专利名称：来自糖丝菌的内切－β－1,4－葡聚糖酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自糖丝菌菌株的内切-β-1，4-葡聚糖酶制剂，编码内切-β-1，4-葡聚糖酶的分离多核苷酸分子，用重组技术产生的分离酶，以及这些制剂或酶在洗涤剂、纸和纸浆、石油钻探、石油提炼、酒和果汁、食品配料、动物饲料和纺织工业中的用途。发明背景纤维素是由β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖多聚体。纤维素链形成许多分子内和分子间氢键，这导致形成不溶性纤维素微丝。从纤维素到葡萄糖的微生物水解过程涉及以下三种主要种类的纤维素酶(i)随机裂解纤维素分子内的β-1，4-糖苷键的内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)；(ii)从非还原末端消化纤维素并释放纤维二糖的纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)；及(iii)水解纤维二糖和低分子量纤维糊精并释放葡萄糖的β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。纤维素酶由许多微生物产生，并常以多种形式出现。纤维素酶促降解之经济重要性的认识促进了广泛寻找可供工业使用的微生物纤维素酶。因此研究了大量纤维素酶的酶促特性和一级结构。基于催化结构域氨基酸序列的疏水簇分析结果，已将这些纤维素酶归于糖基水解酶的不同家族；真菌和细菌糖基水解酶已分成35个家族(Henrissat et.al.(1991)，(1993))。大部分纤维素酶由纤维素结合结构域(CBD)和催化结构域(CAD)组成，它们之间由可能富含脯氨酸和羟氨基残基的连接子间隔开。基于它们CBD的相似性(Gilkes等，(1991))，建立了纤维素酶的另外分类，即划分为糖基水解酶的5个家族(I-V)。
纤维素酶由包括真菌、放线菌、粘细菌和真细菌在内的许多微生物合成，也可由植物合成。尤其是已鉴定了有广泛特异性的内切-β-1，4-葡聚糖酶。许多细菌内切葡聚糖酶已有描述(Henrissat(1993)；Gilbert等，(1993)。
按照NCBI分类学浏览器(网址http//www.ncbi.nlm.Nih。gov/Taxonomy/tax.html)，分类学上的假诺卡氏菌科属于革兰氏阳性菌纲(硬壁菌门)放线菌目，包括放线动孢菌、放线多孢菌、无枝酸菌、拟无枝酸菌、拟孢囊菌、假诺卡氏菌、糖单孢菌、糖多孢菌、糖丝菌和热密卷菌等属。按涉及核糖体数据方案的细菌和Archaea的分类学(B.L.Maidak等，(1996)核酸研究2482-85)，革兰氏阳性菌门、高G+C摩尔百分比亚门包括链霉菌属种群(如世田北里孢菌，白浅灰链霉菌，浅青紫链霉菌，纤维黄链霉菌(Streptomyces celluflavus)，黄灰链霉菌和灰色链霉菌、节杆菌属种群(如粪肥纤维单孢菌，凝胶纤维单孢菌，产黄纤维单孢菌和潮湿纤维单孢菌)和糖多孢菌属种群(如弯曲高温单孢菌，中温簇形高温单孢菌，肌醇小单孢菌，澳大利亚糖丝菌，长孢糖丝菌，易变糖丝菌，地中海拟无枝酸菌和白拟诺卡氏菌)。
纤维素分解酶的一项重要工业用途是用于处理纤维素纺织品或织物，如作为洗涤剂组合物或织物柔软剂组合物的成分、用于新织物(服装整理)的生物抛光及用于获得含纤维素织物，尤其是粗纹斜棉布的“石洗”外观，已提出了进行这些处理的多种方法，如在GB-A-1 368599、EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876、WO91/17243、WO91/10732、WO91/17244、PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132中。纤维素分解酶的另一重要工业用途是用于纸浆的处理，如用于改善排水或用于再循环纸的脱墨。
一直需要有新型纤维素酶或酶制剂可用于纤维素酶(优选内切-β-1，4-葡聚糖酶)的活性是合乎需要的应用中。
本发明的目的是提供在弱酸至碱性条件下具实质性的纤维素分解活性，并在纸浆加工、纺织品处理、洗衣过程、抽提过程或动物饲料中具改善特性的新型酶或酶组合物；优选的是可用或用重组技术高产率产生的具这种新型良好特性的内切葡聚糖酶。发明概述现已发现属于糖丝菌属的许多菌株产生具实质性的纤维素分解活性的酶，即糖丝菌内源的内切-β-1，4-葡聚糖酶，发明者已成功地克隆和表达了编码该酶的DNA序列。
因此，本发明首先涉及含具内切-β-1，4-葡聚糖酶活性之酶的酶制剂，该酶可获自糖丝菌属菌株或是其内源酶，优选选自以下种类的菌株澳大利亚糖丝菌、德克萨斯糖丝菌、外外安德糖丝菌、喜冷糖丝菌、黄糖丝菌、淡蓝褐糖丝菌、长孢糖丝菌、易变糖丝菌荚膜亚种、气生菌落糖丝菌、易变糖丝菌易变亚种、丁香糖丝菌、糖丝菌之种。其次，本发明涉及编码具内切-β-1，4-葡聚糖酶活性之酶或酶核心(即酶的催化活性结构域)的分离多核苷酸分子，优选DNA分子，其选自以下分子(a)含SEQ ID NO1第676-1470位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子，(b)所编码多肽与SEQ ID NO2第226-490位氨基酸序列具至少80％同一性的多核苷酸分子，及(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列；优选在中度严格条件下可与变性双链DNA探针杂交的多核苷酸分子，其中的探针选自含SEQ ID NO1第676-1470位所示序列的DNA探针和含SEQ ID NO1第676-1470位的亚序列、长度至少约为100个碱基对的DNA探针。
含编码本发明内切葡聚糖酶之DNA序列的质粒pSJ1678已被转化入大肠杆菌菌株中，该菌株由发明者按为专利步骤目的而定的国际公认微生物保藏布达佩斯条约，于1997年3月17日保藏于德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig，联邦德国，保藏号DSM11476。
在第三、四和五方面，本发明提供了含有DNA区段的表达载体，所述DNA区段例如是本发明的多核苷酸分子；含该DNA区段或该表达载体的细胞；及产生具纤维素分解活性之酶的方法，该方法包括在允许此酶产生的条件下培养细胞，并从培养物中回收此酶。
在另一方面，本发明提供了具纤维素分解活性的分离酶，其特征在于(i)无同源杂质及(ii)由上述方法。
本发明进一步涉及内切-β-1，4-葡聚糖酶，它或者是由澳大利亚糖丝菌IFO 14444产生的多肽，或者是含SEQ ID NO2第226-490位所示氨基酸序列的多肽，或是与这些多肽中任一种至少有75％同源性的类似物，或是通过一个或几个氨基酸的取代、删除或添加而衍生自这些多肽中任一种的多肽，或是与针对纯化形式的这些多肽中任一种产生的多克隆抗体具免疫反应性的多肽。
此外，本发明涉及本发明酶和酶制剂在工业应用中的用途，诸如用于在家用或工业用传统洗衣过程中所需的洗涤剂组合物或织物柔软剂组合物中；用于工业清洗过程中；用于纺织工业中以改善纤维素纤维或织物的性能或提供斜纹粗棉布的石洗外观。
本发明还涉及含纤维素酶编码DNA序列的大肠杆菌菌株DSM11476之分离的基本上纯的生物培养物(克隆到大肠杆菌DSM11476内质粒pSJ1678中的DNA序列之纤维素酶编码部分衍生自澳大利亚糖丝菌)，或所说大肠杆菌菌株的任何突变体。发明详述本发明的酶或酶制剂可获自糖丝菌属菌株或是其内源酶，优选以下种类澳大利亚糖丝菌、德克萨斯糖丝菌、外外安德糖丝菌、喜冷糖丝菌、黄糖丝菌、淡兰褐糖丝菌、长孢糖丝菌、易变糖丝菌荚膜亚种、气生菌落糖丝菌、易变糖丝菌易变亚种、丁香糖丝菌、糖丝菌之种。有用菌株的实例是澳大利亚糖丝菌IFO 14444、德克萨斯糖丝菌NRRL B-16134、外外安德糖丝菌NRRL B-16159、喜冷糖丝菌NRRL B-16238、糖丝菌之种IFO 13785、黄糖丝菌ATCC 29533、淡蓝褐糖丝菌(青蓝褐马杜拉放线菌)ATCC 35108或DSM 43679、长孢糖丝菌(长孢马杜拉放线菌)ATCC 31109或DSM 43749、易变糖丝菌易变亚种ATCC31520、气生菌落糖丝菌ATCC 23870、易变糖丝菌荚膜亚种ATCC 23892、易变糖丝菌DSM 40225或DSM 43853、丁香糖丝菌DSM 43886。
本发明的酶和酶制剂在一宽pH范围内是有活性的，优选在大约pH4-11之间有活性，更优选在大约pH5.5-10之间有活性。
在优选实施例中，本发明的酶或酶制剂属于糖基水解酶家族6(Henrissat等，文献同上)。
在本篇上下文中，术语“表达载体”指含目的多肽编码区段及与其可操作相连提供其转录的额外区段的线性或环状DNA分子。这些额外区段可能包括启动子和终止子序列，并可选择性地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号，等等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可包括二者的元件在内。本发明的表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作的表达载体，载体的选择常决定于它将引入的宿主细胞。因而，该载体可为自主复制型载体，即作为一染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。或者，载体可以是这样一种形式，当将其引入宿主细胞时，可以整合入宿主细胞基因组中并与其整合入的染色体一起复制。
此处有关多肽或蛋白质表达时所用的术语“重组体表达”或“重组表达”是按本领域的标准定义限定的。蛋白质的重组表达通常是利用上文刚提到的表达载体进行的。
当用于多核苷酸分子时，术语“分离的”表示已脱离天然环境因而无其它外源或不希望有的编码序列的多核苷酸，它处于适用于基因工程蛋白质生产系统的形式。这种分离分子是那些分离自其天然环境的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含通常与它们相关的其它基因，但可以包括诸如启动子和终止子之类的天然5′和3′非翻译区。相关区域的鉴定对本领域常规技术人员将是明显的(见例如Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”或者可称为“克隆的多核苷酸”。
当用于蛋白质/多肽时，术语“分离的”表明该蛋白质处于非其天然环境下的状态。在优选的形式中，该分离的蛋白质基本上不含其它蛋白质，尤其是无其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下文))。优选提供纯度高于40％的蛋白质，更优选提供纯度超过60％的蛋白质。
甚至更优选提供高度纯化形式的蛋白质，即用SDS-PAGE测定纯度高于80％，更优选纯度高于95％，还更优选纯度高于99％。
术语“分离的蛋白质/多肽”或者可称为“纯化的蛋白质/多肽”。
术语“同源杂质”意指来自最初得到本发明多肽的同源细胞的任何杂质(如除本发明多肽之外的其它多肽)。
此处所用与特定微生物来源相关的术语“获自”指由该特定来源产生的多核苷酸和/或多肽，或已插入此来源的基因的细胞产生的多核苷酸和/或多肽。
当指DNA区段时，术语“可操作连接”表示该区段被连接在一起的方式使得它们所起作用与它们原预期目的一致，如转录起始于启动子，通过编码部分直到终止子。
术语“多核苷酸”表示以5′到3′末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可分离自天然来源、体外合成或制备自天然和合成分子联合体。
术语“多核苷酸分子的互补物”是指与参照序列相比具互补碱基序列并反向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′与5′CCCGTGCAT3′互补。
术语“简并核苷酸序列”是指包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子包括不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码天冬氨酸)。
术语“启动子”表示基因的一部分，它所包括的DNA序列可用于结合RNA聚合酶并起始转录。启动子序列通常，但并非总是，存在于基因的5′非编码区。
术语“分泌信号序列”表示编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为更大多肽的一个组分，可指导该更大多肽穿过合成它的细胞的分泌途径。在通过分泌途径的时候，该更大的肽通常被裂解去除了分泌肽。多核苷酸在本发明优选实施例中，本发明的分离多核苷酸在至少是中度严格条件下可与SEQ ID NO1相似大小区域或其互补序列杂交。
具体地说，本发明的多核苷酸在至少是中度严格条件下、优选如下详述的高度严格条件下可与下述变性双链DNA探针杂交包含SEQ IDNO1第676-1470位所示全长序列的探针，或含SEQ ID NO1中至少长为约100个碱基对的亚序列的任何探针。测定中度或高度严格条件下核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交情况的合适实验条件包括将含有需杂交之DNA片段或RNA的滤膜预浸泡于5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)10分钟，并于5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理鲑精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交该滤膜，然后在含10ng/ml随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)，分析生物化学(Anal.Biochem.)1326-13)、32P-dCTP标记的(比活性高于1×109cpm/μg)探针的同样溶液中约45℃杂交12小时。滤膜随后在2×SSC、0.5％SDS中洗两次，每次30分钟，洗涤温度至少60℃(中度严格条件)，更优选至少65℃(中/高度严格条件)，还更优选至少70℃(高度严格条件)，更优选至少75℃(极高严格条件)。
用X-射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针能杂交上的分子。
如前面所提到的，本发明的分离多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。可用本领域已知方法从基因库或DNA文库中克隆编码目的基因的DNA和RNA。
随后用例如杂交或PCR方法鉴定和分离编码本发明具内切葡聚糖酶活性的多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供了来自不同细菌菌株的多肽和多核苷酸对应物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。特别感兴趣的是来自革兰氏阳性嗜碱菌株，包括糖丝菌属菌株的内切葡聚糖酶多肽。
将本发明提供的信息和组合物与常规克隆技术相结合可克隆本发明具内切葡聚糖酶活性的多肽的物种同系物。例如，本发明的DNA序列可用来自表达该蛋白质的细胞类型的染色体DNA进行克隆。可用按此处公开序列设计的探针通过探测RNA印迹鉴别DNA的合适来源。随后从阳性细胞系的染色体DNA制备文库。编码具内切葡聚糖酶活性之多肽的本发明DNA序列可随后用各种方法分离，诸如用按本说明书和权利要求书中公开序列设计的探针进行探测，或用基于公开序列的一套或多套简并探针进行探测。本发明的DNA序列也可采用聚合酶链式反应或PCR(Mullis，美国专利号4,683,202)，用设计自本文公开序列的引物进行克隆。在另外的方法中，可用DNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对内切葡聚糖酶的抗体(单克隆或多克隆抗体)检测目的DNA的表达，该内切葡聚糖酶克隆自澳大利亚糖丝菌IFO14444，按材料和方法及实施例1和3中所述方法表达和纯化；或者可通过涉及有内切葡聚糖酶活性的多肽的活性测定检测目的DNA的表达。
克隆入大肠杆菌DSM 11476中质粒pSJ 1678的DNA序列的内切葡聚糖酶编码部分和/或本发明的类似DNA序列可克隆自产生具内切葡聚糖酶活性之酶的澳大利亚糖丝菌菌株，优选菌株IFO 14444，或克隆自如本文所述的其它或相关生物。
或者，以可获自大肠杆菌DSM 11476中质粒的DNA序列(被认为与附加的SEQ ID NO1完全相同)为基础可构建类似序列，如是它的亚序列，并且/或者可通过引入核苷酸取代而构建类似序列，这些核苷酸取代不会使该DNA序列编码的甘露聚糖酶的氨基酸序列不同，但符合预期用于生产该酶的宿主生物的密码子用法，或者可通过引入会产生不同氨基酸序列的核苷酸取代而构建类似序列(即本发明甘露聚糖降解酶的变体)。多肽SEQ ID NO2中氨基酸第226-490位的序列是催化活性结构域的成熟内切葡聚糖酶序列。
本发明还提供与SEQ ID NO2多肽基本同源的内切葡聚糖酶多肽及其物种同系物(直向同系物或共生同系物)。此处所用的术语“基本同源”表示多肽与SEQ ID NO2的氨基酸第226-490位的序列或者它们的直向同系物或共生同系物的序列同一性达75％，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％的多肽。这些多肽将更优选与SEQ ID NO2的氨基酸第226-490位或它的直向同系物或共生同系物所示序列至少具95％同一性的多肽，最优选具98％或更大同一性的多肽。序列同一性百分率是用常规方法，通过本领域已知的计算机程序进行测定的，诸如GCG程序包(Wisconsin Package的程序手册，第8版，1994年8月，遗传计算机组，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)提供的GAP，该程序包公开于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-453，在此全文引用作为参考。GAP与以下设置一起用于多肽序列比较缺田产生罚分3.0及缺口延伸罚分0.1。
通过相似方法测定多核苷酸分子的序列同一性，将带以下设置的GAP用于DNA序列比较缺口产生罚分5.0及缺口延伸罚分0.3。
基本同源的蛋白质和多肽其特征在于具有一个或多个氨基酸取代、删除或添加。这些改变优选影响较小的变换，即保守氨基酸取代(见表2)及其它不会严重影响蛋白质或多肽的折叠和活性的取代；小的删除，通常是1-约30个氨基酸的小删除；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基，长达约20-25个残基的小连接肽，或便于纯化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸束、蛋白A(Nilsson等，EMBOJ.41075，1985；Nilsson等，酶学方法，1983，1991)。通常参阅，Ford等人，蛋白质表达和纯化295-107，1991，在此引用作为参考。编码亲和标记的DNA可从产品供应商处购买到(如，PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)。
然而，即便上述优选的变化是影响较小的改变，这些改变也可以是影响较大的改变，如将长达300个氨基酸或更长的较大多肽作为氨基或羧基端延伸融合到具内切葡聚糖酶活性的本发明多肽上。表1保守氨基酸取代碱性氨基酸 精氨酸赖氨酸组氨酸酸性氨基酸 谷氨酸天冬氨酸极性氨基酸 谷氨酰胺天冬酰胺疏水性氨基酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸芳香族氨基酸苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小氨基酸甘氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸除20种基本氨基酸之外，也可用非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代本发明多肽的氨基酸残基。也可用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸及非天然氨基酸取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”已在蛋白质合成后被修饰，且/或在它们侧链上有不同于标准氨基酸侧链的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或优选地购买得到，包括六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、及3，3-二甲基脯氨酸。
本发明之内切葡聚糖酶多肽中的必需氨基酸可按本领域已知步骤进行鉴别，如定位诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学2441081-1085，1989)。在后一技术中，在分子的每个残基位置处引入单个丙氨酸突变，检测所产生的突变分子的生物学活性(即内切葡聚糖酶活性)以鉴别对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可参阅，Hilton等，生物化学杂志2714699-4708，1996。酶的活性位点或其它生物学相互作用也可通过对用诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记之类技术测定的结构的物理分析连同假定接触位点氨基酸的突变进行测定。参阅，例如，de Vos等人，科学255306-312，1992；Smith等人，分子生物学杂志224899-904，1992；Wlodaver等人，FEBS Lett.30959-64，1992。必需氨基酸的位置也可从涉及本发明多肽的多肽同源性分析中推断。
可用已知的诱变、重组和/或重排方法及随后的相关筛选步骤进行多个氨基酸取代和检测，这些方法例如有Reidhaar-Olson和Sauer(科学24153-57，1988)、Bowie和Sauer(美国国家科学院院报862152-2156，1989)、WO 95/17413或WO 95/22625所公开的技术。简要地说，这些作者公开了使多肽中两个或多个位置同时随机化，或进行不同突变的重组/重排(WO95/17413，WO95/22625)，随后从功能上选择多肽，然后将诱变多肽测序以测定每个位置可允许取代的范围。其它可用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学3010832-10837，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和定位诱变(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
上面公开的诱变/重排方法可与大容量、自动筛选方法结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收，并用现代设备迅速测序。这些方法可快速测定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并可用于未知结构的多肽。
利用上述方法，本领域普通技术人员能鉴定和/或制备与SEQ IDNO2之226-490位残基基本同源并保留野生型蛋白质之内切葡聚糖活性的各种多肽。
除含催化结构域的酶核心外，本发明的内切葡聚糖酶还可包含纤维素结合结构域(CBD)，该纤维素结合结合域和该酶的酶核心(催化活性结构域)可操作连接。纤维素结合结构域(CBD)可作为所编码之酶的内在部分存在，或者可将另一来源的CBD引入内切葡聚糖酶中，从而产生酶杂合体。在本文中，术语“纤维素结合结构域”应按Peter Tomme等人[《不溶性碳水化合物的酶促降解》一书中，“纤维素结合结构域分类和特性”，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACSSymposium Series，No.618，1996]的定义理解。这一定义将120种以上的纤维素结合结构域归为10个家族(I-X)，并证实在诸如纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和壳多糖酶之类的多种酶中有CBD。在藻类，如红藻Porphyra purpurea中也已找到了作为非水解性多糖结合蛋白质的CBD，参阅Tomme等人，出处同前。然而，大部分CBD是来自纤维素酶和木糖聚酶，CBD可存在于蛋白质的N和C末端或在其内部。参阅如WO90/00609和WO95/16782，本领域已知有酶杂合体的形式，通过将含有纤维素结合结构域的编码DNA至少一个片段、及通过或不通过连接子与之相连的内切葡聚糖酶编码DNA序列的DNA构建体转化宿主细胞，并培养此宿主细胞以表达融合基因，可制备酶杂合体。酶杂合体可用以下公式描述CBD-MR-X其中CBD是相应于至少为纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区域；MR是中间区域(连接子)，可以是一个键，或一个短的连接基团，优选约2-100个碳原子长的，更优选2-40个碳原子长；MR或者优选约2-100个氨基酸长，更优选2-40个氨基酸长；而X是本发明第一或第二DNA序列所编码多肽的N-末端或C-末端区域。
在优选实施方案中，本发明的分离多核苷酸分子进一步包含编码纤维素结合结构域(CBD)的部分DNA序列。这样的部分DNA序列的例子有，相应于SEQ ID NO1第60-435位核苷酸的序列或克隆至大肠杆菌DSM 11476内质粒pSJ1678中的DNA序列的CBD编码部分。本发明之分离多核苷酸分子可进一步含有编码连接区的部分核苷酸序列，该连接区与所述分离多核苷酸分子所含核苷酸序列编码的酶的纤维素结合结构域(CBD)和催化活性结构域(CAD)可操作连接。优选地，连接区由约2-120个氨基酸残基组成，尤其是由10-80个氨基酸残基组成。
包括上述部分DNA序列在内的本发明多核苷酸分子可用标准方法例如Sambrook等(1989，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室；冷泉港，纽约)所述的那些方法，克隆自大肠杆菌菌株DSM11476。
本发明的多核苷酸分子和它的部分DNA序列还可用任何普通方法进行克隆，包括_在合适载体中克隆来自任何生物的DNA文库，优选原核生物，更优选来自细菌，更优选来自革兰氏阳性细菌，尤其是来自放线菌纲的菌株，更特别是来自假诺卡氏菌科的菌株，例如来自糖丝菌属，特别是来自澳大利亚糖丝菌的DNA文库，所述生物体预期会产生目的内切-β-1，4-葡聚糖酶，_用所说载体转化合适的宿主细胞，_在合适的条件中培养该宿主细胞，以表达由DNA文库中克隆所编码的任何目的酶，_通过测定这些克隆所产生之酶的纤维素分解活性筛选阳性克隆，并_从这样的克隆中分离编码该酶之DNA。
或者，按照众所周知的步骤，通过使用依据可获自大肠杆菌DSM11476内质粒的DNA序列制备的合成寡核苷酸探针，可从合适来源，如下述任一种生物，方便地克隆本发明编码纤维素酶的DNA。
怎样使用本发明的序列来得到其它的相关序列此处所公开的涉及编码本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶之多核苷酸序列的序列信息可作为工具用于鉴别其它同源甘露聚糖酶。例如，可用聚合酶链式反应(PCR)，从多种微生物来源，特别是各种糖丝菌扩增编码其它同源甘露聚糖酶的序列。免疫交叉反应性可通过使用纯化的纤维素分解酶制备将用于测定免疫交叉反应性的多克隆抗体，尤其是单特异性的多克隆抗体。更具体地说，可按以下文献所述步骤通过免疫接种兔子(或其它啮齿类)得到抗本发明内切葡聚糖酶的抗血清N.Axelsen等，《定量免疫电泳操作指南》，Blackwell科学出版社，1973，第23章；或A.Johnstone和R.Thorpe，实践免疫化学，Blackwell科学出版社，1982(更明确的是第27-31页)。可从抗血清中获取纯化的免疫球蛋白，例如通过盐析(硫酸铵)，随后用透析和离子交换层析，如用DEAE-Sephadex进行。可用Outcherlony双向扩散分析(O.Ouchterlony，《实验免疫学手术》(D.M.Weir编)，Blackwell科学出版社，1967，第655-706页)或交叉免疫电泳(N.Axelsen等，见上，第3、4章)或火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)进行蛋白质的免疫化学鉴定。
微生物的来源为了本发明的目的，此文就特定来源所用的术语“获自”或“可获自”意思是该酶产生自或可产生自特定来源或已插入该来源的基因的细胞。
目前认为本发明的纤维素酶可获自属于假诺卡氏菌科的革兰氏阳性细菌，尤其是糖丝菌属的菌株，特别是澳大利亚糖丝菌菌株。
在优选实施例中，本发明的纤维素酶获自澳大利亚糖丝菌菌株IFO14444。目前认为与本发明之酶同源的酶的DNA编码序列可获自属于糖丝菌属的其它菌株。
可产生本发明之内切-β-1，4-葡聚糖酶的澳大利亚糖丝菌菌株分离物可公开获自发酵研究所(IFO)，17-85 Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka 532，日本，保藏号IFO 14444。
此外，含编码本发明内切葡聚糖酶之DNA序列的质粒pSJ1678已被转化入大肠杆菌菌株并进行了保藏，保藏号为DSM 11476。
重组表达载体含有编码本发明所述酶的DNA构建体的重组载体可以是能够方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于它将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是一种自主复制的载体，即以染色体外实体存在的载体，它的复制独立于染色体的复制过程，例如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当它被导入宿主细胞中时，会部分或全部整合到宿主细胞基因组中，并与其整合入的染色体一起复制。
载体优选是一种表达载体，其中编码本发明酶的DNA序列可操纵地连接了DNA转录所需的附加片段。一般来说，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或者可以含有两者的成分。术语“可操纵地连接”表明各片段的排列方式使其功能与它们的预期用途一致，例如，使转录在启动子内起始并贯穿编码酶的DNA序列。
启动子可以是在所选宿主细胞内显示转录活性的任何DNA序列，并可以来自编码宿主细胞同源或异源蛋白质的基因。
适用于细菌宿主细胞的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖源淀粉酶基因的启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子，或者短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子，或者噬菌体λPR或PL启动子，或大肠杆菌lac，trp或tac启动子。
在必要时，编码本发明酶的DNA序列也可以可操纵地连接合适的终止子。
本发明的重组载体还可以再含有使载体能在所选宿主细胞中复制的DNA序列。
载体也可以含有一个选择性标记，例如，一个其产物可补偿宿主细胞缺陷的基因，或者编码抗例如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等抗生素的基因，或者重金属或除草剂的抗性基因。
为了指导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供一个分泌信号序列(也称为前导序列，前体序列或前序列)。分泌信号序列以正确阅读框加接在编码酶的DNA序列中。分泌信号序列通常置于编码酶的DNA序列的5’端。它可以是正常情况下就与该酶相关联的或者可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。
将编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列分别连接，或者通过合适的PCR扩增方案组合这些序列，并将它们插入含有复制或整合必需信息的合适载体中的步骤，是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等，出处同前)。
宿主细胞导入宿主细胞的克隆DNA序列可以是该选定宿主细胞的同源或异源序列。如果是宿主细胞的同源序列，即宿主细胞天然产生的，一般将它可操纵连接另外的启动子序列，或者，如果可行，则连接另外的分泌信号序列和/或终止子序列，而不是其天然的状态。术语“同源”意指包括编码所选宿主细胞内源的酶的DNA序列。术语“异源”意指包括天然情况下宿主细胞不表达的DNA序列。因此，该DNA序列可以是来源于另一种微生物，或者可以是合成序列。
克隆DNA分子或者重组载体被导入的宿主细胞可以是能够表达所述酶的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
经过培养能产生本发明酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌属的菌株，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、液化芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；乳杆菌属菌株；链球菌属菌株；链霉菌属的菌株，特别是浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌菌株。
细菌的转化可以通过原生质体转化、电穿孔、接合或用感受态细胞依照已知方式进行(参见Sambrook等，出处同前)。
当在细菌如大肠杆菌中进行表达时，酶可以保留在细胞质中，通常以不溶性颗粒存在(称为包涵体)，或者可以被细菌分泌序列引导到周质空间。前一种情况下，裂解细胞，收集颗粒，变性，随后稀释变性剂使酶重新折叠。后一种情况下，可以在例如超声破碎或渗透压休克破碎细胞以释放壁膜间隙成分后，再回收酶，从而由壁膜间隙收集酶。
当在如芽孢杆菌或链霉菌菌株等革兰氏阳性细菌中表达酶时，酶可以保留在细胞质中，或者被细菌分泌序列引导到胞外培养基中。
培养时可产生本发明之酶的真菌宿主细胞的例子是例如曲霉属或镰孢属菌株，尤其是泡盛曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉和尖镰孢的菌株，或者是木霉属菌株，优选Trichoderma harzianum、Trichoderma reesei和绿色木霉。
可通过包括原生质体形成、原生质体转化及细胞壁的再生在内的过程以已知方式转化真菌细胞。曲霉属菌株作为宿主细胞的用途可见于EP 238 023(Novo Nordisk A/S)中，此文内容在此引入作为参考。
培养中能产生本发明酶的酵母来源宿主细胞的实例是如汉森酵母属之种的菌株、克鲁维酵母之种的菌株，尤其是乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母，毕赤酵母属之种的菌株，酵母属菌株，尤其是卡尔酵母、酿酒酵母、克鲁弗酵母和葡萄汁酵母，裂殖酵母属之种的菌株，尤其是非洲粟酒裂殖酵母，还有Yarrowia属之种的菌株，尤其是Yarrowia lipolytica。
培养中能产生本发明酶的植物来源宿主细胞例子是如马铃薯或烟草的植物细胞。
生产纤维素分解酶的方法本发明提供一种生产本发明的分离酶的方法，其中，在允许该酶产生的条件下，培养已转化了编码该酶的DNA序列的合适宿主细胞，并从培养物中回收得到的酶。
如本文中的定义，一种分离的多肽(例如酶)是基本不含其它多肽的多肽，例如经SDS-PAGE测定，至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，最最优选约95％纯。
术语“分离多肽”也可称为“纯化多肽”。
当将含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞中时，就有可能异源重组生产本发明的酶。
由此，有可能制备很纯或单组分的纤维素分解组合物，其特征在于不含同源杂质。
本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明酶的同源细胞的任何杂质(例如本发明酶之外的多肽)。
本发明的同源宿主细胞可以是澳大利亚糖丝菌的一个菌株。
用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适于所选宿主细胞生长的任何常规培养基。表达的纤维素分解酶可以方便地分泌到培养基中，并可以通过熟知的程序从中回收，包括通过离心或过滤将细胞从培养基中分离出来，用盐(例如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质成分，随后进行如离子交换层析、亲和层析等层析技术。
酶组合物更进一步，本发明涉及含有上述具纤维素分解活性的酶的酶组合物。
本发明的酶组合物，除包含本发明的纤维素酶之外，还可以含有一或多种其它酶类，例如半纤维素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶，其他纤维素酶或内切-β-1，4-葡聚糖酶组分，壳多糖酶、脂肪酶、酯酶、果胶酶、角质酶、肌醇六磷酸酶、氧化还原酶(过氧化物酶，卤素过氧化物酶(haloperoxidase)，氧化酶，漆酶)、蛋白酶、淀粉酶、还原酶、酚氧化酶、木质素酶(ligninase)、支链淀粉酶、果胶酸酯分解酶(pectate lyase)、木糖葡聚糖酶(xyloglucanase)、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、果胶分解酶、果胶甲酯酶、纤维素二糖水解酶、转谷氨酰胺酶，或者其混合物。
酶组合物可以依照本领域已知方法制备，可以是液态或干性组合物形式。例如，酶组合物可以是颗粒或微粒形式。包含在组合物中的酶可以用本领域已知方法稳定化。
内切葡聚糖酶在许多工业和应用领域都有潜在的用途。以下给出了本发明酶组合物的优选用途的例子。本发明酶组合物的剂量和它的其它使用条件可以依据本领域已知方法测定。
依照本发明的酶组合物可以用于下列目的中的至少一种。
用途在洗涤和穿着过程中，染色织物或服装上的染料通常会从织物上渗出，这使得织物看起来比较陈旧和褪色。除去织物表面上的纤维可部分恢复织物的原色和外观。本文所用的术语“颜色清晰化”是指通过多次洗涤循环而部分恢复织物或服装的原色。
术语“去小球”指除去织物表面上的小球。
术语“浸泡液”是指可在进行常规洗涤过程之前浸泡衣物的水溶液。浸泡液可含有洗涤或洗衣过程中常规使用的一种或多种成分。
术语“洗涤液”指在其中洗涤衣物的水溶液，这种衣物洗涤通常是通过手工或在洗衣机中联合进行化学和机械作用。洗涤液通常是粉状或液态洗涤剂组合物的水溶液。
术语“漂洗液”指衣物在洗涤之后立即泡入或在其中处理以漂洗衣物(即基本上除去衣物上的洗涤剂溶液)的水溶液。漂洗液中可含有织物调理或柔软化组合物。
可用本发明方法处理的衣物可以是常规的可洗涤衣物。优选衣物的主要部分是由棉花、棉混纺纱或者天然或人工纤维素(如来源于含木聚糖之纤维素纤维，如来自纸浆)或其混合物制成的已缝制或未缝制的织物，包括针织物、机织物、粗斜纹布、纱线和毛巾布。混合物的例子是棉或人造丝/粘胶丝与一种或多种配对材料的混合物，所述配对材料例如是羊毛，合成纤维(如聚酰胺纤维，丙烯酸纤维，聚酯纤维，聚乙烯醇纤维，聚氯乙烯纤维，聚偏二氯乙烯纤维，聚氨基甲酸乙酯纤维，聚脲纤维，芳族聚酰胺纤维)，和含纤维素的纤维(如人造丝/粘胶丝，苎麻，大麻，亚麻/亚麻布，黄麻，醋酸纤维素纤维，lyocell)。
洗涤剂的公开内容和实例本发明的洗涤剂组合物中含有表面活性剂体系，其中表面活性剂可以选自非离子表面活性剂和/或阴离子表面活性剂和/或阳离子表面活性剂和/或两性表面活性剂和/或两性离子表面活性剂和/或半极性表面活性剂。
表面活性剂一般以0.1-60％重量的量存在。
优选将表面活性剂配制成与组合物中存在的酶组分相容。在液体或凝胶组合物中，最优选以这样的方式配制表面活性剂，致使它促进或至少是不降低这些组合物中的任何酶的稳定性。
根据本发明使用的优选体系包括本文中所述的作为表面活性剂的一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。
烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯缩合物适合用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂，聚氧乙烯缩合物是优选的。这些化合物包括具有含约6-14个碳原子，优选约8-14个碳原子直链或支链构型烷基的烷基酚与烯化氧的缩合产物。在优选的实施方案中，环氧乙烷存在的量相当每摩尔烷基酚约2-25摩尔，更优选约3-15摩尔的环氧乙烷。这类市售的非离子表面活性剂包括由GAF Corporation销售的IgepalTMCO-630；和均由Rohm & Haas Company销售的TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂通常被称之为烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合物(AE)适合用作本发明的非离子表面活性剂。该脂族醇的烷基链可以是直链或支链的、伯或仲的，并且通常含有约8-22个碳原子。优选的是具有含约8-20个碳原子，更优选约10-18个碳原子之烷基的醇与每摩尔醇约2-10摩尔环氧乙烷的缩合产物。所述的缩合产物中每摩尔醇有约2-7摩尔的环氧乙烷，最优选2-5摩尔的环氧乙烷。可从市场上购得的这类非离子表面活性剂的例子包括由Union Carbide Corporation销售的TergitolTM15-S-9(C11-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)和TergitolTM24-L-6 NMW(C12-C14伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)；和由Shell Chemical Company销售的NeodolTM45-9(C14-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM23-3(C12-C13直链醇与3.0摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM45-7(C14-C15直链醇与7摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM45-5(C14-C15直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)；由Procter & Gamble Company销售的KyroTMEOB(C13-C15醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)；和由Hoechst销售的Genapol LA050(C12-C14醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)。这些产物的HLB的优选范围是8-11，最优选8-10。
也可用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是在US4565647中公开的烷基多糖，该多糖具有含约6-30，优选约10-16个碳原子的疏水基团和含约1.3-10，优选约1.3-3，最优选约1.3-2.7个糖单元的多糖如多糖苷亲水基团。可以使用任何含有5或6个碳原子的还原糖，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分代替葡萄糖基部分(任选地，在2-，3-，4-等位连接疏水基团从而得到对应于葡萄糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。该糖间键可以在，例如，附加糖单元的1位和前一糖单元的2-，3-，4-，和/或6-位之间。
优选的烷基多糖苷具有下式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2选自烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基、和其混合物，其中烷基含有约10-18，优选约12-14个碳原子；n是2或3，优选2；t是0-约10，优选0；x是约1.3-10，优选约1.3-3，最优选约1.3-2.7。该糖基优选是从葡萄糖衍生的。为了制备这些化合物，先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应，从而形成葡糖苷(在1-位连接)。然后另外的糖基单元在其1-位置与前面的糖基单元2-，3-，4-，和/或6-位置，优选主要在2-位之间连接。
环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基之间的缩合产物也适合用作本发明的附加非离子表面活性剂体系。这些化合物的疏水部分的分子量优选为约1500-1800并显示出水不溶性。将聚氧乙烯部分加成到该疏水部分会增加整个分子的水溶性，在聚氧乙烯含量不超过该缩合产物总重量的约50％(相当于与多达约40摩尔的环氧乙烷缩合)时，仍能保持该产品的液体性质。这类化合物的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售的PluronicTM表面活性剂。
也适合用作本发明非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂是环氧乙烷与从环氧丙烷和乙二胺反应得到的产物的缩合产物。这些产物的疏水部分由乙二胺和过量环氧丙烷的反应产物组成，并且分子量一般是约2500-3000。该疏水部分与环氧乙烷缩合，缩合程度为该缩合产物含有约40-80％重量的聚氧乙烯并且分子量为约5000-11000。这类非离子表面活性剂的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售的TetronicTM化合物。
优选用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是烷基酚的聚氧乙烯缩合物、伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖、和其混合物。最优选的是具有3-15个乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10个乙氧基的C8-C18(优选平均为C10)醇乙氧基化物、和其混合物。
非常优选的非离子表面活性剂是下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂
其中R1是H，或R1是C1-4烃基、2-羟基乙基、2-羟基丙基或其混合物，R2是C5-31烃基，Z是具有直链烃基链、至少3个羟基直接连接到该链上的多羟基烃基，或其烷氧基化的衍生物。优选地，R1是甲基，R2是直链C11-15烷基或C16-18烷基或链烯基链，例如椰油烷基，或其混合物，Z是在还原性胺化反应中从还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖衍生的。
非常优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化的硫酸盐表面活性剂。其例子是式RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羟基烷基，优选C12-C20烷基或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单元，m大于0，一般为约0.5-6，更优选约0.5-3，M是H或阳离子，该阳离子可以是例如金属阳离子(如钠、钾、锂、钙、镁离子等)、铵或取代铵阳离子。本文也涵盖烷基乙氧基化硫酸盐以及烷基丙氧基化硫酸盐。取代铵阳离子的具体例子包括甲基、二甲基、三甲基铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和从烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些阳离子等。举例说明的表面活性剂是C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸盐(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸盐(C12-C18E(2.25)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸盐(C12-C18E(3.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸盐(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地选自钠和钾。
适用的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括按照“The Journal of the American Oil Chemists Society”，52(1975)，pp.323-329用气态SO3磺化的C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直链酯。合适的原料包括从牛脂、棕榈油等衍生的天然脂类物质。
优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂(尤其是用于洗衣用途的)包括下面结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂
其中R3是C8-C20烃基，优选烷基，或其混合物，R4是C1-C6烃基，优选烷基，或其混合物，M是与烷基酯磺酸根形成水溶性盐的阳离子。合适的成盐阳离子包括金属阳离子(如钠、钾和锂)和取代或未取代的铵阳离子(例如单乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。优选地，R3是C10-C16烷基，R4是甲基、乙基或异丙基。特别优选的是甲基酯磺酸盐，其中R3是C10-C16烷基。
其它合适的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐表面活性剂，它们是式ROSO3M的水溶性盐或酸，其中R优选是C10-C24烃基，优选具有C10-C20烷基部分的烷基或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，M是H或阳离子，例如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)，或铵或取代铵(如甲基、二甲基和三甲基铵)阳离子和季铵阳离子(例如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子，和从烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺和其混合物衍生的季铵阳离子)等。一般地，对于较低的洗涤温度(例如低于约50℃)，C12-C16烷基链是优选的，而对于较高的洗涤温度(例如高于约50℃)，C16-C18烷基链是优选的。
其它对洗涤目的有用的阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的洗衣洗涤剂组合物中。它们可以包括皂的盐(包括，例如钠、钾、铵、和取代的铵如单、二和三乙醇胺盐)、C8-C22伯或仲烷烃磺酸盐、C8-C24烯烃磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物的磺化制备的磺化多羧酸(例如，如在英国专利说明书号1082179中所述的)、C8-C24烷基聚二醇醚硫酸盐(含有多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘油磺酸盐、脂肪油基甘油硫酸盐、烷基酚氧乙烯醚硫酸盐、石蜡烃磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙磺酸盐如酰基羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸的单酯(特别是饱和和不饱和C12-C18单酯)和磺基琥珀酸的二酯(特别是饱和和不饱和C6-C12二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖的硫酸盐例如烷基多葡糖苷(下面所述的非离子型非硫酸化的化合物)的硫酸盐、支链伯烷基硫酸盐、和烷基多乙氧基羧酸盐例如那些式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的盐，其中R是C8-C22烷基，k是1-10的整数，M是形成水溶性盐的阳离子。树脂酸及氢化的树脂酸也是合适的，例如松香酸、氢化松香酸，以及存在于或衍生于松浆油的树脂酸和氢化树脂酸。
烷基苯磺酸盐是非常优选的。特别优选的是线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基优选含有10-18个碳原子。
其它例子描述于“Surface Active Agents and Detergents”(Vol.I and II，Schwartz，Perry and Berch)中。各种这样的表面活性剂也一般性地公开于US3929678中(第23栏58行-第29栏23行，该文献引入本文作为参考)。
当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约1-40％，优选约3-20％重量的上述阴离子表面活性剂。
本发明的洗衣洗涤剂组合物也可以含有阳离子、两性、两性离子和半极性表面活性剂，以及上文中并未述及的非离子和/或阴离子表面活性剂。
适用于本发明洗衣洗涤剂组合物中的阳离子洗涤表面活性剂是具有一个长链烃基的那些表面活性剂。这样的阳离子表面活性剂的例子包括铵表面活性剂例如烷基三甲基铵卤化物，和具有下式的那些表面活性剂[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-其中R2是在烷基链中具有约8-18个碳原子的烷基或烷基苄基，每个R3选自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-、和其混合物；每个R4选自C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基、由两个R4连接在一起形成的苄基环结构、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是己糖或分子量低于约1000的己糖聚合物，并且当y不是0时为氢)；R5与R4所述相同或是烷基链，其中R2+R5的总碳原子数不大于约18；每个y是0-约10，且该y值的和是0至约15；X是任何相容的阴离子。
非常优选的阳离子表面活性剂是具有下式的、在本发明组合物中有用的水溶性季铵盐化合物R1R2R3R4N+X-(i)其中R1是C8-C16烷基，每个R2、R3和R4各自独立地是C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基、苄基和-(C2H4O)xH(其中x的值为2-5)，X是阴离子。R2、R3、R4中不多于1个是苄基。
R1的优选烷基链长度是C12-C15，当该烷基是从椰油或棕榈仁脂衍生的链长度的混合物，或是通过烯烃合成或OXO醇合成而合成衍生的时尤为如此。
用于R2、R3和R4的优选基团是甲基和羟基乙基，阴离子X可以选自卤素离子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根离子。
用于本文中的合适的式(I)季铵化合物的例子是
氯化或溴化椰油基三甲基铵；氯化或溴化椰油基甲基二羟基乙基铵；氯化癸基三乙基铵；氯化或溴化癸基二甲基羟基乙基铵；氯化或溴化C12-15二甲基羟基乙基铵；氯化或溴化椰油基二甲基羟基乙基铵；甲基硫酸肉豆蔻基三甲基铵；氯化或溴化月桂基二甲基苄基铵；氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4铵；胆碱酯(式(i)的化合物，其中R1是
烷基，R2、R3、R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。
其它在本文中有用的阳离子表面活性剂也描述于US4228044和EP000224中。
当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2-25％，优选约1-8％重量的上述阳离子表面活性剂。
两性表面活性剂也适用于本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的脂族衍生物，或者杂环仲或叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链或支链的。其中1个脂族取代基含有至少约8个碳原子，一般约8-18个碳原子，并且至少一个脂族取代基含有阴离子水型增溶基团，例如羧基、磺酸基、硫酸基。见US3929678(第19栏18-35行)的两性表面活性剂的例子。
当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述两性表面活性剂。
两性离子表面活性剂也适用于本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的衍生物，杂环的仲或叔胺的衍生物，或者季铵、季鏻或叔锍化合物的衍生物。见US3929678(第19栏38行-22栏48行)的两性离子表面活性剂的例子。
当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述两性离子表面活性剂。
半极性非离子表面活性剂是一特殊类型的非离子表面活性剂，它们包括含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化胺；含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化膦；和含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和1个选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基部分的水溶性亚砜。
半极性非离子表面活性剂包括具有下式的氧化胺表面活性剂
其中R3是含有约8-22个碳原子的烷基、羟基烷基、或烷基苯基，或其混合物；R4是含有约2-3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其混合物；x是0-约3；每个R5是含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基，或含有约1-3个氧乙烯基团的多氧乙烯基。R5基团可以彼此连接，例如通过氧或氮原子，从而形成环结构。
特别地，这些氧化胺表面活性剂包括氧化C10-C18烷基二甲基胺和氧化C8-C12烷氧基乙基二羟基乙基胺。
当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物一般含有约0.2-15％重量，优选约1-10％重量的上述半极性非离子表面活性剂。
助洗剂体系本发明的组合物还可含有助洗剂体系。任何常规助洗剂体系都适用于本文中，其包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸、诸如乙二胺四乙酸盐的材料、金属离子螯合剂例如氨基多膦酸特别是乙二胺四亚甲基膦酸和二乙三胺五亚甲基膦酸。尽管由于明显的环境原因并不优选，但本文中也可以使用磷酸盐助洗剂。
合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合的硅铝酸盐材料，更具体地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。
另一种合适的无机助洗剂材料是层状硅酸盐例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na2Si2O5)组成的结晶层状硅酸盐。
合适的含有1个羧基的多羧酸包括乳酸、乙醇酸和其醚衍生物，如在比利时专利号831368、821369和821370中所公开的。含有2个羧基的多羧酸盐包括琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基)二乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐，以及在德国专利2446686和2446687及US3935257中所述的醚羧酸盐，和在比利时专利号840623中所述的亚硫酰基羧酸盐。含有3个羧基的多羧酸盐包括具体地，水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐(aconitrate)和柠康酸盐以及琥珀酸盐衍生物，例如，在英国专利号1379241中所述的羧基甲氧基琥珀酸盐，在荷兰申请7205873中所述的乳氧琥珀酸盐(lactoxysuccinate)，和氧多羧酸盐材料例如在英国专利号1387447中所述的2-氧杂-1，1，3-丙三羧酸盐。
含有4个羧基的多羧酸盐包括在英国专利号1261829中公开的氧联二琥珀酸盐、1，1，2，2-乙四羧酸盐、1，1，3，3-丙四羧酸盐和1，1，2，3-丙四羧酸盐。含有磺基取代基的多羧酸盐包括在英国专利号1398421和1398422和US3936448中公开的磺基琥珀酸盐衍生物、和在英国专利号1082179中所述的磺化的热解柠檬酸盐，而英国专利号1439000中公开了含有膦取代基的多羧酸盐。
脂环和杂环多羧酸盐包括环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸盐、环戊二烯五羧酸盐(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐、2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2，2，5，5-四氢呋喃-四羧酸盐、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸盐和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸盐包括苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和在英国专利号1425343中公开的苯二甲酸衍生物。
在上面的多羧酸盐中，优选的多羧酸盐是每分子含有最多达3个羧基的羟基羧酸盐，更具体地是柠檬酸盐。
用于本发明组合物中的优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A或层状硅酸盐(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸盐螯合剂例如柠檬酸。
包括在本发明洗涤剂组合物中的合适的螯合剂包括乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐，或其混合物。优选的EDDS化合物是游离酸形式的和其钠或镁盐。这样的优选EDDS钠盐的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。这样的优选EDDS镁盐的例子包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐是最优选包括在本发明组合物中的。
优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A和水溶性羧酸盐螯合剂例如柠檬酸的混合物。
可以形成用于粒状组合物的助洗剂体系中一部分的其它助洗剂材料包括无机材料例如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，和有机材料例如有机膦酸盐、氨基多亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐。
其它合适的水溶性有机盐是均聚或者共聚的酸或其盐，其中该聚羧酸包括两两之间被不多于2个碳原子分开的至少两个羧基。
这类聚合物公开于GB-A-1596756中。这类盐的例子是MW 2000-5000的聚丙烯酸盐和其与马来酸酐的共聚物，这样的共聚物具有20000-70000，特别是约40000的分子量。
洗涤助洗剂盐的量通常为组合物重量的5-80％。用于液体洗涤剂的助洗剂的优选量是5-30％。
酶除了本发明的酶制剂外，优选洗涤剂组合物还含有提供清洗性能和/或织物护理益处的其它酶。
这样的酶包括其它的蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
蛋白酶可以使用任何适用于碱性溶液的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的。微生物来源是优选的。包括化学或基因改性的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶，尤其是从芽孢杆菌衍生的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06270中)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO 89/06270中的镰孢属蛋白酶。
优选的市售蛋白酶包括由Novo Nordisk A/S(Denmark)以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase销售的那些，由Genencor International以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、和Purafect OXP销售的那些，和由SolvayEnzymes以商品名Opticlean和Optimase销售的那些。按组合物重量计，可以以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将蛋白酶掺入到本发明的组合物中。
脂肪酶可以使用任何适用于碱性溶液的脂肪酶。合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因工程改性的突变体。
有用的脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如描述于EP258068和EP305216中的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如描述于EP238023中的，假丝酵母属脂肪酶例如C.antarctica脂肪酶，例如描述于EP214761中的C.antarctica脂肪酶A或B，假单胞菌属脂肪酶例如描述于EP 218272中的产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌脂肪酶、例如描述于EP 331376中的洋葱假单胞菌脂肪酶、例如公开于GB1372034中的司徒茨氏假单胞菌脂肪酶，荧光假单胞菌脂肪酶，芽孢杆菌脂肪酶例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophsica acta 1131，253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌脂肪酶(WO 91/16422)。
此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等在1991年《基因》103，61-67上描述的沙门氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化学杂志，106，383-388)，和各种根霉属脂肪酶例如德列马根霉脂肪酶(Hass，M.J.等，(1991)，Gene 109，117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，Biosci.Biotech.Biochem.56，716-719)和米根霉脂肪酶。
其它类型的脂类分解酶，如角质酶也是有用的，例如WO88/09367所述来自门多萨假单胞菌的角质酶，来自Fusarium solani pisi的角质酶(如WO90/09446所述)。
特别合适的脂肪酶是下面这些脂肪酶例如M1 LipaseTM、LumafastTM和LipomaxTM(Genecor)，LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NovoNordisk A/S)，和Lipase P“Amano”(Amano Pharmacetical Co.Ltd.)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将脂肪酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。
淀粉酶可以使用适用于碱性溶液的任何淀粉酶(a和/或b)。合适的淀粉酶包括细菌和真菌来源的那些。包括化学或基因工程改性的突变体。淀粉酶包括例如，在GB1296839中详细描述的从地衣芽孢杆菌特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(从Novo Nordisk A/S得到)和RapidaseTM和Maxamyl PTM(从Genencor得到)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将淀粉酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。
纤维素酶可以使用适用于碱性溶液的任何纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌和真菌来源的那些。包括化学或基因工程改性的突变体。合适的纤维素酶公开于US4435307(其中公开了从Humicolainsolens生产的真菌纤维素酶)，WO96/34108和WO96/34092(其中公开了来自芽孢杆菌的细菌嗜碱性纤维素酶BCE103)，WO94/21801、US5,475,101和US5,419,778(其中公开了木霉的EGIII纤维素酶)中。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是描述于欧洲专利申请0495257中的纤维素酶和本发明的内切葡聚糖酶。市售的纤维素酶包括从一株Humicola insolens生产的CelluzymeTM和CarezymeTM(Novo Nordisk A/S)，KAC-500(B)TM(Kao Corporation)，以及PuradaxTM(Genecor International)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将纤维素酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。
过氧化物酶/氧化酶过氧化物酶与过氧化氢或其源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)一起使用。氧化酶与氧一起使用。两种类型的酶均可用于“溶液漂白”，即在洗涤液中一起洗涤，优选与例如WO 94/12621和WO 95/01426中所述的增强剂一起洗涤所述织物时，防止染料从染色的织物转移到另一织物上。合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因工程改性的突变体。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将过氧化物酶和/或氧化酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。
在本文中包括上述酶的混合物，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纤维素酶的混合物。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将本发明的酶或掺入到洗涤剂组合物中的其它任何酶掺入到本发明的洗涤剂组合物中。
漂白剂可以包括在本发明洗涤剂组合物中的附加的任选组分包括漂白剂，例如粒径为400-800微米的PB1、PB4和过碳酸盐。这些漂白剂组分可以包括一种或多种氧漂白剂，并且根据所选择的漂白剂，可包括一种或多种漂白活化剂。当存在氧漂白化合物时，其存在的量一般是约1-25％。通常，在非液体配方例如粒状洗涤剂中，漂白化合物是任选加入的组分。
用于本文中的漂白剂组分可以是任何在洗涤剂组合物中有用的漂白剂，包括氧漂白剂以及本领域已知的其它漂白剂。
适合于本发明的漂白剂可以是活化的或未活化的漂白剂。
一类可以使用的氧漂白剂包括过羧酸漂白剂和其盐。这类试剂的合适的例子包括单过氧邻苯二甲酸镁六水合物，间氯过苯甲酸、4-壬氨基-4-氧代过氧丁酸和双过氧十二烷双酸的镁盐。这样的漂白剂公开于US4483781、US740446、EP0133354和US4412934中。非常优选的漂白剂也包括如在US4634551所述的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。
另一类可以使用的漂白剂包括卤素漂白剂。例如，次卤酸盐漂白剂的例子包括三氯异氰脲酸，以及二氯异氰脲酸的钠和钾盐，和N-氯代和N-溴代烷烃磺酰胺。这样的材料通常以最终产品重量的0.5-10％、优选1-5％的量加入。
可以将过氧化氢释放剂与漂白活化剂一起使用，该漂白活化剂是例如四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐酯(NOBS，描述于US4412934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐酯(ISONOBS，描述于EP120591中)或五乙酰基葡萄糖(PAG)；将它们过水解后能形成过氧酸作为活性漂白物质，导致改进的漂白作用。另外，非常合适的是这些漂白活化剂C8(6-辛酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐酯、C9(6-壬酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐酯和C10(6-癸酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐酯或其混合物。还合适的活化剂是酰化的柠檬酸酯，例如在欧洲专利申请号91870207.7所公开的。
可用于本发明清洗组合物中的有用的漂白剂，包括过氧酸和含有漂白活化剂和过氧漂白化合物的漂白体系描述于专利申请USSN08/136626中。
通过在洗涤和/或漂洗过程的开始或期间加入能够生成过氧化氢的酶体系(即酶和其底物)，也可以存在过氧化氢。这样的酶体系公开于欧洲专利申请EP0537381中。
除了氧漂白剂以外的漂白剂也是本领域已知的，并且可以在本文中使用。特别重要的一类非氧漂白剂包括光活化漂白剂，例如磺化的锌和/或铝酞菁。这些材料可以在洗涤期间沉积在被洗物上。当存在氧时用光照射，例如通过将衣服挂出在日光中干燥时，该磺化的锌酞菁被活化，结果该被洗物被漂白。优选的锌酞菁和光活化漂白方法描述于US4033718中。洗涤剂组合物一般含有约0.025-1.25％重量的磺化锌酞菁。
漂白剂也可以包括锰催化剂。锰催化剂可以是例如在“低温漂白的有效锰催化剂(Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching)”，自然369，1994，pp.637-639中所述的一种化合物。
抑泡剂另一个任选的组分是抑泡剂，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷通常可以用烷基化的聚硅氧烷材料来表示，而二氧化硅一般以细分散形式使用，例如二氧化硅气凝胶和干凝胶和各种类型的疏水二氧化硅。这些材料可以作为颗粒加入，其中抑泡剂有利地可释放地掺入到水溶性或水分散性的、基本上无表面活性的洗涤剂不可渗透的载体中。另外，可以将抑泡剂溶解或分散在液体载体中并通过喷雾在一种或多种其它组分上来涂覆。
优选的硅氧烷抑泡剂公开于US3933672中。其它特别有用的抑泡剂是德国专利申请DTOS2646126中所述的自乳化硅氧烷抑泡剂。这样的化合物的例子是可从Dow Corning购得的DC-544，它是硅氧烷-二元醇共聚物。特别优选的抑泡剂是含有硅油和2-烷基-链烷醇混合物的抑泡剂体系。合适的2-烷基-链烷醇是以商品名Isofol 12 R销售的2-丁基-辛醇。
这样的抑泡剂体系公开于欧洲专利申请EP0593841中。
特别优选的硅氧烷泡沫控制剂描述于欧洲专利申请92201649.8中。所述的组合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的无孔硅石例如AerosilR。
按组合物重量计，通常以0.001-2％，优选0.01-1％的量使用上述的抑泡剂。
其它组分可以在洗涤剂组合物中使用的其它组分有例如污垢悬浮剂、污垢除去剂、荧光增白剂、磨料、杀菌剂、变色抑制剂、着色剂和/或包覆或未包覆的香料。
特别合适的包覆材料是由多糖基质和多羟基化合物组成的水溶性胶囊，如在GB 1464616中所述的。
其它合适的水溶性包覆材料包括从取代二羧酸的未凝胶化淀粉酸酯衍生的糊精，例如在US3455838中所述的。这些酸酯糊精优选是从诸如蜡质玉米、蜡质高粱、西米、木薯和马铃薯的淀粉制备的。所述的包覆材料的合适例子包括由National Starch生产的N-Lok。该N-Lok包覆材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖组成。该淀粉是通过加上单官能取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。
适合于本文中的防再污染剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，和均聚或共聚的聚羧酸或其盐。这类聚合物包括上述作为助洗剂提到的聚丙烯酸盐和马来酸酐-丙烯酸共聚物，以及马来酸酐与乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸的共聚物，该马来酸酐至少构成该共聚物的20％摩尔。按组合物重量计，这些材料通常以组合物重量的0.5-10％，更优选0.75-8％，最优选1-6％的量使用。
优选的荧光增白剂是阴离子性的，其例子是4，4’-双-(2-双乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二钠盐、4，4’-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二钠、4’，4”-双-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二钠、4，4’-双-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)芪-22’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二钠、2(芪基-4”-(萘并-1’，2’4，5)-1，2，3-三唑-2”-磺酸钠和4，4’-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特别是分子量为1000-10000，更具体是2000-8000和最优选是约4000的那些。以0.20-5％重量，更优选0.25-2.5％重量的量使用这些聚合物材料。这些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸盐对于存在过渡金属杂质时改进白度，织物灰分沉积和对粘土、蛋白质性可氧化污垢的清洗性能是重要的。
在本发明组合物中有用的污垢除去剂是对苯二甲酸与乙二醇和/或丙二醇单元各种排列的常规共聚物或三元共聚物。这样的聚合物的例子公开于US4116885和US4711730及EP0272033中。根据EP0272033特别优选的聚合物具有下式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)，T是(pOOC6H4CO)。
还非常有用的是作为二甲基对苯二甲酸酯、二甲基磺基间苯二酸酯、乙二醇和1，2-丙二醇无规共聚物的改性聚酯，该端基主要由磺基苯甲酸酯组成，还有一小部分是乙二醇和/或丙二醇的单酯。目的是“主要”得到在两端由磺基苯甲酸基团封端的聚合物，本文中是绝大多数本文所述共聚物是由磺基苯甲酸基团封端的。然而，某些共聚物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯组成，其“次要”地由这样的物质组成。
本文中选择的聚酯含有约46％重量的二甲基对苯二甲酸，约16％重量的1，2-丙二醇，约10％重量的乙二醇，约13％重量的二甲基磺基苯甲酸和约15％重量的磺基间苯二酸，并且其分子量为约3000。该聚酯和其制备方法详细地叙述于EP311342中。
柔软剂可以将织物柔软剂加入到本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些试剂在类型上可以是无机或有机的。无机柔软剂的例子是在GB-A-1400898和US5019292中公开的绿土粘土。有机的织物柔软剂包括如在GB-A-1514276和EP0011340中公开的水不溶性叔胺，其与单C12-C14季胺盐的混合物(公开于EP-B 0026528中)，和如在EP-B 0242919中所公开的二长链酰胺。织物柔软剂体系的其它有用有机组分包括高分子量的聚氧乙烯材料，如在EP 0299575和0313146中所公开的。
绿土粘土的含量一般在5-15％重量的范围，更优选8-12％重量，作为干混合组分材料加入到配方的其余部分中。以0.5-5％重量，一般1-3％重量的量加入有机织物柔软剂，例如水不溶性叔胺或二长链酰胺材料，而以0.1-2％重量，一般0.15-1.5％重量的量加入高分子量聚氧乙烯材料和水溶性阳离子材料。尽管在某些情况下作为干混颗粒加入它们可能更方便，但一般将这些材料加到该组合物的喷雾干燥组分上，或者作为熔融的液体将它们喷雾到组合物的其它固体组分上。
聚合染料转移抑制剂按照本发明的洗涤剂组合物还包括0.001-10％重量，优选0.01-2％重量，更优选0.05-1％重量的聚合染料转移抑制剂。一般将所述的聚合染料转移抑制剂加入到洗涤剂组合物中以便抑制染料从有色织物转移到与其一起洗涤的其它织物上。在染料于洗涤中附着到其它物品上之前，这些聚合物会络合或吸附从有色织物洗涤下来的短效染料。
特别合适的聚合染料转移抑制剂是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。
加入这样的聚合物也增强了本发明酶的性能。
本发明的洗涤剂组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状或粒状形式。
可以按例如US4106991和US4661452(两者均是Novo Industri A/S的专利)中所公开的生产无尘的颗粒，并且该颗粒可以任选地用本领域已知的方法涂覆。蜡质涂覆材料的例子是平均分子量为1000-20000的聚(氧乙烯)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中该醇含有12-20个碳原子并且其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-及三-甘油酯。在GB1483591中给出了适合于流化床技术涂覆的成膜涂覆材料的例子。
本发明的粒状组合物也可以是“致密形式”的，即它们具有比常规的粒状洗涤剂相对高的密度，即550-950g/l；在这样的情况下，本发明的粒状洗涤剂组合物将含有比常规颗粒洗涤剂更少量的“无机填料盐”；一般的填料盐是碱土金属的硫酸盐和氯化物，一般是硫酸钠；“致密”的洗涤剂一般包括不多于10％的填料盐。本发明的液体组合物也可以是“浓缩形式”的，在这样的情况下，本发明的液体洗涤剂组合物将比常规的液体洗涤剂含有较低量的水。按组合物重量计，浓缩的液体洗涤剂的水含量一般低于30％，更优选低于20％，最优选低于10％。
例如，可以将本发明的组合物配制为手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括洗衣添加剂组合物和适用于脏织物预处理的组合物，漂洗时加入的织物柔软剂组合物，和用于普通家庭硬表面清洗操作和洗碗碟操作的组合物。
下面的实例旨在举例说明本发明的组合物，而不对本发明范围作任何限制。
在洗涤剂组合物中，缩写组分符号具有下面的意义LAS 直链C12烷基苯磺酸钠TAS 牛脂烷基硫酸钠XYAS C1X-C1Y烷基硫酸钠SS式2-丁基辛酸的仲皂表面活性剂25EY 与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C12-C15的直链伯醇45EY 与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C14-C15的直链伯醇XYEZS 每摩尔与平均Z摩尔环氧乙烷缩合的C1X-C1Y烷基硫酸钠非离子由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404销售的、平均乙氧基化程度为3.8和平均丙氧基化程度为4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇CFAA C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAA C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸盐无定型硅酸钠(SiO2∶Na2O比＝2.0)NaSKS-6 式d-Na2Si2O5的结晶层状硅酸盐碳酸盐 无水碳酸钠磷酸盐 三磷酸钠MA/AA 1∶4的马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约80000聚丙烯酸BASF GmbH以商品名PA30销售的平均分子量为酯约8000的聚丙烯酸酯均聚物沸石A 式Na12(AlO2SiO2)12.27H2O的水合硅铝酸钠，主要粒径为1-10微米柠檬酸盐柠檬酸三钠二水合物柠檬酸 柠檬酸过硼酸盐无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式为NaBO2.H2O2PB4 无水过硼酸钠四水合物过碳酸盐经验式为2Na2CO3.3H2O2的无水过碳酸钠漂白剂TAED四乙酰基乙二胺CMC 羧甲基纤维素钠DETPMP 由Monsanto以商品名Dequest 2060销售的二乙三胺五(亚甲基膦酸)PVP 聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS钠盐形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]异构体抑泡剂 25％熔点为50℃的石蜡，17％的疏水性二氧化硅，58％的石蜡油颗粒抑泡颗粒形式的12％硅氧烷/二氧化硅，18％硬脂剂醇，70％淀粉硫酸盐 无水硫酸钠HMWPEO 高分子量聚氧乙烯TAE 25 牛脂醇乙氧基化物(25)
洗涤剂实施例I可以按如下所示制备本发明粒状织物清洗组合物线性C12烷基苯磺酸钠 6.5硫酸钠 15.0沸石A 26.0次氮基三醋酸钠 5.0本发明的酶 0.1PVP0.5TAED 3.0硼酸 4.0过硼酸盐 18.0苯酚磺酸盐 0.1次要组份 至100洗涤剂实施例II可以按如下所示制备本发明的致密粒状织物清洗组合物(密度800g/l)45AS8.025E3S 2.025E53.025E33.0TFAA2.5沸石A 17.0NaSKS-6 12.0柠檬酸 3.0碳酸盐 7.0MA/AA 5.0CMC 0.4
本发明的酶 0.1TAED 6.0过碳酸盐 22.0EDDS 0.3粒状抑泡剂 3.5水/次要组份至100％洗涤剂实施例III按如下所示制备在洗涤彩色织物中特别有用的本发明粒状织物清洗组合物LAS 10.7 -TAS 2.4 -TFAA -4.045AS 3.1 10.045E7 4.0 -25E3S-3.068E111.8 -25E5 -8.0柠檬酸盐 15.0 7.0碳酸盐 -10柠檬酸 2.5 3.0沸石A32.1 25.0NaSKS-6 -9.0MA/AA5.0 5.0DETPMP 0.2 0.8本发明的酶 0.10 0.05硅酸盐 2.5 -硫酸盐 5.2 3.0PVP 0.5 -
聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物 - 0.2/乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物过硼酸盐 1.0 -苯酚磺酸盐0.2 -水/次要组份 至100％洗涤剂实施例IV可按如下所示制备本发明的提供具有“通过洗涤进行软化”的能力的粒状织物清洗组合物45AS - 10.0LAS 7.6 -68AS 1.3 -45E7 4.0 -25E3 - 5.0氯化椰油烷基二甲基羟乙基铵1.4 1.0柠檬酸盐 5.0 3.0NaSKS-6 - 11.0沸石A15.0 15.0MA/AA4.04.0DETPMP 0.40.4过硼酸盐 15.0 -过碳酸盐 - 15.0TAED 5.05.0绿土粘土 10.0 10.0HMWPEO - 0.1本发明的酶 0.10 0.05硅酸盐 3.05.0碳酸盐 10.0 10.0
粒状抑泡剂1.04.0CMC 0.20.1水/次要组份 至 100％洗涤剂实施例V可按如下制备本发明的重垢液体织物清洗组合物I II酸形式的LAS - 25.0柠檬酸 5.0 2.0酸形式的25AS8.0 -酸形式的25AE2S 3.0 -25AE7 8.0 -CFAA5 -DETPMP 1.0 1.0脂肪酸 8 -油酸- 1.0乙醇4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0本发明的酶 0.100.05氯化椰油烷基二甲基羟乙基铵 - 3.0绿土粘土- 5.0PVP 2.0 -水/次要组份 至 100％在纺织业中的用途在另一实施方案中，本发明涉及本发明内切葡聚糖酶在生物抛光加工中的用途。生物抛光是对纱线表面所作的一项特殊处理，可改善织物手感和外观方面的性质，但不会使织物可湿性受到损失。生物抛光最重要的效果可能在于绒毛和起球减少，光泽增加，织物手感改善，持久柔软性增强，水吸收性改变。生物抛光通常是在针织和机织织物生产的湿加工中进行的。湿加工包括一些步骤，例如脱浆、精炼、漂白、洗涤、染色/印花和整理。在各个处理步骤中，织物或多或少要进行机械作用。通常，在针织或机织得到织物后，还对织物进行脱浆，接着还进行精炼操作等等。脱浆是除去纺织品上浆料的过程。在纺织机上纺织之前，常常会用淀粉浆料或淀粉衍生物包覆经纱，以提高其抗张强度。纺织后，必须在对织物进一步加工之前除去浆料涂层，以确保均匀和耐洗涤。众所周知，为达到生物抛光效果，需要结合纤维素分解作用和机械作用。人们还知道，当结合进行纤维素酶处理和柔软剂常规处理，还可达到“超柔软性”。预计使用本发明内切葡聚糖酶进行纤维素织物的生物抛光比较有好处，例如可达到更彻底的抛光。也可应用WO93/20278所述方法达到生物抛光目的。
石洗已知通过在浮石存在下洗涤染色织物制成的粗斜纹棉布或劳动布，使织物的颜色局部变浅，或者通过酶促处理织物，特别是用纤维素分解酶处理，可以使织物，尤其是粗斜纹棉布织物或劳动布获得“石洗”外观(局部颜色磨损)。可用本发明内切葡聚糖酶按例如US4832864所述单独进行处理，或者与比传统工艺更少量的浮石一起使用，或者与如WO95/09225所述的珍珠岩一起使用。材料和方法生物体澳大利亚糖丝菌，IFO 14444，包含本发明纤维素酶编码DNA序列。
大肠杆菌，DSM 11476，含有在克隆载体pSJ1678中包含本发明纤维素分解酶编码DNA序列的质粒。其它菌株大肠杆菌菌株制备大肠杆菌SJ2细胞(Diderichsen，B.等人，(1990))，并使用购自BIORAD公司的Gene PulserTM电击仪，根据供应商的说明，电穿孔转化。质粒pSJ1678(参阅WO 94/19454，在此引用作为参考)。普通分子生物学方法使用分子生物学的标准方法(Sambrook等人，(1989)；Ausubel等人，(1995)；Harwood等人，(1990))进行DNA操作和转化。
根据供应商的说明书使用用于DNA操作的酶。编码本发明纤维素分解酶的DNA序列的分离包含SEQ ID NO.1所示编码本发明内切葡聚糖酶的DNA序列可通过使用本领域众所周知的方法(Sambrook等人，(1989))提取质粒DNA，从保藏生物体大肠杆菌DSM 11476中得到。澳大利亚糖丝菌内切-β-1，4葡聚糖酶基因的克隆染色体DNA的制备将澳大利亚糖丝菌菌株IFO 14444在TY-琼脂培养基上于30℃培养2～3天。从平板上刮下细胞，并用Pitcher等人描述的方法(1989)分离染色体DNA。对发表的方法的唯一改变是，往最初只含有溶菌酶的裂解缓冲液中加入30μg/ml变溶菌素(产品目录编号M-9901，SIGMA，USA)。染色体文库的构建染色体DNA用限制性酶Sau3A部分消化，并用0.7％琼脂糖凝胶电泳分离片段。将大小位于2-7kb的片段转移至DEAE-纤维素膜上(Dretzen等人，(1981))。
将分离得到的DNA片段连接到BamHI消化的pSJ1678质粒DNA上，并用连接混合物转化大肠杆菌SJ2。
将细胞在含0.1％CMC(羧甲基纤维素钠，Aqualon，法国)和9μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上涂板，并于37℃培养过夜。通过菌落杂交识别阳性克隆将如上文所述构建于大肠杆菌中的DNA文库，涂在含0.1％CMC(羧甲基纤维素钠，Aqualon，法国)和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，并于37℃培养过夜。随后将转化子复制到同类培养基平板上，并将这些新的平板于37℃培养8小时或过夜。
原始平板用1mg/ml刚果红(SIGMA，USA)染色。染色过程持续半小时，适度绕圈摇动，然后用1M NaCl清洗两次(每次15分钟)。
纤维素酶阳性克隆存在的地方会出现淡黄色的晕圈。在复制板上，这些阳性克隆被保留下来，将其在含0.1％CMC和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上重新划线，并于37℃培养过夜。阳性克隆的鉴定从重新划线的平板上，挑取内切葡聚糖酶阳性克隆的单菌落，并提取质粒。通过大肠杆菌SJ2的再转化确认表型，并通过限制性消化进行质粒鉴定。
使用Taq脱氧终端循环测序试剂盒(Perkin-Elmer公司，USA)，荧光标记的终止物和5pmol引物#3507，通过DNA测序进行内切葡聚糖酶基因的鉴定5′-GGC TTT TAA GCC GTC TGT ACG-3′.
在另一个反应中，使用引物#8392测定核苷酸序列5′-CTC ACG TTA AGG GAT TTT GGT CTG G-3′根据Devereux等人(1984)进行序列数据的分析。此序列对应于SEQ ID No 1显示的DNA序列。根据从这种方法得到的这第一个DNA序列，设计用于内切葡聚糖酶下一步测序的新引物，接着再设计用于再下一步测序的新引物，等等。培养基TY和LB琼脂培养基(如Ausubel等人(1995)描述的)。纤维素分解活性的测定相对于分析标准测定内切葡聚糖酶的纤维素分解活性，可以用ECU单位表示。
纤维素分解酶会水解CMC，因此降低培养混合物的粘性。造成的粘性降低可以用振动粘度计(例如MIVI 3000，Sofraser，法国)测定。
以ECU为单位的纤维素分解活性的测定，可以根据分析方法AF301.1进行。索要时可由申请人提供。
ECU实验通过测量样品降低羧甲基纤维素(CMC)溶液粘性的能力来量化样品中存在的催化活性的量。实验在40℃，pH7.5条件下进行，使用相对酶标准来测定CMC底物粘度的降低。
下列非限制性的实施例举例说明了本发明。实施例1澳大利亚糖丝菌IFO14444的内切-β-1，4-葡聚糖酶的克隆和表达按照材料和方法中描述的方法，进行澳大利亚糖丝菌IFO 14444基因组DNA的制备、内切葡聚糖酶基因的克隆和DNA测序。分离得到一阳性转化株DSM 11476，其中含有携带约2,300bp插入物的质粒pSJ1678。对这段插入物进行部分DNA测序，显示存在编码内切葡聚糖酶的基因序列。根据糖基水解酶的分类(Henrissat等人，1993)，内切葡聚糖酶属于糖基水解酶的家族6。
SEQ ID NO 1列出了该核苷酸序列。
相应于内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的DNA可由能得自保藏菌株DSM11476的质粒中得到。实施例2来自各种糖丝菌菌株的内切-β-1，4葡聚糖酶检验了下列菌株德克萨斯糖丝菌，NRRL B-16134，外外安德糖丝菌，NRRL B-16159，
喜冷糖丝菌，NRRL B-16238，糖丝菌属之种，IFO 13785，黄糖丝菌，ATCC 29533，淡蓝褐糖丝菌，ATCC 35108，长孢糖丝菌，ATCC 31109，易变糖丝菌易变亚种，ATCC 31520，气生菌落糖丝菌，ATCC 23870，易变糖丝菌荚膜亚种，ATCC 23892，丁香糖丝菌，DSM 43886。A.糖丝菌菌株的DNA杂交检验基因组DNA的制备在TY-琼脂培养基(含有2％可溶淀粉)上接种每一种糖丝菌菌株(参阅上文)，于25℃培养3-4天。收获细胞，并用Pitcher等人描述的方法[Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J.，(1989)。用硫氰酸胍快速抽提细菌染色体DNA。微生物应用通讯(Lett.Appl.Microbiol.)，8，151-156]分离染色体DNA。杂交条件用于测定核苷酸探针与同源DNA或RNA序列杂交的合适条件，包括将含有待杂交的DNA片段和RNA的滤膜在5×SSC(标准柠檬酸盐溶液)中预先浸泡10分钟，然后将滤膜在含5×SSC(Sambrook等人，1989)、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等人，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性超声波降解鲑鱼精DNA(Sambrook等人，1989)的溶液中预杂交，接着在含有随机起发(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.，1983，分析生物化学(Anal.Biochem.)，1326-13)的32P-dCTP标记(比活＞1×109cpm/μg)探针的相同溶液中于约45℃杂交12小时。然后将滤膜在2×SSC、0.5％SDS溶液中清洗两次，30分钟，洗涤温度优选至少55℃，更优选至少60℃，更优选至少65℃，甚至更优选至少70℃，尤其是至少75℃。实验方法探针pMB145的2.5kb片段(澳大利亚糖丝菌，IFO 14444)。结果所有菌株均与BamHI杂交。因此，所有菌株产生均属于家族6的内切-β-1，4葡聚糖酶。B.糖丝菌菌株的CMC-刚果红实验(通过菌落杂交鉴定阳性克隆)方法将菌株在麸皮培养基(麸皮4％，酵母提取物0.1％和琼脂1.5％)中于30℃培养4天。将琼脂栓放置在不同pH(pH5，7，9，10)的CMC实验平板上(基本成分CMC 0.1％，琼脂1.5％)。加入LAS(线性烷基硫酸盐)至终浓度为0.1％。在pH7使用AZCL-HE。于40℃培养过夜。然后将平板用刚果红染色，并且测量透明圈的直径(mm)。结果(直径，mm)
实施例3澳大利亚糖丝菌IFO 14444的内切-β-1，4葡聚糖酶的纯化和鉴定将实施例1的质粒插入到大肠杆菌JM109中。将大肠杆菌菌株在超级肉汤培养基(酪蛋白胰消化物32g/L，酵母提取物20g/L和NaCl5g/L，pH调至7.0)中于37℃培养1天。收集细胞并用超声波降解法破碎细胞。将上清液冻干。从13L发酵液中得到24克干粉，总活性4600ECU。纯化将干粉溶解于175ml离子交换水。使用4℃的50克Avicel，加到50mM磷酸缓冲液，pH7.5的层析柱上，并用高盐缓冲液(含0.5M NaCl的相同缓冲液)洗涤。用离子交换纯化水将酶洗脱。得到共2550ECU。样品中还有一些染料，用离子交换层析进一步纯化。用50mM Tris pH7.5平衡的HPQ柱结合洗脱的酶和染料，用NaCl梯度洗脱得到纯酶。鉴定纯化后的蛋白质在SDS-PAGE中只显示一条带，分子量50kDa，pI在3.7左右。
对ECU的比活性为50ECU/mg蛋白质。摩尔消光值113380是建立在氨基酸组成基础上的，得到E280/E260的比值为1.8和使用50kDa分子量时，用来测定蛋白质的浓度。
对磷酸溶胀的纤维素在pH8.5的催化活性，表观kcat为22sec-1，表观KM为0.6g/L。纤维素酶对PNP-β纤维素二糖苷没有活性。缓冲液所有酶实验在下列缓冲液中进行pH 3.0-3.5 0.1M柠檬酸钠pH 4.0-5.5 0.1M醋酸钠pH 6.0 0.1M MES钠缓冲液pH 6.5-7.5 0.1M MOPS钠缓冲液pH 8.0-8.5 0.1M巴比妥缓冲液pH 9.0-10.00.1M甘氨酸缓冲液pH活性曲线使用CMC得到pH活性曲线。CMC的终浓度为7.5g/L，于40℃保温20分钟，使用从Lever(1972)改进的对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定还原糖的形成。除1.5gPHBAH外，再加入5g酒石酸钾钠。最适pH为8.0，而且在pH6.5～9.0得到大于50％的相对活性。使用磷酸溶胀的纤维素(PASC)测定表观动力学常数如下制备PASC储存液取5g纤维素(Avicel)，用水弄湿，再加入150ml用冰预冷的正磷酸。在冰浴中缓慢搅动悬浮液1小时。在搅动中加入100ml用冰预冷的丙酮。将混合物转移到装有3号Pyrex耐热玻璃烧结板的布氏漏斗中，用100ml用冰预冷的丙酮冲洗三次，每次冲洗后尽可能抽干。最后用500ml水冲洗两次，每次冲洗后仍然尽可能抽干。将PASC与去离子水混合，至总体积300ml。(使用Ultra TurraxHomogenizer)混匀并在冰箱中储存不超过1个月。
使用下列步骤用缓冲液平衡底物取20g磷酸溶胀的纤维素PASC储存液以5000rpm速度离心20分钟，倒掉上清液，将沉淀重悬于30ml缓冲液。以5000rpm速度离心20分钟后，倒掉上清液，将沉淀重悬于缓冲液至30g。这相当于10mg/L的底物浓度。
为了测量动力学参数，使用底物浓度0.2-8mg/ml。在8个不同底物浓度下测定速率两次。使用Lever(1972)的方法测定还原性糖的量。
使用摩尔吸光度计算酶浓度。使用电脑程序GraFit(Leatherbarrow，1992)中的酶动力学方程计算表观动力学常数KM(app.)，Vmax(app.)和kcat(app.)。实施例4用来自澳大利亚糖丝菌IFO 14444的内切-β-1，4-葡聚糖酶处理织物引起抗张强度损失测定由于使用实施例3的纯化内切葡聚糖酶处理引起纺织品抗张强度的损失，并与真菌内切葡聚糖酶家族6进行比较。实验步骤缓冲液0.05M磷酸盐缓冲液pH7.0体积 100ml温度 室温纺织品预先老化的ED 9613829抹布5片，5×25cm剂量2x0，1000，10,000，100,000 ECU/L Carezyme59100 ECU/L MB1451900，19,000，190,000 ECU/L家族6纤维素酶时间7天暗处保存漂洗时间自来水冲洗10分钟测量间隔20+/-3秒，在Instron仪器5564上测量抗张强度损失将预先老化的织物在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中用不同剂量的酶处理一周。然后将织物用水漂洗，在空调室内适应24小时(60％RH，20℃)。在Instron仪器上测量抗张强度。与未经消化的预老化织物(参照)相比，计算出抗张强度的损失。比较实验包括空白(不加酶)和来自真菌Humicola insolens的EG VI(内切葡聚糖酶家族6)。结果
本发明的酶不会使抗张强度受到损失。实施例5在Terg-O-meter中的颜色澄清在此实施例中，使用在小型洗衣机(100ml Terg-O-meter)中测定对棉布颜色的保护作用，即“颜色澄清”的方法，证明了本发明的内切葡聚糖酶有复原棉织物颜色的能力。
将盛有100ml缓冲液(或洗涤剂)的250ml烧杯放置在Terg-O-Meter中，并平衡至35℃。然后将2片7×7cm的黑色机织棉布样品加入每只烧杯中，开动搅拌器，最后加入酶A)空白，B)三种不同剂量的标准品(例如商品化的酶制剂CelluzymeTM)，和C)两种不同剂量的本发明内切葡聚糖酶。然后于35℃保温30分钟。
保温30分钟之后，将样品用冷的自来水冲洗10分钟，并在滚筒干燥器中干燥。
重复一次保温、冲洗和干燥循环，或直到样品在颜色和/或样品表面绒毛方面有明显区别。
最后与空白(不加酶)和标准(例如Celluzyme)样品比较，给样品评分。由一组经过训练的评分员进行视觉评分，并用免除(remission)分光计测量颜色。表1中给出了用每活性单位酶得到的样品“颜色澄清”度(CC)表示的结果。表1<
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序列表(1)一般资料(i)申请人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)国家丹麦(F)邮政编码(ZIP)DK-2880(G)电话45 4444 8888(H)传真45 4449 3256(ii)发明题目来自糖丝菌的内切-β-1，4-葡聚糖酶(iii)序列数2(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC可兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度1470个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGCACCCCC GCTCGAAGAG ACCCCTCACC ACCAGACGCA AGGTCGTCCC GGCCGTCGCG 60GCCGGAACCG TCCTCGCCGG CGGCGTCACC GCCCTGACCT CCAACATCGC GCAGGCCGCC120GCCGGCTGCC GCGTCGACTA CGCCGTGACG AGCCAGTGGC CCGGTGGCTT CGGTGCAGCC180GTCACCGTCA CGAACCTCGG CGACCCGCTC TCGTCCTGGG AGCTGAGCTG GACGTTCCCC 240GACGGCCAGG GCGTGCAGCA GCTCTGGAAC GGCGTGCACT CGACCTCCGG TTCGAACGTC 300ACCGTGAAAG AAATGTCGTG GAACGGTTCG GTCGGCACCA ACGCCAGCGT CCAGGTCGGC 360TTCAACGGCT CCTGGAACGG CGCGAACAAC GCGCCGACGT CCTTCACGCT CAACGGCACC 420TCGTGCAACG GTGCGGTCGG TGGCCCGACG ACGGAGCCGA CGCCCGAGCC GACCCCGGAG 480CCCACGCCCG AGCCGACGCC GGAGCCGACG CCCGAGCCGA CGCCGGAGCC CACGCCCGAG 540CCGACGCCGG AGCCCACGCC CGAGCCGACC CCGGAGCCCA CGCCCGAGCC CACGCCCGAG 600CCCACGCCCG AGCCCACGAT GCCGCCGGTC CAGGCCGGTC AGTTCCACGT CGACACCACG 660AACCAGTCGT ACCGCGCCTG GCAGGCGGCC AGCGGCTCCG ACAAGGACCT GCTGGCGAAG 720ATCGCCCTGA CGCCGCAGGC GTACTGGGTC GGCAACTGGA ACGAAGCCTC GCACGCGCAG 780CAGGAAGTCC GTGACATCAC GTCGGCCGCT GCGGCCGCCG GCAGGACCGC CGTGCTCGTC 840GTCTACGCCA TCCCGGGCCG CGACTGCGGC CAGCACTCCA GCGGCGGCGT GTCGACCTCC 900GAGTACGCGC AGTGGATCGA CACGGTCGCC CAGGGCATCG TCGGCAACCC GTGGGTGGTC 960CTCGACCCCG ACGCGCTGCC GATGCTCGGC GACTGCGACG GCCAGGGCGA CCGGGTCGGC 1020TTCCTCAAGT ACGCCGCGAA GTCCCTGACC GCCAAGGGTG CGCGCGTCTA CATCGACGCC 1080GGCCACTCGG CGTGGCTGTC GCCGTCGGAA GCCGCGAACC GCCTCAACCA GATCGGGTTC 1140GAGGACGCCG TGGGCTTCTC GATCAACGTC TCCAACTACC GCACGACGGC GGAGTCGAAG 1200ACCTGGGGTC AGCAGGTCTC GCAGCTGACC GGTGGCAAGA AGTTCGTCAT CGACACGTCG 1260CGCAACGGCA ACGGCCCGTC CGGGTCGGAA TGGTGCAACC CGAGCGGCCG CGCCCTCGGC 1320GAGCGCCCGA CGCTCGTGAA CGACCGCAGC GGGCTCGACG CGCTGCTGTG GATCAAGCTG 1380CCCGGTGAGT CGGACGGCGC CTGCAACGGC GGCCCGGGCG CCGGTCAGTG GTGGCACTCC 1440ATGGCACTGG CTGGCCGCAA CGCGAAGTGG 1470(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度490个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID N02Met His Pro Arg Ser Lys Arg Pro Leu Thr Thr Arg Arg Lys Val Val1 5 10 15Pro Ala Val Ala Ala Gly Thr Val Leu Ala Gly Gly Val Thr Ala Leu20 25 30Thr Ser Asn Ile Ala Gln Ala Ala Ala Gly Cys Arg Val Asp Tyr Ala35 40 45Val Thr Ser Gln Trp Pro Gly Gly Phe Gly Ala Ala Val Thr Val Thr50 55 60Asn Leu Gly Asp Pro Leu Ser Ser Trp Glu Leu Ser Trp Thr Phe Pro65 70 75 80Asp Gly Gln Gly Val Gln Gln Leu Trp Asn Gly Val His Ser Thr Ser85 90 95Gly Ser Asn Val Thr Val Lys Glu Met Ser Trp Asn Gly Ser Val Gly100 105 110Thr Asn Ala Ser Val Gln Val Gly Phe Asn Gly Ser Trp Asn Gly Ala115 120 125Asn Asn Ala Pro Thr Ser Phe Thr Leu Asn Gly Thr Ser Cys Asn Gly130 135 140Ala Val Gly Gly Pro Thr Thr Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu145 150 155 160Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu165 170 175Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu180 185 190Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Pro Glu Pro Thr Met Pro195 200 205Pro Val Gln Ala Gly Gln Phe His Val Asp Thr Thr Asn Gln Ser Tyr210 215 220Arg Ala Trp Gln Ala Ala Ser Gly Ser Asp Lys Asp Leu Leu Ala Lys225 230 235 240Ile Ala Leu Thr Pro Gln Ala Tyr Trp Val Gly Asn Trp Asn Glu Ala245 250 255Ser His Ala Gln Gln Glu Val Arg Asp Ile Thr Ser Ala Ala Ala Ala260 265 270Ala Gly Arg Thr Ala Val Leu Val Val Tyr Ala Ile Pro Gly Arg Asp275 280 285Cys Gly Gln His Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Ser Glu Tyr Ala Gln290 295 300Trp Ile Asp Thr Val Ala Gln Gly Ile Val Gly Asn Pro Trp Val Val305 310 315 320Leu Asp Pro Asp Ala Leu Pro Met Leu Gly Asp Cys Asp Gly Gln Gly325 330 335Asp Arg Val Gly Phe Leu Lys Tyr Ala Ala Lys Ser Leu Thr Ala Lys340 345 350Gly Ala Arg Val Tyr Ile Asp Ala Gly His Ser Ala Trp Leu Ser Pro355 360 365Ser Glu Ala Ala Asn Arg Leu Asn Gln Ile Gly Phe Glu Asp Ala Val370 375 380Gly Phe Ser Ile Asn Val Ser Asn Tyr Arg Thr Thr Ala Glu Ser Lys385 390 395 400Thr Trp Gly Gln Gln Val Ser Gln Leu Thr Gly Gly Lys Lys Phe Val405 410 415Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gly Asn Gly Pro Ser Gly Ser Glu Trp Cys420 425 430Asn Pro Ser Gly Arg Ala Leu Gly Glu Arg Pro Thr Leu Val Asn Asp435 440 445Arg Ser Gly Leu Asp Ala Leu Leu Trp Ile Lys Leu Pro Gly Glu Ser450 455 460Asp Gly Ala Cys Ash Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gln Trp Trp His Ser465 470 475 480Met Ala Leu Ala Gly Arg Asn Ala Lys Trp485 490
权利要求
1.包含具有内切-β-1，4葡聚糖酶活性之酶的酶制剂，该酶可以从属于糖丝菌属的菌株得到或是其内源酶。
2.根据权利要求1的制剂，其中所述菌株选自澳大利亚糖丝菌，德克萨斯糖丝菌，外外安德糖丝菌，喜冷糖丝菌，黄糖丝菌，淡蓝褐糖丝菌，长孢糖丝菌，易变糖丝菌荚膜亚种，气生菌落糖丝菌，易变糖丝菌易变亚种，丁香糖丝菌，糖丝菌属之种。
3.根据权利要求2的制剂，其中所述菌株为澳大利亚糖丝菌IFO14444，德克萨斯糖丝菌NRRL B-16134，外外安德糖丝菌NRRL B-16159，喜冷糖丝菌NRRL B-16238，黄糖丝菌ATCC29533，淡蓝褐糖丝菌ATCC35108，长孢糖丝菌ATCC31109，易变糖丝菌荚膜亚种ATCC23892，气生菌落糖丝菌ATCC23870，易变糖丝菌易变亚种ATCC31520，丁香糖丝菌DSM43886，或糖丝菌属之种IFO 13785。
4.根据权利要求1-3任何一项的制剂，其中内切-β-1，4葡聚糖酶属于糖基水解酶家族6。
5.根据权利要求1-4任何一项的制剂，其中内切-β-1，4葡聚糖酶在pH4-11范围内有活性，优选在pH5.5-10.5范围内有活性。
6.一种内切-β-1，4葡聚糖酶，它是(a)由澳大利亚糖丝菌IFO 14444产生的多肽，或(b)包含SEQ ID NO2第226-490位所示氨基酸序列的多肽，或(c)(a)或(b)定义的多肽的类似物，该类似物与所述多肽至少75％同源，或由所述多肽通过取代、删除或添加一个或多个氨基酸而衍生得到，或与针对所述多肽的纯化形式产生的多克隆抗体有免疫学反应性。
7.编码具有内切-β-1，4葡聚糖酶活性的多肽的分离多核苷酸分子，其选自(a)包含SEQ ID NO1第676-1470位核苷酸所示序列的多核苷酸分子；(b)编码与SEQ ID NO2第226-490位氨基酸残基的序列至少80％相同的多肽的多核苷酸分子；和(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列。
8.根据权利要求7的分离多核苷酸分子，其中多核苷酸为DNA。
9.编码具有内切-β-1，4葡聚糖酶活性的多肽的分离多核苷酸分子，该多核苷酸分子与变性的双链DNA探针在中度严格条件下可杂交，其中所述探针选自包含SEQ ID NO1第676-1470位所示序列的DNA探针和包含SEQ ID NO1第676-1470位序列的长度至少约100bp的亚序列的DNA探针。
10.根据权利要求9的分离多核苷酸分子，该多核苷酸分子由原核生物，优选细菌，更优选革兰氏阳性细菌的DNA文库分离得到，或在此基础上产生的。
11.根据权利要求10的分离多核苷酸分子，该多核苷酸分子由属于放线菌纲，优选假诺卡氏菌科，更优选糖丝菌属，特别是澳大利亚糖丝菌，尤其是澳大利亚糖丝菌IFO 14444的菌株的DNA文库分离得到，或在此基础上产生的。
12.根据权利要求7-11任何一项的分离多核苷酸分子，该多核苷酸分子分离自大肠杆菌DSM 11476。
13.根据权利要求7-12任何一项的分离多核苷酸分子，该多核苷酸分子还包含编码纤维素结合结构域(CBD)的部分DNA序列。
14.根据权利要求13的分离多核苷酸分子，其中编码纤维素结合结构域(CBD)的部分核苷酸序列相应于SEQ ID NO1第60-435位核苷酸序列。
15.根据权利要求13或14的分离多核苷酸分子，该多核苷酸分子还包含编码连接区的部分核苷酸序列，该连接区将所述分离多核苷酸分子所含核苷酸序列所编码之酶的纤维素结合结构域(CBD)和催化活性结构域(CAD)可操作连接在一起。
16.包含下列可操作连接元件的表达载体转录启动子；DNA片段，其选自(a)编码具有内切-β-1，4葡聚糖酶活性的多肽、包含SEQID NO1第676-1470位核苷酸所示序列的多核苷酸分子，(b)编码具有内切-β-1，4葡聚糖酶活性，与SEQ ID NO2氨基酸序列第226-490位至少75％相同的多肽的多核苷酸分子，和(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列；和转录终止子。
17.导入了权利要求16的表达载体的培养细胞，其中该细胞表达该DNA片段编码的多肽。
18.根据权利要求17的细胞，该细胞为原核细胞，特别是细菌细胞，或具内切葡聚糖酶活性之多肽的DNA编码片段最初起源的内源细胞。
19.根据权利要求17的细胞，其中该细胞属于芽孢杆菌属菌株，优选枯草芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌菌株。
20.根据权利要求17的细胞，其中该细胞属于澳大利亚糖丝菌菌株，优选澳大利亚糖丝菌IFO 14444菌株。
21.根据权利要求17的细胞，其中该细胞属于假单孢菌属菌株，优选荧光假单胞菌或门多萨假单胞菌菌株。
22.根据权利要求17的细胞，其中该细胞属于链霉菌属菌株。
23.根据权利要求17的细胞，其中该细胞属于酵母属菌株，优选酿酒酵母菌株。
24.具有内切-β-1，4葡聚糖酶活性的多肽的制备方法，包括培养已导入权利要求16的表达载体的细胞，所述细胞由此表达DNA片段所编码的多肽；和回收该多肽。
25.包含权利要求6的纯化多肽的酶制剂。
26.根据权利要求1或25的制剂，其中还包括一种或多种选自下述的酶蛋白酶、纤维素酶(内切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、果胶酸酯分解酶、木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、其它甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶；或其混合物。
27.具有内切-β-1，4葡聚糖酶活性的分离酶，该酶(i)不含同源杂质，且(ii)根据权利要求24的方法生产。
28.大肠杆菌DSM 11476菌株的基本上纯的分离生物学培养物。
29.权利要求6或27的酶或者权利要求1-5，25和26中任何一项的酶制剂，在纺织业中改善纤维素纤维或织物的特性或者提供粗斜纹棉布的石洗外观的用途；或在工业清洗过程中的用途。
30.包含权利要求6或27的酶或者权利要求1-5，25和26中任何一项的酶制剂的洗涤组合物。
31.包含权利要求6或27的酶或者权利要求1-5，25和26中任何一项的酶制剂的织物柔软组合物。
全文摘要
含有具内切－β－1,4－葡聚糖酶活性之酶的酶制剂,所述酶可获自诸如澳大利亚糖丝菌,IFO14444之类糖丝菌属菌株,或是其内源酶;编码具内切－β－1,4－葡聚糖酶活性的酶或酶核心(酶的催化活性结构域)的分离多核苷酸(DNA)分子,其选自:(a)含如SEQ ID NO:1第676—1470位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子;(b)所编码多肽与SEQ ID NO:2第226—490位氨基酸残基的氨基酸序列至少80%相同的多核苷酸分子;及(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列,所表达的内切葡聚糖酶和酶制剂可用于洗涤剂或织物柔软组合物中,或用于纺织工业中用以改善纤维素纤维或织物的特性或提供斜纹粗棉布的石洗外观。
文档编号C11D3/00GK1261913SQ98806769
公开日2000年8月2日 申请日期1998年6月30日 优先权日1997年7月4日
发明者M·E·伯约恩瓦德, M·哈塔克亚马, M·舒莱因, J·B·尼尔森 申请人:诺沃挪第克公司