全性。
【发明内容】
[0007]本发明为了解决上述问题，提供一种透皮能力强且生物相容性好的柔性纳米脂质体制剂。
[0008]本发明提供一种皮肤活性因子类柔性纳米脂质体，能保证皮肤活性因子类在其的稳定性和使用安全性。
[0009]本发明提供了一种简单，且具有较高的包封率和载药量的皮肤活性因子类柔性纳米脂质体制备方法。
[0010]本发明提供了一种皮肤活性因子类柔性纳米脂质体在化妆品中的应用。
[0011]本发明的技术方案如下:
[0012]所述的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成:1-1000份中性磷脂、1-1000份胆固醇、0.5-500份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和0.5-500份皮肤活性因子类成分。
[0013]在本发明一较佳实施例中，本发明的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成:100-120份中性磷脂、15-100份胆固醇、10-100份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和
0.5-60份皮肤活性因子类成分。[0014]在本发明一更佳实施例中，本发明的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成:100-120份中性磷脂、15-20份胆固醇、10-20份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和30份皮肤活性因子类成分。
[0015]在本发明一较佳实施例中，本发明的柔性纳米脂质体其还包括占脂质体总重量
0.1-0.5%的抗氧化剂；优选地为0.2% ;所述的氧化剂选自维生素C、维生素E、丁基羟基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、茶多酚、愈创树脂、芝麻酚或者波尔定碱中的一种或多种。
[0016]在本发明一较佳实施例中，本发明还包括相当于所述的脂质体总重量2-8倍的冷冻保护剂；所述的冷冻保护剂选自甘油、乳糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖或者海藻糖的一种或多种。
[0017]优选地，所述的冻干保护剂:脂质体的重量比在3:1至6:1。
[0018]在本发明一较佳实施例中，所述的柔性纳米脂质体的粒径范围50_200nm。
[0019]在本发明一较佳实施例中,所述的中性磷脂选自大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二肉豆蘧酸磷脂酰胆碱、二月桂酸磷脂酰胆碱或者二棕榈酸磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；所述的表面活性剂是胆酸钠或去氧胆酸钠。
[0020]优选地，中性磷脂为大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的一种或多种。
[0021]本发明胆固醇的使用是为了调节脂质体膜的流动性和通透性，进而调整脂质体膜的稳定性。
[0022]本发明使用的表面活性剂，可以使脂质体膜具有更大的弹性与变形性，从而促进脂质体的透皮吸收性能。优选胆酸钠或去氧胆酸钠。
[0023]本发明的柔性纳米脂质体中的抗氧化剂的使用，以防止其在常温条件下贮存时被氧化。所述的氧化剂选自维生素C、维生素E、丁基羟基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、茶多酚、愈创树脂、芝麻酚或者波尔定碱中的一种或多种。优选维生素E和丁基羟基茴香醚(BHA)组成的混合抗氧化剂。
[0024]在本发明脂质成分与所包裹活性成分的重量比，对脂质体的稳定性、包封率及载药量有较大影响，适宜的脂质成分与所包裹活性成分的重量比在2:1至5:1 ;冻干保护剂与脂质体的重量比，对最终产品的载药量亦有较大影响，适宜的比例范围是冻干保护剂:脂质体 3:1 至 6:1。
[0025]在本发明一较佳实施例中，所述的皮肤活性因子类选自表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、胰岛素生长因子(IGF-1)、碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)或者酸性纤维原细胞生长因子(aFGF)的一种或多种。
[0026]本发明提供了脂质体混悬液中，脂质体包裹的活性成分与游离的活性成分分离的低温超速离心法，还可以采用透析方法、柱层析法等分离脂质体与游离成分。
[0027]本发明柔性纳米脂质体的制备方法，所述方法采用薄膜分散-超声-均质-挤出-冻干法，其包括如下步骤:
[0028]I)将所述比例的中性磷脂、胆固醇在10_50°C水浴条件下溶解于挥发性有机溶剂中；
[0029]2)将步骤I)旋转蒸发，得到均匀的脂质膜；
[0030]3)将所述比例的表面活性剂、皮肤活性因子、冷冻干燥保护剂在10-50°C水浴条件下溶解于PH=7.0的磷酸缓冲溶液中；
[0031]4)将步骤3)加入2)进行超声混合，得到脂质体混悬液，并超声破碎60-90次后，5000PS1-10000PSI均质，最后通过挤出仪过滤膜；
[0032]5)将步骤4)得到的混悬液，采用低温超速离心法分离脂质体包裹的活性成分和游离在磷酸缓冲液中的活性成分；
[0033]6)在步骤5)得到的脂质体混悬液于-50至-100°C预冻12小时以上，再置于冷冻干燥机冻干，得到冻干柔性纳米脂质体粉末。
[0034]优选地，所述步骤I中加入占脂质体总重量0.1-0.5%的复合抗氧化剂的脂溶性成分。
[0035]本发明的另一方面，一种柔性纳米脂质体在制备皮肤活性因子类化妆品活性成分方面的应用
[0036]本发明的积极进步效果在于:本发明制备的柔性纳米脂质体粒径在50_200nm之间，保证了所包裹的活性成分具有更好的稳定性和皮肤吸收效果。而本发明采用的薄膜分散-超声-均质-挤出-冻干法，产品制备方法简单、且具有较高的包封率和载药量；整个工艺过程均由机械手段完成，使产品工艺和质量具有较好的稳定性和重现性。本发明最终的产品为流动性良好的粉末，便于使用、运输和贮存。
【具体实施方式】:
[0037]实施例1
[0038]将120mg氢化大豆卵磷脂、IOmg胆固醇水浴超声溶于乙醚中，将0.25mg维生素E与BHA混合抗氧化剂溶于少量乙醇中，再与乙醚液混合，置于旋转蒸发仪上旋转蒸发成膜；将1000Π表皮活性因子(EGF)和1000Π角质细胞活性因子(KGF)、15mg胆酸钠、1.7mg透明质酸、500mg乳糖溶于pH7.0的磷酸缓冲液中；将前述的磷酸缓冲液加入脂质膜，置旋涡式振荡仪振荡得初步的脂质体混悬液；将脂质体混悬液用探针式超声细胞破碎仪超声90个循环(每循环超声5秒，间歇5秒，冰浴)后，用AVESTIN高压均质机均质3次，再通过AVESTIN挤出仪过IOOnm的微孔滤膜10次，将挤出的脂质体混悬液于4°C 100000转/min离心3小时；弃去上液，得到的脂质体混悬液-80°C预冻12小时后，放置于冷冻干燥机冷冻干燥成粉末状。
[0039]所得到的EGF和KGF混合物柔性纳米脂质体的粒径和Zeta电位经Zitasizer(Nano ZS,Malvern)纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta电位分别为97.4±18.7nm、70.0±8.2mV ;采用超速离心法分离测得产品的包封率为28.34%。
[0040]实施例2
[0041]将IOOmg大豆卵磷脂、50mg胆固醇水浴超声溶于氯仿中，将0.26mg维生素E与BHA混合抗氧化剂溶于少量乙醇中，再与氯仿液混合；将2000瓜表皮活性因子(EGF)UOmg胆酸钠、1.5mg透明质酸、400mg甘露醇溶于pH7.0的磷酸缓冲液中；将前述的磷酸缓冲液与氯仿溶液在水浴中超声成均匀乳浊液，静置30分钟后，旋转蒸发得脂质体混悬液；将脂质体混悬液用探针式超声细胞破碎仪超声60个循环(每循环超声5秒，间歇5秒，冰浴)后，用AVESTIN高压均质机均质3次，再通过AVESTIN挤出仪过IOOnm的微孔滤膜10次，挤出的脂质体混悬液放入透析袋(分子截留量8000-14000)中透析6小时；取透析袋中的脂质体混悬液，于_80°C预冻12小时后,放置于冷冻干燥机冷冻干燥成粉末状。
[0042]所得到的表皮活性因子柔性纳米脂质体的粒径和Zeta电位经Zitasizer (NanoZS, Malvern)纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta电位分别为113.5±16.7nm、70.2±7.5mV ;采用透析法分离测得产品的包封率为30.44%。
[0043]实施例3
[0044]将IOmg 二棕榈酰 磷脂酰胆碱、Img胆固醇溶于乙醚中，将0.25mg维生素E与BHA混合抗氧化剂溶于少量乙醇中，再与乙醚液混合；混合液于旋转蒸发仪上蒸干形成薄膜；将0.1mg表皮生长因子(EGF)、0.25mg胆酸钠、0.2mg透明质酸、50mg乳糖溶于ρΗ7.0的磷酸缓冲液中；将前述的磷酸缓冲液加入脂质膜，置旋涡式振荡仪振荡得脂质体混悬液；将脂质体混悬液用探针式超声细胞破碎仪超声90个循环(每循环超声5秒，间歇5秒，冰浴)后，用AVESTIN高压均质机均质3次，再通过AVESTIN挤出仪过IOOnm的微孔滤膜10次；将挤出的脂质体混悬液于4°C 100000转/min离心6小时；弃去上液,得到的脂质体混悬液于_80°C预冻12小时后，放置于冷冻干燥机冷冻干燥成粉末状。
[0045]所得到的EGF柔性纳米脂质体的粒径和Zeta电位经Zitasizer (Nano ZS,Malvern)纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta电位分别为54.2±8.3nm、74.1±11.8mV ;采用超速离心法分离测得产品的包封率为39.88%。
[0046]实施例4
[0047]将500mg氢化大豆卵磷脂、200mg胆固醇水浴超声溶于乙醚中，将L 8mg维生素E与BHA混合抗氧化剂溶于少量乙醇中，再与氯仿液混合，混合液旋转蒸发成膜；将120mg表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、胰岛素生长因子(IGF-1)、碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)、酸性纤维原细胞生长因子(aFGF)(质量比1:0.5:0.2:0.2:0.1)混合物、75mg去氧胆酸钠、8.5mg透明质酸、2.5g甘露醇溶于pH7.0的磷酸缓冲液中；将前述的磷酸缓冲液加入脂质膜，置旋涡式振荡仪振荡得脂质体混悬液；将脂质体混悬液用探针式超声细胞破碎仪超声90个循环(每循环超声5秒，间歇5秒，冰浴)后，用AVESTIN高压均质机均质3次，再通过AVESTIN挤出仪过IOOnm的微孔滤膜10次；将挤出的脂质体混悬液于40C 100000转/min离心5小时；弃去上液，得到的脂质体混悬液于_80°C预冻12小时后，放置于冷冻干燥机冷冻干燥成粉末状 。
[0048]所得到的柔性纳米脂质体的粒径和Zeta电位经Zitasizer (Nano ZS, Malvern)纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta电位分别为168.2±21.9nm、54.6±8.7mV。
[0049]实施例5
[0050]将IOOmg大豆磷脂、50mg胆固醇溶于乙醚中，将0.25mg维生素E与BHA混合抗氧化剂溶于少量乙醇中，再与氯仿液混合；混合液于旋转蒸发仪上蒸干形成薄膜；将IOmg角质细胞生长因子(KGF)、1.6mg胆酸钠、1.7mg透明质酸、400mg甘露醇溶于ρΗ7.0的磷酸缓冲液中；将前述的磷酸缓冲液加入脂质膜，置旋涡式振荡仪振荡得脂质体混悬液；将脂质体混悬液用探针式超声细胞破碎仪超声80个循环(每循环超声5秒，间歇5秒，冰浴)后，用AVESTIN高压均质机均质3次，再通过AVESTIN挤出仪过IOOnm的微孔滤膜10次；将挤出的脂质体混悬液于4°C 100000转/min离心4小时；弃去上液，得到的脂质体混悬液，于_80°C预冻12小时后，放置于冷冻干燥机冷冻干燥成粉末状。
[0051 ] 所得到的KGF柔性纳米脂质体的粒径和Zeta电位经Zitasizer (Nano ZS,Malvern)纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta电位分别为166.7土 18.5nm、54.1 ±13.8mV ;采用超速离心法分离测得产品的包封率为27.7%。
[0052]上述实施例中，中性磷脂由日油株式会社提供，胆固醇、去氧胆酸钠以及胆酸钠由天津市大茂化学试剂厂生产，透明质酸由山东福瑞达生物医药有限公司生产，甘露醇和乳糖由上海实验试剂有限公司生产，BHA由上海QIGANG Pd生产，维生素E为美国Sigma产品，磷酸缓冲液根据中国药典自配，其余试剂均为市售产品，除有机溶剂外均符合食品或药用标准。
[0053]效果实施例1形态学
[0054]将EGF柔性纳米脂质体混悬液，磷钨酸负染，透射电镜下观察形态，见图1。图1EGF柔性纳米脂质体电镜图。
[0055]由图1中可以看出，所制备的脂质体为类圆形，大小较为均一，粒径< 200nm，脂质体膜具有“指纹”特征，确证了方法制备脂质体是成功的。
[0056]效果实施例2稳定性
[0057]取3批EGF柔性纳米脂质体及冻干EGF柔性纳米脂质体粉末，分别置于室温、4°C条件下，于Om和3m测定其包封率、pH、粒径和Zeta电位,并观察外观，以确定其稳定性。见表1。
[0058]表1脂质体混悬液及冻干脂质体分别放置3个月后其稳定性结果
[0059]
【权利要求】
1.一种皮肤活性因子类柔性纳米脂质体，其特征在于:所述的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成:1-1000份中性磷脂、1-1000份胆固醇、0.5-500份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和0.5-500份皮肤活性因子类成分。
2.根据权利要求1所述的柔性纳米脂质体，其特征在于:其包括下列重量份的组分所制成:100-120份中性磷脂、15-100份胆固醇、10-100份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和0.5-60份皮肤活性因子类成分。
3.根据权利要求1所述的柔性纳米脂质体，其特征在于:其包括下列重量份的组分所制成:100-120份中性磷脂、15-20份胆固醇、10-20份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和30份皮肤活性因子类成分。
4.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于:其还包括占脂质体总重量0.1-0.5%的抗氧化剂，优选地为0.2%;所述的氧化剂选自维生素C、维生素E、丁基羟基茴香醚(BHA)、2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、茶多酚、愈创树脂、芝麻酚或者波尔定碱中的一种或多种。
5.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于:其还包括相当于所述的脂质体总重量2-8倍的冷冻保护剂；所述的冷冻保护剂选自甘油、乳糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖或者海藻糖的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的柔性纳米脂质体，其特征在于:所述的冻干保护剂:脂质体的重量比在3:1至6:1。
7.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于:所述的柔性纳米脂质体的粒径范围为50-200nm。
8.根据权利要求1-3所·述的柔性纳米脂质体，其特征在于:所述的中性磷脂选自大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二肉豆蘧酸磷脂酰胆碱、二月桂酸磷脂酰胆碱或者二棕榈酸磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；所述的表面活性剂是胆酸钠或去氧胆酸钠。
9.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于:所述的皮肤活性因子类选自表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、胰岛素生长因子(IGF-1)、碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)或者酸性纤维原细胞生长因子(aFGF)的一种或多种。
10.一种根据权利要求5所述的柔性纳米脂质体的制备方法，其特征在于:所述方法采用薄膜分散-超声-均质-挤出-冻干法，其包括如下步骤: 1)将所述比例的中性磷脂、胆固醇在10_50°C水浴条件下溶解于挥发性有机溶剂中； 2)将步骤I)旋转蒸发，得到均匀的脂质膜； 3)将所述比例的表面活性剂、皮肤活性因子和冷冻干燥保护剂在10-50°C水浴条件下溶解于PH=7.0的磷酸缓冲溶液中； 4)将步骤3)加入2)进行超声混合，得到脂质体混悬液，并超声破碎60-90次后，5000PS1-10000PSI均质，最后通过挤出仪过滤膜； 5)将步骤4)得到的混悬液，采用低温超速离心法分离脂质体包裹的活性成分和游离在磷酸缓冲液中的活性成分； 6)在步骤5)得到的脂质体混悬液于-50至-100°C预冻12小时以上，再置于冷冻干燥机冻干，得到冻干柔性纳米脂质体粉末。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于:所述步骤I中加入占脂质体总重量0.1-0.5%的复合抗氧化剂的脂溶性成分。
12.一种根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体在制备皮肤活性因子类化妆品活性成分方面的应用。·
【文档编号】A61Q19/00GK103520007SQ201310479332
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】江妍 申请人:天博医药技术（苏州）有限公司