索拉胶在抑制紫外线对皮肤损伤中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种索拉胶在抑制紫外线对皮肤损伤中的应用。本发明涉及不同质量浓度的索拉胶溶液在保护对紫外线UVA导致的皮肤损伤中的用途，本发明所采用的细胞模型为紫外线UVA所诱导的细胞损伤模型，索拉胶的给药量为0.625μg/μl～5μg/μl，本发明所采用的小鼠模型为紫外线UVA所诱导的小鼠皮肤损伤模型，索拉胶的给药量为200μl的1%的溶液，索拉胶能提高细胞在紫外照射下的细胞存活率，降低小鼠皮肤中的炎症因子和提高合成胶原蛋白的基因表达，从而抑制由紫外线UVA导致的皮肤损伤。本发明经细胞和动物实验证明索拉胶具有显著的抑制紫外线UVA对皮肤损伤的作用，故索拉胶可用于紫外线UVA对皮肤损伤的预防与修复过程，可制备抗紫外线辐射损伤药物和抗紫外辐射化妆品。
【专利说明】索拉胶在抑制紫外线对皮肤损伤中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药、化妆品【技术领域】，本发明涉及一种索拉胶在抑制紫外线对皮肤损伤中的应用。
【背景技术】
[0002]紫外线是电磁波谱中波长从IOnm到400nm辐射的总称，依据紫外线自身波长的不同，主要将紫外线分为三个区域，即短波紫外线(UVC)、中波紫外线(UVB)和长波紫外线(UVA)0紫外线对人体皮肤的渗透程度是不同的。长波紫外线可达到真皮深处，引起皮肤黑色素沉着，使皮肤晒黑、脂质和胶原蛋白受损，长期积累，是导致皮肤老化和严重损害的主要原因。
[0003]目前，市场上的抗紫外线的防晒产品主要有物理性防晒品、化学性防晒品和物理化学相结 合的防晒品。物理防晒霜常用的是一些非常细的矿物质颗粒，如氧化锌、二氧化钛等，同时还会加入一些滑石粉和钙，形成一层保护膜，用来散射和吸收紫外线，其缺点是:必须涂得很厚，比较油腻，容易堵塞毛孔，并且在阳光下由于出汗溶化而影响美观。化学防晒是利用化学反应，替皮肤吸收阳光中的紫外线，化学防晒品用后效果自然，显得相对轻盈清透，这是化学防晒最大的优势，缺点是:化学防晒添加剂较多，其中的一些有效成分可能引起个别肌肤的过敏，且涂后半小时才发挥作用，长期使用对皮肤有一定的伤害。化学物理相结合的防晒品是融合了化学性和物理性两种防晒品的优势，用的比较普遍。
[0004]上世纪四十年代，图伦大学的Diluzio博士首次从酵母细胞壁中分离得到β -葡聚糖，β_葡聚糖就得到了广泛的关注。近年来，β_葡聚糖已经广泛应用于医药、食品、个人护理品、饲料等领域，如含有β_葡聚糖的功能性化妆品可以滋养皮肤，改善皮肤外观，并对各种皮肤病具有积极地疗效(Singh RP, Agarwal R.Cosmeceuticals and silibinin.Clin Dermatol, 2009，27:479-484.)。β -葡聚糖是一种天然的高聚糖,可在皮肤上形成一层透明、有弹性、透气的薄膜，能有效隔绝环境中有害物质对皮肤的侵害。
[0005]索拉胶是一种土壤杆菌Agrobacterium sp.ΖΧ09分泌产生的胞外多糖，结构为β-葡聚糖(中国专利，201010146371.2)。经过急性毒理学和慢性毒理学的评价，索拉胶无毒安全。
[0006]目前已发现索拉胶具有降低血糖(中国专利，201010146371.2)和降低肝脂、血脂、体脂、体重和胆固醇(中国专利，201010198223.5)以及预防和治疗便秘的作用，本发明为首次发现索拉胶对紫外线UVA造成的皮肤损伤具有一定的抑制和/或修复作用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是要提供一种索拉胶在抑制紫外线对皮肤损伤中的应用，该索拉胶具有使用方便、抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤的功能。
[0008]实现本发明目的的技术方案为:一种索拉胶在抑制紫外线对皮肤损伤中的应用，将索拉胶溶液直接涂抹与皮肤表面。[0009]所述的索拉胶溶液的质量浓度为0.5-1.5%。
[0010]所述的紫外线对皮肤的损伤是紫外线UVA所导致的。
[0011]所述的应用包括人在内的哺乳动物。
[0012]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0013]1.本发明方法中的索拉胶生产、提取方法简便，可直接溶于冷水，其溶液具有优异的抗紫外线功能，增加了皮肤对紫外线的耐受性。
[0014]2.索拉胶溶液可提高皮肤成纤维细胞在紫外线UVA下的存活率，动物实验中，与经紫外线UVA照射的正常小鼠比，涂抹索拉胶溶液的小鼠皮肤组织中的炎症细胞因子明显降低，合成胶原蛋白的相关基因明显提高，HE切片显示索拉胶明显减轻了紫外线UVA对皮肤的损伤。
[0015]3.索拉胶配成溶液后可直接涂抹于哺乳动物皮肤，索拉胶溶液在皮肤表面形成一层保护薄膜，可有效抵挡紫外线，可用于制备具有抑制紫外线对皮肤损伤的防晒系列的功倉泛广1(?。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是索拉胶提高NIH3T3小鼠成纤维细胞在紫外照射后的细胞存活率。
[0017]图2是索拉胶对紫外照射后小鼠皮肤炎症细胞因子表达的影响(A为TNF-α的mRNA表达，B为IL-1 β的 mRNA表达)。
[0018]图3是索拉胶对紫外照射后小鼠皮肤胶原蛋白基因表达的影响(A为Coll α I的mRNA表达，B为Col3 α I的mRNA表达)。
[0019]图4是索拉胶对紫外照射后小鼠皮肤形态变化的影响。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0021]实施例1索拉胶溶液的制备
[0022]索拉胶溶液的制备包括以下步骤:
[0023]I)索拉胶粗品采用改进后的Sevag法纯化。纯化步骤为:
[0024]a.配制0.5%的索拉胶溶液，加热(105°C，15min)，待冷却至室温时，7000r/10min,取上清，以除去残余菌体。
[0025]b.按1:30的比例加入pH4.0的乙酸乙酸钠溶液，以除去DNA。
[0026]c.按1:1的比例将上清与苯酚氯仿溶液(按1:1的比例配制成混合溶液)混合，剧烈振荡约15min,7000r/10min,取上清。重复此步骤2~3次，以彻底除去蛋白。
[0027]d.向上清液中加入2倍体积的工业酒精，糖絮凝成团状，捞出，挤去酒精。
[0028]e.用75%的酒精洗涤沉淀2~3次，再用95%的酒精洗涤沉淀I~2次。
[0029]f.真空冷冻干燥。
[0030]2)称取经步骤I)得到的30mg索拉胶，溶于30ml蒸馏水中，待完全溶解后，加入6%。的苯氧乙醇(防腐剂)，混合均匀后，进行常规灭菌后包装为独立小瓶，即为lwt%索拉胶溶液。用于细胞实验的索拉胶溶液无需添加防腐剂，且分装时要保证无菌操作。
[0031 ] 实施例2索拉胶对经紫外线UVA照射的细胞存活率研究[0032]实验细胞为NIH3T3小鼠成纤维细胞。在标准试验条件下培养:细胞使用含10%的小牛血清和1%的青链霉素的DMEM高糖培养基培养(完全培养基)，置于37°C，5%C02的生化培养箱中，每2~3天更换一次培养基。细胞使用含0.25%胰酶-EDTA的胰酶液消化、传代。
[0033]实验采用对细胞进行不同处理后，紫外线UVA照射导致细胞损伤，通过检测紫外线UVA照射后细胞的存活率，评价细胞损伤程度及索拉胶对细胞的保护程度。
[0034]NIH3T3小鼠成纤维细胞以2 X IO4密度种于96孔板中，设置分成6组，每组5个孔。实验分组情况为:CK, UVA，Salecan 组分为 0.625 μ g/μ 1、1.25 μ g/μ 1、2.5 μ g/μ 1、5 μ g/ μ I四个剂量组，其中CK为实验对照组，UVA组和Salecan四个剂量组。培养24小时后，弃去培养基，每孔均先加100 μ I的不含小牛血清的DMEM培养基，再按组处理，其中CK组和UVA组各加100 μ 1PBS, Salecan四个剂量组则各加100 μ I的0.125%,0.25%,0.5%和1%的索拉胶溶液，放入培养箱培养，3小时后，UVA组和Salecan组接受30min的紫外线UVA照射，辐射剂量为18J/cm2，福射距离为20cm。照射结束后，连同CK组，一起弃去培养基，更换为完全培养基。24小时后，用凯基MTT细胞增殖/毒性检测试剂盒进行细胞存活率检测。
[0035]实施例3索拉胶对紫外照射后小鼠皮肤模型的研究
[0036]实验动物为8周龄的雄性C57BL/6J小鼠。在标准实验条件下饲养:12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。将所有实验小鼠通过腹腔注射10%水合氯醛(4ml/kg)麻醉，待麻醉充分时，固定小鼠使其背部朝上。以背部脊椎为中间线，用剪刀将背部鼠毛剪去，大小约2 X 2cm。一周后，小鼠随机分成3组，分为CK组、UVA组、Salecan组，其中，CK组为正常对照组，UVA组为紫外线UVA照射组，这两组在实验过程中给予对应溶剂(即蒸馏水)处理；Salecan组为索拉胶溶液处理组，即在接受紫外线UVA照射前，涂抹200 μ I的索拉胶溶液，半小时后接受紫外照射，每4小时涂抹皮肤表面一次。UVA组和Salecan组接受6天共48h的紫外线UVA照射，辐射剂量为18J/cm2，辐射距离为20cm。最后一次照射24小时后，处死小鼠，取背部去毛区域的皮肤组织，用于评价皮肤损伤情况。
[0037]I)皮肤组织RNA的提取
[0038]取新鲜的背部皮肤组织约25mg,按照Invitrogen RNA提取试剂盒和M-MLV逆转录试剂盒的说明，提取RNA和逆转录cDNA。cDNA原液稀释20倍后用于RT-PCR反应，反应体系为20 μl:
[0039]
【权利要求】
1.索拉胶在抑制紫外线对皮肤损伤中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的紫外线对皮肤的损伤是紫外线UVA所导致的。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的索拉胶为质量浓度为0.5-1.5%的溶液。
4.根据权利要求1所述 的应用，其特征在于所述的应用包括人在内的哺乳动物。
【文档编号】A61Q17/04GK103735566SQ201310730754
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】张建法, 余晓红, 詹亦贝, 陈金苹, 周梦怡 申请人:南京理工大学