专利名称：一种聚乙烯醇降解酶高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产聚乙烯醇降解酶的制作方法
技术领域：
一种聚乙烯醇降解酶高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产聚乙烯醇降解酶，属于生物工程技术领域，尤其是属于利用生物酶在织物表面直接对聚乙烯醇浆料进行降解的技术领域。
背景技术：
聚乙烯醇(PVA)作为纺织行业中一种上浆剂，以其粘度、pH稳定，混溶性及乳化能力强等优良特性，在各类高分子合成浆料中占主要地位，其耗用量已占40％。但在PVA浆料的退浆过程中，用传统的碱退浆和氧化剂退浆一直存在着损伤织物表面纤维，成本高等缺点，并且由于PVA本身的难降解性，使退浆后的废水很难处理，给环境治理带来巨大压力。为了解决传统方法带来的一系列问题，现采用生物技术实现纺织产品的退浆即利用生物酶在织物表面直接对PVA进行降解，从而达到既保护织物品质，又实现清洁生产的目的。
对于生物法实现PVA的无污染降解，国内外已有相关报道。1973年Suzuki T等人首次分离得到一株假单胞菌(Pseudomonas 0-3)，它能以PVA为唯一碳源并将PVA完全降解。Hashimoto等人分离得到的菌株Pseudomonas vesicularis必须在添加酵母膏或者添加苯丙氨酸、异亮氨酸、胱氨酸和硫胺素的情况下才能降解PVA并产酶。Sakazawa等人分离出一组共生细菌共同作用降解PVA，都属于假单胞菌，代号分别为VM15A和VM15C。其中，只有VM15C产PVA降解酶。而单一的VM15C不能降解PVA，必须由VM15A提供生长因子PQQ。Takuo sakai等人分离得到一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)在共生菌株PN19的情况下降解PVA并产PVA降解酶。在对PVA降解酶进行纯化后，在实验室条件下做了PVA降解酶用于纺织退浆的应用实验，取得了较好的效果。国内方面，中国科学院武汉病毒研究所的王银善等人也分离出共生细菌代号SB1，对PVA的降解有较好的效果。共生细菌SB1包括两种细菌SB1r和SB1s，分别属于假单胞菌和产碱杆菌，其中SB1r为SB1s产酶提供生长因子。并且继续对PVA降解酶进行了纯化和性质方面的研究。
目前国内外报道的具PVA降解能力的菌株都是细菌或共生细菌，尚无青霉属真菌降解PVA并产酶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙烯醇降解酶高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产聚乙烯醇降解酶。并进行了酶法退浆试验，与传统的热水退浆进行了比较。
本发明技术方案从不同纺织厂采集的污水、土壤和污泥等数十个样品分别置于PVA平培养基中反复富集、驯化获得一种青霉菌(Penicillium.sp)WSH02-21，已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NOM 203035属于青霉属聚乙烯醇降解酶高产菌，该菌株对数生长期为18～48小时，镜检种子菌丝粗壮，且无自溶，菌体呈典型的扫帚状形态。
该菌株的选育方法采用无色透明圈法和降解PVA速率法，将两种方法结合使用，得到具有PVA降解酶高产菌株。
本发明内容中所用的测定方法1.PVA含量测定Finley法。原理在硼酸存在时，PVA与碘作用会产生绿色络合物，颜色的深浅可用分光光度计所测A690nm消光值表示。
2.菌体生长的测定取发酵液5ml离心(3000r/min，10min)收集菌体，去离子水洗两次，105℃干燥至恒重。
3.筛菌方法3.1.无色透明圈法利用PVA和I2反应时，如有硼酸存在会呈绿色的性质，先将待测菌株点种于固体培养基培养3～4天，然后取硼酸-碘化钾-碘试剂5～6ml倾于培养皿，置室温避光与培养基中PVA充分反应20分钟，然后观察透明圈的有无和大小。有者表示有酶活，大者表示酶活较高。
3.2.降解PVA速率法分别将菌种接种于液体培养基中，通过在培养过程中测定各发酵液PVA含量的变化，判断各菌株对PVA的降解性能。降解速率快则酶活大。
将以上两种方法结合使用，得到具较高降解PVA性能的菌株。
4.PVA降解酶酶活测定收集振荡培养三天的发酵液，离心(3000r/min，10min)去菌体得到粗酶液。依次加入100ul 0.1％PVA(溶于pH8.0的磷酸缓冲液)和100ul粗酶液配制得到反应混合液。将此反应液于30℃培养6小时。分别测定酶反应前后反应混合液所对应PVA含量的吸光度。
酶活单位定义在以上实验条件下，每分钟使吸光度下降1×10-3所需酶的量定义为一个酶活单位。
试剂1.试验用PVA(No.1799；聚合度1700；醇解度99.0％)其他试验药品均为分析纯。
2.硼酸-碘化钾-碘试剂I.4％(W/V)硼酸溶液；II.碘-碘化钾溶液将2.5g碘化钾置100ml棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解，再加入0.65g碘，用水定容至刻度。使用时，分别取I液和II液15ml、1.5ml，混匀。
菌株的选育方法和发酵条件的优化，如下述。
1.菌株选育培养基分离培养基和斜面培养基同为(g/L)PVA(No.1799，聚合度1700，醇解度99％)5，NH4NO31，K2HPO41.6，KH2PO40.2，MgSO40.05，CaCl20.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，琼脂20(固体培养基)，用去离子水定容至1L pH6.0；种子培养基(g/L)葡萄糖50，酵母膏3，K2HPO41.6，KH2PO40.2，MgSO40.05，CaCl20.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，用去离子水定容至1L，pH6.0；发酵培养基(g/L)葡萄糖1～5，PVA 30～40，NH4Cl 6～12，KH2PO41～5，酵母膏1～5，MgSO40.05，CaCl20.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，用去离子水定容至1L；培养条件旋转式摇床摇瓶培养，转速160～240r/min，培养温度25～35℃。取斜面菌种接入装有150ml种子培养基的500ml三角瓶中，培养36～48小时。将培养好的5ml种子接入装有30ml发酵培养基的250ml的三角瓶中，发酵产酶60～84小时。
菌株的分离初筛将在不同纺织厂采集的污水、土壤和污泥等数十个样品分别置于分离培养基反复富集、驯化，分别检测其PVA含量的变化，得到八个混合培养物能利用PVA作为唯一碳源生长。取其中降解PVA能力强者接种在上述培养基中，振荡培养3天，用稀释分离法在PVA培养基分离纯化，根据菌落形态分离得到六株具PVA降解能力的菌株。
复筛主要是将无色透明圈法和PVA降解速率法相结合。将初筛分离得到的六株菌株分别接入以上培养基振荡培养，定时测定其中PVA含量的变化。同时将它们分别点种在PVA固体培养基上培养，后滴加硼酸-碘化钾-碘试剂观察透明圈的大小。将以上两种方法相结合，确认其中的一株真菌具最强的PVA降解能力。经初步鉴定属于青霉属(Pencilium.sp)，CCTCC NOM 203035实验室编号为WSH02-21，见图1。
2.PVA降解酶的摇瓶发酵条件2.1种子生长过程曲线种子生长过程曲线如图2所示。可以看出，18小时后细胞生长速率明显加快，在48小时之后细胞干重开始下降，表明WSH02-21的对数生长期为18～48小时。镜检发现，此时的种子菌丝粗壮，且无自溶，表明细胞处于生长旺盛期。因此确定适宜的种龄为40h。
2.2营养条件对PVA降解酶发酵过程的影响2.2.1不同碳源种类对菌体生长和产酶的影响分别采用PVA、葡萄糖、可溶性淀粉进行摇瓶发酵，结果仅在以PVA为碳源的培养基中测得酶活为537mU/ml，而在葡萄糖和可溶性淀粉的培养基中，虽然细胞生长旺盛，但检测不到酶活。由此可推测，WSH02-21产PVA降解酶是靠细胞生长在PVA作碳源的基质上诱导产生的。所以，将PVA作为发酵培养基的碳源。
2.2.2初始PVA浓度对菌体生长和产酶的影响以PVA为碳源，比较了不同初始PVA浓度对PVA降解酶发酵过程中菌体生长和酶活的影响(图3)。但由于PVA非常难溶且粘度较大，在80～90℃需搅拌30min才能溶解，所以所配PVA培养基最大浓度为40g/L。由图3可以看出，随着PVA浓度的增加，细胞干重和酶活都得以提高。所以选择PVA初始浓度为40g/L。
2.2.3不同氮源对菌体生长和产酶的影响分别采用NaNO3，NH4NO3，(NH4)2SO4，NH4Cl，酵母膏，蛋白胨进行PVA降解酶的摇瓶发酵考察氮源对细胞干重和酶活的影响。结果如图4所示。可以看出，采用无机氮源NH4Cl和有机氮源酵母膏有利于酶活的提高。
2.2.4采用NH4Cl和酵母膏复合氮源对菌体生长和产酶的影响分别考察在培养基中单独添加NH4Cl、酵母膏和同时添加NH4Cl和酵母膏对产酶的影响。如图5可知，同时添加NH4Cl和酵母膏两种氮源有利于细胞生长和产酶。
2.2.5 NH4Cl添加量对产酶的影响在酵母膏添加浓度为1g/L的情况下，分别考察NH4Cl不同浓度对菌体生长和酶活的影响。如图6所示，NH4Cl添加浓度为10g/L时有利于菌体生长和产酶。
2.2.6酵母膏添加量对菌体生长和产酶的影响在NH4Cl添加浓度为10g/L时，分别考察酵母膏不同浓度对菌体生长和酶活的影响。如图7所示，酵母膏添加量为5g/L时有利于菌体生长和产酶。
2.2.7 KH2PO4添加量对菌体生长和产酶的影响考察添加不同浓度KH2PO4添加量对菌体生长和产酶的影响。由图8可知，KH2PO4添加量为3g/L时有利于菌体生长和产酶。
2.2.8在发酵液中添加葡萄糖对菌体生长和产酶的影响考察在发酵培养基中添加葡萄糖对菌体生长和产酶的影响。如图9所示，葡萄糖浓度为1g/L时，有利于菌体生长和产酶。
3.pH、温度对PVA降解酶酶活的影响3.1 pH对PVA降解酶酶活的影响在反应混合液中加入100ul 0.1％PVA溶液和100ul粗酶，然后用磷酸缓冲液分别调节pH在5.0～9.0之间，反应温度30℃。由图10可知，酶反应最适pH为7.4～8.0。
3.2温度对PVA降解酶酶活的影响在反应混合液中加入100ul 0.1％PVA溶液和100ul粗酶，分别考察不同温度(20℃～50℃)对酶活的影响。由图11可知，最适酶促反应温度为35℃。
通过考察pH、温度对PVA降解酶酶活的影响，为酶法退浆的pH、温度条件打下良好的基础，即控制酶退浆pH为7.4～8.0，温度为35℃。
4.酶法退浆应用试验4.1上浆织物的制备将未上浆的织物剪成2×2cm2的小方块，然后在25g/L的PVA溶液中浸泡15min并在105℃烘30min。
4.2酶法退浆与热水退浆对照实验将上浆后的织物分别用粗酶液和热水处理。织物上PVA残余采用失重法测量。35℃酶法退浆(2ml酶液和2ml pH8.0磷酸缓冲液)与80℃热水退浆实验对照示意图如图12。
由图12可知，酶法退浆经6小时将上浆织物上的PVA完全降解，基本达到热水退浆相同的效果。与热水退浆相比，酶法退浆不但可以大大节省能耗，而且起到清洁生产，减少污染等优点。
本发明的有益效果综合国内外文献报道，本发明是首次筛选到属于青霉属的产PVA降解酶菌株，其具较强产PVA降解酶能力。将微生物学和发酵工程学相结合，通过对微生物产酶营养条件的优化，使酶活有了较大提高。同时在PVA降解酶退浆应用实验中，与以往热水退浆相比，此酶具良好退浆能力，并且有能耗低，清洁生产等优良特性，因此在纺织工业中有着良好的应用前景。
图1青霉WSH02-21(a)孢子和气生菌丝(放大1500倍)的电镜照片(b)具扫帚状的菌体形态光镜照片图2菌株WSH02-21的种子生长过程曲线图3初始PVA浓度对菌体生长和产酶的影响图4不同氮源对菌体生长和产酶的影响图5采用NH4Cl和酵母膏复合氮源对菌体生长和产酶的影响图6NH4Cl添加量对菌体生长和产酶的影响图7酵母膏添加量对菌体生长和产酶的影响图8KH2PO4添加量对酵母膏添加量对菌体生长和产酶的影响图9添加葡萄糖对酵母膏添加量对菌体生长和产酶的影响图10pH对酶活的影响图11温度对酶活的影响图12酶法退浆和热水退浆对照实验生物材料样品保藏青霉菌，保藏日期2003.5.20 保藏单位中国典型培养物保藏中心，CCTCCNOM 203035。
具体实施例方式
用青霉菌CCTCC NOM 203035制备PVA降解酶。
发酵培养基(g/L)葡萄糖5，PVA 40，NH4Cl 8，KH2PO43，酵母膏1，MgSO40.05，CaCl20.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，用去离子水定容至1L，pH6.0；发酵条件旋转式摇床摇瓶培养，转速200r/min，培养温度30℃。取斜面菌种制成孢子悬浮液接入装有150ml种子培养基的500ml三角瓶中，培养40小时。将培养好的5ml种子液接入装有30ml发酵培养基的250ml的三角瓶中，发酵产酶72小时，起始pH控制在6.4。
权利要求
1.一种青霉菌(Penicillium sp.)，其特征是命名为青霉菌WSH02-21，现已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NOM 203035，属于青霉属聚乙烯醇降解酶高产菌，该菌株对数生长期为18～48小时，镜检种子菌丝粗壮，具体形态呈典型的扫帚状形态。
2.一种青霉菌CCTCC NOM 203035的选育方法，其特征是采用无色透明圈法和降解PVA速率法，将两种方法结合使用，得到具有降解PVA性能的菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是菌株选育经初筛和复筛，初筛将在不同纺织厂采集的污水、土壤和污泥等数十个样品分别置于分离培养基反复富集、驯化，分别检测其PVA含量的变化，得到能利用PVA作为唯一碳源生长的混合培养物，再接种至分离培养基中，根据菌落形态分离得到具降解PVA能力强的菌株；复筛将初筛分离得到的菌株分别接入分离培养基中振荡培养，定时测定其中PVA含量的变化，同时将它们分别点种在PVA固体培养基上培养，后滴加硼酸-碘化钾-碘试剂观察透明圈的大小。
4.青霉菌CCTCC NOM 203035的用途，其特征是用CCTCC NOM 203035发酵法生产聚乙烯醇降解酶，发酵培养基(g/L)葡萄糖1～5，PVA 30～40，NH4Cl 6～12，KH2PO41～5，酵母膏1～5，MgSO40.05，CaCl20.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，用去离子水定容至1L，发酵条件旋转式摇床摇瓶培养，培养温度25～35℃。取斜面菌种接入种子培养基中，培养36～48小时，将培养好的种子液接入发酵培养基中发酵产酶60～84小时。
全文摘要
一种聚乙烯醇降解酶高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产聚乙烯醇降解酶，属于生物工程技术领域。本发明采用新方法选育了一株PVA降解酶高产菌株青霉菌(Pencillium sp.)CCTCC NoM 203035。在菌株选育的方法上，将降解PVA速率法与以往的无色透明圈法相结合，方便、快速的从纺织污水中选育得到。CCTCC NoM 203035发酵生产聚乙烯醇降解酶的能力强且稳定，摇瓶培养72小时，PVA降解酶酶活为4.3U/ml。
文档编号D06M16/00GK1513974SQ03131679
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者陈坚, 钱鼎, 堵国成, 李寅, 伦世仪, 陈 坚 申请人:江南大学