用嵌段共聚物促使酶稳定的制作方法

专利名称：用嵌段共聚物促使酶稳定的制作方法
技术领域：
本发明涉及用非离子型的聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂促使酶稳定。
酶通常被配制成为某种特殊工业生产所设计的以水作溶剂的液相酶组合物。然而这种液相酶组合物一直受到诸如化学不稳定性等问题所困扰，这种化学不稳定性导致酶的失活，特别是在贮存过程中的失活。由于贮存而使酶失活这一尖锐问题已经特别地影响到液体清洗工业。
将诸如液相酶组合物这样的工业品在世界各地贮存在各种气候条件下的仓库里是很普遍的现象，这些酶长时间地经受着从零度到高于50℃的温度。在温度从0℃到50℃条件下贮存数月之后，大多数酶由于酶的不稳定性使酶组合物的活性损失了从20％到100％不等。
为了使包含在液相酶组合物中的酶稳定已采取了各种尝试。采用加入醇、甘油、二烷基甘油醚，以及这些化合物与其它化合物的混合物等方法来增加液相酶组合物的稳定性的尝试即使在温和的贮存温度范围内也仅得到了微不足道的成功。
在美国专利4,801,544中，Munk利用了一种乙二醇和乙氧基化的直线醇非离子型表面活性剂与碳氢化合物作溶剂的体系作为稳定剂，并描述了将酶与溶剂/表面活性剂混合后装入胶囊中。水份的含量少于5％，并测定了酶在35°、70°、100°F温度下的稳定性。
在美国专利4,548,727中，Shaer描述了采用一定的酯制成的水相酶的稳定化。作为稳定剂的酯的分子式为RCOOR1、R为H或C1-C3的烷基，R1为C1-C6的烷基。酯在水相酶制剂中的重量百分比为0.1-2.5％。按照该专利的报导，被使用的酶是一种商业化的，以粉末状、液体或膏剂形式出售的酶，其中包括有2％-80％的活性酶，载体是硫酸钠或钙、氯化钠、甘油、非离子型表面活性剂或含上述物质20％到98％的混合物。
Letton等在美国专利4,318,818中描述了一种水相酶组合物稳定体系，该体系含有钙离子和一种低分子量的羧酸或它的盐。稳定体系的PH值从约6.5到约10。
Guilbert等在美国专利4,243,543中描述了含有蛋白水解酶的液态清洗剂组合物的稳定化方法。这种清洗剂组合物通过加入抗氧化剂和一种亲水性的多元醇，同时稳定其PH值来进行稳定化。
Weber在美国专利4,169,817中描述了一种含有稳定化的酶的液体清洗剂组合物。这种组合物是一种水溶液，包含从10％到50％重量的固体和包含清洗剂组分、表面活性剂、从Bacillus Subtilus得到的酶和一种酶稳定剂。这种稳定剂由高水溶性的钠或钾盐和/或水溶性的羟基醇，从而使该溶液可长期贮存而不使酶失活。
Dorrit等在欧洲专利0,352,244 A2中描述了采用两性表面活性剂作为稳定化的液相清洗剂组合物。
Kaminsky等在美国专利4,305,837中描述了含有钙离子和一种低分子羧酸或盐和一种低分子醇作稳定体系的稳定化的水相酶组合物。这种稳定化的酶被用于清洗剂组合物。这种组合物可包括非离子型表面活性剂，其分子式为RA(CH2CH2O)nH，其中R为亲脂残基，A为带有活泼氢原子的一个基团，n代表乙氧残基部分的平均个数。R一般包含约8至约22个碳原子，但能够通过氧化丙烯与低分子量的化合物缩合而形成，而n通常为2-24。所用的低分子量的醇可以是C1-C3的一元醇或含2-6个羟基的多元C2-C6醇。Kaminsky等注意到多元醇能改善酶的稳定性，它们包括丙二醇、乙二醇和丙三醇。
Tai在美国专利4,404,115中描述了一种水相酶的液体清洗组合物，它包括作为酶稳定剂的碱金属五硼酸盐、任选地含有碱金属亚硫酸盐和/或多元醇。这种多元醇含有2-6个羟基，包括象1，2-二丙醇、乙二醇、赤藓醇、丙三醇、山梨糖醇、甘露糖醇、葡萄糖、果糖、乳糖等的物质。
Boskamp在美国专利4,462,922中也描述了一种水相酶清洗剂组合物，它具有一种稳定剂，它是硼酸或硼酸盐与多元醇或多功能团氨基化合物组成，这种氨基化合物中存在一种还原的碱金属盐。使用了与Kaminsky等专利中的基本相同的多元醇。
本发明的目的是提供一种能克服上述和其它缺点的稳定化酶和稳定化酶组合物的方法。本发明的优点在于提供了一种稳定化酶的方法以及稳定化的酶组合物。
本发明提供了一种新的方法和组合物，它们基本上克服了由相关文献中的方法和组合物所存在的局限和缺点所带来的上述或其它问题。
本发明另外的特点和优点将在下文给以描述。通过本发明的说明书和权利要求书所述的方法和组合物可理解到本发明的优点。
为了取得这些和其他优点并与本发明的目的相一致，正如所述，本发明提出了一种新的稳定酶的方法，使其免受高温和水的作用而使活性丧失，该方法包括将酶与一种稳定剂量的非离子型的聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂相组合。
当酶被稳定化，而不由于温度升高而失活，所选择的表面活性剂的浊点应高于这一温度。
在一个实施方案中，这种非离子型的聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂是一种聚亚氧烷基乙二醇醚全嵌段(all-block)、嵌段异型(block-heteric)、异型嵌段(heteric block)或者异一异嵌段(heteric-heteric block)共聚物，亚烷基单元具有2至约4个碳原子，特别是那些含有亲脂和亲水性片段的表面活性剂，每个这种片段至少是基于氧乙烯基团或氧丙烯基团或这些基团的混合物。
本发明也包括基于前面提到的酶和表面活性剂的组合物。
应该说明的是，前面的一般性叙述和下面的详细叙述均为示例性和解释性的，本发明在权利要求书中将得到进一步的解释。
本发明的目的是提出一种稳定酶的方法，使其免受由于升高温度或由水而引起失活。该方法是将酶与非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂相组合。
在过去几年中，工业和商业上，酶和液相酶组合物的使用得到迅速地发展。众所周知，酶可能是酸、碱或中性的，这依赖于它们活性范围的PH值。单独的脂酶或包含有脂酶的酶，即脂酶与下列的酶相组合均可使用。所有这些类型的酶与本发明相联系时均被视为有用。
许多酶和液相酶组合物已与液体清洗剂相联并已用作溶解和清洗配方。除了与液体清洗剂相关联外，酶和液相酶组合物在许多商业和工业领域同样也得到应用，在这些领域中有多种类型的酶已得到应用。
蛋白酶是一种众所周知的酶种类，有多种工业用途，它们水解蛋白质和含蛋白质的底物中的肽键。蛋白酶被用于帮助除去象血渍、蛋渍之类基于蛋白质的污渍。含有碱性蛋白酶的液相酶组合物也用作冷凝水塔和金属加工液池中细菌膜和藻类和真菌类薄层的分散剂。
蛋白酶根据其活性的PH值范围可被分为酸性、中性或碱性蛋白酶。酸性蛋白酶包括粗制微生物凝乳酶，凝乳酶，胃蛋白酶，和真菌酸性蛋白酶。中性蛋白酶包括胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶/无花果蛋白酶和细菌中性蛋白酶。碱性蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶相关的蛋白酶。商业上含蛋白酶的液相酶组合物可以下述商品名得到，RennilaseR，“PTN”(pancreatic Trypsin Novo)，“PEM”(Proteolytic Enzyme Mixture)，NeutraseR，Alcal-aseR，EsperaseR，和SavinaseTM，所有这些酶均为Novo NordiskBioindustrials，Inc of Danbury，CT提供。另一种商业蛋白酶的商品名为HT-Proteolytic，由Solvay酶产品公司提供。
另外一类酶是淀粉酶，同样已用于许多工业和商业过程中。在此它们用作催化或促进淀粉的水解。这类淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉葡萄苷酶、真菌淀粉酶和支链淀粉酶。包含有淀粉酶的商业液相酶组合物可以下述商业品名得到BAN，TermamylR，AMG，FungamylR，和PromozymeTM，这些产品由Novo Nordisk提供，和Diazyme L-200，一种Salvay酶产品公司的产品。
其他有商业价值的酶是能够水解纤维的酶。这些酶包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和葡聚糖酶。纤维素酶是降解纤维素的酶，纤维素是一种存在于植物细胞壁中的线型葡萄糖多聚物。半纤维素酶是水解半纤维素的酶，半纤维素象纤维素一样，是一种存在于植物中的多糖。果胶酶是降解果胶的酶。果胶的主成份为糖酸碳水化合物。β-葡聚糖酶用作水解β-葡聚糖，它也类似于纤维素，是一种线型葡萄糖聚合物。
纤维素酶包括内纤维酶，外纤维素酶，胞外生物水解酶，纤维二糖酶和半纤维素酶。商业上可得到的包含有纤维素酶的液相酶组合物的商品名有CelluclastR和NovozymR188，二者均由Novo Nordi-sk公司提供。
半纤维素酶包括木聚糖酶。PULPZYMR产品由Novo Nordisk公司生产，ECOPULPR产品由ALKO生物技术公司生产，这两种商业品液相酶组合物均以木聚糖酶作基酶。
作为一个类型，半纤维素酶包括半纤维素酶混合物和半乳甘露聚糖酶。含有半纤维素酶的商业上可得到的液相酶组合物有Novo生产的PULPZYMR，产于Alko生物技术公司的ECOPULPR和Novo Nordisk生产的NovozymR280和GamanaseTM。
可以使用的果胶酶包括endoplygalacturonase，exopoly-galacturonase，endopectate lyase(transeliminase)，exope-ctate lyase(transeliminase)，and endopectin lyase(trans-eliminase)。含果胶酶的商品液相酶组合物有PectinexTMUltra SP和PectinexTM*，二者均是Novo Nordisk的产品。
可使用的β-葡聚糖酶包括Lichenous，昆布多糖酶，和外葡聚糖酶(exoglucanase)。含β-葡聚糖酶的商品液相酶组合物有NovozymR234，CerefloR，BAN，FinizymR，和CeremixR，所有这些均为Novo Nordisk公司的产品。
除脂酶外，磷酸脂酶也可使用。脂酶和磷酸脂酶是酯酶，它通过攻击酯键来水解脂肪和油。脂酶作用于甘油三酯，而磷酸脂酶作用于磷酯。在工业领域，脂酶和磷酸脂酶代表商品化的酯酶。NovoNordisk公司的两个商品化的液体脂酶制剂商品各为ResinaseTMA和ResinaseTMA 2X。
含脂酶的商品化液相酶组合物是可得到的。例如，下列产品均可得到Lipoase 100，Greasex 50L，PalataseTMA，PalatalseTMM，和LipozymeTM，它们均是Novo Nordisk公司的产品。
另外的有商业价值的一类酶是异构化酶，它们催化有机化合物异构体之间的转化。产品SweetzymeTM是一种含葡萄糖异构酶的液相酶组合物，由Novo Nordisk公司生产。
氧化还原酶是催化化学氧化/还原反应的酶，通常分解和合成许多生物化合物。然而氧化还原酶还没有在工业上取得突出的位置，原因在于许多氧化还原酶需要辅助因子。而当这些辅助因子是酶的完整部分或不是必须提供时。氧化还原酶在商业上是有用的。
氧化还原酶中糖氧化酶和脂肪氧化酶能够得到使用。其它氧化还原酶可能已应用到甾类衍生物的酶法合成到诊断试验。这些氧化还原酶包括过氧化物酶、超氧岐化酶、醇氧化酶、聚酚氧化酶、黄嘌呤氧化酶、巯基氧化酶、羟化酶、胆甾氧化酶、漆酶、醇脱氢酶，和甾体脱氢酶。
在各种可得到的非离子型聚合醚-多元醇表面活性剂嵌段共聚物中，优选的物质含有聚亚氧烷基乙二醇醚，它们包含亲脂和亲水性的嵌段，每个嵌段最好是基于至少氧乙烯基团或氧丙烯基团或者这些基团的混合物。
得到这些表面活性剂最普通的方法是通过环氧乙烷与含至少一个活泼氢的亲脂性物质反应。可变换的方法包括将该亲脂化合物与预制的聚乙二醇反应或者使用2-氯乙醇代替环氧乙烷。
反应的亲脂化合物应至少含一个活泼氢，优选为醇，任选为酸、酰胺、硫醇、烷基酚等等。也可使用伯胺。
特别优选的非离子型表面活性剂是那些通过嵌段聚合技术而得到的。通过小心控制单体的加入和反应条件，能够制得一系列表面活性剂，其中，一些特点如亲水/亲脂平衡(HLB)，润湿和发泡能力可得到可以进行重复的严格控制。用于制成初始多聚嵌段的原料的化学性质通常决定表面活性剂的类型。初始的原料并不必须是亲脂性的，因为亲脂性可来源于两个多聚嵌段之一。形成第一个多聚嵌段的初始原料的化学性质通常确定了表面活性剂的类型。典型的起始原料包括单羟基醇，如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等和两个羟基的物质，如乙二醇、丙三醇，更高的多元醇，乙二胺等。
优选的各种类型的表面活性剂，且适合于本发明的表面活性剂在Schmolka著“非离子型表面活性剂”，Surfactant Science Ser-ies Vol.2，Schick，M.J.，Ed.Marcel Dekker，Inc.，New York，1967，第10章，引入本文作为参考。第一种和最简单的表面活性剂是每个嵌段是同系物，就是说在制备过程中每步加入的单体都是烯化氧。这种物质叫做全嵌段表面活性剂。第二类表面活性剂是杂嵌段和嵌段杂表面活性剂，其中，该分子的一部分(即，或亲脂或亲水)是由单一的烯化氧组成，而另一部分是由两种或更多种的这种物质组成，其中之一可以与该分子的同系嵌段部分的相同。在制备这种物质的过程中，分子中的杂部分将完全是无规律的。这些非离子化合物性质完全不同于纯嵌段表面活性剂。另外一类表面活性剂是在制备亲脂性部分和亲水性部分过程中都加入烯化氧的混合物，被命名杂-杂嵌段共聚物。
嵌段聚合物表面活性剂以单功能基团起始原料，如单羟基醇、酸、硫醇、仲胺或N-取代酰胺分类。这些物质通常可用下列分子式表示I-[Am-Bn]X这里的I是上述起始物分子。A部分是亲脂基团，含有一个烯化氧单元，其中至少一个氢己被烷基或芳基取代。m是聚合度，通常大于6。B部分是水溶性基团，如氧乙烯，n也为聚合度。X值是I的功能基个数。因此，如果I是单功能醇或胺，X就是1；如果I是多功能基起始物，如二元醇(例如丙二醇)X就是2，如PluronicR表面活性剂就是这种情况。如果I是四个功能基团的起始原料，如乙二胺，X将是4，TetronicR表面活性剂就是这种。优选的这类表面活性剂是聚合氧丙烯-聚合氧乙烯嵌段共聚物。
多功能基起始原料也可以用于制备同系嵌段表面活性剂。
在嵌段杂和杂嵌段材料中，A或B中之一是氧化物的混合物，其余的嵌段为同系嵌段。一种嵌段将是亲脂的，另一种将是亲水的。其两种聚合单元之一将作为水溶性单元，其特性将根据其应用不同而不同。多官能起始原料同样能用作这种类型的起始原料。
杂-杂嵌段共聚物基本上采取与前述讨论的相同方法制备，不同之处在于每步中烯化氧单体是两种或更多种原料的混合物。嵌段因此将是无规律的单体的共聚物，其可溶性特点由潜在的水溶性和非水溶性原料的相对比例而定。
本发明采用的聚亚氧烷基乙二醇醚嵌段共聚物的平均分子量从大约500到大约30,000，特别是从大约800到大约25,000，最好是从大约1,000到大约12,000。亲脂与亲水基团的重量比同样将从大约0.4∶1到2.5∶1之间变化，特别是从大约0.6∶1到大约1.8∶1，最好从大约0.8∶1到大约1.2∶1。
在一特别优选的实施方案中，这些表面活性剂一般分子式为RX(CH2CH2O)nH其中，嵌段共聚物的亲脂部分平均分子量从大约500到大约2,500，特别是从大约1,000到大约2,000，最好是从大约1,200到大约1,500，R通常是典型的表面活性剂亲脂性基团，但也可以是聚醚，如聚氧丙烯基或聚氧丙烯基和聚氧乙烯基团的混合物。在上述分子式中，X可以是氧或氮或另一种可连接聚氧乙烯链到亲脂性基团的功能团。多数情况下，n，代表亲水性基团中氧乙烯单元平均个数，必须大于5或6以满足充分的水溶性，这样才能使该材料具有使用价值。
该聚亚氧烷基乙二醇醚是优选的非离子聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂。然而，本发明中其它有用的非离子型嵌段共聚物表面活性剂可以是通过下列起始原料生成的改性的嵌段共聚物(a)醇类，(b)脂肪酸类，(c)烷基酚衍生物，(d)甘油和它的衍生物，(e)脂肪胺类，(f)-1，4-山梨聚糖和其衍生物，(g)蓖麻油和衍生物；和(h)甘醇衍生物。
浊点对大多数非离子型表面活性剂来说是最明显的特性之一，它依赖于本发明中在形成表面活性剂嵌段共聚物时反应的氧乙烯、氧丙烯和/或氧丁烯基的数量。浊点同样受本体系中溶液，表面活性剂的浓度，溶剂等其它因素的影响。浊点是由升温过程中非离子型表面活性剂溶液的浊度猛然上升来确定的。当非离子型表面活性剂溶解在水中时，理论上来说，随着温度的上升水分子的反应活性增加，由此引起非离子型表面活性剂中聚氧乙烯基团的醚氧原子的脱水反应。分子中氧乙烯基团所占比例越大，水合作用的能力越强，因而浊点越高。由于酶的长期稳定性是在50℃评价的，因此浊点对溶液中酶的稳定性是重要的。如果非离子型表面活性剂的浊点低于50℃，当溶液温度升高到该点时酶将发生水合作用，而表面活性剂已集结并且水溶性下降。
浊点同样被用于描述非离子型表面活性剂的特性，在此显示出水中相反的温度-溶解性相互关系，就是说随着溶液的温度升高，表面活性剂的水溶性降低。这种现象是由于分子中水和聚氧乙烯单元之间如氢键这样的特殊相互作用受到断裂所致。聚氧乙烯表面活性剂组分开始从溶液中沉淀出来的温度也被称为“浊点”。通常同类表面活性剂的浊点随着氧乙烯基团的平均数目的增加而增加。
非离子型聚合醚-多元醇表面活性剂嵌段共聚物和特别是本发明的聚亚氧烷基乙二醇醚表面活性剂聚合物的浊点高于酶或酶体系降解温度，浊点温度为从大约0℃到大约110℃，特别是从大约10℃到大约100℃，最好是从大约20℃到大约95℃。这些浊点是对于表面活性剂在水中含1％(重量)含量时的浊点。
虽然发明者不希望受到任何理论上的束缚，然而可以认为本发明中非离子型表面活性剂是通过提高配方中水的粘性来提高酶的稳定性的。通常高粘性将导致降低象蛋白酶这样的酶中向Ca++富集区域的转移或减慢离子的转移。虽然在本发明描述的某些情况下，较高的粘性可能对稳定性是不必要的，然而高粘性也有助于保持酶基质的完整性。
通常螯合剂降低酶的活性，降低酶分子的致密性和引起酶的变形。非离子表面活性剂不受静电效应的影响，即不受酶的带电基团的影响，从而不对酶的特殊结构产生影响。
根据本发明的可以使用的适当的聚亚氧烷基乙二醇醚嵌段共聚物含一个亲脂部分，它是一个单羟基脂肪醇的碳氢部分，含有1-约8个碳原子，该碳氢部分通过醚氧连键与氧乙烯和1，2-氧丙烯基团的杂混合链相连接，在亲脂物中氧乙烯基团与1，2-氧丙烯基团的重量比从大约5∶95到大约15∶85，亲脂物的平均分子量从大约1,000到大约2,000。亲水物连接在混合链上，由氧乙烯基组成。亲水物对亲脂物的重量比从大约0.8∶1到大约1.2∶1。该聚亚氧烷基乙二醇醚在Steele，Junior等的美国专利3,078,315中已做更深入地描述，引入本文作为参考。
优选的聚亚氧烷基乙二醇醚之一是商品Tergitol XD，是美国Union Carbide公司根据Steele，Jr.，等美国专利3,078,315的方法生产的。这是一种非离子型嵌段共聚物，浊点为1％水溶液时大约76℃，根据它的羟基数计算其分子量大约为3120。
其它可使用的非离子型聚亚氧烷基乙二醇醚嵌段共聚物，如由BASF Wyandotte Corporation生产的产品，包括PluronicR和Tetr-onicR。PluronicR和TetronicR多元醇表面活性剂从流动的液体到片状的固体，具有高环氧乙烷含量的那些产品在溶液中即使在100℃时也未显示已达到了其浊点。其它类似的可使用的非离子聚亚氧烷基乙二醇醚嵌段共聚物表面活性剂有例如Dow Chemical Company和Witco Chemical Corporation生产的产品。
根据本发明同样可以被使用的PluronicR表面活性剂是通过采用控制氧化丙烯加入到含两个羟基的丙二醇中合成所需分子量的亲脂物来制备。然后环氧乙烷加到亲脂物的两端来形成氧乙烯链，这种链的重量是最终分子重量的大约10％到大约80％。PluronicR表面活性剂的平均分子量从大约1,100到大约12,600，HLB(亲脂/亲水平衡)是大约1-7到大约18-23或大于约24。本发明所采用的Plur-onicRP-105平均分子量大约为6,500，溶点大约为35℃，浊点大约91℃和HLB大约12-18。同样本发明所采用的TetronicR表面活性剂是四功能基团嵌段共聚物，是通过在乙二胺上顺序加入氧化丙烯和随后的环氧乙烷而得到。这些表面活性剂的平均分子量从大约1,650到大约30,000，HLB从大约1-7到大约18-23和大于约24。本发明采用的TetronicR1304平均分子量大约10,500，熔点大约59℃，浊点高于100℃和HLB大于约24。
酶和表面活性剂用样可以与能与酶相容的有机溶剂相组合，并且这种溶剂同样将作为非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂的溶剂。优选的溶剂是亲水性的，如多元醇或多元醇混合物，其中该多元醇含2至约6个碳原子和2至约6个羟基，包括象1，2-丙二醇、乙二醇、赤藓醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、葡萄糖、果糖、乳糖等物质。
因此根据本发明的稳定化的酶组合物含酶的重量比从大约2％到大约95％，特别是占大约5％到大约90％，最理想的是占大约10％到大约80％，水占重量的大约1％到大约90％，特别是从重量的大约2％到大约85％，最好从重量的大约5％到大约80％，溶剂从重量的大约0％到大约70％，特别是从重量的大约2％到大约60％，最好是重量的大约3％到大约55％。非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂占重量的大约0.2％到大约40％特别是从重量的大约0.8％到大约30％，最好是从重量的大约1％到大约25％。
举例说明实施例1下面所列举的组合物由以下酶制得Pulpzyme HB，一种水相酶悬浮液，由Novo Nordisk生物工业公司生产，从细菌制备的木聚糖酶。前面所描述过的Tergitol XD同样可以使用。所使用的甘油纯度96％，杂质是水。更高纯度的甘油同样可以使用。甘油作为Ter-gitol XD的溶剂，Tergitol XD室温下是固体。此配方的粘性为2,200cps，使用Brookfield粘度计，型号LVT，在30rpm，纺锤数在室温(20℃)为4时测得。该配方易溶于水。酶活性，每毫升的IU，是采用Bailey，M.J.等发表在J.Biotech.23，257-270，1992上的方法测定的。该方法必需将木聚糖酶(适当地用pH为5.3的柠檬酸缓冲液稀释)与1％的桦木树木聚糖底物温育5分钟。温育之后，所释放的糖通过与原有的Sumner(1921)的DNS试剂反应5分钟后测定。在540nm下测定相对于含有底物、DNS试剂和缓冲液的空白反应液的吸光度。通过减去由底物和DNS试剂组成的酶空白液来校正酶读数，该酶空白液中加入了稀释的酶，并立即进行了显色/淬火，而没有进行温育。
组分重量百分数Pulpzyme HB 75甘油5Tergitol XD 20下面表1显示出此配方卓越的稳定性。酶的活性增加是在实验误差之内。
表1实施例1中酶的稳定性酶活性[IU/mL]*原始样品 室温8℃ 50℃9170 91309820 10900*在所示条件下贮存30天后实施例2采用Pulpzyme HB，而Tergitol XD则由BASF Wyandotte公司生产的非离子型嵌段共聚物PluronicRP-105R代替，重复实施例1。这种共聚物的浊点是91℃(1％的水溶液)和94℃(10％水溶液)。此表面活性剂的平均分子量大约6,500。
在实验误差范围内，表2显示由于PluronicRP-105的功能与Tergitol XD相比有差别，与实施例1相比这种配方的稳定性下降。与没有加PluronicRP-105的酶相比，稳定性有所提高。在不加PluronicR105稳定剂情况下，酶在这些条件下将迅速失去其活性。
表2实施例2中酶的稳定性酶活性[IU/mL]*原始样品 室温8℃50℃8400 82808970 7370*在所示条件下贮存30天后。实施例3采用Solvay酶公司的蛋白酶，或Novo Nordisk生物工业公司的脂酶重复实施例1。结果列于表3。
表3组分 重量％HT-Proteolytic L-175R(蛋白酶) 70 100甘油(纯度96％以上) 20Tergitol XD 10活性(14天)在50℃45 24在室温(20℃)90 91组分 重量％Resinase A2XTM(脂酶) 85 85 85 85甘油(纯度96％以上) 5-- 55Tergitol XD10 -- -- --水 -- 15 -- --PluronicRP 105-- -- 10 --Tetronic 1304R-- -- -- 10BASF Uyandotte公司活性(30天)50℃ 0.0490.0330.0470.0553室温(20℃) 0.0480.0670.0540.0472对熟悉本专业的人员来说，在没有脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的方法和组合物进行变化，这些变化或改变包含在本发明的范围内，只要他们进入本发明的权利要求的范围内。
权利要求
1.一种稳定酶使其免受由于升高温度或由水引起的活性丧失的方法，该方法是将所说酶与稳定剂量的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂相组合。
2.如权利要求1的方法，其中所说的酶由所说的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂所稳定，使其免遭由于温度升高而分解，该表面活性剂具有高于所说温度的浊点。
3.如权利要求2的方法，其中所说的温度是从大约0℃到大约100℃。
4.如权利要求1的方法，其中所说的酶是一种与水组合的酶的体系，所说的酶由所说的非离子聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂所稳定，使其免遭水的分解，此表面活性剂提高所说体系中水的粘度。
5.如权利要求4的方法，其中存在的水量为所说的酶和水重量的1％到90％。
6.如权利要求2的方法，其中所说的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂溶解在与所说的酶相容的有机溶剂中。
7.如权利要求4的方法，其中所说的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂溶解在一种与所说的酶相容的有机溶剂中。
8.如权利要求6或7的方法，其中所说的溶剂是亲水性的。
9.如权利要求8的方法，其中所说的溶剂是多元醇或多元醇的混合物。
10.如权利要求9的方法，其中所说的多元醇具有2到约6个碳原子和2到约6个羟基。
11.如权利要求1的方法，其中所说的酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、脂酶、磷酸脂酶、葡萄糖异构酶、葡糖氧化酶和脂氧化酶。
12.如权利要求2，3或4中任一项的方法，其中所说的非离子聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂是一种聚亚氧烷基乙二醇醚全嵌段，嵌段-杂，杂-嵌段或杂-杂嵌段共聚物，这里所说的亚烷基单元有2到约4个碳原子。
13.如权利要求12的方法，其中所说的聚亚氧烷基乙二醇醚含亲脂基和亲水基，它们基于至少氧乙烯基团、氧丙烯基团或二者的混合物。
14.如权利要求13的方法，其中所说的聚亚氧烷基乙二醇醚的平均分子量为约500到约30,000，所说的聚亚氧烷基乙二醇醚的亲脂基对亲水基的重量比为从大约0.4∶1到大约2.5∶1，所说聚亚氧烷基乙二醇醚的浊点从大约0℃到大约100℃。
15.一种稳定酶免遭由升高温度或由水引起失活的酶组合物，其中所说组合物是一种酶与稳定剂量的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂相组合。
16.如权利要求15的组合物，其中所说的酶被所说的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂所稳定，使其免遭由升高温度引起的分解，该表面活性剂具有高于所说温度的浊点。
17.如权利要求16的组合物，其中所说的温度是从大约0℃到大约110℃。
18.如权利要求15的组合物，其中所说的酶是一个与水组合的酶体系，所说的酶被所说的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂所稳定，使其免遭水引起的分解，此表面活性剂提高所说体系中水的粘度。
19.如权利要求18的组合物，其中所说水的存在量占所说的酶和水总重量的大约1％到大约90％。
20.如权利要求16的组合物，其中所说的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂溶解在一种与所说酶相容的有机溶剂中。
21.如权利要求18的组合物，其中所说的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂溶解在一种与所说的酶相容的有机溶剂中。
22.如权利要求20或21的组合物，其中所说的溶剂是亲水性的。
23.如权利要求22的组合物，其中所说的溶剂是一种多元醇或多元醇混合物。
24.如权利要求23的组合物，其中所说的多元醇具有2到大约6个碳原子和2到大约6个羟基。
25.如权利要求15的组合物，其中所说的酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、脂酶、磷酸脂酶、葡糖异构酶、葡糖氧化酶和脂氧化酶。
26.如权利要求16、17或18的任何一项的组合物，其中所说的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂是一种聚亚氧烷基乙二醇醚全嵌段、嵌段-杂，杂-嵌段或杂-杂嵌共聚物，这里所说的亚烷基单元具有2到约4个碳原子。
27.如权利要求26的组合物，其中所说的聚亚氧烷基乙二醇醚含亲脂性的和亲水性的嵌段，每个嵌段至少含有氧乙烯基团，或氧丙烯基团或两者的混合物。
28.如权利要求27的组合物，其中所说的聚亚氧烷基乙二醇的平均分子量从大约500到大约30,000，所说的聚氧乙二醇醚的亲脂基/亲水基的重量比从大约0.4∶1到大约2.5∶1，所说的聚亚氧烷基醚的浊点从大约0℃到大约100℃。
29.如权利要求20的组合物，其中所说的聚合醚-多元醇嵌段共聚物是一种具有由含1到约8个碳原子的一元脂肪醇的碳氢部分组成的亲脂基，这里的碳氢部分通过醚氧链键，一个氧乙烯和1，2-氧丙烯基的混合杂链相连接，在亲脂基中氧乙烯基团与1，2-氧丙烯基团的重量比为大约5∶95到大约15∶85，亲脂基的平均分子量从大约1,000到大约2,000，和连接到混合链并且由氧乙烯基团组成的亲水基的聚亚氧烷基乙二醇醚嵌段共聚物，亲水基与亲脂基的重量比从大约0.8∶1到大约1.2∶1。
30.如权利要求29的组合物，其中任选地含有作为一种溶剂的多元醇，该多元醇含2到大约6个碳原子和2到大约6个羟基。
31.如权利要求30的组合物，其中所说的酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、脂酶、磷酸脂酶、葡糖异构酶、葡糖氧化酶和脂氧化酶。
32.如权利要求31的组合物，其中所说的溶剂是甘油和所说的酶是淀粉酶或蛋白酶或脂酶。
33.如权利要求20的组合物，其中所说的聚合醚-多元醇嵌段共聚物是一种聚亚氧烷基乙二醇醚嵌段共聚物，具有由一个丙二醇的氧化丙烯加合物组成的亲脂基，这里的丙二醇已通过醚氧连键，氧丙烯基团连接，和一个连接到亲脂基上的由氧乙烯基组成的亲水基，此表面活性剂的平均分子量从1,100到大约12,600，HLB从大约1-7到大于约24。
34.如权利要求33的组合物，其中任选地含有一种作为溶剂的多元醇，该多元醇含2到大约6个碳原子和2到大约6个羟基。
35.如权利要求34的组合物，其中所说的酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、脂酶、磷酸脂酶、葡糖异构酶、葡糖氧化酶和脂氧化酶。
36.如权利要求35的组合物，其中所说的溶剂是甘油和所说的酶是淀粉酶、蛋白酶、或脂酶。
37.如权利要求20的组合物，其中所说的聚合醚-多元醇嵌段共聚物是一种聚亚氧烷基乙二醇醚嵌段共聚物，具有由乙二胺的氧化丙烯加合物组成的亲脂基，这里的乙二胺已通过醚氧键、1，2-氧丙烯基团连接，和通过混合链连接和由氧乙烯基团组成的亲水基，此表面活性剂的平均分子量从大约1,650到大约30,000，HLB从大约1-7到大于约24。
38.如权利要求37的组合物，含有任选地含一种作为溶剂的多元醇，它含有2到约6个碳原子和2到约6个羟基。
39.如权利要求38的组合物，其中所说的酶是蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、脂酶、磷酸脂酶、葡糖异构酶、葡糖氧化酶和脂氧化酶。
40.如权利要求39的组合物，其中所说的溶剂是甘油和所说的酶是淀粉酶、蛋白酶或脂酶。
全文摘要
本发明描述一种稳定酶使其免遭由于升高温度或由水引起的分解的方法。该方法包括将酶与稳定剂量的非离子型聚合醚-多元醇嵌段共聚物表面活性剂相组合。也描述了基于酶和表面活性剂的稳定化组合物。
文档编号C11D3/38GK1136823SQ94194370
公开日1996年11月27日 申请日期1994年12月1日 优先权日1993年12月3日
发明者詹姆斯·C·李 申请人:巴科曼实验室国际公司