一种代代花提取物的新功能及用途
【专利摘要】本发明涉及一种代代花提取物的新功能及其用途，具体是代代花提取物中的橙皮苷、新橙皮苷等类黄酮物质能够促进细胞增殖，促进成纤维细胞IV型胶原mRNA地表达，抑制弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶活性，同时降低紫外线对细胞的伤害，降低活性氧水平，降低炎症因子分泌，从而对皮肤起到防辐射、抗老化的功能。借此功能，本发明提供了一种代代花提取物应用的新方向，即在护肤产品中的应用。
【专利说明】一种代代花提取物的新功能及用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及代代花提取物的一种新功能，具体是代代花提取物的防辐射，抗衰老 的新功能及其应用。
【背景技术】
[0002] 代代属芸香科柑桔属植物酸橙的变种，分布于我国南部各地，浙江、江苏、广东、贵 州等地有栽培。代代花味甘，味苦，性平，能疏肝理气，和胃止呕。其未成熟果皮中含有新橙 皮苷、柚皮苷、橙皮苷等黄酮类物质，挥发油中主要成分为柠檬烯、芳樟醇、脱氢芳樟醇、丁 子香酚等。
[0003] 目前对代代花的研宄主要是使用其含有的挥发油生产香料。代代花提取物作为香 料应用于烟草等领域中。同时，近几年的研宄报道，代代花提取物还具有减肥降脂的功效。 CN201110317409公开了代代花的水提取物或醇提取物在制备减肥降脂药物或制备具有脂 肪酶活性抑制作用的药物中的应用。而对其含有的橙皮苷、新橙皮苷等类黄酮物质的抗氧 化及UV保护功能的研宄较少。
[0004] 皮肤老化的过程是一个复杂的生物现象，分为自然老化和外源性老化（光老化）。 光老化主要是通过紫外线辐射和其他环境因素接触或是生活方式的原因产生的损害积累 [1-4]。皮肤老化表现为表皮和真皮细胞代谢率降低，皮肤萎缩[5]，表皮真皮交界处的褶皱 变的扁平。此外，胶原蛋白和弹性蛋白合成减少而导致的皮肤弹性减低也是皮肤老化的一 个方面。
[0005] 抽烟、酒精、环境污染、营养不良以及紫外（UV)暴露是引起皮肤损伤的重要因 素。UV作用于皮肤中的各种光敏物质，可诱导产生以OH-和脂质过氧化物为主的氧自由基 (ROS)，破坏皮肤自身的抗氧化体系，使抗氧化酶活性水平下降并造成脂质过氧化物堆积。 UV造成的氧化性应激还可引发一系列细胞内信号传导，通过核转录因子NF-κ B或转录因 子激活蛋白I(AP-I)激活下游MMP等基因的表达。AP-I在UV照射之后，含量明显增高，导 致了 MMP mRNA的含量和表达增加，特异性降解细胞外基质，出现光老化性皮损。同时，紫外 线可显著增加表皮细胞IL-Ia的表达，从而引起更多炎症因子如IL-6、IL_8、TNF-α的表 达，加速皮肤老化。
[0006] 本发明代代花提取物中的橙皮苷、新橙皮苷等类黄酮物质的防衰老及UV保护功 能的研宄，提供了防紫外、抗肌肤老化的新的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供代代花提取物的新功能即防辐射，抗衰老及其在 护肤品领域中的应用。
[0008] 本发明涉及代代花提取物的新功能。经实验发现，代代花提取物可显著降低紫外 线对细胞的伤害，促进细胞的增殖，同时促进成纤维细胞IV型胶原mRNA地表达，抑制弹性 蛋白酶活性。
[0009] 因此，代代花提取物可以应用于抗辐射，抗肌肤衰老的护肤品领域。所述护肤品代 代花提取物可以作为唯一活性成分，可也含有其他辅料及公知护肤成分。所述其他辅料及 公知护肤成分调和后为非酸性。
[0010] 同时，代代花提取物可作为添加剂或辅料制备具有抗衰老功效的的食品、饮料和 保健品等。
[0011] 本发明所用试剂盒原料均市售可得。
[0012] 本发明的有益效果为：本发明提供了代代花提取物防辐射，抗衰老的新功能，也提 供了其在护肤品领域中的应用，拓宽了其功能及应用范围，为肌肤防辐射和抗衰老提供了 新途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通 技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明 的限制。在附图中：
[0014] 图1代代花提取物促进细胞增殖示意图；
[0015] 图2代代花提取物促进细胞弹性蛋白表达示意图；
[0016] 图3代代花提取物抑制弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶活性活性示意图；
[0017] 图4代代花提取物降低炎症因子分泌示意图；
[0018] 图5代代花提取物降低环丁烷嘧啶二聚体（CPDs)形成示意图；
[0019] 图6代代花提取物降低活性氧产生示意图。
【具体实施方式】
[0020] 实验材料：
[0021] 细胞培养：细胞种类为人胚胎成纤维细胞（ESF)、永生化上皮细胞（Hacat细 胞）均购自北京协和细胞资源中心。培养条件为DMEM培养基（Gibco,美国），含10%的 FBS (Hyclone，澳大利亚）及1 %的抗细菌和真菌的抗生素（Invitrogen，美国），在37°C、C02 浓度为5 %的培养箱内培养。
[0022] 代代花提取物制备：代代花药材适当粉碎，称取20g置于密闭容器中，按I : 10比 例加60%乙醇200mL，超声提取lh，放置到室温，过滤，滤液50°C烘箱烘干，得到代代花提取 物干粉。提取物干粉称取适量提取物干粉，使用去离子水溶解，过滤备用。
[0023] 实施例1抗衰老实验
[0024] 1.促进细胞增殖
[0025] ESF细胞调整细胞浓度为4X 104/ml，接种于24孔板中，0. 5ml/孔，即2X IO4个/ well。细胞培养过夜待细胞贴壁后，换用含有1% FBS的培养基培养24h，细胞分为2组，即 control组（培养基无代代花提取物添加）、实验组（培养基添加不同浓度的代代花提取 物）。实验组代代花提取物添加浓度分别为：1〇 μ g/ml，50 μ g/ml，100 μ g/ml。72h后，除去 培养基，用DPBS洗一次，加入200ul含10%的CCK-8的新培养液，37°C温浴Ih左右，取上清 于96孔板中，使用酶标仪450nm波长检测上清液OD值。
[0026] 2.促进细胞弹性蛋白和Jj父原蛋白表达
[0027] 细胞培养：
[0028] ESF细胞分为2组，即control组（培养基无代代花提取物添加）、实验组（培养 基添加不同浓度的代代花提取物）。代代花提取物添加浓度为10 μ g/ml，20 μ g/ml，50 μ g/ ml 〇
[0029] RNA提取和QPCR实验
[0030] 实验组细胞被上述不同浓度代代花提取物处理24h后，control组细胞与实 验组细胞使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Germany)提取细胞总RNA，RNA含量使 用 nanodrop 2000 检测定量后，取 Iyg 作为模板，使用 SUPERSCRIPT III 1ST STRAND 50RT-PCR REACTIONS (Invitrogen，美国）进行反转录。反转录后，稀释cDNA浓度为IOng/ ul。Q-PCR 反应体系为 cDNA 模板 Iul，正反向引物各 0.5ul，Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI，美国）10ul，加水补至 20ul。弹性蛋白引物：GGTATCCCATCMGGCCCC(SEQ ID NO. 1)， TTTCCCTGTGGTGTAGGGCA(SEQIDN0·2);IV型胶原引物：CGCTTACAGCTTTTGGCTCG(SEQID NO. 3)，GACGGCGTAGGCTTCTTGAA(SEQ ID NO. 4)。
[0031] 3.对弹性蛋白酶（HLE)和基质金属蛋白酶（MMP-I)抑制实验
[0032] 代代花对弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶的抑制试验使用非细胞实验进行，代代花 提取物对弹性蛋白酶活性的抑制作用使用弹性蛋白酶活性检测试剂盒进行（Invitrogen， 美国），对基质金属蛋白酶MMP-I酶活性的抑制作用使用MMP-I检测试剂盒进行 (Invitrogen，美国）。代代花提取物浓度分别为：0· lmg/ml，0. 5mg/ml，lmg/ml。
[0033] 实施例2抗辐射实验
[0034] Hacat 细胞和 ESF 细胞以 4X104cells/well 接种于 12 孔板中，或 2xl05cells/well 接种于6孔板中，培养至细胞融合80%以上时准备进行UVB辐照处理。
[0035] L炎症因子IL-I a、IL-6及TNF-a含量检测
[0036] 细胞分为3组，即control组（无UVB处理，培养基无代代花提取物添加）、UVB组 (UVB处理，培养基无代代花提取物添加）、UVB+代代花组（UVB处理，培养基添加不同浓度 的代代花提取物）。UVB+代代花组代代花提取物浓度分别为：10 μ g/ml，50 μ g/ml，100 μ g/ ml 〇
[0037] 细胞接种24h后，细胞吸去培养基，加入PBS清洗细胞一次，除去PBS，放入紫外辐 照箱中进行UVB处理。UVB辐照源波长280-320nm，波峰为312nm。UVB处理Hacat细胞辐 照剂量为20mJ/cm 2,处理ESF细胞辐照剂量为60mJ/cm2。辐照处理完成后加入完全培养基 和代代花提取物培养24h，细胞培养上清液用于IL-I含量检测。
[0038] Hacat细胞经过UVB处理后培养上清液中的IL-I α含量使用人IL-I α / IL-IFlDuoSet ELISA试剂盒（R&D System，美国）进行检测，IL-6含量检测使用human IL-6DuoSet ELISA 试剂盒（R&D System，美国）进行，TNF-a 含量检测使用 human TNF-a DuoSet ELISA试剂盒（R&D System，美国）进行，方法同说明书。同时检测蛋白含量对结果 进行校正，蛋白含量测定使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，中国）进行检测。
[0039] 2. CPD 检测
[0040] Hacat细胞处理同上，使用代代花提取物浓度为10yg/ml，20yg/ml，50yg/ml。 使用UVB剂量为5mJ/cm 2。处理后细胞使用DNA提取试剂盒（QIAGEN，德国）进行总DNA提 取后，经过定量，调整DNA浓度为0. 2ng/ μ 1，加入事先使用鱼精蛋白硫酸盐（sigma，美国） 铺板的96孔酶标板上，使用ELISA方法进行CPD含量检测。所述(PD抗体为日本Cosmobio 公司产品，二抗为Invitrogen公司Biotin标记的兔抗小鼠IgG。
[0041] 3.活性氧（ROS)水平检测
[0042] Hacat细胞和ESF细胞经过UVB处理，方法同炎症因子检测。使用ROS检测试剂 盒（碧云天，中国）进行胞内活性氧（ROS)水平的检测。荧光信号使用荧光分析仪（Thermo Scientific，美国）进行，激发波长为485nm，发射波长为538nm。同时检测蛋白含量对结果 进行校正，蛋白含量测定使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，中国）进行检测。
[0043] 实验结果及分析
[0044] 1、抗衰老实验：如图1所示，代代花可促进ESF细胞增殖，促进作用与浓度呈正相 关（图1)。
[0045] 提取代代花处理后的E S F细胞总RNA进行QPCR，结果显示为代代花可促进弹性 蛋白的表达，并与浓度呈依赖关系（图2)。如图3所示，弹性蛋白是弹性蛋白酶（HLE)的主 要底物，抑制弹性蛋白酶活性可更好的保护弹性蛋白，可检测生物活性物质对弹性蛋白酶 的抑制作用。弹性蛋白被标记上荧光基团和淬灭基团，此时不发荧光。当弹性蛋白被弹性 蛋白酶降解后，淬灭基团解离，底物发出荧光，根据荧光强度可判断酶活性，加入酶活性抑 制剂即可判断抑制剂对酶活性的抑制强度。以不加抑制剂时无抑制率计算，在代代花提取 物浓度为lmg/ml时，对HLE的抑制率可达70%左右。MMP-I活性抑制的检测原理同HLE的 检测，代代花提取物对MMP-I活性也具有较强的抑制率，在lmg/ml浓度时达40%左右（图 3)
[0046] 2、抗辐射实验：
[0047] 如图4所示，UVR处理可引起Hacat细胞前炎症因子IL-I a、IL-6及TNF-a表达 增加，从而导致另一些炎症因子的活化，使用UVB处理Hacat细胞后，IL-I α表达显著增加， 使用代代花提取物处理后，IL-I a、IL-6及TNF-a表达明显降低（图4)。表明代代花提取 物可抑制由UVB引起的炎症反应对上皮细胞起保护作用。
[0048] 如图5所示，紫外线导致细胞DNA损伤形成的光产物主要有两种类型，即环丁 烷嘧啶二聚体（CPDs)和 6-4 光产物（6-4)PPs，其中 CPDs 约占 80 %。CPD(Cyclobutane Pyrimidine Dimer)是DNA分子中同一条链相邻的喃啶碱基形成以共价键连接成环丁烧结 构的二聚体，影响DNA的双螺旋结构，使复制和转录功能受阻。为检测代代花是否影响CPD 的产生，本实验使用5mJ/cm 2UVB处理Hacat细胞，结果显示UVB处理可显著增加Hacat细 胞(PD含量，加入代代花提取物，(PD含量显著降低（图5)。
[0049] 如图6所示，UV引起的细胞损伤大部分原因是由于活性氧的产生。为研宄代代花 对活性氧产生的影响，使用UVB对Hacat和ESF细胞进行照射处理，结果显示UVB可显著提 高Hacat和ESF细胞的ROS水平，使用代代花处理细胞，可降低UVB引起的ROS水平（图 6) 〇
[0050] 由于代代花提取物能有效防止ROS产生，因此其还可以应用作为添加剂或辅料在 制备功效为抗衰老的食品、饮料和保健品等。
[0051] 综上，代代花提取物能显著促进细胞增殖，促进成纤维细胞IV型胶原mRNA地表 达，抑制弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶活性，同时降低紫外线对细胞的伤害，降低活性氧水 平，降低炎症因子分泌，从而对皮肤起到防辐射、抗老化的功能。
[0052] 因代代花提取物具有上述的新功能，因此可以作为防晒和防皮肤衰老护肤产品的 有效成分，其即可作为护肤产品中唯一的有效成分，调配为水溶液，也可与现有的辅料、及 其它非酸性护肤成分融合调配，不局限于单一的产品形式，可以为面霜、护肤水、隔离霜、乳 液、面膜等。
[0053] 在上述实施例中，对本发明的最佳实施方式做了描述，很显然，在本发明的发明构 思下，仍可做出很多变化。在此，应该说明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将 落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1. 一种代代花提取物在制备护肤产品中的应用。
2. 代代花提取物在制备防辐射、抗衰老护肤产品中的应用。
3. 代代花提取物作为添加剂或辅料在制备功效为抗衰老的食品、饮料和保健品方面的 应用。
4. 如权利要求1-3所述的应用，代代花提取物的功能为防辐射，抗衰老，促进细胞增 殖，促进成纤维细胞IV型胶原mRNA地表达，抑制弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶活性，同时 降低紫外线对细胞的伤害，降低活性氧水平，降低炎症因子分泌。
5. 如权利要求1所述的应用，其应用于的护肤产品可为面霜、护肤水、隔离霜、乳液、面 膜。
【文档编号】A61Q19/08GK104434622SQ201410613299
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】党磊, 王小雪, 张美姿, 庞欣, 曹茜 申请人:航天神舟生物科技集团有限公司