含il-ii和毒素基因片段的分子导向药物的基因克隆及表达的制作方法

专利名称：含il-ii和毒素基因片段的分子导向药物的基因克隆及表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含白介素II和免疫毒素基因片段的分子导向药物的基因克隆及表达，具体地将涉及含白介素II和绿脓毒素基因片段的分子导向药物的基因克隆及表达，及其在克隆和表达过程中使用的载体，工程菌和表达产物。
导向治疗目前已成为现代治疗学中十分看好的一只独秀，具有很强的生命力，所述的导向治疗即利用特异地结合细胞表面受体的配基作为载体将毒性基团(TOXICMOIETY)等弹头引导至体内非正常组织，将其杀死从而达到治疗作用。早在本世纪初，德国的Paul Eeh根据抗原抗体结合原理，提出了针对肿瘤细胞的″魔弹″的概念(Himmelwell，F.1960.The collected Papersof Paul Ehrich Vol，3 Pergamon)，此后，全世界众多的科学家在此基础上进行了大量有益的研究探讨，使导向药物的研究有了巨大的发展。作为导向药物的弹头经历了重金属、同位素、抗生素、细胞因子及酶抑制剂等过程进年来广泛采用的是毒性极强的细菌性或植物来源的蛋白毒素，如绿脓毒素、白喉毒素、相思豆毒素、蓖麻毒素和蒴莲根毒素等。这种以蛋白毒素作为弹头的导向药物又称为免疫毒素，它成为当前导向药物的主流。
免疫毒素的发展经历了三个阶段，第一阶段的免疫毒素是由包含A、B肽链的完整毒素和抗体的交联物，本领域技术人员熟知，白喉毒素、相思豆毒素、蓖麻毒素和蒴莲根毒素等均由A、B两条链组成，单独的一条肽链对细胞或整个动物都没有毒性。B链负责结合到大部分细胞膜的受体上，A链穿透细胞膜完成抑蛋白合成的致死作用，参见Moolten，F.L.and Cooperband，S.R.(1990).Science 169，68-70；Mool ten，F.L.，Capparell，N，J.，Zajdel，S.H.and Cooperband，S.R.(1975).J.Nat.Cancer Inst.55，473-477。为了产生强列而有选择性的细胞毒作用，人们将毒素的A链连接到与细胞结合的实体，如抗体分子上，完全去除毒素的B链，利用完整毒素所遇到的非特异性结合的问题就可以解决，这样的结合物对动物无毒性，此乃第二代免疫毒素。参见Masuho，Y.，Hara，T.andTeruhisa，N.(1979).Biochem.Biophys.Res.Commun.91，143-151；Masuho Y.and Hara，T.(1980).Gann 71，759-765；Miyazaki，H.，Beppu，M.，Terao，T.and Osawa，T(1980).Gann 71，766-774.。
近年来，随着现代分子生物学特别是基因工程和蛋白工程的发展，已对很多作为载体的配体及作为弹头的毒素的分子结构和基因结构有了深入的了解，使设计免疫毒素不必再采用分子量很大的整个毒素分子和整个抗体分子，而是选用配基中与受体结合的功能区(DOMAIN)的基因和毒素中跨膜和毒性基团的基因，按导向治疗的目的要求，在基因水平上组合出新的重组免疫毒素基因，并可按照人为修饰改造不同的基团，使其功能按照人们的要求发生一定程度的改变，这种重组的基因片段表达后即可产生第三代的免疫毒素，即基因工程重组免疫毒素，也称分子导向药物。这种毒素的载体通常采用蛋白抗体的最小结合片段、细胞生长因子、激素和CD4等，而弹头则通常采用细菌毒素，如去掉结合部位的绿脓毒素PE40及白喉毒素DT388。由于第一、第二代毒素是应用某些异型双功能交联剂使毒素和抗体通过二硫键或硫醚键交联，这种化学制备方法比较复杂，得率低，欠安全，而且在体内不稳定，加速了免疫毒素的降解，毒素部分含有的糖残基使得这类免疫毒素在体内很快被清除，毒素和抗体的结合物由于分子量大，因此渗透性差，并且容易引起机体对这类免疫毒素的免疫中和反应，而基因工程重组毒素中毒性基团与导向载体的偶联是基因之间的融合，且对弹头和载体的修饰可使免疫毒素分子量达到最小，这样就增强了免疫毒素的特异性、稳定性、渗透性，降低了免疫原性，另外应用基因工程的方法，易于大规模生产，高产率，高纯度以及成本低廉，如见Siegall CB et al.，FASER J，1989；32647；Chaudhary VK et al.，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，1990；871066； Batra JKet al.，Bio Chem.1990；26515198等等。
现有技术中已知，EP0-369-316-A2中Ju，GraceW等人用人的完整的IL-2 cDNA取代绿脓毒素基因PE中的细胞结合区Domain I，表达出IL-2-PE40融合蛋白，实验证明该融合蛋白对携带有IL-2R的活化T细胞有显著杀伤作用，而对没有IL-2R的T细胞没有毒性作用(Lorberboum-Galsi H et al.Proc.Acad.Sci.USA，1988 851922)。因此，这类药物在治疗或预防移植排斥、自身免疫性疾病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、T淋巴细胞白血病、艾滋病、克隆氏病等疾病中超重要作用。
值得注意的是，现有技术还是存在着不足，这种IL-2-PE40融合蛋白同时存在着由IL-2和绿脓毒素所造成的免疫源性，容易引起毒付作用。本发明人在实践中发现，IL-2分子前的60个氨基酸的基因片段，本文以下简称IL-2(60)，是IL-2分子同受体结合的结合功能区(BINDING DOMAIN)，因此，IL-2(60)基因区段可以在由IL-2R阳性细胞疾病的分子导向治疗中充当靶向性部分。这种对IL-2-PE40基因结构的改变或修饰所产生的益处对本领域技术人员来说是不言而寓的。
本发明的目的在于提供一种含有白介素Ⅱ结合功能区的基因片段直接与绿脓毒素基因片段融合的核苷酸序列。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述核苷酸序列的重组表达载体。
本发明的再一目的在于提供一种合有上述重组表达载体的大肠杆菌；以及本发明的再一目的在于提供一种由合上述重组表达载体的大肠杆菌表达出的融合蛋白，该重组表达载体合有白介素II结合功能区的基因片段直接与绿脓毒素基因片段融合的核苷酸序列。
为了完成本发明之目的，本发明采用如下技术方案本发明涉一种含有白介素II基因片段和绿脓毒素基因片段的核苷酸序列，其特征是所述的白介素Ⅱ结合受体功能区的基因片段直接与绿脓毒素基因片段融合。其中，所述的白介素II基因片段具有第一功能区的功能。所述的绿脓毒素基因片段具有第二和第三功能区的功能。本发明之绿脓毒素可穿透受体细胞，并携带该融合蛋白进入胞内(区段二)，和在胞内破坏细胞正常蛋白合成，从而致死细胞(区段三)。本发明扩增并克隆了绿脓毒素基因PE40区，该基因区段编码穿透细胞膜的Domain II和抑制蛋白合成的Domain III区，而不合绿脓毒素中同细胞膜结合的Domain I区，因而可以作为分子导向药物构建中的毒素部分广泛应用。本发明的关键在于选用了尽可能短的弹体，即只用与细胞受体结合部分的功能区蛋白的基因片段，如IL-2部分蛋白基因片段，同绿脓毒素蛋白基因片段，如PE40，融合形成一核苷酸序列，这种核苷酸序列的例子可以是序列表中序列标识号1的序列。
本发明还涉及一种重组表述载体，该载体含有白介素II结合功能区的基因片段直接与绿脓毒素基因片段融合的核苷酸序列。所述的重组表达载体可是重组质粒pZMl0。
当然，本发明还涉及合有pZM-10表达载体的大肠杆菌，即E.coli JBDE3/(tets)/pZM-10。该菌已于1994年8月22日在中国武汉CCTCC保藏，其保藏号为CCTCC M 94054。
另外，本发明还涉及由所述的含有pZM-10表达载体的大肠杆菌，即E.coli JBDE3/(tets)/pZM-10表达出的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为下文序列表中所述的序列标识号2的序列中所对应的氨基酸序列。
外源基因在大肠杆菌中的表达，可因宿主细胞启动子，SD序列与起始密码ATG之间的距离及表达产物等诸多因素的影响而不同。本发明将IL-2(60)-PE40插在pBV220上，插入pT7-10中则表达量较高，由于SD序列与ATG之间的距离是相同的，因此，被认为这可能是由于T7启动子和PRPL启动子对不同基因作用不同的缘故。PE40基因中G＋C含量接近70％，比较起来，T7启动子可能有较强的推动RNA聚和酶超越二级结构进行转录的功能。美国哈佛医学院构建的pT7-7表达系统可以把表达质粒存放在其它宿主中，在需要表达时，才将其转入含T7 RNA聚合酶的表达宿主，如JBDE3，这样就保证了重组表达质粒的稳定性和可靠性。本发明中构建的JBDE3/IL-2(60)-PE40-pT7-7的表达近二年来一直很稳定也说明了这一点。
外源基因在原核细胞中高水平表达，往往会形成不溶性的包涵体。包涵体的形成避免了细菌蛋白的降解，也会降低对细胞的毒性，但也引起蛋白复性的问题，在盐酸胍裂解后，通过复性后柱层析等方法纯化可得到均一的融合蛋白。
本发明的优点如下首先，本发明中的IL-2(60)通过Asp-Glu-Leu-Met与PE40(253aa-613aa)连接。
另外，本发明所采用的PE40与EP0-369-316-A2中的PE40也有所不同，其一为PE272氨基酸由Phe(TTC)变为Ser(TCC)；其二为PE338aa由Leu(CTG)变成Leu(CTT)；其三为PE459aa由Ser(AGC)变成Asn(AAC)。
其次，本发明中大胆地采用了IL-2分子中的前60个氨基酸[即IL-2(60)]作为导向载体，它只含有IL-2 N-端前60个氨基酸，从理论上讲保留了IL-2分子与其受体的结合部位，而又不合IL-2生物活性所必需的肽段部分，同国外报道的完整IL-2同PE40融合物相比，由于分子量减少了38KD。本发明将IL-2-PE40改建成IL-2(60)-PE40是重大的设计改变。这一改变切去了IL-2第二和三功能区段，保留了IL-2的第一功能区段。这种改变不仅改变了IL-2的三维立体结构，也改变了IL-2PE40的三维立体结构。这一改变保持了IL-2-PE40的功能，即生物活性。
再次，把IL-2改变为IL-2(60)的优点之一是，切去了在IL-2第二和三两个区段中的两个半胱氨酸(Cys)。这样，避免了在蛋白质纯化的过程中，经变性与复性处理经常造成三个Cyc之间二硫键错配导致IL-2失活的危险。在IL-2(60)中只有一个Cyc，其硫键显然是游离的。因为，由于势能关系，它不会与PE40中距离较远的4个Cyc发生错配。
本发明的IL-2(60)-PE40经变性与复位后，生物学活性很强，说明没有二硫键配错失活的情况发生。
再者，动物与临床试验表明，IL2有较大的毒副作用，主要原因在于IL-2的第二和第三区段。本发明切除了IL-2的上述区段，消除了IL-2引起毒副作用的根源。
最后，IL-2-PE40临床上易引起免疫过敏反应，主要原因是PE40。本发明将其改变成IL-2(60)-PE40，缩短了肽链(分子量变小)，在免疫原性方面比IL-2-PE40要弱。
因此有希望成为一种有应用前途的临床新药，在抗器官移植排斥、自身免疫病、成人T淋巴细胞白血病及AIDS等方面发挥作用。
附图简要说明

图1是实施例7中所述的重组质粒pZM-1的构建图。
图2是实施例8中所述的重组质粒pZM-4的构建图。
图3是实施例9中所述的重组质粒pZM-7的构建图。
图4是实施例10中所述的重组质粒pZM-10的构建图。
图5是实施例11中PE40的PCR扩增产物的琼脂糖电泳分析结果其中，(1.0％agarose)1Temple DNA2-7PCR(pE40)产物8标记物 pBR322/BstNI9标记物 λDNA/EcoRI＋HindIII图6是实施例12中重组质粒pZM-1的酶切鉴定电泳分析图其中，1pZM-l/EcoRI 4pZM-1/BamHI2pZM-1/PstI 5pUCl9/EcoRI3pZM-1/AccI6标记物λDNA/EcoRI＋HindIII21226，5148，4973，4277，3530，2027，1904，1584，1330，983，831，125图7是实施例12中重组质粒pZM-1的酶切鉴定电泳分析图其中，2，3，4，5pZM-1/EcoRI＋PstI1λDNA/EcoRI＋HindIII图8是实施例13中重组质粒pZM-1的酶切鉴定电泳分析图其中，2，3，4，5pZM-1/ApaI1λDNA/EcoRI＋HindIII图9是实施例14中重组质粒pZM-4的酶切鉴定电泳分析图其中1pZM-4/EcoRI＋PstI2pZM-4/PstI3pBR322/BstNI4标记物λDNA/EcoRI＋HindIII图10是实施例15中所述的重组质粒pZM-7的酶切分析电泳图，其中ApZM-7/SacIBpZM-7/SacI＋EcoRICpBR322/MspI DpBR322/BstNIE标记物λ/EcoRI＋HindIII图11是实施例16中所述的重组质粒pZM-10的酶切分析电泳图，其中，1标记物λ/EcoRI＋HindIII2pZM-10/PstI＋NdeI3pZM-10/NdeI4pZM-10/PstI图12是实施例18中所述的IL-2(60)-PE40的纯化电泳图2IL-2(60)-PE401蛋白标记(200，97，68，43，29，18，14KD)图13是实验例1中所述的IL-2(60)-PE40对CTLL和P815细胞的细胞毒性。
图14是实验例1中所述的IL-2(60)-PE40对L1210和KB细胞的细胞毒性。
以下将结合附图实施例进一步描述本发明的技术方案
绿脓毒素基因PE40区的克隆和序列分析以下为实施例1-14中采用的实验材料菌种、质粒、DNAPAl03购自ATCC，分泌绿脓毒素的标准绿脓杆菌菌株DH5α其基因型为sup E44，Δlac U169，(φ80 lac ZΔM15)hsdRl7，rec A1，end A1，gyr A96，thi-1，rel A1JM103其基因型为ΔLac pro，thi，StrA，Sup E，end A，Sbc B15，hsd R4，F′tra D36，pro A B，Lac lq，ZΔM15pUC19pBV220预防医学科学院病毒所构建，含λCI857，λPRPL串联启动子，核糖体rrnB基因转录终止信号单链寡核苷酸41mer和43mer，IL-2(60)的PCR引物起始引物(33mers)NdeI5′＞AGCA GAATTCAT[TAG GCA CCT ACT TCA AGT TCT]＜3′EcoRI半引物(32mers)5′＞AGAC GAGCTC GTC[TAG ACA CTG AAG ATG TIT C]＜3′SaCT
以上的引物由中国科学院微生物所合成λDNA/EcoRI＋HindIII华美生物工程公司产品(分子量大小分别为21226，5148，4973，4277，3530，2027，1904，1584，1330，985，831，125bp)pBR322/BstNI协和友谊公司产品(分子量大小分别为1857，1060，929，383bp)工具酶PCR扩增试剂盒为上海复旦大学产品T7 DNA测序试剂盒为美国Promaega公司产品T4 DNA连接酶和大肠杆菌聚合酶I大片段为德国Boehringer Manheim公司产品蛋白酶K为美国BRL公司产品溶菌酶和RNase为美国Sigma公司产品SalI等其他限制性内切酶为协和友谊公司产品化学试剂胰蛋白胨和酵母浸出物为英国Oxoid公司产品X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)，CsCl，ATP和溴乙锭为德国Boehringer Manheim公司产品回收用琼脂糖、IPTG、和TEMED为美国BRL公司产品Sephadex G-50为Pharmacia公司产品α-35S-dATP为Amersham公司产品SDS为华美生物工程公司产品丙烯酰胺为日本进口分装N-N′-甲叉双丙烯酰胺为Merck公司产品分析纯尿素为中国医药公司北京分公司进口分装其它分析纯试剂均为北京化学试剂商店的国产分析纯试剂主要培养基及缓冲液1.培养基各种培养基均按文献J.Sambrook等人的方法配制(J.Sambrook et al.，MolecilarCloning，a Laboratory Manual，Second Edition)2.缓冲液TE，STE，TAE，TBE，均按上述J.Sambrook等人的方法配制Klenow反应缓冲液(10×)0.5mol/L Tris·Cl(PH7.6)0.1mol/L MgC12实施例1.细菌Total DNA的制备单菌落接种100ml LB过夜培养，6,000rpm，15分钟离心收集菌体，STE洗细胞两次，加5ml TE悬浮细胞，加5mg溶菌酶，0.5 ml EDTA(100mM)，然后37℃短暂水浴至溶液变粘(3-5分钟)，迅速加入SDS至1％浓度，蛋白酶K至50-100ug/ul，用玻棒温和地十分小心地混匀。37℃水浴20-30分钟，然后用TE稀释至50ml，酚抽提五次，氯仿抽提三次，每次用大口径移液管(出口直径大于0.3cm)将粘稠的水相转移，二倍体积乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后干燥(不要等完全干燥，否则极难溶解)，加0.5ml TE，水浴振荡溶解。实施例2.寡核苷酸引物的纯化按Narang，S.A.等人和Itakura，K.等人的方法(Narang，S.A.et al.，Chemic al synthesis ofdeoxyoligonucleotides by the modified trestermethod.Met hods Enzymol.65610；Itakura，K.et al.，Synthesis and use of syntheticoligonucleotides.Annu.Rev.Biochem.53323)合成的每管DNA样品，用500ul饱和尿素溶解，加150ul尿素饱和的6×溴酚兰载样buffer，用16％聚丙烯酰胺凝胶(7mol/L尿素)电泳分离(用制备性梳子，每孔长12.5cm，高4.5cm，厚0.4cm)，600V，10小时后，溴酚蓝迁移至底部时结束电泳，剥落凝胶，平铺于萤光硅胶板上，紫外灯照射观察，切下移动最慢的DNA片段带，以0.5N Nacl水溶液浸泡切下的凝胶，37℃水浴过夜。玻璃棉滤除凝胶块，收集滤液，于UV-120-02分光光度计上测260nm波长的OD260值。估算粗产品的量。然后，SEP-PAK C18反相柱进一步纯化，SEP-PAK C18反相柱先用甲醇过夜浸泡，再依次用10ml甲醇，60％甲醇水溶液和双蒸水洗涤柱子。将上述浸泡滤液反复上柱4-6次，直至洗脱液的OD260＜0.1(或洗脱液OD260小于上柱前总OD260的5-10％)将DNA结合到柱上。洗脱前先用10ml双蒸水洗涤柱子，以洗去无机盐离子。然后用2ml新配制的60％甲醇反复洗柱子3-5次，使大部分DNA洗脱下来，OD260定量。合并所有洗脱液，测OD260定总量。分装成约400ul一小管在eppendorf管中进行冷冻抽干，-20℃存放。实施例3质粒的制备采用碱裂解法，系根据上述J.Sambrook等人介绍的方法改进挑选单个菌落接种到5ml含抗菌素的LB培养基中，37℃活化过夜，次日转种到100ml LB培养基中，37℃震摇培养至OD600≈0.8时，加入氯霉素达170ug/ml，使质粒扩增。继续在37℃培养18-24小时后，离心5,000rpm，4℃收集细菌，混悬于6ml溶液I(50mM葡萄糖，50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA，含溶菌酶3mg/ml)。冰浴10分钟后，加溶液II(1％SDS，0.2N NaOH)12ml。冰浴5分钟，加溶液III(3M KAc，2MHAc，pH4.8)9ml，冰浴30分钟后，离心7,000rpm，4℃，30分钟去沉淀，加等体积酚氯仿(1∶1)抽提，然后加0.6倍体积的异丙醇，离心沉淀DNA。按上述J.Sambrook等人相同的方法进行质粒的酶切。实施例4.DNA片段的回收与纯化DNA电泳后，将所需DNA片段从琼脂糖凝胶上切下并电洗脱回收，回收的DNA分别用Elutip TM-d柱纯化，方法如下(1)柱的预处理用5ml注射器吸取2ml高盐溶液(1.0M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.4)缓慢通过柱子，再取另一5ml注射器吸取5ml低盐溶液(0.2MNaCl，20mM Tris-HCl，pH7.4)通过柱子。
(2)上柱DNA样品溶于低盐中缓慢通过柱子，DNA结合于其上，用2-3ml低盐溶液洗注射器，并缓慢过柱。
(3)洗脱用高盐溶液400ul缓慢过柱，收集过柱液，再次缓慢过柱，另取新高盐溶液400ul同法处理，合并过柱液，乙醇沉淀回收DNA。实施例5 DNA片段的连接与转化将内切酶切成线状的载体与插入片段按一定比例(1∶5-10)混合，65℃水浴后，迅速置于冰浴中，依次加入10×T4连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为10-20ul，4℃连接过夜或16℃连接4小时。
取5ul连接混合物，稀释到100ul 75mM CaCl2中，再力200ul CaCl2致敏的宿主细胞，冰浴1小时，再42℃2分钟，然后加入等量LB，在37℃或30℃(当质粒上带PL启动子时)震摇1小时，然后涂在含抗菌素的平板上培养。按上述相同的J.Sambrook等人文献的方法进行小量快速抽提质粒。实施例6.PCR扩增PE40基因PCR扩增方法参见文献(Henry A.ErlichPCRTechnology，principles and Applications forDNA Amplification，Stockton Press，1989)提供的一些方法，在新的0.5ml eppendorf管中，依次加入PA103总DNA(OD260＝4)2ul引物(50pmol/ul) 各1ul10×buffer 5ul
dNTPs(5mM) 2ulBSA(10ug/ul) 1ulDMSO 5uldH20 32.5ul混匀离心，37℃变性7分钟，3,000rpm离心20秒，迅速加3u(1.5ul)Taq DNA聚合酶，轻轻混匀，再加入35ul石蜡油覆盖表面，3,000rpm离心5秒，70℃延伸1.5分钟后便进入PCR循环。循环条件为变性94℃，1分钟；退火57℃，30秒；延伸70℃，1.5分钟。从第五个循环开始，退火温度改为67℃，其余不变，经20个循环后，70℃保温10分钟结束反应，并取少量样品1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。经鉴定后的反应物经酚氯仿抽提后，加入1/2体积的7.5M NH4Ac和2.5体积乙醇混匀后室温10分钟，离心去除过量的dNTP并沉淀DNA。实施例7.重组质粒pZM-1(PE40-pUC19)的构建如图1，将扩增出的PE40基因利用ECORI和PstI插入pUC19，转化JM103感受态细胞，含有插入片段的转化子12-16小时内可在X-gal IPTG的LB/Amp平板上形成白色菌落，小量快速抽提质粒，酶切鉴定重组体。实施例8.重组质粒pZM-4(PE40-pBV220)的构建PE40经测序验证后，从pZM-1中用EcoRI和PstI切下PE40插入同酶切的pBV220中(见图2)，获得表达重组体PE40-pBV220，命名为pZM-4。实施例9重组质粒pZM-7(IL-2(60)-PE40-pBV220)的构建参见图3，从白介素II中用EcoRI和SacI切下IL-2(60)插入同酶切的PE40-pBV220，得重组质粒(IL-2(60)-PE40-pBV220)，命名为pZM-7。实施例10.重组质粒pZM-10(IL-2(60)-PE40-pT7-7)的构建参见图4，从本发明制得的pZM-7中，用NdeI和PstI切下IL-2(60)-PE40插入同酶切的pT7-7，得重组质粒(IL-2(60)-PE40-pT7-7)，命名为pZM-10。
最终制得的重组质粒，如pZM-10具有如下文中序列号3的序列。实施例11 PCR扩增的PE40基因在PCR反应过程中，由于设计的引物含有较多非配对碱基，它只能同自身扩增出的模板配对，采用两步退火法以尽可能提高反应的退火温度来提高扩增的特异性，反应产物的琼脂糖凝胶电泳如图5所示，2-7均为特异扩增出的1086bp左右的基因，与预计PE40基因大小相等。其结果参见图5。实施例12重组质粒pZM-1(PE40-pUC19)的酶切鉴定
PE40-pUC19中，插入片段PE40为1086bp，pUC19为2686bp，共计3772bp。由于PE40利用pUC19中EcoRI和PstI位点插入，pUC19中将不再有BamHI，PE40中有一个BamHI位点，因此，EcoRI，PstI，AccI，BamHI和ApaI酶切均产生3772bp的一条带，EcoRI和PstI双酶切将产生1086bp＋2686bp两条带，图6，7和8电泳结果与以上分析相符合。实施例13 PE40基因的序列分析经序列分析结果表明，扩增出的PE40基因同文献报道相比较，有三处突变(1)PE 272氨基酸由Phe(TTC)→Ser(TCC)；(2)PE338氨基酸由Leu(CTG)→Leu(CTT)；(3)PE459氨基酸由Ser(AGC)→Asn(AAC)。经自动测序仪(ABI381型)测序核对无误，产生变化的两个氨基酸均不是文献报道中的重要活性位点，PE459氨基酸处于PE中613个氨基酸的最后部分，不会对三级结构产生很大影响。
经测定，本发明制得的PE40之序列为GAGCTCATGG GCGGCAGCCT GGCCGCGCTG ACCGCGCACC AGGCTTGCCA CCTGCCGCTG 60GAGACTTCCA CCCGTCATCG CCAGCCGCGC GGCTGGGAAC AACTGGAGCA GTGCGGCTAT 120CCGGTGCAGC GGCTGGTCGC CCTCTACCTG GCGGCGCGGC TGTCGTGGAA CCAGGTCGAC 180CAGGTGATCC GCAACGCCCT GGCCAGCCCC GGCAGCGGCG GCGACCTGGG CGAAGCGATC 240CGCGAGCAGC CGGAGCAGGC CCGTCTTGCC CTGACCCTGG CCGCCGCCGA GAGCGAGCGC 300TTCGTCCGGC AGGGCACCGG CAACGACGAG GCCGGCGCGG CCAACGCCGA CGTGGGTAGC 360CTGACCTGCC CGGTGGCCGC CGGTGAATGC GCGGGCCCGG CGGACAGCGG CGACGCCCTG 420CTGGAGCGCA ACTATCCCAC TGGCGCGGAG TTCCTCGGCG ACGGCGGCGA CGTCAGCTTC 480AGCACCCGCG GCACGCAGAA CTGGACGGTG GAGCGGCTGC TCCAGGCGCA CCGCCAACTG 540TAGGAGCGCG GCTATGTGTT CGTCGGCTAC CACGGCACCT TCCTCGAAGC GGCGCAAAGC 600ATCGTCTTCG GCGGGGTGCG CGCGCGCAAC CAGGACCTCG ACGCGATCTG GCGCGGTTTC 660TATATCGCCG GCGATCCGGC GCTGGCCTAC GGCTACGCCC AGGACCAGGA ACCCGACGCA 720CGCGGCCGGA TCCGCAACGG TGCCCTGCTG CGGGTCTATG TGCCGCGCTC GAGCCTGCCG 780GGCTTCTACC GCACCAGCCT GACCCTGGCC GCGCCGGAGG CGGCGGGCGA GGTCGAACGG 840CTGATCGGCC ATCCGCTGCC GCTGCGCCTG GACGCCATCA CCGGCCCCGA GGAGGAAGGC 900GGGCGCCTGG AGACCATTCT CGGCTGGCCG CTGGCCGAGC GCACCGTGGT GATTCCCTCG 960GCGATCCCCA CCGACCCGCG CAACGTCGGC GGCGACCTCG ACCCGTCCAG CATCCCCGAC 1020AAGGAACAGG CGATCAGCGC CCTGCTGGAC TGCGCCAGCC AGCCCGGCAA ACCGCCGCGC 1080GAGGACCTGA AGTAA 1095实施例14重组质粒pZM-4(PE40-pBV220)的酶切鉴定pZM-4由1086bp的PE40经EcoRI和PstI双酶切后插入3666bp的pBV220构成，PstI单酶切应产生一条4752bp带，EcoRI和PstI双酶切后产生3666bp和1086bp两条带，图9电泳结果与以上分析相符合。IL-2(60)-PE40融合蛋白的基因克隆、表达及纯化以下为实施例15-18中使用的实验材料菌种、细胞、质粒、DNACTLL20细胞(ATCC TIB214)可长期培养的IL-2依赖的鼠T淋巴细胞系；P815细胞 (ATCC TIB 64)鼠肥大细胞瘤；KB细胞(ATCC CCL 17)人表皮癌细胞；L1210细胞 (ATCC CCL 219)鼠淋巴细胞白血病细胞；MLA上清 含MLA细胞分泌的IL-2；pBR322/MspI协和友谊公司产品(分子量大小为622，527，404，309，242，238，217，201，190，180，160bp )工具酶NdeI为美国BRL公司产品其余同第一部分化学试剂及其它3H-Leu为中国原子能研究院同位素所产品MEM基本培养基为美国GIBCO公司产品胎牛血清为天津血研所产品液闪液(碱裂解细胞用)(1)PPO5g(2)POPOP 0.15g(3)甲苯667ml(4)Triton X-100332ml闪烁液(1)PPO 6g(2)POPOP 0.2g(3)甲苯1000ml其余同上述实施例中使用的试剂。实施例15重组质粒pZM-7(IL-2(60)-PE40)的酶切分析鉴定重组质粒pZM-7大小约为4832bp，EcoRI和SacI都是单切点，故SacI酶切产生4832bp的片段，EcoRI和SacI双酶切可将IL-2(60)从中切出，得到一条180bp的IL-2(60)带和一条4746bp的PE40-pBV220带。图10显示结果与以上数据相符合。实施例16重组质粒pZM-10的酶切分析鉴定重组质粒pZM-10应为3.7Kb，PstI和NdeI都是单切点，各自单酶切应成3.7Kb的一条带，双酶切则成两条带2.45Kb(载体pT7-7)＋1.26 Kb(IL-2(60)-PE40)，酶切分析的电泳结果与以上数据相符合。如图11电泳结果与以上分析相符合。实施例17重组质粒pZM-7(IL-2(60)-PE40-pBV220)和
pZM-10(IL-2(60)-PE40-pT7-7)的诱导表达pZM-7和pZm-10采用本领域公知的技术分别转化大肠杆菌JBDE3，30℃过夜培养，但是，LB培养基中不加卡那霉素；培养温度均为37℃；在OD650＝0.4时，加1mM IPTG诱导一个半小时，离心收集菌体。
以上表达产物个收集3ml表达菌体，经1ml10％三氯醋酸沉淀，1.5ml丙酮洗涤二次，加入1×SDS载样缓充液100μl，100℃煮3分钟，立即淬入水中，4000rpm离心3分钟，取10-15μl作12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
pZM-7经诱导表达量很低(图片略)，而pZM-10在JBDE3中有较高的表达，经快速凝胶扫描显示，表达量可占细胞可溶性蛋白总量的17.96％。
经对大肠杆菌JBDE3/pZM-10的稳定性测定表明合有pZM-10表达载体的大肠杆菌，即JBDE3/pZM-10是稳定的。实施例18 pZM-10表达的IL-2(60)-PE40融合蛋白的纯化如图12所示，经过Sephacryl S-200层析柱和超滤后，复性的IL-2(60)-PE40的纯度已达到85％以上。实验例1 IL-2(60)-PE40融合蛋白的生物活性测定根据设计，IL-2(60)-PE40应该对含有IL-2R的CTLL细胞有特异性杀伤，而对无IL-2R的P815细胞和KB细胞则无毒副作用。从表1和图13，14中的数据，我们可以发现在IL-2(60)-PE40浓度为2.5ug/ml时，对CTLL细胞的抑制率可达64.8％，而此浓度对P815细胞和KB细胞均无抑制作用。除此之外，IL-2(60)-PE40还对L1210细胞有很强的杀伤能力，其机制尚不清楚。
表1 IL-2(60)-PE40抑制蛋白合成的能力
序列表序列标识号1序列长度1281bp链数单链分 子 型质粒DNA特征从1bp至180 bp为ILII的结合功能区(BINDING DOMAIN)从193 bp至1275 bp为绿脓毒素基因片段来源人和绿脓杆菌性质IL-2与绿脓毒素融合蛋白的表达性重组体ATGGCACCTA CTTACCGTTC TACAAAGAAA ACACAGCTAC AACTGGAGCA TTTACTGCTG 60GATTTACAGA TGATTTTGAA TGGAATTAAT AATTACAAGA ATCCCAAACT CACCAGGATG 120CTCACATTTA AGTTTTACAT GCCCAAGAAG GCCACAGAAC TGAAACATCT TCAGTGTCTA 180GACGAGCTCA TGGGCGGCAG CCTGGCCGCG CTGACCGCGC ACCAGGCTTG CCACCTGCCG 240CTGGAGACTT CCACCCGTCA TCGCCAGCCG CGCGGCTGGG AACAACTGGA GCAGTGCGGC 300TATCCGGTGC AGCGGCTGGT CGCCCTCTAC CTGGCGGCGC GGCTGTCGTG GAACCAGGTC 360AGCCAGGTGA TCCGCAACGC CCTGGCCAGC CCCGGCAGCG GCGGCGACCT GGGCGAAGCG 420AGCCGCGAGC AGCCGGAGCA GGCCCGTCTT GCCCTGACCC TGGCCGCCGC CGAGAGCGAG 480CGCTTCGTCC GGCAGGGCAC CGGCAACGAC GAGGACGGCG CGGCCAACGC CGACGTGGAG 540AGCCTGACCT GCCCGGTCGC CGCCGGTGAA TGCCGGGGCC CGGCGGACAG CGGCGACGCC 600CTGCTGGAGC GCAACTATCC CACTGGCGCG GAGTTCCTCG GCGACGGCGG CGACGTCAGC 660TTCAGCACCC GCGGCACGCA GAACTGGACG GTGGAGCGGC TGCTCCAGGC GCACCGCCAA 720CTGGAGGAGC GCGGCTATGT GTTCGTCGGC TACCACGGCA CCTTCCTCGA AGCGGCGCAA 780AGCATCGTCT TCGGCGGGGT GCGCGCGCGC AACCAGGACC TCGACGCGAT CTGGCGCGGT 840TTCTATATCG CCGGCGATCC GGCGCTGGCC TACGGCTACG CCCAGGACCA GGAACCCGAC 900GCACGCGGCC GGATCCGCAA CGGTGCCCTG CTGCGGGTCT ATGTGCCGCG CTCGAGCCTG 960CCGGGCTTCT ACCGCACCAG CCTGACCCTG GCCGCGCCGG AGGCGGCGGG CGAGGTCGAA 1020CGGCTGATCG GCCATCCGCT GCCGCTGCGC CTGGACGCCA TCACCGGCCC CGAGGAGGAA 1080GGCGGGCGCC TGGAGACCAT TCTCGGCTGG CCGCTGGCCG AGCGCACCGT GGTGATTCCC 1140TCGGCGATCC CCACCGACCC GCGCAACGTC GGCGGCGACC TCGACCCGTC CAGCATCCCC 1200GACAAGGAAC AGGCGATCAG CGCCCTGCCG GACTACGCCA GCCAGCCCGG CAAACCGCCG 1260CGCGATTACC TGAAGTAATA G 1281序列标识号2序列长度1280 bp链数单链分 子 型质粒DNA及其对应的氨基酸特征从1bp至180bp为ILII的结合功能区(BINDING DOMAIN)从193bp至1275bp为绿脓毒素基因片段来源人和绿脓杆菌性质IL-2与绿脓毒素融合蛋白的表达性重组体ATG GCA CCT ACT TAC CGT TCT ACA AAG AAA ACA CAG CTA CAA CTG GAGMet Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu5 10 15CAT TTA CTG CTG GAT TTA CAG ATG ATT TTG AAT GGA ATT AAT AAT TACHis Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr20 25 30AAG AAT CCC AAA CTC ACC AGG ATG CTC ACA TTT AAG TTT TAC ATG CCCLys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro35 40 45AAG AAG GCC ACA GAA CTG AAA CAT CTT CAG TGT CTA GAC GAG CTC ATGLys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Asp Glu Leu Met50 55 60GGC GGC AGC CTGGCCGCG CTG ACC GCG CAC CAG GCT TGC CAC CTG CCGGly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro65 70 75 80CTG GAG ACT TCC ACC CGT CAT CGC CAG CCG CGC GGC TGG GAA CAA CTGLeu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu85 90 95GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG CAG CGG CTG GTC GCC CTC TAC CTG GCGGlu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala100 105 110GCG CGG CTG TCG TGG AAC CAG GTC AGC CAG GTG ATC CGC AAC GCC CTGAla Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu
115 120 125GCC AGC CCC GGC AGC GGC GGC GAC CTG GGC GAA GCG AGC CGC GAG CAGAla Ser Pro Gly Ser Gly Gly AsP Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln130 135 140CCG GAG CAG GCC CGT CTT GCC CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG AGC GAGPro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu145 150 155 160CGC TTC GTC CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GAC GGC GCG GCC AACArg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn165 170 175GCC GAC GTG GAG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA TGC CGGAla Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala180 185 190GGC CCG GCG GAC AGC GGC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC TAT CCC ACTGly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr195 200 205GGC GCG GAG TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC AGC ACC CGCGly Ala Glu Phe Leu Gly Ala Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg210 215 220GGC ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG CAC CGC CAAGly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln225 230 235 240CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC ACC TTC CTCLeu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu245 250 255GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG CGC AAC CAGGlu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Asn Gln260 265 270GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC GAT CCG GCGAsp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala275 280 285CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC GCA CGC GGC CGGLeu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg
290 295 300ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC TAT GTG CCG CGC TCG AGC CTGIle Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu305 310 315 320CCG GGC TTC TAC CGC ACC AGC CTG ACC CTG GCC GCG CCG GAG GCG GCGPro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala325 330 335GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT CCG CTG CCG CTG CGC CTG GACGly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp340 345 350GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA GGC GGG CGC CTG GAG ACC ATT CTCAla Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu355 360 365GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG GCG ATC CCCGly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro370 375 380ACC GAC CCG CGC AAC GTC GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC ATC CCCPhr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro385 390 395 400GAC AAG GAA CAG GCG ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC CAG CCCAsp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro405 410 415GGC AAA CCG CCG CGC GAT TAC CTG AAG TAA TAG 1404Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys420 425序列标识号3序列类型核苷酸序列长度1404 bp链数单链分 子 型质粒DNA特征从44bp至66bp为T7启动子序列，从109bp至115bp为核糖体结合位点，从124bp至303bp为ILII的结合功能区(BINDING DOMAIN)从316bp至1398bp为绿脓毒素基因片段，从1399bp至1404bp为串联终止子，来源人和绿脓杆菌性质IL-2与绿脓毒素融合蛋白的表达性重组体CGATTCGAAC TTCTCGATTC GAACTTCTGA TAGACTTCGA AATTAATACG ACTCACTATA 60GGGAGACCAC AACGGTTTCC CTCTAGAAAT AATTTTGTTT AACTTTAAGA AGGAGATATA 120CATATGGCAC CTACTTACCG TTCTACAAAG AAAACACAGC TACAACTGGA GCATTTACTG 180CTGGATTTAC AGATGATTTT GAATGGAATT AATAATTACA AGAATCCCAA ACTCACCAGG 240ATGCTCACAT TTAAGTTTTA CATGCCCAAG AAGGCCACAG AACTGAAACA TCTTCAGTGT 300CTAGACGAGC TCATGGGCGG CAGCCTGGCC GCGCTGACCG CGCACCAGGC TTGCCACCTG 360CCGCTGGAGA CTTCCACCCG TCATCGCCAG CCGCGCGGCT GGGAACAACT GGAGCAGTGC 420GGCTATCCGG TGCAGCGGCT GGTCGCCCTC TACCTGGCGG CGCGGCTGTC GTGGAACCAG 480GTCAGCCAGG TGATCCGCAA CGCCCTGGCC AGCCCCGGCA GCGGCGGCGA CCTGGGCGAA 540GCGAGCCGCG AGCAGCCGGA GCAGGCCCGT CTTGCCCTGA CCCTGGCCGC CGCCGAGAGC 600GAGCGCTTCG TCCGGCAGGG CACCGGCAAC GACGAGGACG GCGCGGCCAA CGCCGACGTG 660GAGAGCCTGA CCTGCCCGGT CGCCGCCGGT GAATGCCGGG GCCCGGCGGA CAGCGGCGAC 720GCCCTGCTGG AGCGCAACTA TCCCACTGGC GCGGAGTTCC TCGGCGACGG CGGCGACGTC 780AGCTTCAGCA CCCGCGGCAC GCAGAACTGG ACGGTGGAGC GGCTGCTCCA GGCGCACCGC 840CAACTGGAGG AGCGCGGCTA TGTGTTCGTC GGCTACCACG GCACCTTCCT CGAAGCGGCG 900CAAAGCATCG TCTTCGGCGG GGTGCGCGCG CGCAACCAGG ACCTCGACGC GATCTGGCGC 960GGTTTCTATA TCGCCGGCGA TCCGGCGCTG GCCTACGGCT ACGCCCAGGA CCAGGAACCC1020GACGCACGCG GCCGGATCCG CAACGGTGCC CTGCTGCGGG TCTATGTGCC GCGCTCGAGC1080CTGCCGGGCT TCTACCGCAC CAGCCTGACC CTGGCCGCGC CGGAGGCGGC GGGCGAGGTC1140GAACGGCTGA TCGGCCATCC GCTGCCGCTG CGCCTGGACG CCATCACCGG CCCCGAGGAG1200GAAGGCGGGC GCCTGGAGAC CATTCTCGGC TGGCCGCTGG CCGAGCGCAC CGTGGTGATT 1260CCCTCGGCGA TCCCCACCGA CCCGCGCAAC GTCGGCGGCG ACCTCGACCC GTCCAGCATC 1320CCCGACAAGG AACAGGCGAT CAGCGCCCTG CCGGACTACG CCAGCCAGCC CGGCAAACCG 1380CCGCGCGATT ACCTGAAGTA ATAG 140权利要求
1.一种含有白介素II基因片段和绿脓毒素基因片段的核苷酸序列，其特征是所述的白介素II结合其受体的功能区的基因片段直接与绿脓毒素基因片段融合。
2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征是所述的白介素II基因片段具有第一功能区的功能。
3.如权利要求1或2所述的核苷酸序列，其特征是所述的绿脓毒素基因片段具有第二和第三功能区的功能。
4.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征是所述的核苷酸序列可为ATGGCACCTA CTTACCGTTC TACAAAGAAA ACACAGCTAC AACTGGAGCA TTTACTGCTG 60GATTTACAGA TGATTTTGAA TGGAATTAAT AATTACAAGA ATCCCAAACT CACCAGGATG 120CTCACATTTA AGTTTTACAT GCCCAAGAAG GCCACAGAAC TGAAACATCT TCAGTGTCTA 180GACGAGCTCA TGGGCGGCAG CCTGGCCGCG CTGACCGCGC ACCAGGCTTG CCACCTGCCG 240CTGGAGACTT CCACCCGTCA TCGCCAGCCG CGCGGCTGGG AACAACTGGA GCAGTGCGGC 300TATCCGGTGC AGCGGCTGGT CGCCCTCTAC CTGGCGGCGC GGCTGTCGTG GAACCAGGTC 360AGCCAGGTGA TCCGCAACGC CCTGGCCAGC CCCGGCAGCG GCGGCGACCT GGGCGAAGCG 420AGCCGCGAGC AGCCGGAGCA GGCCCGTCTT GCCCTGACCC TGGCCGCCGC CGAGAGGCGAG480CGCTTCGTCC GGCAGGGCAC CGGCAACGAC GAGGACGGCG CGGCCAACGC CGACGTGGAG 540AGCCTGACCT GCCCGGTCGC CGCCGGTGAA TGCCGGGGCC CGGCGGACAG CGGCGACGCC 600CTGCTGGAGC GCAACTATCC CACTGGCGCG GAGTTCCTCG GCGACGGCGG CGACGTCAGC 660TTCAGCACCC GCGGCACGCA GAACTGGACG GTGGAGCGGC TGCTCCAGGC GCACCGCCAA 720CTGGAGGAGC GCGGCTATGT GTTCGTCGGC TACCACGGCA CCTTCCTCGA AGCGGCGCAA 780AGCATCGTCT TCGGCGGGGT GCGCGCGCGC AACCAGGACC TCGACGCGAT CTGGCGCGGT 840TTCTATATCG CCGGCGATCC GGCGCTGGCC TACGGCTACG CCCAGGACCA GGAACCCGAC 900GCACGCGGCC GGATCCGCAA CGGTGCCCTG CTGCGGGTCT ATGTGCCGCG CTCGAGCCTG 960CCGGGCTTCT ACCGCACCAG CCTGACCCTG GCCGCGCCGG AGGCGGCGGG CGAGGTCGAA1020CGGCTGATCG GCCATCCGCT GCCGCTGCGC CTGGACGCCA TCACCGGCCC CGAGGAGGAA1080GGCGGGCGCC TGGAGACCAT TCTCGGCTGG CCGCTGGCCG AGCGCACCGT GGTGATTCCC 1140TCGGCGATCC CCACCGACCC GCGCAACGTC GGCGGCGACC TCGACCCGTC CAGCATCCCC 1200GACAAGGAAC AGGCGATCAG CGCCCTGCCG GACTACGCCA GCCAGCCCGG CAAACCGCCG 1260CGCGATTACC TGAAGTAATA G1281
5.一种合有权利要求1所述的核苷酸序列的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征是所述的表达载体合有如权利要求4所述的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征是所述的表达载体是重组质粒pZM10。
8.一种含有如权利要求5或6所述表达载体的大肠杆菌。
9.如权利要求8所述的大肠杆菌，其特征是所述的大肠杆菌含有如权利要求2所述的核苷酸序列，该大肠杆菌已于1994年8月22日在中国武汉CCTCC保藏，其保藏号为CCTCC M 94054。
10.一种经权利要求8所述的的大肠杆菌表达出的融合蛋白，其特征是该蛋白具有如下氨基酸序列Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu5 10 15His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr20 25 30Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro35 40 45Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Asp Glu Leu Met50 55 60Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro65 70 75 80Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu85 90 95Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala100 105 110Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu115 120 125Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln130 135 140Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu145 150 155 160Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn165 170 175Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala180 185 190Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr195 200 205GIy Ala Glu Phe Leu Gly Ala Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg210 215 220Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln225 230 235 240Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu245 250 255Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Asn Gln260 265 270Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala275 280 285Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg290 295 300Ile Arg Ash Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu305 310 315 320Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala325 330 335Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp340 345 350Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu355 360 365Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro370 375 380Phr Asp Pro Arg Asn Val GIy Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro385 390 395 400Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro405 410 415Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys420 42全文摘要
本发明提供了一种含有白介素II基因片段和绿脓毒素基因片段的分子导向药物的核苷酸序列，该序列是将白介素II结合其受体的功能区的基因片段直接与绿脓毒素基因片段融合，本发明还提供含有上述核苷酸序列的重组表达载体，以及含有这种表达载体的大肠杆菌。
文档编号B27M3/00GK1119677SQ9411659
公开日1996年4月3日 申请日期1994年9月29日 优先权日1994年9月29日
发明者卢圣栋, 张萌, 李焕娄 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所