专利名称：一种用于皮肤护理的被修饰酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及被修饰酶、包含所说的被修饰酶和已知用于皮肤护理组合物中的诸成分的皮肤护理组合物、包含本发明的皮肤护理组合物的皮肤护理产品以及所说的被修饰酶用于提高酶的稳定性和/或降低酶的致敏能力的用途。
背景技术：
自古人就喜欢洗澡和淋浴。这到目前还没有变化。对于今天的大多数人，洗澡和淋浴是用于保持良好身体卫生并获得令人愉快的气味的日常生活一部分。某些人也把在早晨进行一次清爽的淋浴或洗澡作为重要而必需的精神体验，没有这项内容，这些人就无法清醒。
在消费市场上可以发现许多用于身体护理和保持良好身体卫生的产品，例如用于清洁和湿润身体所有部分的产品。一些这样的产品包含作为有效成分的被修饰酶。
用于皮肤护理的酶长期以来，已经知道，以蔬菜和水果(如黄瓜、番茄、胡萝卜、香蕉等)形式的酶处理皮肤具有有益的潜在作用。
然而，在20世纪70年代之前，尚未将酶引入商业皮肤护理产品，部分是因为关于酶的知识有限，而且还因为人们认为酶的稳定性不能令人满意，并在皮肤护理产品中具有一些不利的性质。例如，人们发现纤维素酶可以改变包含羧甲基纤维素的洗剂和乳膏的粘度；脂酶会导致包含脂肪酸酯的乳膏发生变化；发现蛋白酶会使蛋白质成分破坏并造成粘度降低。
此外，在那时，酶的高成本也阻碍了酶在这种个人护理产品中的应用。
人的皮肤人的皮肤是由几层组成的。最上层(表皮)含有纤维状蛋白质角蛋白，其功能是充当隔离环境的保护层。表皮的外层是由位于其下方的粒层中的细胞有组织地死亡而形成的。粒层中释放出许多酶，它们将死细胞物质转化成角蛋白。
真皮通过基膜与表皮连接，并通过循环系统将皮肤与身体其余部分连接起来。真皮具有血管、神经纤维和淋巴管，并包含主要是由胶原纤维以及有限量的弹性蛋白和网硬蛋白纤维组成的纤维状网络。
用于个人护理产品的被修饰酶如上所述，某些酶的稳定性不能令人满意，而且在某种条件下(取决于接触的方式)可能会引起免疫应答，通常是IgG和/或IgE应答。
今天一般都认识到，当多肽(如酶)与聚合分子偶联时，多肽的稳定性会得到提高，免疫应答会减少。
用于连接多肽和聚合分子的技术在本领域是熟知的。
最适合的商业技术之一早在20世纪70年代早期就已描述(美国专利no.4,179,337)。所说的专利涉及非免疫原性多肽，如与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶联的酶和肽激素。其中至少15％的多肽生理活性得到保持。
英国专利no.1,183,257(Crook等)描述了通过三嗪环将酶与多糖连接的化学。
另外，用于维持酶-聚合物结合物之酶促活性的技术在本领域也是已知的。
WO 93/15189(Veronese等)涉及一种通过将蛋白水解酶连接到大分子化的抑制剂上来保持经聚乙二醇修饰的蛋白水解酶活性的方法。该结合物旨在于医疗应用。
已经发现将多肽连接到聚合分子上通常会降低多肽活性或干扰多肽与其底物相互作用。EP 183 503(Beecham Group PLC)公开了上述概念的一种发展，即提供了结合物，所述结合物含有借助于可逆的连接基团而连接到至少一种水溶性聚合物上的药学上有用的蛋白质。
EP471,125(Kanebo)公开了包含通过三嗪环偶联到多糖上以提高耐热性和保存稳定性的亲本蛋白酶(芽孢杆菌蛋白酶Esperase)的皮肤护理产品。所利用的偶联技术在上述的英国专利no.1,183,257(Crook等)中有描述。
JP 3083908描述了一种皮肤化妆品材料，该材料中含有来自豚鼠肝脏的、用一种或多种水溶性物质(如PEG、淀粉、纤维素等)修饰过的转谷氨酰胺酶。这种修饰是通过激活聚合分子并将其偶联到所说的酶上而进行的。据称该组合物对皮肤比较温和。
基于现有技术的一般知识概述用于将一种或多种聚合分子偶联到多肽分子上的技术在本领域中是已知的。而且，已经知道这种修饰过的酶-聚合物结合物的免疫应答降低，稳定性提高。
发明概述本发明的目的是提供适合于在皮肤护理产品中使用的改进的被修饰酶结合物。
本发明的发明者发现当使用具有适合于皮肤护理的活性的被修饰酶时，对酶和聚合物分子必须有一定的要求，以获得提高的稳定性和降低的致敏能力，而同时仍保持了显著的残留酶促活性。
本发明的发明者发现与酶表面偶联的聚合分子的数目与重量必须与酶的重量和/或表面积平衡。而且，偶联聚合分子的位置也很重要。
本发明的第一个方面涉及一种被修饰酶，其中分子量为1-35kDa的4-70个聚合分子被共价偶联到分子量为15-100kDa的亲本酶的表面。
在亲本酶分子量为15-35kDa的情况下，4-20个共价偶联的聚合分子应该共价偶联到所说的亲本酶的表面上。
如果亲本酶的分子量在35-60kDa的范围内，则将7-40(优选地10-30)个聚合分子偶联到所说的亲本酶的表面上。
同样地，如果亲本酶具有60-80kDa的分子量，则将10-50(优选地13-40)个聚合分子偶联到所说的亲本酶的表面上。
将15-70(优选地18-60)个聚合分子偶联到具有80-100kDa分子量的亲本酶的表面上。
通常，聚合分子被偶联到酶表面上的氨基(-NH2)和N末端氨基上，然而，聚合分子也可以偶联到酶链中处于表面的氨基酸的羧基(-COOH)上。
优选的连接基团是赖氨酸残基和位于N末端的氨基。
羧酸连接基团可以是天冬氨酸或谷氨酸的羧酸基和C末端的COOH基团。
在本申请中，“连接基团”的数目是多肽链中赖氨酸残基的氨基数加上N末端氨基的数目。
本发明的亲本酶可以是水解酶，包括蛋白酶(尤其是枯草杆菌蛋白酶)、或脂酶，或氧化还原酶(包括漆酶和超氧化物歧化酶)。
本发明的第二个方面涉及包含本发明的被修饰酶以及用于皮肤护理产品的成分的皮肤护理组合物。
本发明的第三个方面涉及包含本发明皮肤护理组合物的皮肤护理产品。
与相应的皮肤护理产品(包含亲本酶)比较，本发明皮肤护理产品的稳定性有所提高，致敏能力有所降低。
术语“致敏能力降低”在本发明的上下文中是指“变应原性降低”，这指在吸入本发明的被修饰酶时，产生的、可导致变应性状态的IgE(在人类中，在特定的动物中是具有类似效果的分子)的量比相应的亲本酶降低。
在本发明的上下文中，“皮肤护理产品”包括所有的用于身体皮肤清洁、护理和/或美化的个人护理产品以及其它产品，如头发护理产品，这些产品在使用期间可能会与皮肤或呼吸系统接触。本发明也包括用于动物的相应产品。
按照本发明所涉及的皮肤护理产品的特定例子是肥皂、化妆品、护肤膏、护肤凝胶、护肤奶、洁肤洗液、清洁霜、清洁露、洁肤奶、冷霜、冷制皂、化妆基料(make-up base)、清洁乳、面膜、含锌化妆水、T区精华素(T zone essence)、润手香脂、香粉(essencepowder)、增白粉、皂粉、块皂、透明皂、唇膏、口红、营养素、粉底霜、搽脸粉、眼影粉、粉底、指甲油清洁剂、生发油、美发液、发乳、发用凝胶、滋发剂、头发定形制品、染发剂、头发着色剂、头皮滋润剂(scalp treatment)、香波、香膏、护发素、发胶、晒黑油(sun oil)、防晒品、剃须泡沫与凝胶、剃须膏、婴儿油、粉刺护理制品、止汗剂、驱虫剂、祛臭剂等。
变应原性评价可以通过吸入检验，并比较气管内施用亲本酶的效果与施用本发明相应的被修饰酶的效果来评价变应原性。
现有几种用于酶变应原性评价的体内动物模型。某些这样的模型为人类中的危险评价提供了合适的依据。适合的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。这些模型设法将呼吸性变应原表示为以前致敏的动物中所诱导的刺激反应的函数。按照这些模拟，将所宣称的变应原通过气管内引入动物。
豚鼠的一个适合品系(Dunkin Hartley品系)不会因变应性应答而产生IgE抗体，这一点与人类不同。然而，它们产生另一种类型的抗体IgG1A与IgG1B(参见，例如，Prentφ，ATLA，19，P.8-14，1991)，这些抗体造成了对所吸入的多肽(包括酶)产生变应原性应答。因此，当使用Dunkin Hartley动物模型时，IgG1A和IgG1B的相对量可以表示变应原性水平。
适合于气管内接触多肽和酶的大鼠品系是Brown Norway品系。Brown Norway大鼠产生IgE作为变应性应答。
BALB/C小鼠品系适合于确定由皮下注射引起的IgE应答。
在豚鼠和小鼠中评价呼吸性变应原的更多细节由Kimber等(1996)，基础与应用毒理学，33，P.1-10描述。
其它动物(如大鼠，兔子等)也可以用于类似研究中。
附图的简要描述
图1显示了在用修饰的PD498-SPEG、未修饰的PD498与甘氨酸-SPEG15,000免疫之后，BALB/C小鼠中特异性的抗PD498 IgE应答的动力学。
图2显示了气管内施用修饰的PD498-SPEG和未修饰的PD498的Dunkin Hartley豚鼠的IgG1水平。
图3显示了Dunkin Hartley豚鼠IT剂量应答研究中3μg、30μg和300μg修饰的PD498-SPEG 5000引起的IgG1水平(■3.0μg；▲30μg；300μg)。由于0.3μg的剂量不产生应答，故省略了0.3μg剂量曲线。
图4显示了Dunkin Hartley豚鼠IT剂量应答研究中0.3μg、3.0μg和30μg未修饰的亲本PD498引起的IgG1水平(■0.3μg；▲3.0μg；30μg)。
发明详述本发明的目的是提供适合于皮肤护理的被修饰酶。
如上所述，已经知道，将聚合分子与酶偶联，可以提高多肽(包括酶)的稳定性并降低其致敏能力。当将聚合分子与酶偶联时，出现的一个问题是酶促活性的丧失。
按照上述的EP 471,125(Kanebo)，将芽孢杆菌蛋白酶Esperase(可由Novo Nordisk A/S提供)通过三嗪环与40kDa葡聚糖(实施例1)及50kDa支链淀粉(实施例2)结合。
所说的芽孢杆菌蛋白酶(即Esperase)具有3个可及氨基(-NH2)连接基团，聚合分子(在这种情况下是多糖)可以偶联在其上。这几个连接基团是两个氨基(即在3D结构表面上的两个赖氨酸残基)和一个N末端氨基。当将不超过3个聚合分子偶联到所说的蛋白酶上时(修饰率为68％-71％，通过TNBS方法(Haynes等，(1967)，生物化学，6，P.641)测定)，据称所保持的剩余酶促活性在45％(参见实施例4)-67％(参见实施例3)之间。
本发明的发明者发现当使用具有适合于皮肤护理之活性的被修饰酶时，对酶和聚合物分子必须有一定的要求，以获得提高的稳定性和降低的致敏能力，而同时仍保持了显著的剩余酶促活性。本发明的发明者发现与酶表面偶联的聚合分子的数目与重量必须与酶的重量和/或表面积平衡。而且，偶联聚合分子的位置(表面上)也很重要。
聚合分子数目与酶重量本发明基于下列一般原则酶的表面积和/或重量越大，就必须有越多的聚合分子偶联在酶的表面上，以获得提高的稳定性、显著的剩余酶促活性和/或降低的致敏能力。
如果仅仅极少聚合分子偶联到具有大表面积的大酶上，那么所说的极少聚合分子不能遮蔽(即隐藏/覆盖)酶表面上的表位，而这种表位会造成导致抗体(尤其是IgE抗体)形成的免疫应答。
上述EP 471,125(Kanebo)描述了极少(即最多达3)大(即40和50kDa)聚合分子偶联到具有大约28kDa分子量的微生物蛋白酶Esperase表面的情况。
本发明的第一个方面涉及一种适合于皮肤护理的被修饰酶，该酶具有分子量为1-35kDa的4-70个聚合分子共价偶联到分子量为15-100kDa的亲本酶的表面。
按照本发明，将具有15-35kDa分子量(这对许多微生物酶比较典型)的酶(如源于芽孢杆菌的细菌蛋白酶)与4-20个聚合分子共价偶联。
换句话说，被修饰酶可以具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、1 3、14、15、16、17、18、19或20个共价偶联于亲本酶3D结构表面(包括N末端氨基)的聚合分子。
按照本发明，酶的重量和/或表面积、偶联的聚合分子的数目以及聚合物的重量之间的优选比例如表1所示。
表1
按照本发明，聚合分子的分子量可以是1-35kDa。然而，如果聚合分子更小和/或更少，则酶表面的表位可能不能被充分遮蔽，从而导致免疫应答。按照本发明，聚合分子优选的分子量是4-25kDa，尤其是6-25kDa，如8-20kDa。
论及的所有聚合物分子量均是平均分子量。
偶联的聚合分子的位置实际上，所有离子化基团(如赖氨酸残基的氨基)均位于多肽分子的表面(参见例如Thomas E.Creighton，(1993)，“蛋白质”，W.H.Freeman和Company，纽约)。因此，在酶的表面上容易达到的连接基团(即氨基)数目通常等于酶一级结构中的赖氨酸残基加N-末端氨基的数目。
当选择欲进行结合以用于皮肤护理组合物与产品的亲本酶时，优选地使用具有表1中所示连接基团数目的酶。
致敏能力与保持的残余酶促活性相比于其它蛋白质与多肽来说，尤其是对于酶，由于酶的活性和底物与酶结构裂缝中的活性位点之间的相互作用有关，因此在减少免疫系统对酶的应答和保持显著的残余酶促活性之间有些冲突。
按照本发明，“显著”保持的残余活性指保持了酶活性的20％、30％或40％以上，更好是50％、60％或70％以上，还要更好是70％或80％，高达80％-90％，甚至是高达100％。
不受任何理论的限制，被修饰酶的酶促活性损失可能是由于大/重聚合分子空间阻碍底物到达酶的催化裂缝而阻碍底物达到活性位点所造成的结果。也有可能(至少部分上)是因为酶的3D结构发生了不利的结构变化。当将极少的大/重聚合分子偶联到酶表面时，有可能会在酶分子的不同部分引起不均匀的相互作用。这可能会导致酶结构局部偏离其正常构型，这在大多数情况下会导致酶促活性损失。
在EP 471,125(Kanebo)中描述的修饰蛋白酶具有极少(即最多达3个聚合分子)重/大聚合分子(即40和50kDa多糖)偶联到酶表面的氨基上。观察到的酶促活性损失(即45％-67％残余酶促活性)可能是因为在酶表面不同部分上的不均匀相互作用，引起酶结构偏离其正常的亲本状态构型。而且，酶表面上所偶联的大/重聚合分子还可能会阻止底物到达酶的活性位点，导致所保持的酶促活性降低。
人们确信，当将更多的更小/轻聚合分子偶联到酶的表面上时，聚合分子的不利影响就较不明显，因为对酶结构具有影响的力在酶表面上的更大区域中更平衡/均一地分布。这样，聚合分子对活性损失的影响就较不明显。
因而，优选是将具有相对低分子量(即1-35kDa)的更多聚合分子(即大于4)偶联到酶的表面上(在酶具有15-35kDa的分子量的情况下)。
在本发明优选的实施方案中，聚合分子广泛分布于除邻近活性位点的区域之外的酶表面上。在本发明的上下文中，“广泛分布于”是指其所处的位置能使得偶联到酶连接基团的聚合分子遮蔽酶表面的不同部分(优选地是除活性位点外的整个表面或接近于整个表面)，以确保所说的可识别的有关表位受到遮蔽，由此不被免疫系统的抗体识别。人们相信酶和抗体之间相互作用的表面积大约为5002(26×19)(参见Sheriff等，(1987)，美国国家科学院学报，84卷，p.8075)。
优选地，酶上的两个或多个连接基团应不相互靠近，因为连接基团相互邻近很可能会导致仅能偶联一个聚合分子。
为了确保酶促活性的损失最小，优选地不将聚合分子偶联到活性位点的近距离范围内。这一距离取决于聚合分子的大小。因为不希望被大聚合分子阻碍到达活性位点，这样，聚合分子越庞大，所偶联的聚合分子离活性位点的距离就应越远。
通常看来以距离酶的活性位点5、优选地10的范围内没有聚合分子偶联到所说的酶上为佳。
而且，按照本发明，在可由免疫系统识别的已知表位或接近于可由免疫系统识别的已知表位或接近于所说的表位偶联了聚合分子的酶也被视为很有好处。如果表位的位置是未知的，则将许多聚合分子偶联到酶表面可及的连接基团上是颇为有利的。优选的是所说的连接基团以离活性位点适合的距离广泛分布于酶的表面。按照本发明，优选的是符合上述有关偶联聚合分子在酶表面分布要求的被修饰酶。尤其优选没有或只有极少数聚合分子(即0-2)偶联到距离酶的活性位点0-5范围内、优选地0-10范围内的酶。
聚合分子偶联到酶上的聚合分子可以是任何适合的聚合分子，包括天然和合成的同聚物[如多元醇(即poly-OH)、多胺(即poly-NH2)以及多羧酸(即poly-COOH)]以及杂聚物，即包含一种或多种不同偶联基团(如羟基与胺基)的聚合物。
适合的聚合分子的例子包括选自含有下述各类分子的组中的聚合分子聚亚烷基氧化物(PAO)，如聚亚烷基二醇(FAG)，包括聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(mPEG)以及聚丙二醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸盐、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚D，L-氨基酸、乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源的白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素以及羟丙基纤维素，聚氨基葡糖的水解产物、淀粉(如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉)、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、支链淀粉、菊粉、合成生物聚合胶、角叉菜胶(carrageenan)、果胶、藻酸水解产物和生物聚合物。
优选的聚合分子是无毒性的聚合分子，如(m)聚乙二醇((m)PEG)，还要求这些分子共价偶联到酶表面连接基团上的化学方法相对比较简单。
一般看来，聚亚烷基氧化物(PAO)(如聚乙烯氧化物，如PEG，特别是mPEG)是优选的聚合分子，因为这些聚合分子与多糖(如葡聚糖、支链淀粉等)相比，它们所具有的能交联的活性基团很少。
按照本发明，尽管可以使用所有上述的聚合分子，但优选地使用甲氧基聚乙二醇(mPEG)。这是因为这样的事实甲氧基乙二醇仅具有一个可与酶连接的活性末端。因而，交联的可能性相对较不明显。而且，这将使产物更均一，聚合分子与酶的反应更容易控制。
聚合物的活化如果将与酶偶联的聚合分子没有活性，就必须使用适合方法使其活化。聚合分子可通过接头与酶偶联。适合的接头对熟练技术人员是熟知的。
用于活化聚合分子以及用于连接蛋白质的方法和化学在文献中有详细描述。一般用于活化不溶性聚合物的方法包括用下列化合物活化官能团溴化氰、高碘酸、戊二醛、biepoxides、环氧氯丙烷、二乙烯基砜、碳二亚胺、磺酰基卤化物、三氯三嗪等(参见R.F.Taylor，(1991)，“蛋白质固定，基础和应用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白质结合和交联的化学”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定的亲和性配体技术”，学院出版社，N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但是也适用于可溶性聚合物(如高碘酸，三氯三嗪、磺酰基卤化物、二乙烯基砜、碳二亚胺等)的活化。在选择活化与结合化学方法中必须考虑聚合物上的官能团氨基、羟基、巯基、羧基、醛或硫氢基以及蛋白质上选定的连接基团，活化与结合化学通常包括i)聚合物的活化，ii)结合，iii)剩余活性基团的封闭。
下面简要描述许多适合的聚合物活化方法。然而，应该理解也可以使用其它方法。
将聚合分子偶联到酶的游离酸基团上可以借助于二酰亚胺和，例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.，98，289-291)或重氮基乙酸酯/酰胺(Wong等，(1992)，“蛋白质结合和交联化学”，CRC出版社)进行。
将聚合分子偶联到羟基通常是非常困难的，因为这必须在水中进行。而通常水解反应比与羟基的反应更占优势。
将聚合分子偶联到游离硫氢基可以用特定基团(如马来酰亚胺或正吡啶基二硫化物)达到。乙烯基砜(美国专利no.5,414,135，(1995)，Snow等)对于硫氢基也有偏好，但是不象提到的其它化合物那样有选择性。
可以通过包含两个邻近羰基的基团靶向多肽链中的可及精氨酸残基。
涉及将亲电子性地活化的PEG偶联到赖氨酸的氨基上的技术也有用。醇的许多常规离去基团形成胺键。例如，可以使用烷基磺酸盐，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶学方法，104卷，JacobyW.B.编，学院出版社Orlando，P.56-66；Nilsson等，(1987)，酶学方法，135卷，Mosbach K.编，学院出版社Orlando，P.65-79；Scouten等，(1987)，酶学方法，135卷，Mosbach K.编，学院出版社Orlando，P.79-84；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，pp.4217-4219)、甲磺酸盐(Harris，1985，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，pp 341-352)、芳基磺酸盐(如甲苯磺酸盐)以及对硝基苯磺酸盐。
有机磺酰氯(例如Tresyl氯化物)可有效地将许多聚合物(例如PEG)中的羟基转化成良好的离去基团(磺酸盐)，当与多肽中的亲核基团(如氨基)进行反应时，该离去基团使得可以在聚合物和多肽之间形成稳定的键。除了要有高的结合产率之外，反应条件通常还要求比较温和(中性或微碱性pH值，以避免变性和活性极少或没有破坏)，并且满足多肽需要的非破坏性条件。
甲苯磺酸盐比甲磺酸盐反应性更强，而且更不稳定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，生物结合物化学，6，150-165)。环氧化合物也可以用于产生胺键，但是活性比上述基团弱得多。
用碳酰氯将PEG转化成氯甲酸酯将产生与赖氨酸的氨基甲酸酯键。这一转变可以多种变化形式进行，如用N-羟基琥珀酰亚胺(美国专利no.5,122,614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技术应用和生物化学，15，P.100-114；Monfardini等，(1995)，生物结合物化学，6,62-69)、用咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，pp 309-319)、用对硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1，(1993)，Looze，Y.)等替代氯。通常通过使氯甲酸酯与所需的离去基团反应来制备衍生物。所有这些基团均产生与肽的氨基甲酸酯键。
此外，可以分别使用异氰酸盐和异硫氰酸盐来产生尿素和硫脲。
使用如上所述的相同的离去基团和环状亚胺thrones，可以从PEG酸(美国专利no.5,349,001，(1994)，Greenwald等)获得酰胺。这些化合物的反应活性十分高，但是可能会使水解变快。
也可以使用从与琥珀酸酐反应制备的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使结合物对水解更加敏感得多(美国专利no.5,122,614，(1992)，Zalipsky)。这一基团可以用N-羟基琥珀酰亚胺活化。
此外，可以引入一个特殊的接头。最古老的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物化学杂志，252,3578-3581；美国专利no.4,179,337，(1979)，Dayis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24,375-378)。
将PEG偶联到芳香族胺上，随后重氮化，将产生非常活跃的重氮盐，其在原位可与肽反应。通过使PEG的吖内酯衍生物(美国专利no.5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)反应，因此引入又一个酰胺键，也可以形成酰胺键。
由于一些肽不包含许多赖氨酸，因此，将多于一个PEG连接到相同的赖氨酸上有可能是有利的。这可以通过例如使用1，3-二氨基-2-丙醇进行。
也可以将PEG通过氨基甲酸酯键连接到酶的氨基上(WO95/11924，Greenwald等)。赖氨酸残基也可以用作主链。
亲本酶上述的本发明结合物可以使用本领域中已知的任何适合技术基于所选择的亲本酶制备。
术语“亲本”酶是指任何未偶联的酶(即要修饰的酶)。该酶优选地可以是微生物来源的，如细菌、丝状真菌或酵母来源的。
亲本酶可以是天然存在的(或野生型)酶或其变体。
评价/选择适合的亲本酶酶的三维结构在评价/选择要修饰的适合亲本酶方面有些用处。三维结构可以是X-射线结构、核磁共振结构或建立的模型结构。Brookhaven数据库可以作为X-射线和核磁共振结构的来源。
如果与所说的酶有至少30％序列等同的一种或多种同源酶的一个或多个3D结构已知，则可由本领域熟练人员建立模型结构。有几个软件包，如Biosym的“Homo1ogy95.0”软件包，可以用来构建模型结构。
构建模型结构所需要的典型工作是对存在3D结构的同源序列进行序列对比、确定结构保守区域(SCR)、确定SCR的等同序列、在结构数据库中搜索结构片段/环以取代变异区、确定这些区域的等同序列、通过能量最低化使结构精确化。已知相对于已知的3D结构含有大插入物(≥3个残基)的区域相当难以模拟，必须小心地预测其结构。
获得所说酶的3D-结构或基于与已知结构的同源性建立的结构模型后，这种结构即是确定合适亲本酶(当修饰时，这些酶变应原性降低，充分保持残余酶促活性)的必要先决条件。
用于皮肤护理产品的优选的酶是在皮肤护理产品中使用的pH值范围内有显著酶促活性的那些酶。
酶活性亲本酶可以具有已知用于皮肤护理的任何活性。所涉及的酶包括氧化还原酶(E.C.1，“酶命名法，(1992)，学院出版公司)，如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶E.C.3，包括蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶，以及脂解酶；转移酶，(E.C.2)，如转谷氨酰胺酶(TG酶)；异构酶(E.C.5)，如蛋白质二硫键异构酶(PDI)。
水解酶蛋白水解酶所涉及的蛋白水解酶包括选自下列组的、具有上述性质(即连接基团的数目，连接基团的位置等)的酶酸性天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶，或金属蛋白酶。
具有适合数目偶联基团的合适亲本蛋白酶的特定例子示于表2中表2
枯草杆菌蛋白酶PD498具有29kDa的分子量，并示于SEQ IDNO.2中。PD498在其表面上具有12个赖氨酸基团可用于连接，还有一个N末端氨基。如上所述，优选的酶中，赖氨酸广泛分布于酶表面。PD498中没有任何一个赖氨酸残基位于距离活性位点0～10的范围内，这使得PD498特别适合于处理成修饰形式。此外，诸赖氨酸残基在该酶的表面上广泛分布(即远离活性位点)。
枯草杆菌蛋白酶DY具有27kDa的分子量，在其表面上有12个氨基(即赖氨酸残基)，还有一个N末端氨基(参见SEQ ID NO.3)。
亲本蛋白酶Lion Y具有46kDa的分子量，在其表面上有14个氨基(即赖氨酸残基)，还有一个N末端氨基(参见SEQ ID NO.4)。
中性金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶具有34kDa的分子量，并在其表面上有11个氨基(即赖氨酸残基)，还有一个N末端氨基(参见SEQ IDNO.5)。
脂解酶所涉及的脂解酶包括柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂酶(如在EP 258 068和EP 305 216中描述的那一种)，Humicolainsolens、Rhizomucor miehei脂酶(如EP 238 023所述)，犁头酶脂解酶(WO 96/13578)，假丝酵母属脂酶(如C.antarctica脂酶，例如在EP 214 761中描述的C.antarctica脂酶A或B)，假单胞菌属脂酶(例如产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌脂酶，如EP 218 272中所述；洋葱假单孢菌脂酶，如EP 331 376中所述；WO95/14783中所公开的假单孢菌脂酶)，芽孢杆菌脂酶(例如枯草芽孢杆菌脂酶(Dartois等，(1993)Biochemica et Biophysica acta，1131，253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂酶(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌脂酶(WO 91/16422))。其它类型的脂解酶包括角质酶，例如在WO88/09367中描述的源自门多萨假单胞菌的角质酶，或源自Fusariumsolani pisi的角质酶(如在WO 90/09446中所述)。
氧化还原酶漆酶所涉及的漆酶包括在Novo Nordisk的WO 96/00290与WO95/33836中所公开的漆酶。
转移酶转谷氨酰胺酶适合的转移酶包括在WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中所公开的任何转谷氨酰胺酶。
异构酶蛋白质二硫键异构酶适合的蛋白质二硫键异构酶包括在WO 95/01425(Novo NordiskA/S)中描述的那些PDI，但并不限于此。
适于皮肤护理的酶活性本发明的第二个方面涉及包含本发明的被修饰酶和已知用于皮肤护理组合物的诸成分的皮肤护理组合物。
已知许多酶活性可用于皮肤护理组合物。
蛋白酶蛋白酶是洁肤产品中的有效成分。蛋白酶能除去皮肤死亡角质细胞的上层，由此使皮肤看上去更有光泽、更为清新。而且，蛋白酶也能提高皮肤的光滑性。
蛋白酶可用于化妆用品、盆浴和淋浴产品，包括香波、调理剂、洗剂、乳膏、肥皂块、香皂以及液态肥皂。
脂酶脂酶可作为洁肤产品和抗痤疮产品中的有效成分用于化妆品用途中，以除去过多的皮肤脂类，也可作为皮肤护理有效成分用于盆浴和淋浴产品(如乳膏和洗剂)中。
脂酶也可以用于头发清洁产品(例如香波)中，以有效地从头发表面除去皮脂和其它脂肪物质。
氧化还原酶用于个人护理用途的最常用的氧化还原酶是与底物(如葡萄糖)一起能确保产生H2O2的氧化酶(通常是葡糖氧化酶)，然后H2O2可起始过氧化物酶(通常是乳过氧化物酶)对例如SCN-或I-的氧化，形成抗微生物试剂(SCNO-或I2)。已知这一酶促复合物天然存在于例如乳汁和唾液中。
商业上，过氧化物酶在口腔护理产品(漱口液、牙粉、口香糖)中一直用作抗微生物体系，在这些产品中，它也可以与淀粉葡糖苷酶结合使用，以产生葡萄糖。已知这些体系也用于化妆品产品中，以利于保存。
氧化还原酶另一个应用是使用氧化酶、过氧化物酶和漆酶进行氧化性染发(参见例如Novo Nordisk的WO 96/00290或WO95/33836)。
已知在皮肤(和头发)表面形成的自由基与皮肤的老化过程(头发的损坏)相关。
自由基会激活能导致脂膜、胶原以及细胞破坏的链式反应。
自由基清除剂(如超氧化物歧化酶)在化妆品中的应用是众所周知的(R.L.Goldemberg，DCI，Nov.93，P.48-52)。
蛋白质二硫键异构酶(PDI)也是一种氧化还原酶。它可以用于烫发(使头发中的二硫键还原和再氧化)和修复受损头发(其中损伤主要是原有二硫键发生了还原)。
转谷氨酰胺酶用于皮肤、头发或指甲的皮肤护理组合物包含(a)氨基功能活性成分，(b)催化活性成分与皮肤、头发或指甲交联的转谷氨酰胺酶，以及(c)在美国专利NO.5,490,980中已知的载体。
适合用于哺乳动物皮肤、头发或指甲的化妆品组合物包含(a)量足以在所说的皮肤、头发或指甲上形成保护层的至少一种角质细胞(corneocyte)包膜蛋白；(b)量足以使得在角质细胞包膜蛋白和所说皮肤、头发或指甲角质层中的外部暴露的角质细胞蛋白质之间形成共价键的转谷氨酰胺酶；(c)量足以激活转谷氨酰胺酶的钙离子；以及(d)化妆上可接受的载体，其中所说的组合物包含具有两相的乳化剂，其中所说的角质细胞包膜蛋白质包含在该两相中的一相内，而转谷氨酰胺酶包含在另一相内(参见美国专利NO.5,525,336)。
JP 3083908描述了一种皮肤化妆品材料，其中含有用水溶性物质修饰过的转谷氨酰胺酶。该修饰物质是例如聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、海藻酸、羧甲基纤维素、淀粉以及羟丙基纤维素中的一种或多种。这种修饰是通过例如导入活性基团并与酶键合完成的。这样提供了一种对皮肤比较温和、随时间褪色和变味的程度较小、并具有良好的医治粗糙皮肤、保湿性以及美化调理皮肤效果的物质。
本发明的皮肤护理产品本发明的第三个方面涉及包含本发明皮肤护理组合物的皮肤护理产品。术语“皮肤护理产品”如上定义。
本发明的皮肤护理产品可以包含有效量的本发明的被修饰酶。本领域熟练人员所知的这种有效量常占最终皮肤护理产品的0-5％。
所涉及的本发明皮肤护理产品包括但不限于下列产品肥皂、化妆品、护肤膏、护肤凝胶、护肤奶、洁肤洗液、清洁霜、清洁露、洁肤奶、冷霜、冷制皂、化妆基料、清洁乳、面膜、含锌化妆水、T区精华素、润手香脂、香粉、增白粉、皂粉、块皂、透明皂、唇膏、口红、营养素、粉底霜、搽脸粉、眼影粉、粉底、指甲油清洁剂、生发油、美发液、发乳、发用凝胶、滋发剂、头发定形制品、染发剂、头发着色剂、头皮滋润剂(scalp treatment)、香波、香膏、护发素、发胶、晒黑油(sur oil)、防晒品、剃须泡沫与凝胶、剃须膏、婴儿油、粉刺护理制品、止汗剂、驱虫剂、祛臭剂等。
常规皮肤护理产品配方术语“用于皮肤护理产品的成分”是指包括已知用于皮肤护理产品配方中的所有有效成分。这种成分的例子可参见“化妆品和化妆用品”(由Wilfried Umbach编辑，由Ellis Horwood有限公司出版，英国，(1991))以及“消费品中的表面活性剂”(由J.Falbe编辑，由Spring-Verlag出版，(1987))。
下面非穷尽性地列出了一些指导性配方。这些配方概述了本发明所涉及的重要皮肤护理产品配方。
香皂成分 例子％表面活性剂 肥皂(钠盐) 83-87螯合剂 乙二胺四乙酸盐 0.1-0.3稠度调节剂 氯化钠 大约0.5染料 ＜0.1光学增白剂 ＜0.1抗氧化剂 2，6-双(1，1-二甲基乙基)-4-甲 0.1-0.3基苯酚(BHT)增白剂 二氧化钛0.1-0.3香料 1.0-2.0酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差额合成洗涤剂成分例子 ％表面活性剂 月桂基醚硫酸盐30-50月桂基磺基琥珀酸盐1-12加脂剂 脂肪醇10-20成形剂 甘油的单/二硬脂酰酯 0-10填料淀粉 0-10活性剂 水杨酸0-1染料 ＜0.2香料 0-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差额泡沫浴和淋浴成分 例子％泡沫浴 ％淋浴表面活性剂月桂基醚硫酸盐 10-20 10-12椰油酰胺丙基二甲基甜菜碱2-4 2-4乙氧基化脂肪酸 0.5-2 -加脂剂脂肪醇 0.5-3乙氧基化脂肪醇 0.5-5 0-4酶蛋白酶/脂酶 0-5 0-5成分 例子％泡沫浴 ％淋浴泡沫稳定剂脂肪酸链烷醇酰胺0.2-2 0-4调理剂季铵化羟丙基纤维素 - 0-0.5增稠剂氯化钠 0-3 0-3珠光剂乙二醇硬脂酸酯 0-2 -活性剂蔬菜提取物 0-1 0-1防腐剂5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1 0.1染料 0.1-0.2 0.1香料 0.3-3 0.3-2酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差额 差额护肤膏(油包水型和水包油型)成分 例子 ％油包水型/水包油型乳化剂 脱水山梨醇倍半油酸酯 3-5 -硬脂酸铝 1-2 -三乙醇胺硬脂酸 - 1-2十六烷醇/十八烷醇聚乙二醇 - 1-3醚脂肪衍生 棕榈酸异丙酯 1-5 0-3物十六烷醇/十八烷醇 - 0-22-辛基十二烷醇 2-103-7硬脂酸/棕榈酸 - 0-3辛酸/癸酸甘油三酯 5-10-甘油硬脂酸酯 - 0-5湿润剂 甘油 1-5 1-5山梨糖醇 1-5 1-5聚(羟基羧酸) 0.5-2 -丙二醇 - 0-3稳定剂 硫酸镁 0-0.8 -防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂酶0-5 0-5水分 差额差额用于湿润皮肤的爽身水(水包油型)和皮肤洗剂成分例子 ％爽身水％皮肤洗剂乳化剂 十六烷醇/十八烷醇聚乙二醇1-3 -醚脱水山梨醇单月桂酸酯 0.5-1 -硬脂酸钠 - 1-2月桂基硫酸钠 - 0.5-2脂肪衍生2-辛基十二烷醇 1-3 0-5物石蜡油(paraflin oils)- 20-25蜂蜡 0.5-1 -硬脂酸异辛酯 3-7 -棕榈酸异丙酯 - 2-5湿润剂 甘油 3-5 5-10山梨糖醇 - 0-5增稠剂 聚丙烯酸酯 0-0.3 0-1甲基羟丙基纤维素 0-0.3 0-0.5防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差额差额润面露成分 例子 ％表面活性剂 月桂基硫酸镁 0.2-0.5加脂剂 己二酸二正丁基酯 1-2增溶剂 蓖麻油聚乙二醇醚 0.1-1清洁和清爽组分 乙醇 0-15湿润剂 甘油 0-5山梨醇0-5防腐剂 对羟基苯甲酸酯0.2-0.4收敛剂 蔬菜提取物 1-5抗刺激剂泛酰醇 0-1尿囊素 0-0.2蔬菜提取物 0.5-3酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差额洗发香波成分例子 ％表面活性剂 月桂基醚硫酸盐 12-16椰油脂肪酸酰氨丙基二甲 2-5基甜菜碱脂肪酸聚乙二醇酯 0-2增泡剂 脂肪酸乙醇酰胺 0.5-2.5调理剂 季铵化羟乙基纤维素 0.4-1蛋白质水解产物 0.2-1加脂剂 乙氧基化的羊毛脂醇 0.2-1添加剂 去头屑剂 0-1防腐剂 5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1-0.3珠光剂 乙二醇硬脂酸酯 0-2染料 ＜0.1pH调节剂酸/碱0.1-1香料 0.3-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5水分 差额护发素和头发调理剂成分 例子 ％护发素 ％头发调理剂表面活性 脂肪醇聚乙二醇醚 0.1-0.2 1.5-2.5剂十六烷基三甲基铵氯化物 0.5-1-二甲基苄基硬脂基铵氯化 -0.5-1物加脂剂 甘油的单/二鲸蜡酸/硬脂 0.5-1.5 1.5-2.5酸酯稠度调节 脂肪醇 1-2.52.5-3.5剂增稠剂 甲基羟丙基纤维素 0.3-0.6 0.4-0.8调理剂 季铵化羟乙基纤维素 0.1-0.3 0.3-0.4防腐剂 对羟基苯甲酸酯 0.1-0.3 0.1-0.3染料 ＜0.1＜0.1pH调节剂 酸/碱0.1-10.1-1香料 0.2-0.5 0.2-0.5酶 蛋白酶/脂酶 0-5 0-5水分 差额 差额染发剂成分 例子 ％组分1碱性染发膏表面活性剂 月桂基醚硫酸盐1-4乙氧基化的蓖麻油 1-2稠度调节剂 脂肪醇8-10还原剂 亚硫酸钠 0.8-1.2缓冲液 氯化铵0.5-1螯合剂 1-羟基乙烷-1，1-二膦酸0.1-0.2碱性剂 氨1.2-2氧化染料 显色剂(Developing agent) 1
偶联剂 1酶 漆酶 0-5水分 差额组分II过氧化氢分散物表面活性剂 月桂基硫酸盐 0.5-1氧化剂 过氧化氢 6-9稳定剂 1-羟基乙烷-1，1-二膦酸 1-1.5增稠剂 聚丙烯酸酯 3-5酶 漆酶 0-5水分 差额剃须膏成分例子 ％肥皂棕榈酸/硬脂酸30-40氢氧化钾 5-7氢氧化钠 1-2脂肪组分椰子油 5-10聚乙二醇 0-2稳定剂 四硼酸钠 0-0.5硅酸钠 0-0.5山梨醇 0-3酶 蛋白酶 0-5水分 差额剃须液成分例子 ％消毒剂 乙醇 40-80加脂剂 己二酸二正丁基酯 1-2增溶剂 乙氧基化的蓖麻油 0.5-1收敛剂蔬菜提取物 1-10抗刺激剂 泛酰醇 0-0.5蔬菜提取物稳定剂甘油 0-5山梨醇 0-5丙二醇 0-3酶蛋白酶 0-5水 差额发油成分 例子 ％稠度调节剂脂肪醇 4-5乙氧基化的羊毛脂醇 3-6矿物脂凡士林 45-52支链石蜡 10-18抗氧化剂 2，6-双(1，1-二甲基乙基)-0.5-14-甲基苯酚(BHT)香料 0.2-0.4染料 0.1酶脂酶 0-5润肤剂甘油 差额定型水成分 例子 ％溶剂 异丙醇 12-20成膜组分 乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯 2-3.5酯共聚物软化剂乙烯基吡咯烷酮/二甲基氨 0.2-1基乙基异丁烯酸酯调理剂 蛋白质水解产物 0.2-0.5抗静电剂 十六烷基三甲基铵氯化物 0.1-0.5乳化剂 乙氧基化的蓖麻油0.1-0.5香料 0.1-0.2染料 ＜0.1酶 脂酶0-5水分 差额本发明的最后一个方面涉及本发明的被修饰酶的用途，使用皮肤护理产品时，通过降低IgE应答而降低了皮肤护理产品的致敏能力。
材料和方法材料酶PD498WO 93/24623中所示的枯草杆菌蛋白酶类型的蛋白酶。PD498的序列在SEQ ID NO.1和2中显示。
枯草杆菌蛋白酶DY分离自芽孢杆菌变种的、示于SEQ ID NO4的枯草杆菌蛋白酶类型蛋白酶(Detzel等(1993)，生物物理学档案，302卷，2，P.499-502)。
ELISA试剂辣根过氧化物酶标记的抗大鼠Ig(Dako，DK，P162，#031；稀释度1∶1000)。
小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀释度1∶200)。
大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA419；稀释度1∶100)。
生物素标记的小鼠抗大鼠IgG1单克隆抗体(Zymed03-9140；稀释度1∶1000)生物素标记的大鼠抗小鼠IgGl单克隆抗体(Serotec MCA336B；稀释度1∶1000)链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Kirkegard和Perry 14-30-00；稀释度1∶1000)。
溶液终止溶液(DMG缓冲液)硼酸钠，硼砂(Sigma)3，3-二甲基戊二酸(Sigma)CaCl2(Sigma)Tresyl氯化物(2，2，2-三氟乙磺酰氯)(Fluka)吐温20聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(Merck目录号822184)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(Fluka)N-羟基琥珀酰亚胺(Fluka art.56480)碳酰氯(Fluka art.79380)乳糖(Merck 7656)PMSF(苯基甲基磺酰氟)Sigma琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-酰基对硝基苯胺(Suc-AAPF-pNP)Sigma NO.S-7388，分子量624.6g/摩尔。
着色底物OPD邻苯二胺，(Kementec目录号4260)试验动物Brown Norway大鼠(得自Charles River，DE)Brown Norway大鼠(BN)在实验开始时称得体重为大于250克，在实验结束时测得大约为450克。
Dunkin Hartley豚鼠，(得自Charles River，Wiga GmbhSulzfeld 1，Sandhofer Weg，DE)。
雄Dunkin Hartley(为Parainfluenza 3，E.cuniculi，Kpneumonia和P multocida的血清阴性)。动物在实验开始时称得体重为350-450克雌BALB/C小鼠(大约20g)(购自Bomholdtgaard，Ry，DK)装备XCEL II(Novex)ELISA读数仪(UVmax，Molecular Devices)HPLC(Waters)PFLC(Pharmacia)Superdex-75柱，Mono-Q，Mono S(购自Pharmacia，SW.)SLT购自SLT LabInstruments的Fotometer。
大小排阻层析仪(Spherogel TSK-G2000 SW)。
大小排阻层析仪(Superdex 200，Pharmacia，SW)Amicon小槽方法BALB/C小鼠的免疫通过皮下注射分别含有25μl PD498、PD498-SPEG 5,000和甘氨酸-SPEG-15,000的50μl 0.9％(重量/体积)NaCl溶液，对雌性Balb/C小鼠(20克)进行免疫。每一批的蛋白质量通过NanoOrange蛋白质定量试验(Molecular Probes Europe N-6666)测定。免疫每两周进行一次，共进行三个月。在免疫后一周时，从眼睛收集血液样品(200μl)。通过血液凝固和离心获得血清。
确定BALB/C小鼠中IgGl抗体相对浓度的ELISA方法1)用包被缓冲液中的1μg蛋白质/ml包被ELIAS板，在4℃下温育过夜，或在室温下温育至少3小时。50μl/孔。轻微摇动。
2)倒空板，并用封闭缓冲液在室温下封闭至少1/2小时。200μl/孔。轻微摇动。以洗涤缓冲液洗涤板3次。
3)将抗原与在稀释缓冲液中的1/2稀释度血清温育。诸溶液在制备后立即添加到孔中。留一些孔仅用稀释缓冲液处理(空白)。在室温下温育至少1小时。50μl/孔。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
4)在稀释缓冲液中稀释生物素标记的大鼠抗小鼠IgGl单克隆抗体或生物素标记的小鼠抗大鼠IgGl单克隆抗体。在室温下温育至少1小时。50μl/孔。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
5)在稀释缓冲液中稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶。在室温下温育至少1小时。50μl/孔。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
6)在底物缓冲液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。制备该溶液后立即使用。温育10分钟。50μl/孔。
7)终止反应加入终止溶液。50μl/孔。
8)在492nm对平板读数，以620nm的读数作为参照。数据用Lotus软件计算并显示。
确定BALB/C小鼠中IgE抗体相对浓度的ELISA方法使用三层夹心ELISA(three layer sandwish ELISA)确定特异性IgE血清抗体的相对浓度。
1)用10μg大鼠抗小鼠IgE或小鼠抗大鼠IgE/ml缓冲液1包被ELISA板。
50μl/孔。在4℃下温育过夜。
2)倒空板并以封闭缓冲液在室温下封闭至少1/2小时。
200μl/孔。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
3)与小鼠/大鼠血清一起温育，从未稀释的血清开始，并以2倍稀释度连续稀释。留一些孔仅用缓冲液4处理(空白)。50μl/孔。在室温下温育30分钟。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
4)在稀释缓冲液中将酶稀释成适当的蛋白质浓度。50μl/孔。
在室温下温育30分钟。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
5)用稀释缓冲液稀释特异性多克隆抗酶抗血清血清(pIg)以用于检测结合抗体。50μl/孔。在室温下温育30分钟。轻微摇动。在洗涤缓冲液中洗涤板3次。
6)用稀释缓冲液稀释辣根过氧化酶结合的抗pIg抗体。50μl/孔。在室温下温育30分钟。轻微摇动。用洗涤缓冲液洗涤板3次。
7)于底物缓冲液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。制备好该溶液后立即使用。温育10分钟。50μl/孔。
8)终止反应加入终止溶液。50μl/孔。
9)在492nm对平板读数，以620nm的读数作为参照。数据用Lotus软件计算并显示。
用于测定IgGl阳性豚鼠的ELISA方法用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的兔抗PD498 1∶8000包被ELISA微量滴定板，并在4℃下温育过夜。第二天，用2％BSA封闭各板1小时，并用PBS吐温20洗涤各板3次。
将1μg/ml PD498加入至各板中，温育1小时，再用PBS吐温20洗涤板3次。
将所有豚鼠血清样品与对照加到具有2μl血清和98μl PBS的ELISA板上，温育1小时，并以PBS吐温20洗涤板3次。
然后将山羊抗豚鼠IgG1(PBS缓冲液中的1∶4000稀释度(NordicImmunology 44-682))加到板上，温育1小时，并用PBS吐温20洗涤各板。
加入碱性磷酸酶标记的兔抗山羊1∶8000(Sigma A4187)，温育1小时，用PBS吐温20洗涤板两次，用二乙醇胺胺缓冲液洗涤板1次。
在37℃下，使用对硝基苯基磷酸酯对标记的碱性磷酸酶显色30分钟，或者直到显示出适当的颜色。
使用终止介质(包含EDTA的K2HPO4/HaH3缓冲液(pH 10))终止反应，并使用ELISA读数仪读取OD 405/650的数值。
在所有ELISA板上均包括双盲样本。
阳性和阴性血清值计算为平均盲值加2倍的标准差。这样达到的准确度为95％。
大鼠的气管内(IT)刺激使用具有2英寸长度金属探头的一次性注射器进行气管内施用分子。这一探头插入进大鼠的气管中大约在会厌下1cm，放置0.1ml的分子溶液。刺激动物4次，最后一次刺激至放血之间间隔5天。
试验动物是每组10只的Brown Norway大鼠(BN)。在实验开始时重量大于250克，实验结束时重量大约450克。
豚鼠的气管内(IT)刺激使用具有2英寸长度金属探头的一次性注射器进行气管内施用分子。这一探头插入进豚鼠的气管中大约在会厌下1cm，放置0.1ml的分子溶液。一周刺激动物一次，连续刺激10周。
ELISA IgE试验系统(用于Brown Norway大鼠)使用三层夹心ELISA确定特异性抗体的相对浓度。
使用免疫分子作为包被抗原(10μg/ml于中性磷酸盐缓冲液中，50μl/孔)，于4℃下温育过夜。所有残留于孔表面的结合点用磷酸盐缓冲液中的2％脱脂奶粉(200μl/孔)在室温(RT)封闭至少30分钟。用8-通道取液器，按50μl/孔，将欲用该抗原进行测试的所有血清的10倍稀释度及随后的3倍连续稀释度加至平板中。各稀释是在含有0.5％脱脂奶粉和0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液中进行的，于室温下在搅拌平台上温育2小时。“示踪”分子是生物素酰化的小鼠抗大鼠IgE(50μl/孔)，在具有0.5％脱脂奶粉和0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液中稀释2000倍，于RT下在搅拌平台上温育2小时。对照(空白对照)的操作相同，但没有大鼠血清。将稀释2000倍的链霉亲和素-辣根过氧化物酶50μl/孔在搅拌平台上温育1小时。50μl/孔的显色底物是每10ml柠檬酸盐缓冲液(pH5.2)中的OPD(6mg)和H2O2(4μl 30％的溶液)。按100μl/孔加入2N H2SO4以终止反应。利用SLT读取486nm处的值，使用620nm处的值作为参照。数据用Lotus软件计算和显示。
测定分子量使用4-20％梯度的SDS聚丙烯酰胺凝胶(Novex)，通过标准方法进行蛋白质的电泳分离。蛋白质通过银染检测。相对于Novex的Mark-12宽范围分子量标准的迁移率测量分子量。
蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析蛋白酶切割肽和对硝基苯胺之间的键，产生在405nm吸收的可见黄色。
缓冲液例如Britton和Robinson缓冲液pH8.3底物将100mg suc-AAPF-pNa溶解在1ml二甲基亚砜(DMSO)中。将100μl的这种溶液用Britton和Robinson缓冲液稀释成10ml。
分析混合底物和蛋白酶溶液，在405nm下监测作为时间和ABS405nm/min的函数的吸光度。应该控制温度(在20-50之间，取决于蛋白酶)。这测量的是样品中的蛋白酶活性。
实施例实施例1用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG 15,000
将mPEG 15,000悬浮在甲苯中(4ml/g mPEG)，在正常压力下蒸馏除去20％以共沸干燥反应物。当溶液冷却到30℃时，加入二氯甲烷(1ml/g干燥mPEG)，并加入甲苯中的碳酰氯(1.93M 5摩尔/摩尔mPEG)，混合物在室温下搅动过夜。混合物蒸发至干燥，所得的目的产物为蜡状块。
在蒸发之后，添加二氯甲烷和甲苯(1∶2，3ml/g干燥mPEG)以重新溶解白色固体。以固体形式加入N-羟基琥珀酰亚胺(2摩尔/摩尔mPEG)，然后加入三乙胺(1.1摩尔/摩尔mPEG)。将混合物搅动3小时。混合物最初并不清亮，然后变得清亮，最后形成小沉淀。将混合物蒸发至干燥，在乙酸乙酯(10ml)中重结晶，热过滤以除去盐和不溶性的微量物质。放置清亮液体，使其在室温下缓慢冷却16小时，然后在冰箱中过夜。滤出白色沉淀，以一些冷乙酸乙酯洗涤，并进行干燥，得到98％(w/w)的产物。核磁共振表明有80-90％被活化和5o/oo(w/w)HNEt3Cl。mPEG 15,000(CDCl3)的1H-NMR为δ1.42t(I＝4.8 CH3iHNEt3Cl)，2.84s(I＝3.7琥珀酰亚胺)，3.10dq(I＝3.4 CH2iHNEt3Cl)，3.38s(I＝2.7 CH3iOMe)，3.40*dd(I＝4.5o/oo，13C satellite)，3.64bs(I＝1364主峰)，3.89*dd(I＝4.8o/oo13C satellite)，4.47dd(I＝1.8，PEG中的CH2)。于22℃下在干燥器中存储4个月后未见变化。
实施例2用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG 5,000用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化mPEG 5,000如实施例1所述进行。
实施例3PD498蛋白酶与活化的mPEG 5,000的结合在20ml的终体积内，于50mM硼酸钠(pH10)中，将200mg PD498与1.8g用N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG 5,000(按照实施例2制备)一起温育。通过磁性搅拌，在室温下进行反应。反应时间是1小时。通过添加DMG缓冲液至终浓度为5mM戊二酸二甲酯、1mM CaCl2和50mM硼酸盐(pH5.0)来终止反应。
所得衍生物的分子量大约是100kDa，相当于每摩尔PD498连接了大约13摩尔mPEG。
与亲本酶比较，被修饰酶对肽底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-酰基对硝基苯胺)的剩余活性接近100％。
实施例4枯草杆菌蛋白酶DY蛋白酶和活化的mPEG 5,000的结合使用与实施例3中所述相同的方法，将枯草杆菌蛋白酶DY蛋白酶与经N-琥珀酰亚胺碳酸酯活化的mPEG 5,000进行结合。
实施例5BALB/C小鼠皮下(SC)追踪使用如上述实施例描述所制备的修饰的PD498-SPEG 5,000、未修饰的亲本PD498和甘氨酸-SPEG 15,000皮下刺激BALB/C小鼠。
免疫小鼠的血清在特异性的IgE ELISA(如上所述)中进行检测，以分析诸分子是否能活化免疫应答系统，引起特异性IgE应答(参见图1)。
两周一次共四次的免疫接种足以引发对PD498的IgE应答。
两周一次的免疫方案持续3个月。在研究的最后，进行了七次免疫。如图1所示，经未修饰的亲本PD498免疫的BALB/C小鼠中，抗PD498 IgE水平在第5次免疫之前均增加，然后维持相当稳定的水平。相对而言，在用修饰的PD498-SPEG 5,000免疫过的小鼠中没有检测到特异性IgE应答。
实施例6豚鼠中PD498-SPEG 5,000的变应原性气管内追踪通过气管内施药，用1.0μg纯化的PD498和1.0μg修饰的PD498-SPEG 5,000刺激Dunkin Hartley豚鼠。
用特异性的IgG1 ELISA(如上所述)检测追踪期间经免疫的Dunkin Hartley豚鼠的血清，以分析该分子是否能活化免疫应答系统，引起指示为变应性应答的特异性IgG1应答(参见图2)。测定水平是1∶50。
图2显示了在10周的追踪期间Dunkin Hartley豚鼠的IgG1水平。从图中可以看出，在相当于第7周的第7号穿刺抽液(Tap-7)之前，检测不到修饰的PD498的IgG1水平。用修饰的PD498连续刺激后，IgG1水平没有明显的提高。
实施例7豚鼠中剂量-反应的气管内追踪(IT)在豚鼠中通过气管内追踪检测修饰的PD498-SPEG 5,000的潜在变应性应答。豚鼠一周刺激一次，连续10周。
在第一次气管内刺激之前，使用如上所述用于豚鼠的ELISA，对从每只Dunkin Hartley豚鼠收集的血样进行血液检测。这样做是为了确保在ELISA中没有血清的非特异性结合。
10只一组的豚鼠用0.3微克、3微克、30微克、300微克的下列物质进行气管内刺激■亲本PD498，和■修饰的PD498-SPEG 5,000。
下列溶液用于盲检■0.9％NaCl(用于亲本PD498的盲检)，■在0.9％NaCl中的300微克PEG 5,000(相当于PD498-SPEG5,000中的PEG量)(用于修饰的PD498-SPEG的盲检)。
在IgG1 ELISA(如上所述)中检验所有试验豚鼠的血清。图3中给出了修饰的PD498-SPEG 5,000的气管内追踪结果。图4中给出了未修饰的亲本PD498的追踪结果。
通过比较图3和图4可以看出与用亲本酶气管内刺激的豚鼠相比，用修饰的酶气管内刺激豚鼠引起的应答有所降低。
按照前面公开的内容，对本领域技术人员来说明显的是，实施本发明时，在不偏离本发明的实质或范围的情况下可以有许多变更和修改。因此，本发明的范围应按照下列权利要求定义的内容理解。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsveard(E)国家丹麦(F)邮区代码(ZIP)DK-2880(G)电话45 4444 8888(H)传真45 4449 3256(ii)发明名称用于皮肤护理的被修饰酶(iii)序列数4(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度840个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(B)菌株芽孢杆菌PD498，NCIMB No.40484(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..840(xi)序列描述SEQ ID NO1TGG TCA CCG AAT GAC CCT TAC TAT TCT GCT TAC CAG TAT GGA CCA CAA 48Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15AAC ACC TCA ACC CCT GCT GCC TGG GAT GTA ACC CGT GGA AGC AGC ACT 96Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30CAA ACG GTG GCG GTC CTT GAT TCC GGA GTG GAT TAT AAC CAC CCT GAT144Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45CTT GCA AGA AAA GTA ATA AAA GGG TAC GAC TTT ATC GAC AGG GAC AAT192Lau Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60AAC CCA ATG GAT CTT AAC GGA CAT GGT ACC CAT 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Gln1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)关于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度274个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(B)菌株芽孢杆菌变种(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp20 25 30Thr Gly Ile Ala (Ala/Ser) Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly Ala3540 45Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asn85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp100 105 110Ala Thr Gln Asn Gly Leu Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro115 120 125Ser Gly Ser Thr Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Lys Ala Tyr Ala Ser130 135 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Asp50 55 60Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala65 70 75 80Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile85 90 95Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr100 105 110Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser115 120 125Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val130 135 140Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly145 150 155 160Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys165 170 175Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly
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1.一种被修饰酶，其特征在于，其上有分子量为1-35kDa的4-70个聚合分子共价偶联到分子量为15-100kDa的亲本酶的表面。
2.按照权利要求1的被修饰酶，其特征在于，有4-20个聚合分子共价偶联到分子量为15-35kDa的所述酶的表面上。
3.按照权利要求2中任何一项的被修饰酶，其中有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1 5、16、17、18、19或20个聚合分子，优选地13-18个聚合分子，共价偶联到亲本酶3-D结构的表面上。
4.按照权利要求1的被修饰酶，其中有7-40个、优选地10-30个聚合分子偶联到分子量为35-60kDa的所述亲本酶的表面上。
5.按照权利要求1的被修饰酶，其中有10-50个、优选地13-40个聚合分子偶联到分子量为60-80kDa的所述亲本酶的表面上。
6.按照权利要求1的被修饰酶，其中有15-70个、优选地18-60个聚合分子偶联到分子量为80-100kDa的所述亲本酶的表面上。
7.按照权利要求1-6中任何一项的被修饰酶，其中所述聚合分子的分子量为1-35kDa，如4-25kDa，优选地6-25kDa，尤其是8-20kDa。
8.按照权利要求1-7的被修饰酶，其中所述聚合分子选自包含天然或合成同聚物和异聚物的组。
9.按照权利要求8的被修饰酶，其中所述聚合物分子选自包含合成聚合分子的组，所述合成聚合分子包括分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸、聚(乙烯吡咯烷酮)以及聚D，L-氨基酸。
10.按照权利要求8的被修饰酶，其中所述聚合分子选自包含天然存在的聚合分子的组，所述天然存在的聚合分子包括葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖；纤维素，如甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素)；以及聚氨基葡糖的水解产物；淀粉，如羟乙基淀粉、羟丙基淀粉；糖原，琼脂糖，瓜尔胶，菊粉，支链淀粉，合成生物聚合胶，角叉菜胶，果胶以及藻酸。
11.按照权利要求1-10中任何一项的被修饰酶，其中所述酶偶联到已活化的聚合物上下列基团中的一种或多种上氨基、羟基、巯基、羧基、醛基或硫氢基。
12.按照权利要求1-11中任何一项的被修饰酶，其中所述聚合分子通过接头(如三嗪环)偶联到所述酶上。
13.按照权利要求1-12中任何一项的被修饰酶，其中所述酶是微生物来源的，如细菌、丝状真菌或酵母来源的。
14.按照权利要求1-13中任何一项的被修饰酶，其中所述酶是一种水解酶，包括蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶)和脂酶。
15.按照权利要求14的被修饰酶，其中所述亲本蛋白酶选自包括PD498、Savinase、蛋白酶K、蛋白酶R、Thermitase、枯草杆菌蛋白酶DY、Lion Y、Alcalase、蛋白酶T和JA16的组。
16.按照权利要求16的被修饰酶，其中所述酶是SEQ ID NO.1所示的PD498，或SEQ ID NO.3所示的枯草杆菌蛋白酶类型的蛋白酶枯草杆菌蛋白酶DY，或SEQ ID N0.4所示的Lion Y。
17.按照权利要求1-13中任何一项的被修饰酶，其中所述酶是一种氧化还原酶，包括漆酶和超氧化物歧化酶。
18.按照权利要求1-17中任何一项的被修饰酶，其中所述聚合分子通过位于酶表面上的氨基(-NH2)偶联到所述酶上。
19.按照权利要求18的被修饰酶，其中所述聚合分子通过N-末端氨基或位于酶表面上的赖氨酸残基偶联到所述酶上。
20.按照权利要求1-19的被修饰酶，其中所述聚合分子偶联到所述酶上距离酶活性位点大于5、优选地大于10的位置。
21.一种皮肤护理组合物，其中包含按照权利要求1-20中任何一项的被修饰酶以及已知用于皮肤护理产品的诸多成分。
22.一种皮肤护理产品，其中包含按照权利要求21的皮肤护理组合物，所述护理产品选自下组肥皂、化妆品、护肤膏、护肤凝胶、护肤奶、洁肤洗液、清洁霜、清洁露、洁肤奶、冷霜、冷制皂、化妆基料、清洁乳、面膜、含锌化妆水、T区精华素、润手香脂、香粉、增白粉、皂粉、块皂、透明皂、唇膏、口红、营养素、粉底霜、化妆底粉、眼影粉、粉底、指甲油清洁剂、生发油、美发液、发乳、发用凝胶、滋发剂、头发定形制品、染发剂、头发着色剂、头皮滋润剂、香波、香膏、护发素、发胶、晒黑油、防晒品、剃须泡沫与凝胶、剃须膏、婴儿油、粉刺护理制品、止汗剂、驱虫剂、祛臭剂等。
23.按照权利要求1-20中任何一项的被修饰酶用于降低皮肤护理产品致敏能力的用途。
全文摘要
本发明涉及适用于皮肤护理的被修饰酶,其上有分子量为1－35kDa的4－70个聚合分子共价偶联到分子量为15－100kDa的亲本酶表面上。本发明还涉及包含这种被修饰酶的皮肤护理组合物和产品,最后还涉及所述被修饰酶用于降低皮肤护理产品致敏能力的用途。
文档编号A61Q5/10GK1253585SQ9880176
公开日2000年5月17日 申请日期1998年1月12日 优先权日1997年1月10日
发明者A·A·奥尔森, A·普伦特 申请人:诺沃挪第克公司