提高木聚糖酶嗜热性、嗜碱性和热稳定性的修饰的制作方法

专利名称：提高木聚糖酶嗜热性、嗜碱性和热稳定性的修饰的制作方法
技术领域：
本发明的领域是通过蛋白质工程修饰蛋白质。具体来说，本发明涉及耐高温和高pH的经过修饰的木聚糖酶。木聚糖酶用于增强纸浆的漂白以制造白色的纸张。本发明使生产的木聚糖酶具有与家族11木聚糖酶相关的增强漂白能力，但在高温和高pH时仍保持活性，比目前使用的木聚糖酶更适于纸浆厂的操作需要。
背景技术：
自从1991年以来，木聚糖酶一直用于增强纸浆的漂白以生产亮白的纸张。在纸浆漂白之前将这些酶加入纸浆，清除纸浆中的木聚糖部分。此程序使随后的漂白试剂，包括氯气，二氧化氯，过氧化氢，氧，臭氧和氢氧化钠，比没有木聚糖酶处理程序更有效地漂白纸浆。漂白效率的增强使得工厂减少了氯基试剂的用量，从而降低了工厂废水中有毒有机氯化合物的量，使得能生产更白的纸浆或降低工厂在漂白剂方面的开支。木聚糖酶用于漂白的商业用途综述于Tolan，et al，Pulp and PaperCanada，December 1995。
已有近100种微生物中报道存在木聚糖酶。木聚糖酶分属于糖基水解酶40多个家族中的几个。糖基水解酶，包括木聚糖酶，甘露聚糖酶，淀粉酶，β-葡聚糖酶，纤维素酶和其它碳水化合物水解酶，是根据诸如氨基酸序列，三维结构和催化位点的几何学等性质进行分类的(Gilkes，et al，(1991)Microbiol.Reviews 55303-315)。
对纸浆漂白有特殊用处的是归类于家族11的酶。此家族中的所有酶均为木聚糖酶并以“家族11木聚糖酶”而著称。它与一些出版物中使用的家族G木聚糖酶同义，但是我们将使用术语家族11。
表1列出了目前已知的家族11木聚糖酶。其中的大多数分子量约为21,000道尔顿。家族11木聚糖酶中的三个-粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)XynA，变青链霉菌XynB，和褐色热单胞XynA-具有31,000至50,000道尔顿的较高的分子量。但是，这些木聚糖酶与其它家族11木聚糖酶类似具有一个约21,000道尔顿的催化核心序列。家族11木聚糖酶的氨基酸序列(或者，对较大的酶来说，催化核心的序列)显示高度的相似性(图1)。来源于细菌，酵母或真菌的家族11木聚糖酶具有同样的通用分子结构(参见CAMPBELL等的美国专利5,405,769中的图2)。
表1.家族11木聚糖酶微生物木聚糖酶黑曲霉 XynA川地曲霉 XynC塔宾曲霉 XynA环状芽孢杆菌 XynA短小芽孢杆菌 XynA枯草芽孢杆菌 XynA粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi) XynD钦氏菌 Xyn丙酮丁醇梭状芽孢杆菌 XynB粪堆梭菌(Clostridium stercorarium) XynA产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes) XynCNeocallimastix patriciarum XynA达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei) XynII产黄瘤胃球菌 XynA群交裂褶菌 Xyn变青链霉菌 XynB变青链霉菌 XynC链霉菌36a号菌种Xyn嗜热紫链霉菌 XynII褐色热单胞 XynA哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Xyn里氏木霉(Trichoderma reesei) XynI里氏木霉 XynII绿色木霉 Xyn如果一个酶具有家族11的共有氨基酸，包括两个作为关键催化残基的谷氨酸(E)，那么这个酶就被归类于家族11。这些E残基按Trichoderma reesei xynII的编号是氨基酸86和177。通过一种本领域熟练技术人员所熟知的方法-氨基酸序列对比可以容易地确定其它家族11木聚糖酶的关键E残基的相应位置。家族11木聚糖酶共有的氨基酸用黑体字标示于图1(Wakarchuk，et al，Protein Science 3467-475(1994))。
在用于纸浆漂白时，家族11木聚糖酶有几点优于其它木聚糖酶。家族11木聚糖酶中的大多数都比其它家族的木聚糖酶小，与其它木聚糖酶相比较小的分子量可能有助于穿透纸浆纤维以从纸浆中释放出木聚糖并增强漂白作用。就其催化活性而论，家族11木聚糖酶是“纯的”木聚糖酶，与其它家族的木聚糖酶不同，这些酶只水解木聚糖而不水解纤维素。纤维素的水解破坏了纸浆，工厂不能接受。在家族11木聚糖酶中，用木材腐败真菌木霉制造的木聚糖酶已经被最广泛地用于增强纸浆漂白。尤其是，Trichoderma reesei木聚糖酶II(Xyn II)已被广泛使用，其分子量为21,000，等电点为9.1。
家族11木聚糖酶除了用于纸浆漂白的优点外，这些酶还有显著的缺点。这些酶对纸浆显示活性的温度和pH范围是45℃-55℃和pH5.0-7.5。一小部分工厂按传统的方法在这些范围内进行操作。但是，典型的纸浆处于60℃-70℃和pH10-12。在一些工厂中温度和pH的调节是可以接受的和常规的。但是，在很多工厂获得期望的处理条件会引起严重的问题。
根据如何实施漂白，将纸浆冷却到低于60℃的温度会使漂白效率降低到一个不可接受的程度。例如，如果一个工厂正在完全用二氧化氯漂白并在氯化塔中保留时间少于20分钟，那么充分漂白的最低温度是60℃。如果这个工厂不能在酶处理和氯化之间加热纸浆(这是经常的情况)，那么降低温度用于酶处理阶段是不可接受的。
硫酸用于控制纸浆的pH。鉴于设备的金属属性，使用硫酸控制pH会腐蚀钢管和其它设备，硫酸还危及安全。
另外一个在漂白中使用这些酶，尤其是Trichoderma reesei木聚糖酶的次要问题是低的热稳定性。贮存几周后工厂中的温暖的环境温度有可能使这些酶失活。这个问题不如调整纸浆的温度和pH的问题重要，但是也必须考虑使用冷冻贮存或在酶中加入稳定剂化合物。
因此，希望的是使用在比Trichoderma reesei Xyn II更高pH和温度范围时有活性的木聚糖酶，尤其是家族11木聚糖酶。这将允许工厂能够在木霉木聚糖酶的活性范围之外运转以实施木聚糖酶处理并从本文理中获得好处，还会使工厂用比目前状况更少的硫酸和冷却水来实施木聚糖酶处理，节省了生产消耗并提高了可控制性和贮存稳定性。
在讨论改进木聚糖酶的性能所采用的方法之前，定义下列术语是有帮助的。
嗜热性在本文被定义为在高温时酶保持活性的能力。例如，如果木聚糖酶#1比木聚糖酶#2能在更高的温度中水解木聚糖，木聚糖酶#1就具有比木聚糖酶#2更高的嗜热性。嗜热性涉及有底物时的酶活性。在本发明中，底物可以是纸浆木聚糖或纯的木聚糖。
为了定义嗜热性，阐明底物是重要的。在较高温度时大多数木聚糖酶水解纯的木聚糖的效率高于纸浆处理。这是由于底物相关因子(即纸浆中存在的抑制剂)，处理时间，pH，和用于进行测试程序的其它方面联合起作用造成的。除非另有描述，本文所指的嗜热性的定量测定是用纯的木聚糖作底物。
热稳定性在本文被定义为待储存的酶在不存在木聚糖底物时高温温育，当回到标准分析状态时显示木聚糖酶活性的能力。例如，如果木聚糖酶#1可在70℃保温24小时并保留所有活性，而木聚糖酶#2经过70℃24小时后失去所有活性，就可以说木聚糖酶#1的热稳定性高于木聚糖酶#2。与嗜热性相反，热稳定性涉及无木聚糖底物温育后保留的酶活性。
明确地定义这两个术语以克服文献中的混淆，文献中经常将这两个术语用作同义语或互相代表。它们目前的用法与Mathrani and Ahring，Appl.Microbiol.Biotechnol.3823-27(1992)的一致。
嗜碱性在本文被定义为酶在高(碱性)pH时的保持活性的能力。例如，如果木聚糖酶#1比木聚糖酶#2能在更高的pH中水解木聚糖，木聚糖酶#1就具有比木聚糖酶#2更高的嗜碱性。嗜碱性类似于嗜热性，它涉及存在木聚糖底物时的酶活性。
为了改进用于纸浆漂白的木聚糖酶，嗜热性和嗜碱性比热稳定性更为重要。绝大多数现有技术的工作只集中在改进热稳定性上。
可以采用两个通用的途径以使木聚糖酶具有较高的pH和温度范围。它们是(1)筛选具有期望特性的天然的木聚糖酶，和(2)使用蛋白质工程改进已知的木聚糖酶的性能。
在天然的木聚糖酶中，已经从诸如生长在80-100℃的Caldocellumsaccharolyticum，Thermatoga maritima和Thermatoga菌株FjSS3-B.1的嗜热微生物中分离到了热稳定的酶(Lüthi et al.1990；Wenterhalter et al.1995；Simpson et al.1991)。但是所有酶都相当大，分子量为35-120kDa(320-1100个残基)。这些木聚糖酶中的一些(C.saccharolyticum木聚糖酶A)不属于家族11并同时具有木聚糖酶和纤维素酶活性(Lüthi et al.1990)。这种纤维素酶活性在纸浆漂白中是不希望的。另外，在非常高的温度发挥正常功能的超高热稳定性木聚糖酶在纸浆漂白中的相对较低的温度时活性限低。
家族11木聚糖酶的大多数在45℃到55℃范围内对纸浆漂白有效。但是，家族11还包括至少两个热稳定的木聚糖酶，两个酶正巧有比其它家族11木聚糖酶更高的分子量。这两个酶是296个氨基酸、分子量为32,000Da的褐色热单胞木聚糖酶(又称为TfxA)(Irwin et al.(1994)Appl.Environ.Micorbiol.60763-770；Wilson et al.1994，WO 95/12668)和511个氨基酸、分子量为56,000Da、最适温度为70℃的Clostridiumstercorarium木聚糖酶A(Sakka et al.(1993)Biosci.Biotech.Biochem.57273-277)。
这些热稳定的木聚糖酶的有些性质在纸浆漂白应用中是潜在的问题。首先，大分子量可能限制酶穿透进入纸浆纤维。其次，这些酶具有其它家族11木聚糖酶中没有的至少一个单拷贝的纤维素结合结构域(CBD)。位于TfxA的延伸的C-末端的CBD可引起贮存中蛋白的沉淀和活性的丧失。
因此，这些天然的木聚糖酶有局限。
一个替代的途径是对熟知的木聚糖酶进行蛋白质工程改造。通过蛋白质工程手段，可以在蛋白上进行特定的改变以改进一个期望的性能，诸如温度或pH范围，而不改变诸如蛋白可溶性的其它性质。
当实施蛋白质工程以修饰蛋白性质时，我们必须选择通用的方法，然后是特异性位点和要进行的修饰。通用的方法包括(1)定点诱变，(2)随机诱变，(3)嵌合修饰，(4)二聚体形成，和(5)糖基化。这些通用的方法中的每一个都有大量的选择可以用来对蛋白质进行特定修饰。不同突变对酶特性包括嗜热性和嗜碱性的的影响常常是不可预知的。通常，在所有可能的修饰中只有很少的部分(如果有的话)产生显著的益处。因此，通过蛋白质工程来改进一个蛋白的性质是一个艰难的冒险，目前在家族11木聚糖酶上取得的有限成功反映了这一点。修饰木聚糖酶的工作描述如下。
定点诱变方法包括一个蛋白中特定氨基酸的修饰。以定点诱变为基础的修饰被称为点突变。家族11木聚糖酶的定点诱变已经被用来生产热稳定性稍有改进的木聚糖酶。CAMPBELL等(U.S.专利5,405,769)描述了通过两种类型的修饰改进一种家族11的木聚糖酶-环状芽孢杆菌木聚糖酶(缩写为BcX)的方式。它们是(i)分子内二硫键，和(ii)在N-末端的定点诱变。
CAMPBELL等描述了如何在氨基酸#98和#152，#100和#148，及#-1和#187之间插入二硫键，上述氨基酸编号是根据环状芽孢杆菌木聚糖酶的编号。二硫键修饰提高了木聚糖酶在62℃的稳定性。但是，这些二硫键修饰的酶在嗜热性方面没有提高(Wakarchuck et al.(1994)Protein Engineering 71379-1386)。因此，热稳定性和嗜热性不一定是相伴的。
CAMPBELL等还描述在接近BcX的N-末端的三个修饰(命名为T3G，D4Y(F)和N8Y(F))产生了在57℃有热稳定性的突变木聚糖酶，热稳定性只提高了2℃。与CAMPBELL等相关的PCT公开出版物WO94/24270中，描述了为改进BcX的第四个有益的修饰，即S22P。这套四个修饰(在文件中被命名为TS19a)显示了比BcX更高的热稳定性和嗜热性。但是，某些因素限制了这些BcX的修饰在其它家族11木聚糖酶中的应用。这些将残基-3，4，8和22(BcX氨基酸编号)相应地转变成甘氨酸，酪氨酸(或苯丙氨酸)，酪氨酸(或苯丙氨酸)和脯氨酸的突变与家族11木聚糖酶的大多数不相关，因为它们已经拥有了这些“好的”残基(参见图1)。这些修饰不足之处的最好说明是Trichoderma reesei的XynII，它拥有所有四个“好的”残基，但是在嗜热性和嗜碱性方面仍是中等。
随机诱变包括在整个蛋白内的随机的氨基酸修饰。这个方法被ARASE等((1993)FEBS Lett.316123-127)用来产生热稳定性提高的家族11木聚糖酶，他们描述了通过在残基-12，26，38，48和126(根据BpX的氨基酸编号)的修饰使短小芽孢杆菌木聚糖酶(缩写为BpX)的热稳定性有了中等的提高。但是，ARASE等没有报道其特定修饰对嗜热性或嗜碱性的任何改进。ARASE等的BpX木聚糖酶最大改进的例子获得的热稳定性提高是很小的，在57℃温育20分钟后，只保留40％的残留酶活性。另外两个其它的在N-末端附近的残基12和26修饰的BpX木聚糖酶，温育后残留的活性相应为1和11％。另外，残基26修饰的BpX木聚糖酶还有其它修饰，所以这个单一的修饰对热稳定性的贡献，如果有的话，根据ARASE等报道也是不清楚的。
嵌合修饰包括用另外一个蛋白的氨基酸序列替换一个蛋白的氨基酸的一部分。根据我们了解，这种方法还没有在任何家族11木聚糖酶上实施。
二聚体形成包括将两个分子合并成一个蛋白。此技术已经被用来通过分子间二硫键连接两个BcX分子(Wakarchuk，et al，Protein Engineering(1994))，得到的二聚体BcX在热稳定性上只显示不显著的提高，比上面描述的带有分子内二硫键的BcX还要小。
众所周知，自然的糖基化作用，即碳水化合物结合到蛋白质上，有时会提高蛋白质包括Trichoderma reesei xyn II的热稳定性。合成糖基化作用还没有被用来改进家族11木聚糖酶的这些性能。
不管使用哪种蛋白质工程方法，一个关键的方面是确定修饰哪个氨基酸，因为仅有几个选择可以改进酶的性能。Sung，et al，Biochem.Cell Biol.73253-259(1995)的工作说明了这一点，他们将Trichoderma reesei木聚糖酶II的#19氨基酸从天冬酰胺修饰成赖氨酸。这个修饰降低了3℃的酶的嗜热性。
因此，尽管在家族11木聚糖酶上花费了大量的努力，还是没有研制出嗜热性和嗜碱性显著改进的经修饰的家族11木聚糖酶。这种酶，具体来说Trichoderma reeseixyn II的工程化的版本应可以马上应用于商业操作，在满足工厂工艺条件的同时降低漂白化学试剂的需要来生产漂白的纸浆。这种酶在其它领域也有潜在的应用价值，这种应用的一些例子是作为给动物喂食的添加剂以增强饲料的可消化性，其中饲料的高温颗粒化使目前的酶在很多情况下不适合；和加工小麦与玉米以生产淀粉，其中的高温过程破坏目前的酶。

发明内容
本发明涉及修饰某些特定的家族11木聚糖酶以改进嗜热性，嗜碱性，和热稳定性。本发明在创造使纸浆厂获得增强漂白益处的酶方面有特殊用途，已知这些酶与家族11木聚糖酶相关联，但它们在更适于最佳工厂操作参数的比目前使用的任何木聚糖酶都要高的温度和pH条件下发挥漂白作用。
本发明的用途特异地针对具有下列两个重要性质的家族11木聚糖酶(i)从木霉，芽孢杆菌，曲霉或链霉菌制备的酶。
(ii)在Trichoderma reesei木聚糖酶的位置14，或根据用于命名(i)中的其它木聚糖酶的常规编号系统的相对应位置上包括酪氨酸或苯丙氨酸的酶。
对同时拥有这些性质的家族11木聚糖酶来说，下面两类修饰中的任何一个都会惊人地提高酶的嗜热性，嗜碱性，和热稳定性(1)定点诱变对那些选择的在N-末端从位置10(按Trichoderma reesei木聚糖酶II编号)开始的上游有至少8个氨基酸残基的木聚糖酶来说，修饰包括用另一个氨基酸取代氨基酸10。一个优选实施方案是除了用一个不同的氨基酸取代氨基酸10的关键步骤外，还用缬氨酸，甲硫氨酸，异亮氨酸或亮氨酸取代氨基酸27和29。一个最佳的实施方案是用组氨酸，甲硫氨酸，和亮氨酸相应地取代位置10，27和29的天然氨基酸。
(2)嵌合修饰用一段来自褐色热单胞木聚糖酶A(Tfx)的相应位置的序列置换N-末端区域内的一段氨基酸序列。一个优选实施方案是用一个甘氨酸-精氨酸-精氨酸三肽或来源于丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(CaX)N-末端的一段多至10个的氨基酸序列，从N-末端开始向上游延伸嵌合的酶。
出乎意料的是，根据本发明修饰的木聚糖酶比未修饰的酶具有改进很大的嗜热性，嗜碱性，和热稳定性。这些修饰的木聚糖酶中的一些展示了比天然木聚糖酶提高28℃的嗜热性，和提高2个pH单位的嗜碱性。另外，一些修饰的木聚糖酶在85℃和pH9的条件下发挥作用的能力明显好于任何一个经确认的嗜热的家族11木聚糖酶，包括TfxA。
发明人相信以前的报道中没有一个家族11木聚糖酶的修饰如此惊人地提高家族11木聚糖酶的嗜热性，嗜碱性，和热稳定性。
本发明的修饰的环状芽孢杆菌木聚糖酶特别是在比ARASE等(该文中涉及BpX)和CAMPBELL等(该文中涉及BcX)所揭示的那些修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的60-70℃的温度范围更高的温度时有活性。
另外，本发明的修饰的木聚糖酶显示了惊人提高的解决纸浆处理问题的性能。修饰的木聚糖酶在处理纸浆方面还展示出家族11木聚糖酶在最适条件时的典型的整体潜力，但在其它木聚糖酶中没有观察到。
本文所讲授的蛋白修饰对家族11木聚糖酶来说以前没有报道，且现有技术也没有提示本文讲授的改进可以提高嗜热性，嗜碱性，或热稳定性。
ARASE等((1993)FEBS Lett.316123-127)描述了通过在残基12，26，38，48和126(根据BpX的氨基酸编号)的修饰使短小芽孢杆菌木聚糖酶(缩写为BpX)的热稳定性有了中等的提高，这些残基分别对应于Trichoderma reesei xynII的残基11，26，38，48和121，但不是依据本发明原则的残基。另外，与本发明的发明人不同，依据Arase讲授的内容其没有报道嗜热性或嗜碱性的任何改进。Arase改进最大的BpX热稳定性的提高是很小的，在57℃温育20分钟后，只保留40％的残留酶活性。对另外两个其它的在残基12(在xynII中为11)和26修饰的BpX木聚糖酶，热稳定性的提高表现在贮存后残留的活性相应为1和11％。另外，残基26修饰的BpX木聚糖酶还有其它修饰，所以这个单一的修饰对热稳定性的贡献，如果有的话，也是不清楚的。
CAMPBELL等和CAMPBELL等的PCT出版物，阐述了四个可以在环状芽孢杆菌木聚糖酶(BcX)中进行的修饰(命名为T3G，D4Y(F)，N8Y(F)，和S22P)。这些变化对应于Trichoderma reesei木聚糖酶编号的氨基酸12，13，17，和31。CAMPBELL等所讲授的氨基酸在木霉木聚糖酶和大多数其它家族11木聚糖酶中已存在，因此可以认为这些氨基酸实质上与这些木聚糖酶的性能的改进无关。
CAMPBELL等对环状芽孢杆菌木聚糖酶的修饰也没有象本发明的修饰的环状芽孢杆菌木聚糖酶那样多地改进酶的性能。实施例6和10显示本发明的修饰的环状芽孢杆菌木聚糖酶比CAMPBELL等的最好的木聚糖酶具有更高的嗜热性(+14℃)和更高的嗜碱性(+1.5pH单位)。此外，在最适温度时，本发明的修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的活性三倍于CAMPBELL等修饰的木聚糖酶。
以前没有报道表明氨基酸10，27，和29对家族11木聚糖酶的性能是重要的。令人吃惊的是，本发明人显示在木霉xyn II上将这些氨基酸相应地修饰成组氨酸，甲硫氨酸，和亮氨酸可显著提高此酶的嗜热性，嗜碱性，和热稳定性。
应该注意到尽管三个天然的家族11木聚糖酶(由短小芽孢杆菌，Clostridiumstercorarium(xyn A)，和褐色热单胞产生的木聚糖酶)在这些位置具有这些特定的氨基酸，但这三个木聚糖酶中没有一个显示本发明下面结果讲授的期望特性的组合。没有理由预期嗜热性是因为这三个氨基酸的存在所致，并且天然的木聚糖酶没有强调这三个氨基酸对酶的性能是关键的。尽管梭状芽孢杆菌和热单胞木聚糖酶是嗜热的，但B.pumilis木聚糖酶不是嗜热的，因为其最佳温度低于40℃(Nissen，et al，1992)。除了上面提到的三个共有位置以外，这三个木聚糖酶在超过75个位置具有相同的氨基酸。与其它家族的木聚糖酶一样，梭状芽孢杆菌和热单胞木聚糖酶都含有被推测为赋予热稳定性的独特的纤维素结合结构域(Fontes，et al，1995，Biochem.J.307151-158)。
在权利要求书中本发明人无意要求在位置10，27，和29拥有优选残基的三个天然家族11木聚糖酶中的任何一个。本发明限定在那些在T.reesei xyn II的位置14，或其它木聚糖酶的相应位置具有酪氨酸或苯丙氨酸的木聚糖酶，这不包括在位置14具有天冬氨酸的短小芽孢杆菌木聚糖酶。本发明还限定在由木霉，链霉菌，曲霉，和芽孢杆菌产生的木聚糖酶，这不包括热单胞和梭状芽孢杆菌木聚糖酶。
除了这三个木聚糖酶外，其它两个家族11中的木聚糖酶在位置27具有甲硫氨酸和在位置29具有亮氨酸，它们是丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(最适温度43℃)和变青链霉菌xynC(最适温度55℃)。但是，这两个酶中没有一个是嗜热的，因此都没有提示修饰位置27和29是有用的。
在位置10，27，和29特异性选择组氨酸，甲硫氨酸，和亮氨酸会提高Trichodermareesei xyn II的稳定性。鉴于这个事实，现在本领域熟练技术人员应该认识到大量氨基酸中的任何一个取代进入位置10都将改进此酶的性能。鉴于在位置27和29的甲硫氨酸和亮氨酸的改进作用，还应该认识到任何疏水的中等大小的氨基酸，包括缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和甲硫氨酸在这些位置都是有益的。
本发明的这方面的重要发现是位置10，27，和29对Trichoderma reesei xynII的稳定性是重要的。基于这一点讲授的内容，本领域熟练技术人员应该认识到这种修饰将有益于某些其它的家族11木聚糖酶，并且为了从这种修饰得到益处家族11木聚糖酶必须满足两个条件。
首先，家族11木聚糖酶在位置10的上游必须拥有至少8个氨基酸残基。几个家族11木聚糖酶具有截短的N-末端。位置10的修饰与具有截短的N-末端的木聚糖酶无关。
其次，家族11木聚糖酶在Trichoderma reesei木聚糖酶II编号的位置14，或其它木聚糖酶的相应位置必须拥有亮氨酸或苯丙氨酸。在位置14的亮氨酸或苯丙氨酸的侧链直接指向此蛋白的活性位点。亮氨酸和苯丙氨酸大小相似且都具有一个六元芳香环，当结合到一个木聚糖底物上时它可能潜在地参与与木糖环的堆积互作。在此位置上存在其它氨基酸会对此蛋白的整体结构产生显著的改变。因此，只有那些在位置14具有亮氨酸或苯丙氨酸的家族11木聚糖酶适于进行位置10的修饰，而在相应位置具有其它残基的家族11木聚糖酶不受这种修饰的影响。
在已知的木霉，链霉菌，芽孢杆菌，和曲霉的家族11木聚糖酶中，只有Trichoderma reesei xyn II，Trichoderma harzainum xyn，绿色木霉xyn，变青链霉菌xynB，和变青链霉菌xynC满足这两个条件。因此，根据本文的讲授只有这些酶是目前已知的适合在位置10，27，和29进行修饰的酶。
本发明的嵌合木聚糖酶以前还没有被报道过，且没有任何出版物提示这些特定的嵌合木聚糖酶有益于木聚糖酶的性能。更为意外的是，在某些情况下，嵌合木聚糖酶的嗜热性和嗜碱性好于组成嵌合木聚糖酶的任何一个单独的木聚糖酶的嗜热性和嗜碱性。这些酶的例子是实施例7和11中的修饰的木聚糖酶NI-BX6和NI-BX7。
本发明的这方面的重要发现是用褐色热单胞木聚糖酶A嵌合修饰Trichodermareesei木聚糖酶II或环状芽孢杆菌木聚糖酶A的N-末端区的片段可以增加这些酶的嗜热性，嗜碱性，和热稳定性。
基于这一点讲授的内容，本领域熟练技术人员应该认识到假定满足一个条件，用褐色热单胞xynA和来自木霉，曲霉，链霉菌和芽孢杆菌的其它家族11木聚糖酶可以形成性能改进的嵌合木聚糖酶。家族11木聚糖酶必须在Trichoderma reesei木聚糖酶II的位置14，或其它木聚糖酶的相应位置拥有酪氨酸和苯丙氨酸，位置14的酪氨酸或苯丙氨酸的侧链直接指向此蛋白的活性位点。亮氨酸和苯丙氨酸大小相似且都具有一个六元芳香环，当结合到一个木聚糖底物上时六元芳香环可能潜在地参与与木糖环的堆积互作。褐色热单胞木聚糖酶A在此位置上具有苯丙氨酸。只有那些在位置14具有酪氨酸或苯丙氨酸的家族11木聚糖酶适合与褐色热单胞木聚糖酶A形成嵌合木聚糖酶。在相应位置上具有其它残基的家族11木聚糖酶不适合这种修饰。
在已知的木霉，链霉菌，芽孢杆菌，和曲霉的家族11木聚糖酶中，只有Trichoderma reesei xyn II，Trichoderma harzainum xyn，绿色木霉xyn，Trichodermareesei xyn I，变青链霉菌xyn B，变青链霉菌xyn C，环状芽孢杆菌xyn A，枯草芽孢杆菌xyn A，黑曲霉xyn A，川地曲霉xyn A和塔宾曲霉xyn A满足这个条件。因此，根据本文的讲授只有这些酶是目前已知的适合进行嵌合修饰的酶。
以前从来没有报道过蛋白的上游延伸可以增强家族11木聚糖酶的性能，也没有报道过它对其它酶的益处。没有理由预期在N-末端的上游增加氨基酸可以提高嗜热性，嗜碱性或热稳定性。
没有理由预期用三个氨基酸甘氨酸-精氨酸-精氨酸延伸上游会改进酶的性能。这套三氨基酸在任何天然的木聚糖酶中都是没有的。天然家族11木聚糖酶中有两个，短小芽孢杆菌和Clostridium stercorarium，直接在N-末端的上游有一个单一的精氨酸，这两个木聚糖酶都不具有对修饰的BcX和TrX的改进的嗜热性有重要作用的精氨酸和甘氨酸。梭状芽孢杆菌酶是嗜热的，但芽孢杆菌酶不是嗜热的，所以天然的木聚糖酶没有定向于这种修饰。
没有理由预期用来源于丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xyn B(CaX)的一个10个氨基酸序列进行N-末端上游的延伸会改进其它家族11木聚糖酶的嗜热性。CaX最适温度仅为43℃，并不比其它的家族11木聚糖酶更好。因此，从这个酶而来的氨基酸序列可以改进其它木聚糖酶的嗜热性是出乎意料的。
用褐色热单胞木聚糖酶A的N-末端序列取代进入来自T.reesei的木聚糖酶II和来自环状芽孢杆菌的木聚糖酶A形成的嵌合木聚糖酶说明了本文描述的上游延伸。本领域熟练技术人员应该认识到所说的上游延伸将改进嵌合木聚糖酶的性能，嵌合木聚糖酶可以通过将褐色热单胞木聚糖酶A的N-末端序列取代进入木霉，曲霉，链霉菌和芽孢杆菌来源的家族11木聚糖酶而形成。
总之，本发明的发明人开发了对处理纸浆以改进其漂白作用具有商用价值的具有期望特性的独特的酶。


图1显示几个家族11木聚糖酶中多个氨基酸序列的对比。每个字母代表一个氨基酸，选用的是标准的氨基酸缩写。分成的几部分是任意选择以适合页面的字母排列，与蛋白质的结构并无关联。标示出了Trichoderma reesei xyn II的1到30位氨基酸编号。在至少80％所列家族11木聚糖酶中是相同的氨基酸用黑体标出。所有家族11木聚糖酶都相同的残基下有下划线。Clostridium stercorarium，变青链霉菌(xynB)，和褐色热单胞的木聚糖酶只列出了其催化核心序列。
图2显示真菌Trichoderma harzianum木聚糖酶(ThX)和细菌环状芽孢杆菌木聚糖酶(BcX)的主链结构。
图3显示为了在质粒pXYbc(3-190)中构建编码木霉木聚糖酶的基因序列而合成的寡核苷酸。
图4显示为了在质粒pXYbc中构建编码环状芽孢杆菌木聚糖酶BcX的基因序列而合成的寡核苷酸。
图5显示温度对NI-TX突变体木聚糖酶的酶活性的影响。以40℃的酶活性作参照将酶活性标准化。
图6显示温度对NI-BX突变体木聚糖酶的酶活性的影响。以40℃的酶活性作参照将酶活性标准化。还提供了Campbell等的BcX突变体TS19a的曲线。
图7显示65℃时pH对NI-TX修饰的木霉木聚糖酶的酶活性的影响，以最大酶活性作参照将数据标准化。
图8显示65℃时pH对NI-BX修饰的木霉木聚糖酶的酶活性的影响，还提供了BcX突变体TS19a的曲线。以最大酶活性作参照将数据标准化。
图9显示50℃时pH对修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的酶活性的影响。包括了Wilson等(PCT，1995)公布的TfxA数据。为了便于与TfxA进行比较，以pH8的结果作参照将所有的修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的酶活性标准化。
图10显示53℃时修饰的木霉木聚糖酶NI-TX1，NI-TX5，NI-TX10，NI-TX11，TvX(3-190)和天然的TrX的热稳定性。以温育0分钟的酶活性作参照将酶活性标准化。
图11显示68℃时嵌合木聚糖酶NI-TX2，NI-TX5，NI-TX8，NI-TX9和天然TrX的热稳定性。为了比较还包括了53℃时天然TrX的曲线。以温育0分钟的酶活性作参照将酶活性标准化。
图12显示70℃时NI-BX和BcX的热稳定性。以温育0分钟的酶活性作参照将酶活性标准化。
图13显示温度对NI-TX木聚糖酶，重组和天然TrX的增强纸浆漂白的性能的影响(测试由Iogen公司进行)。
图14显示温度对NI-BX1木聚糖酶和野生型BcX的增强纸浆漂白的性能的影响(测试由Iogen公司进行)。
具体实施例方式
本发明包括展示增强的对纸浆漂白应用很重要的性能的修饰的家族11木聚糖酶，这些性能即嗜热性，嗜碱性，和热稳定性。修饰的木聚糖酶表现出相对于天然木聚糖酶增强的性能。天然木聚糖酶选自木霉，芽孢杆菌，链霉菌，和曲霉来源的家族11木聚糖酶。天然木聚糖酶的选择进一步限定在那些Trichoderma reesei木聚糖酶II氨基酸编号的位置14，或其它家族11木聚糖酶的相应位置上具有酪氨酸或苯丙氨酸的木聚糖酶。
对所选择的木聚糖酶的修饰包括下述修饰的一种或两种，本文的描述是根据Trichoderma reesei木聚糖酶II的氨基酸编号并适用于其它所选择的家族11木聚糖酶的相应对比的氨基酸(1)对所选择的从N-末端位置10开始的上游有至少8个氨基酸残基的木聚糖酶，用另外一个氨基酸取代氨基酸10。
(2)用来自褐色热单胞木聚糖酶A(Tfx)的相应位置的序列置换N-末端区域的一段氨基酸序列以形成一个嵌合木聚糖酶，并用另外一个木聚糖酶的多至10个氨基酸的序列延伸蛋白N-末端的上游。
本发明涉及修饰的木聚糖酶，对天然的木聚糖酶没有权利要求。
在实施本发明中，起始点是一个家族11木聚糖酶。如果一个酶拥有与家族11共有的氨基酸，包括两个作为重要催化残基的谷氨酸(E)残基，那么这个酶即被归类为家族11。这些E残基以Trichoderma reesei xyn II编号为氨基酸86和177。通过本领域熟练技术人员所熟知的对比氨基酸序列程序可以很容易地确定其它家族11木聚糖酶的关键E残基的相应位置。家族11木聚糖酶所共有的氨基酸在图1中用黑体标出。(Wakarchuck，et al，Protein Science 3467-475(1994)。
用于实施本发明的天然家族11木聚糖酶必须是那些由木霉，芽孢杆菌，链霉菌，和曲霉产生的家族11木聚糖酶。此酶也必须在木霉木聚糖酶II编号的位置10，或其它木聚糖酶的相应位置上具有酪氨酸或苯丙氨酸。Trichoderma reesei xyn II的氨基酸编号显示于图1。
氨基酸10的取代指的是Trichoderma reesei木聚糖酶II的这个氨基酸。权利要求只是针对那些所选择的在与N-末端氨基酸10相对应的位置上游至少有8个氨基酸残基的木聚糖酶的修饰。
在一个优选实施方案中，所选择的用于这种修饰的木聚糖酶包括T.reesei xynII，T.harzianum xyn，绿色木霉xyn，变青链霉菌xyn B，或变青链霉菌xyn C。在一个优选实施方案中，除了用另外一个氨基酸取代氨基酸10外，还用甲硫氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，或缬氨酸取代氨基酸27和29。如氨基酸10一样，用图1所示的Trichoderma reesei木聚糖酶II编号认定氨基酸27和29。
在一个更为优选实施方案中，氨基酸10，27，和29被相应地取代成组氨酸，甲硫氨酸，和亮氨酸。这种被修饰的木聚糖酶在实施例中被认定为NI-TX11，NI-TX12和NI-TX13。
木聚糖酶的嵌合修饰包括从所选择的木聚糖酶的N-末端区域删除一段氨基酸序列并用褐色热单胞木聚糖酶A的N-末端区域的一段氨基酸序列代替。
本文所用的描述本发明的术语“N-末端区域”指的是Trichoderma reesei木聚糖酶II最靠近N-末端的前31个氨基酸。对其它家族11木聚糖酶来说，N-末端区域包括当进行序列对比时与Trichoderma reesei木聚糖酶II的前31个氨基酸相对应的氨基酸。本领域使用的N-末端区域的一般定义是蛋白质最靠近N-末端的前1/3部分。本发明中使用的N-末端区域的定义与一般的定义一致，但必须更为精确。
被删除的氨基酸的置换是通过用位于同样位置的来源于两个微生物的木聚糖酶的N-末端的一段氨基酸序列来进行的。而在两个木聚糖酶有不同数目的氨基酸的地方，当排列两个酶的氨基酸序列以尽可能的互相匹配时，氨基酸的置换序列位于与原始氨基酸序列一致的位置。这种氨基酸的序列对比是本领域熟练技术人员所熟知的并在图1中演示了一些家族11木聚糖酶的氨基酸序列对比。
在一个优选实施方案中，TrX的氨基酸10到29的序列或另外一个家族11木聚糖酶的等价对比的氨基酸序列用褐色热单胞木聚糖酶A的相应对比的氨基酸序列取代。这种修饰的木聚糖酶的一个例子在实施例中被认定为NI-TX4。
在一个优选实施方案中，TrX的氨基酸1到29的序列或另外一个家族11木聚糖酶的等价对比的氨基酸序列用褐色热单胞木聚糖酶A的相应对比的氨基酸序列取代。这种修饰的木聚糖酶的一个例子在实施例中被认定为NI-TX3。
在另外一个优选实施方案中，环状芽孢杆菌木聚糖酶(BcX)的1到22的氨基酸序列被取代成Tfx的1到31的氨基酸序列。这两个序列是基于图1的序列进行对比的。这种修饰的木聚糖酶的一个例子在实施例中被认定为NI-BX2。
在一个优选实施方案中，所选择的用于这种修饰的木聚糖酶包括Trichodermareesei xyn II，Trichoderma harzianum xyn，绿色木霉xyn，变青链霉菌xyn B，变青链霉菌xyn C，环状芽孢杆菌xyn A，枯草芽孢杆菌xyn A，黑曲霉xyn A，川地曲霉xyn A或塔宾曲霉xyn A。
上游延伸包括在低分子量的家族11木聚糖酶N-末端的上游加上一段多至10个氨基酸的序列。这种上游延伸是与本文描述的用褐色热单胞木聚糖酶A对所选择的家族11木聚糖酶进行嵌合修饰联合进行的。
在一个优选实施方案中，将一个包括甘氨酸-精氨酸-(精氨酸或赖氨酸)的三肽加到家族11木聚糖酶的N-末端上游延伸中，并且这种延伸是与嵌合修饰联合进行的。具有这些修饰的木聚糖酶的例子是NI-TX9和NI-BX7。
在一个优选实施方案中，将1到3个碱性氨基酸加到家族11木聚糖酶Clostridiumacetoburylicum xynB(CaX)的N-末端和一段5到9个氨基酸的序列之间，并且这种延伸是与嵌合修饰联合进行的。具有这些修饰的木聚糖酶的例子是实施例例中的NI-TX8，NI-BX5和NI-BX6。
在一个优选实施方案中，将氨基酸ASAR或ASAK的序列加在N-末端的上游，并且这种延伸是与嵌合修饰联合进行的。具有这些修饰的木聚糖酶的例子是NI-TX7，NI-BX3，和NI-BX4。
另外一套优选实施方案包括用本发明的修饰的酶处理纸浆并改进其漂白性能。所说的酶处理在55℃到75℃的温度下进行，这个温度范围不是使用天然的家族11木聚糖酶来增强纸浆漂白可以接受的范围。在一个优选实施方案中，所说的酶处理在7.5到9.0的pH下进行，这个pH范围不是使用天然的家族11木聚糖酶来增强纸浆漂白可以接受的范围。
本领域熟练技术人员熟知本发明的木聚糖酶可以用于除了纸浆漂白之外其它方面。例如，这些酶可以用作动物食品添加剂以增强饲料的可消化性，其中饲料的高温颗粒化使目前的酶在很多情况下不适合。另外，这些酶还可以用于小麦与玉米淀粉生产的过程，其中加工过程的高温破坏目前的酶。本领域熟练技术人员熟知在这些或其它的应用中，本发明的修饰的木聚糖酶可以在其它酶存在的情况下使用，这些其它酶包括但不限于纤维素酶，甘露聚糖酶，β-葡聚糖酶，和淀粉酶。
通过下面实施例的详细描述将进一步说明本发明，这些实施例不是限制本发明。根据这些实施例的修饰的木聚糖酶列于表2和表3。
表2.Trichoderma reesei木聚糖酶


表3.环状芽孢杆菌木聚糖酶

根据本发明，此后的例1至例3将要描述修饰的木聚糖酶的产生和纯化。在实施例4至实施例13中，修饰的木聚糖酶NI-TX1至NI-TX11和NI-BX1至NI-BX7的惊人增强的嗜热性，嗜碱性，和热稳定性是用木聚糖作底物来证明的。众所周知，木聚糖酶对木聚糖底物的性能与实际纸浆处理时观察到的性能有良好的相关。实施例14和实施例15用选择的修饰木聚糖酶提供了在漂白之前使用本发明修饰的木聚糖酶进行纸浆处理产生的惊人的增强的性能的证据。
实施例1Trichoderma Reesei修饰的木聚糖酶NI-TX的构建诸如质粒制备，限制酶消化，聚合酶链式反应，寡核苷酸磷酸化，连接，转化和DNA杂交等的基本重组DNA方法是根据本领域熟练技术人员所熟知的成熟的方法(Sung et al.，1986)或根据酶或试剂盒的制造商推荐的方法进行的。很多酶的缓冲液作为一个试剂盒的一部分提供或根据制造商的建议重新配制。限制酶，T4多核苷酸激酶和T4DNA连接酶是从New England BioLabs LTD，Mississauga，Ont购买。GeneAmp PCR试剂盒是从Perkin-Elmer公司购买。起始质粒pXYbc是一个插入环状芽孢杆菌木聚糖酶基因的pUC类型的质粒，在此之前已经制备好并已经发表(Sung etal，1993；Campbell et al，US专利5,405,769，1995年4月11日授权)。一个通用的大肠杆菌菌株，HB101(Clonetech Lab，Palo Alto，CA)用作所有基因构建体的转化和表达的宿主。桦木木聚糖是从Sigma公司(St.Louis，Mo)购买。对羟苯甲酸酰肼(HBAH)从Aldricht公司购买。寡核苷酸是用一个Applied Biosystem DNA synthesizer model380B制备。木聚糖酶分析是在一个温度波动范围为±0.1℃的加盖的循环水浴(Haaketype F 4391)中进行。水浴的温度是用一个热电偶确定。
A.起始质粒pTvX(3-190)的构建所有随后突变用的起始质粒pTvX(3-190)在此之前已经制备好并且其构建体也已经发表(Sung et al，1995)。这个质粒是通过用一个新组装的木霉木聚糖酶基因取代pXYbc上的环状芽孢杆菌木聚糖酶基因从pXYbc质粒衍生而来。这个木霉木聚糖酶和随后描述的其它突变体木聚糖酶的表达是在lac启动子的控制之下。木霉木聚糖酶基因的完整组装需要两个阶段，首先是(92-190)区域，然后是(1-92)区域。此基因的构建方法是常规的且与很多其它基因构建的标准程序相同，使用编码木聚糖酶的重叠的合成寡核苷酸的酶促磷酸化，然后将其与一个适当酶切的质粒连接。
首先仿效大肠杆菌的密码子使用频率设计10个编码TvX(92-190)序列的重叠寡核苷酸(XyTv-101至110)(图3)。两个末端寡核苷酸的SalI和BglII粘性末端使10个片段可以酶促连接到SalI-BglII线性化的质粒pXYbc上。在含有10X标准激酶缓冲液(0.4μL)，1mM ATP(4μL)，T4 DNA激酶(5个单位)，和水(3μL)的混合物中使编码木霉木聚糖酶(92-190)区的10个寡核苷酸XyTv-101至XyTv-110(50pmol，每个1μL)磷酸化，磷酸化反应在37℃进行1小时。然后合并溶液并加热至70℃维持10分钟。缓慢冷却至室温后，将合并的溶液加入4mM ATP(3.5μL)，SalI-BglII线性化的质粒pXYbc(0.1pmol)和T4 DNA连接酶(3.5μL)的混合物中12℃温育20小时。连接混合物的等分样品用于转化在含有氨苄青霉素(100mg/L)的YT平板上的大肠杆菌HB101。
为了制备杂交探针，用32P-ATP(10pmol，3μL)在T4 DNA激酶(1μL)，10X激酶缓冲液(1μL)和水(4μL)的混合物中37℃温育1小时对寡核苷酸XyTv-110(10pmol，1μL)进行磷酸化。
随机选择转化体进行杂交分析。菌落在加有氨苄青霉素的YT平板上的尼龙膜上生长过夜。然后用0.5N NaOH-1.5M NaCl(10分钟)将其变性并用0.5N Tris-HCl(pH7.0)-1.5M NaCl(10分钟)中和。用254nm的紫外线照射8分钟后，用6X SSC-0.05％ TritonX-100洗涤尼龙膜30分钟。完全刮除细胞碎片。在新鲜溶液中再次洗涤30分钟后，将复制的膜分别转入分离的6X SSC-1％硫酸葡聚糖-0.05％ TritonX-100-1X Denhardt’s杂交液混合物中。将32P标记的探针加到膜上，45℃16小时后，用6X SSC-0.05％ TritonX-100在室温洗涤尼龙膜两次，每次5分钟，然后65℃保温30分钟。通过放射自显影分析鉴定具有中间质粒pBcX.TvX的阳性杂交克隆。
上述的方法，包括合成的重叠寡核苷酸的酶促磷酸化和与一个线性化质粒的连接，也用在了TX(1-92)区的组装和本发明描述的几个随后产生的突变体系列NI-TX和NI-BX的盒式突变。
为了组装TX(1-92)区以完成全长的木霉基因，用NheI和KpnI内切酶将中间质粒pBcX.TvX线性化以释放BcX(1-83)的DNA插入片段。通过上面描述的方法用NheI和KpnI粘性末端将编码发表的TvX(3-91)序列的10个重叠寡核苷酸(XyTv-1到-10)连接到线性化的质粒pBcX.TvX上，因此新质粒pTvX(3-190)就包含了一个合成的TvX(3-190)基因。与天然的TrX相比，重组的TvX(3-190)具有5个不同的残基Ala-1，Ser-2，Gly-4，Phe-9，Thr-65和Thr-143。
为了比较，编码天然TrX的基因也以同样的方式组装而带有5个天然的残基，此内容也已经发表(Sung et al，1995)。此基因在大肠杆菌中的表达产生一个TrX的重组版本(rec.TrX)。如下面指出和Sung et al(1995)的报道那样，TvX(3-190)和rec.TrX的特性是相同的。但是，大肠杆菌表达的这两个木聚糖酶的嗜热性和热稳定性都比天然的TrX(natl TrX)差，可能是因为缺乏象天然TrX那样的翻译后修饰。
B.质粒pNI-TX1的构建包括下面描述的NI-TX和NI-BX系列的所有突变体木聚糖酶基因都是通过盒式突变的方法构建的，盒式突变的方法与上面充分描述的基因组装方法相同。这种盒式突变包括(i)重叠的合成寡核苷酸的酶促磷酸化，(ii)与线性化的质粒连接，(iii)转化大肠杆菌HB101感受态细胞，(iv)通过用标记的寡核苷酸作探针杂交来鉴定突变的转化体，和(v)通过双脱氧核苷酸测序确定突变。
突变体NI-TX1与具有单一突变Q162H的TvX(3-190)相同。在一个盒式突变中，质粒pNI-TX1的构建是通过将寡核苷酸TX-162H-1和TX-162H-2(下面所示)连接进入NsiI/AvrII线性化的质粒pTvX(3-190)完成的。
TX-162H-1158 159 160 161 162 163 164 165 166AWAQHGLTL5′-TGG GCA GAG CAC GGG TTA ACCA CGT ACC CGT GTC GTG CCC AAT TGG GAT C-5′NsiI AvrIITX-162H-2C.质粒pNI-TX2的构建突变体NI-TX2是NI-TX1的修饰版本，是(i)用Tfx(1-29)序列取代NI-TX1的(1-29)序列和(ii)用四肽ASHA在位置-4至-1延伸N-末端的上游。在一个盒式突变中，质粒pNI-TX2是通过将编码Tfx(1-29)序列的重叠寡核苷酸Tfx-1，-2，-3和-4连接到NheI/ApaI线性化的pNI-TX1质粒上而构建的。
Tfx-1Tfx-4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12A S H A A V T S N E T G Y HDG5′-CT AGC CAC GCG GCC GTA ACT TCA AAT GAA ACC GGT TAT CATGAC GGCGGTG CGC CGG CAT TGA AGT TTA CTTTGG CCAATA GTACTG CCG NheITfx-3PinAITfx-213 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2627 28Y F Y S F W T D A P G T V SMETAT TTC TAC AGC TTC TGG ACC GAT GCA CCG GGA ACT GTG TCCATG GAGATA AAG ATG TCG AAG ACC TGG CTA CGT GGC CCT TGA CAC AGGTAC CTCTfx-429 30 31L G PCTC GGG CCGAGCApaI
D.质粒pNI-TX3的构建NI-TX3是NI-TX2的修饰版本，只是没有象后者的从位置(-4)到(-1)的额外的四肽ASHA。通过用一个新的TrX(1-6)减去额外的上游残基的密码序列取代NI-TX2基因中的Tfx(1-6)密码序列来制备质粒pNI-TX3。在一个盒式突变中，这是通过将寡核苷酸Tfx(1-6)-1和Tfx(1-6)-2连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-TX2上来完成的。
Tfx(1-6)-1Tfx 12345678fmet AVTSNETG5-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG GCA GTA ACA TCA AAT GAA AGATT CCT CC GAC GTC TAC CGT CAT TGT AGT TTA CTTTGG-CCNheI Tfx(1-6)-2 PinAIE.质粒pNI-TX4的构建NI-TX4是NI-TX1的修饰版本，是用Tfx(10-29)序列取代NI-TX1的(10-29)序列。通过用TrX(1-6)的密码序列取代NI-TX2基因中的Tfx(1-6)密码序列来制备质粒pNI-TX4。在一个盒式突变中，这是通过将寡核苷酸TX-1f和TX-8f连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-TX2上来完成的。
TX-1fTx 1 2 3 4 5 6 7st Q T I Q P G T5′-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA A3′-GATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCTTGG CCNheI TX-8f PinAIF.质粒pNI-TX5和pTX-28E-29L-162H的构建除了将NI-TX1的(26-29)区内的四肽TYTN氨基酸序列用Tfx的(26-29)区内的相应的四肽SMEL替换外，突变体NI-TX5与NI-TX1相同。在一个盒式突变中，质粒pNI-TX5的构建是通过将异源双链寡核苷酸TX-26SMEL-1和TX-28E/29L-1(下面所示)连接到NcoI/ApaI线性化的质粒pNI-TX1上完成的。质粒制备物的亚克隆产生两个目标质粒。
TX-26SMEL-122 23 24 25 26 27 28 29 30 31H G G V S M E L G P5′-CAT GGT GGT GTG AGC ATG GAG CTC GGG CCCA CCA CAC TGG ATG CTC GAGC-5′NCoI T YApaITX-28E/29L-1因为两个寡核苷酸是异源双链，用TX-26SMEL-1和TX-28E/29L-1进行亚克隆和杂交产生两个质粒，(i)在(26-29)区具有SMEL的pNI-TX5，和(ii)在位置28和29具有E和L的pTX-28E-29L-162H。
G.质粒pNI-TX6的构建除了具有两个单一的突变Y27M和N29L外，突变体NI-TX6与NI-TX1相同。在一个盒式突变中，质粒pNI-TX6的构建是通过将寡核苷酸TX-27M/29L-1和TX-27M/29L-2(下面所示)连接到NcoI/Apal线性化的质粒pNI-TX1上完成的。
TX-27M/29L-122 23 24 25 26 27 28 29 30 31H G G V T M T L G P5′-CAT GGA GGC GTC ACA ATG ACT CTG GGG CCCT CCG CAG TGT TAC TGA GACCNcoI ApaITX-27M/29L-2H.质粒pTX-27M-162H的构建除了具有一个额外的突变Y27M外，突变体TX-27M-162H与NI-TX1相同。在一个盒式突变中，质粒是通过将双链寡核苷酸TX-27M-1和TX-27M-2(下面所示)连接到NcoI/ApaI线性化的质粒pNI-TX1上构建成的。
TX-27M-122 23 24 25 26 27 28 29 30 31H G G V T M T N G P5′-CAT GGA GGC GTC ACA ATG ACT AAT GGG CCCT CCG CAG TGT TAC TGA TTACNcoI ApaITX-27M-2
I.质粒pNI-TX7的构建突变体NI-TX7是NI-TX3的修饰版本，在-4到-1位置上具有四肽ASAR。在一个盒式突变中，质粒pNI-TX7的构建是通过将寡核苷酸Tf-(-1)R-1和Tf-(-1)R-2(下面所示)连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-TX2上完成的。
Tf-(-1)R-1Tfx-1 1 2 3 4 5 6 7 8A S A R A V T S N E T G5′-CT AGC GCA AGA GCA GTA ACA AGT AAC GAG AGCGT TCT CGT CAT TGT TCA TTG CTCTGG CCNheI PinAITf-(-1)R-2J.质粒pNI-TX8的构建突变体NI-TX8是NI-TX3的修饰版本，是(i)用丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(23-31)序列从(-10)至(-2)位置和(ii)用精氨酸残基在(-1)位置(Tfx氨基酸编号)延伸NI-TX3的N-末端的上游。在一个盒式突变中，质粒pNI-TX8的构建是通过将寡核苷酸CaTf-(-1)R-1和CaTf-(-1)R-2连接到NheI/PinAI线性化的pNI-TX2质粒上而完成的。
CaTf-(-1)R-1CaX Tfx-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5A S A F N T Q A A P R A V T S N5′CT AGC GCA TTC AAC ACA CAG GCC GCT CCT CGA GCT GTC ACC AGC AACGCGT AAG TTG TGT GTC CGG CGA GGA GCT CGA CAG TGG TCG TTGNheICaTf-(-1)R26 7 8E T GGAG ACTCTGG CCPinAIK.质粒pNI-TX9的构建突变体NI-TX是NI-TX3的修饰版本，是用三肽GRR从(-3)至(-1)位置(Tfx氨基酸编号)延伸NI-TX3的N-末端的上游。
构建PCR引物以在(-3)至(-1)位置引入三肽GRR。5’和3’引物如下所示
5’引物，GRR-Tf(1-6)-1TfX-3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8st G R R A V T S N E T G5′ACTCTG CAGATG GGA AGA AGG GCC GTA ACT TCA AAT GAA ACC GGTPstI9 10 11YHDTAT CAT GAC3’引物，Uni-PCR-1r5′GAA AAG TGC CAC CTG ACG TCC CAA GCT THindIII使用质粒pNI-TX2作为PCR模板。反应溶液中含有质粒pNI-TX2 DNA(50ng，15μL)，5μL的10X缓冲液(100mM KCl，100mM硫酸铵，200mM Tris-HCl pH 8.8，40mM硫酸镁，1％TritonX-100，100μg/mlBSA)，5μL的5mM dNTP，5’引物溶液(25pmol，2.5μL)，3’引物溶液(25pmol，2.5μL)，和水(19μL)。
反应用石蜡油(50μL)覆盖以防止蒸发。将反应混合物不加酶预温至94℃ 5分钟，然后将反应混合物冷却至72℃，然后加入DNA聚合酶(1μL，1单位)。将反应在热循环仪上保温30个循环，每个循环包括94℃ 1分钟，55℃ 2分钟，和72℃2分钟。得到的PCR产物是一个约1μg的600bp片段。用琼脂糖凝胶纯化此片段。
用限制酶PstI和HindIII酶切获得的PCR产物，并在一个盒式突变中，将其连接到PstI/HindIII线性化的质粒pNI-TX3上。转化大肠杆菌HB101可获得质粒pNI-TX9。
L.质粒pNI-TX10的构建除了具有两个单一的突变H10N和D11N外，突变体NI-TX10与NI-TX1相同。在一个盒式突变中，质粒pNI-TX10的构建是通过将寡核苷酸TX10HD-1和TX10HD-2(下面所示)连接到PinAI/Apal线性化的质粒pNI-TX1上完成的。
TX10HD-27 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22T G F H D G Y F Y S Y W N D G H5′CC GGT TTC CAC GAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GAC GGC CATAAAG GTG CTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CTG CCG GTAPinAI TX10HD-123 24 25 26 27 28 29 30 31G G V T Y T N G PGGA GGA GTA ACT TAC ACC AAT GGG CCCCT CCT CAT TGA ATG TGG TTACApaIM.质粒pNI-TX11和pNI-TX12的构建突变体NI-TX11和NINI-TX12除了分别具有三个和四个单一突变外，与NI-TX1相同。NI-TX11具有三个突变N10H，Y27M和N29L。NI-TX12具有四个突变N10H，N11D，Y27M和N29L。
通过用质粒pNI-TX6作模板进行PCR构建了期望的基因。5’和3’PCR引物TX10HD/N-1和Uni-PCR-1r，和引入三肽GRR的PCR方法在pNI-TX9的构建中已经描述。
用限制酶PinAI和HindIII酶切获得的PCR产物，并在一个盒式突变中，将其连接到PinAI/HindIII线性化的质粒pNI-TX1上。转化大肠杆菌HB101可获得质粒pNI-TX11和pNI-TX12。通过核苷酸测序对其进行鉴定。
5’引物 TX10HD/N-17 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20T G Y H D/N G Y F Y S Y W ND5′GAAACC GGTTAC CAC XAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GATPin AI21 22G HGGC CX＝G+AN.质粒pNI-TX13的构建除了具有在NI-TX11中描述的三个突变体N10H，Y27M和N29L外，NI-TX13与重组的野生型TrX相同。这个突变体的产生需要将突变体NI-TX11位置1-4的残基转变成TrX位置1-4的残基。突变体NI-TX11中的三个残基Ala-1，Ser-2，Gly-4相应地转变成Gln，Thr和Gln。在一个盒式突变中，质粒pNI-TX13的构建是通过将寡核苷酸TrX1f和TrX8f(下面所示)连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-TX11上完成的。
TrX1fTrX 1 2 3 4 5 6 7 8fmet Q T I Q P G T G5-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA AGATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCTTGG CCNheI TrX8f PinAI实施例2环状芽孢杆菌突变体木聚糖酶NI-BX的构建真菌木霉木聚糖酶的修饰NI-TX2，NI-TX3，NI-TX7，NI-TX8和NI-TX9也在细菌环状芽孢杆菌木聚糖酶(BcX)中再现。起始质粒pXYbc在此之前已经制备好并已经发表(Sung et al，1993；Campbell et al，US专利5,405,769，1995年4月11日授权)，在此只作简要描述。按上面描述的用于pXyTv(3-190)相同的方法，通过用T4DNA激酶酶促磷酸化并通过T4 DNA连接酶将重叠的合成寡核苷酸连接到一个线性化的质粒上来组装编码环状芽孢杆菌木聚糖酶(BcX)的合成基因(图4)(Sung et al，1993)。
A.质粒pNI-BX1的构建NI-BX1的修饰方法已经在制备NI-TX2中使用。突变体NI-BX1是BcX的修饰版本，是用Tfx(1-31)序列取代BcX的(1-22)区。在一个盒式突变中，质粒pNI-BX1的构建是通过将编码Tfx(1-31)序列的重叠寡核苷酸Tfx-1，-2b，-3和-4b连接到NheI/BspEI线性化的质粒pXYBc上完成的。
Tfx-2b11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26D G Y F Y S F W T D A P G T V SACC GAT GCC CCG GGA ACT GTG AGT3′-G CCG ATA AAG ATG TCG AAG ACC TGG CTA CGG GGC CCT TGA CAC TCATfx-4b27 28 29 30 31M E L G PATG GAG CTC GGC CTAC CTC GAG CCGGGG CCBspEI
B.质粒pNI-BX2的构建NI-BX2的修饰方法已经在制备NI-TX3中使用。突变体NI-BX2是NI-BX1的修饰版本，但是没有NI-BX1中的从(-4)到(-1)位置的额外残基。质粒pNI-BX2是通过用一个新的减上游额外残基的TrX(1-6)密码序列替换NI-BX1基因中的Tfx(1-6)的密码序列来制备的。在一个盒式突变中，这是通过将寡核苷酸Tfx(1-6)-1和Tfx(1-6)-2连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-BX1上完成的。
C.质粒pNI-BX3的构建NI-BX3的修饰方法已经在制备NI-TX7中使用。突变体NI-BX3是NI-BX1的修饰版本，但是在(-1)位置用一个精氨酸残基延伸了N-末端。在一个盒式突变中，质粒pNI-BX3的构建是通过将寡核苷酸Tf-(-1)R-1和Tf-(-1)R-2连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-BX1上完成的。
D.质粒pNI-BX4的构建除了在(-1)位置用一个赖氨酸残基代替了精氨酸残基外，突变体NI-BX4与NI-BX3相同。在一个盒式突变中，质粒pNI-BX4的构建是通过将寡核苷酸Tf-(-1)K-1和Tf-(-1)K-2连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-BX1上完成的。
Tf-(-1)K-1Tfx-1 1 2 3 4 5 6 7 8A S A K A V T S N E T G5′-CT AGC GCA AAA GCA GTA ACA AGT AAC GAG AGCGT TTT CGT CAT TGT TCA TTG CTCTGG CCNheIPinAITf-(-1)K-2E.质粒pNI-BX4-K(-1)D和pNI-BX4-K(-1)E的构建除了在(-1)位置用一个酸性残基Asp或Glu替换碱性残基外，突变体NI-BX4-K(-1)D和NI-BX4-K(-1)E与NI-BX4或NI-BX3相同。在一个盒式突变中，质粒的构建是通过将异源双链寡核苷酸Tf-(-1)D-1和Tf-(-1)E-2连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-BX1上完成的，制备的质粒的亚克隆产生目标质粒。
Tf-(-1)D-1Tfx-1 1 2 3 4 5 6 7 8A S A D A V T S N E T G5′-CT AGC GCA GAT GCA GTA ACA AGT AAC GAG AGCGT CTT CGT CAT TGT TCA TTG CTCTGG CCNheIE PinAITf-(-1)E-2F.质粒pNI-BX5的构建NI-BX5的修饰方法已经在制备NI-TX8中使用。突变体NI-BX5是(i)其(1-29)序列被Tfx(1-29)氨基酸序列取代，(ii)在(-1)位置(Tfx氨基酸编号)用一个精氨酸残基延伸，和(iii)在(-10)到(-2)位置用丙酮丁醇棱状芽孢杆菌xynB(23-31)序列进一步延伸上游。在一个盒式突变中，质粒pNI-BX5的构建是通过将寡核苷酸CaTf-(-1)R-1和CaTf-(-1)R-2连接到NheI/PinAI线性化的质粒pNI-BX1上完成的。
G.质粒pNI-BX6的构建构建PCR引物以在NI-BX5的位置(-3)和(-2)产生变异。混合的碱基编码位置(-3)的残基Ser和Gly，和位置(-2)的残基Pro，Ala，Gly和Arg.5’和3’引物如下所示5’引物，CaTf-PCR-1CaX -3 -2 Tfx-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 P/A -1 1 2 34A S A F N T Q A S/G G/R R A V T S5′CCCGCT AGCGCA TTC AAC ACA CAA GCA XGT YYA AGG GCC GTA ACT TCANheI5 6 7 8 9N E T G YAAT GAA ACC GGT T其中X＝A和G混合物Y＝G和C混合物BcX 3’引物，Xy-14a49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 613′GCA TGC TAG TTG ATG TTG CGA CCG CAA ACC CGG GGC TTA-5′质粒pNI-BX1用作PCR的模板，PCR方法已经在NI-TX9的构建中被描述。得到的PCR产物是一个约1μg的200bp片段，用琼脂糖凝胶纯化此片段。
用限制酶NheI和BamHI酶切获得的PCR产物，并在一个盒式突变中，将其连接到NheI/BamHI线性化的质粒pXYBc中。转化大肠杆菌HB101可产生携带在(-3)和(-2)位置编码不同残基的不同的木聚糖酶基因的质粒。在下面的实施例中研究了所表达的木聚糖酶的酶学特性后，改进最大的突变体是NI-BX6。NI-BX6的双脱氧核苷酸测序揭示在位置(-3)和(-2)的残基相应为Gly和Arg。
H.质粒pNI-BX7的构建突变体NI-BX7是NI-BX2的修饰版本，具有用一个三肽GRR从(-3)到(-1)位置(Tfx氨基酸编号)向上游延伸的N-末端。
期望的基因通过用质粒pNI-BX1作模板进行PCR来构建。PCR引物GRR-Tf(1-6)-1和Uni-PCR-lr，和引入三肽GRR的PCR方法在NI-TX9的构建中已经描述。
用限制酶PstI和HindIII酶切获得的PCR产物，并在一个盒式突变中，将其连接到PstI/HindIII线性化的质粒pNI-TX3上。转化大肠杆菌HB101可产生质粒pNI-TX7。
实施例3修饰的木聚糖酶的产生和分析(A)木聚糖酶的产生培养条件与用于其它的大肠杆菌表达的木聚糖酶生产的成熟方法相同。将5ml在含有氨苄青霉素(100mg/L)的2YT培养基(16g酵母提取物，10g胰化蛋白胨，5gNaCl，1L水)中的过夜培养物加入含有氨苄青霉素的2YT培养基中(1L)。37℃振荡培养(200rpm)，16小时后，收获细胞。
(B)修饰的木聚糖酶的纯化从细胞制备蛋白样品，首先用25g铝粉研磨10g细胞样品以制备细胞提取物。研磨成均匀混合物后，加入少量(5mL)冰冷的缓冲液A(10mM乙酸钠，pH5.5，用于BcX突变体)或缓冲液B(10mM乙酸钠，pH4.6，用于TX突变体)，在每次加液之间剧烈研磨混合物。将混合物以8000xg离心30分钟以除去铝粉和细胞碎片。
在柱层析之前，修饰的木聚糖酶的上清(25mL)按下面的方式之一进行预处理(1)NI-BX1，NI-BX2，NI-TX1，NI-TX2，NI-TX3，NI-TX4，NI-TX6，NI-TX7，NI-TX10，NI-TX11，NI-TX12，NI-TX13。
用透析袋(3500分子量截留)在4℃对3L缓冲液A透析过夜，透析袋中形成的少量沉淀用8000xg离心15分钟除去。
(2)NI-BX3，NI-BX4，NI-BX5，NI-BX6，NI-BX7
60℃加热20分钟，然后68℃加热30分钟并离心去除形成的大量沉淀。将上清pH值调到4.6，-20℃冷冻过夜，融化并离心以除去更多的沉淀。
(3)NI-TX8，NI-TX960℃加热20分钟并离心去除形成的大量沉淀，将上清pH值调到4.6，-20℃冷冻过夜，融化并离心以除去更多的沉淀。
(4)NI-TX5不进行透析或加热，将粗提上清直接调pH值到4.6，-20℃冷冻过夜，融化并离心以除去更多的沉淀。
完成上述预处理后，将细胞抽提物泵入用缓冲液A平衡的50mL床体积的快流S-sepharose阳离子交换柱(Kabi-Pharmacia，Canada)。用300mL在缓冲液A中的0-0.3MNaCl线性梯度，以3mL/min的流速洗脱木聚糖酶。分部收集物在SDS-PAGE上检查，收集具有大量木聚糖酶的部分，并用分子量3000道尔顿截留的膜(Amicon YM3)进行超滤以浓缩样品。然后将浓缩的样品加到用50mM乙酸铵pH6平衡的1.5cm×85cmTSK-HW50S凝胶过滤柱上，以90到100mL的体积洗脱木聚糖酶。这些分部收集物用SDS-PAGE分析，并将峰值样品作为纯的木聚糖酶合并。用280nm处的消光系数对蛋白进行定量。从10g细胞中典型的纯化产量是25mg木聚糖酶。所有的NI-TX和NI-BX木聚糖酶在没有甘油的乙酸铵缓冲液中都有良好的可溶性。
(C)酶活性测定的标准分析定量分析可以测定可溶性木聚糖产生的还原糖末端的量，这种分析的底物是将5％的桦木木聚糖悬浊液(Sigma Chemical Co.)溶于水的桦木木聚糖部分。除去不溶的部分后，将上清冻干并贮存于干燥器中。按下述进行比活的测定。含有提前用分析缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH5.5或所测试的木聚糖酶的最佳pH)稀释的100μL的30mg/mL木聚糖，150μL分析缓冲液，50μL用分析缓冲液稀释的酶的反应混合物在40℃温育。在不同的时间段取出50μL反应液并用1mL的5mM NaOH稀释以终止反应。用对羟苯甲酸酰肼试剂(HBAH)测定还原糖的量(Lever，1972，Analytical Biochem 47273-279)。一个酶活单位被定义为在40℃ 1分钟内产生1μmol还原糖的用量。
为了在修饰的和天然的木聚糖酶之间进行比较(表4和表5)，以天然木聚糖酶的比活性作参照将木聚糖酶的比活性进行标准化。
表4.NI-TX木聚糖酶的相对活性

*以770U/mg的天然TrX的比活性为参照将数据进行标准化。
表5.NI-BX木聚糖酶的相对活性

*以330U/mg的BcX的比活性为参照将数据进行标准化。
在NI-TX(表4)和NI-BX(表5)木聚糖酶中，40℃时修饰的木聚糖酶的比活性与天然木聚糖酶没有显著的差异。
实施例4修饰的木霉木聚糖酶的温度/活性曲线这是为了测定温度对木聚糖酶水解可溶性木聚糖的酶活性的影响。除了改变温育温度和时间外，测定方法与标准分析法相同。将酶(15μg/mL)和溶于pH5.5的50mM柠檬酸钠缓冲液的可溶性木聚糖混合并在不同温度的循环水浴中温育。30分钟后，用HBAH测定从木聚糖释放出来的还原糖的量并以40℃时的值为100％计算出相对活性。
温度对木聚糖水解的影响如图5所示，大肠杆菌表达的TvX(3-190)在55℃或更高温度时显示比天然TrX低得多的活性。和Sung et al 1995报道的一样，大肠杆菌表达的TrX显示了低的嗜热性。
天然TrX在高至60℃时还具有高活性。这个酶的耐热性优于大肠杆菌表达的酶的原因可能是木霉宿主的翻译后修饰的结果。
具有突变Q162H的突变体NI-TX1的活性/温度曲线与TvX(3-190)的相同。
将NI-TX2的(1-29)区用Tfx(1-29)的相应序列取代并用四肽ASHA在(-4)至(-1)位置延伸N-末端产生了NI-TX2。如果有效作用温度定义为允许150％相对活性(以40℃时的活性为参照计算)的温度，这个突变体显示了比TvX(3-190)或NI-TX1高10℃的改进。
具有用Tfx(1-29)取代但没有和NI-TX2一样的用残基ASHA在(-4)至(-1)位置延伸N-末端的突变体木聚糖酶NI-TX3的温度/活性曲线与NI-TX2的相同。
另外一个具有用较短的Tfx(10-29)序列取代的突变体NI-TX4的嗜热性稍低于NI-TX2和NI-TX3。
具有用Tfx的四肽在(26-29)区替换的嵌合木聚糖酶NI-TX5显示了比TvX(3-190)或NI-TX1高5℃的改进。
具有Y27M和N29L双突变的突变体NI-TX6在高至60℃时保留了显著的酶活性。它的温度/活性曲线与NI-TX5的相同。
另外一个突变体NI-TX7具有与NI-TX2相同的嗜热性。NI-TX7除了在-4到-1位置用四肽ASAR延伸N-末端外，其具有与NI-TX3相同的氨基酸序列。虽然这个突变体和NI-TX2都显示用这些四肽的延伸对嵌合的木霉木聚糖酶的温度范围没有明显的影响，但还是探索研究了其它的N-末端延伸。
NI-TX8是合成的，它显示了比TvX(3-190)或NI-TX1高13℃，和比天然TrX高约10℃的改进。除了具有一个额外的用丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(23-31)序列在(-10)到(-2)位置延伸上游的N-末端外，NI-TX8与NI-TX7的结构相同。
构建了突变体NI-TX9以测试是否可以将NI-TX8上游延伸中的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(23-31)序列用一个更短的三肽序列GRR代替。在下述的NI-BX7的研究中确认了此三肽。较小的新突变体NI-TX9显示了与NI-TX8相同的温度/活性曲线。
在木聚糖酶的N-末端向上游延伸可以增强酶的性能是首次报道。
为了确认其它残基对家族11木聚糖酶嗜热性的贡献，制备了突变体NI-TX10，它是从NI-TX1衍生而来，具有双重突变N10H和N11D。新突变体NI-TX10与其前体NI-TX1相比有效作用温度提高了6℃。
最后构建了两个突变体木聚糖酶NI-TX11和NI-TX12，它们是NI-TX1的衍生物，分别具有三个突变(N10H Y27M N29L)和四个突变(N10H N11D Y27M N29L)。它们用于测定(i)突变N10H和N11D的各自贡献，和(ii)与上面确认的其它两个有益突变Y27M和N29L的联合作用。两个突变体NI-TX11和NI-TX12都显示相同的温度/活性曲线且有效作用温度提高了13℃。这个结果显示N11D突变对TrX的嗜热性没有影响。将NI-TX11位置(1-4)的残基转变成野生型TrX的残基产生了NI-TX13。NI-TX13和NI-TX11的温度/活性曲线相同。
NI-TX11或NI-TX13达到150％相对活性的有效作用温度的提高(+13℃)高于单个突变N10H(+6℃，在NI-TX11中)和Y27M/N29L(+4℃，在NI-TX2中)的理论总和。如在嵌合突变体NI-TX2(+10℃)，NI-TX3(+10℃)和NI-TX4(+9℃)中所示，这种改进还高于通过用可能具有三个突变的任何天然Tfx序列进行直接取代所获得的任何改进。另外，与在嵌合酶中的用TfX序列31-20个残基的取代相比，NI-TX11或NI-TX13中3个残基的三个突变是一个很小的修饰，这可以间接地减少其它不需要的木霉木聚糖酶一般性质的改变。
实施例5修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的温度/活性曲线分析方法大致与实施例4中NI-TX木聚糖酶的分析方法相同。温度对溶于pH5.5的50mM柠檬酸钠缓冲液的NI-BX木聚糖酶水解可溶性木聚糖的影响如图6所示。
天然的BcX在温度高至60℃时是有活性的。
用Tfx(1-31)序列替换BcX的N-末端的BcX(1-22)序列得到的突变体NI-BX1在温度高至82℃时仍有很高的活性。和NI-TX部分中讨论的一样，有效作用温度定义为允许150％相对活性(以40℃时的活性为参照计算)的温度。在这种情况下，NI-BX1的嗜热性大约提高22℃。突变体NI-BX2，没有NI-BX1中的(-4)到(-1)位置的额外残基ASHA，显示了相同的温度/活性曲线。
在NI-BX3和NI-BX5中(-1)位置插入一个精氨酸残基的进一步修饰使其嗜热性比NI-BX1和NI-BX2提高了2.5℃。
在(-1)位置具有另外一个碱性氨基酸Lys的NI-BX4中也观察到了同样的提高。用酸性残基Glu或Asp替换使最大作用温度降低约10℃(数据未示出)，因此，这些结果证明了在(-1)位置用碱性氨基酸(Arg，Lys)延伸对耐热性的贡献，但存在中性(His)和酸性(Asp，Glu)残基则相反。
突变体NI-BX6显示了比NI-BX3提高2.5℃或比NI-BX1提高5℃的改进。因此，通过在(-10)至(-4)位置加入丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(23-29)序列，在(-3)位置加入Gly和在(-2)和(-1)位置均加入Arg来延伸N-末端可以进一步提高嗜热性。
构建了突变体NI-BX7以测试是否可以将NI-BX6上游延伸中的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(23-31)序列用一个更短的三肽序列GRR代替。虽然NI-BX6和NI-BX7似乎有相同的有效作用温度或高温限，但较小的NI-BX7显示了比NI-BX6更广的酶活性温度范围。和上面描述的突变体NI-TX9一样，不使用CaX序列，同样的三肽也成功地提高了木霉木聚糖酶的有效作用温度。
总之，成功地提高了真菌木霉木聚糖酶嗜热性的修饰大致可以用于细菌环状芽孢杆菌木聚糖酶。
实施例6NI-BX木聚糖酶的嗜热性与Campbell等现有技术的比较Campbell等现有技术中改进最大的环状芽孢杆菌(BcX)突变体TS19a是修饰了氨基酸3，4，8，和22(根据BcX编号系统)。将这个修饰的木聚糖酶与NI-BX木聚糖酶使用上面描述的方法相比，得到的结果如图6所示。NI-BX木聚糖酶的最佳温度比TS19a的最佳温度高8-14℃。另外，在最佳温度时，本发明的NI-BX6和NI-BX7木聚糖酶的活性比Campbell等的高3倍。这套结果说明本发明的修饰的木聚糖酶的性能远远优于Campbell等的木聚糖酶性能。
实施例7NI-BX6和NI-BX7的嗜热性与天然梭状芽孢杆菌木聚糖酶和褐色热单胞木聚糖酶的比较突变体木聚糖酶NI-BX6的N-末端结构域包括一个来自丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(CaX)的一段短序列的延伸。突变体木聚糖酶NI-BX7的N-末端结构域包括一个三肽GRR的延伸。NI-BX6和NI-BX7的一段氨基酸序列用一个来自褐色热单胞的热稳定木聚糖酶TfxA的短序列取代。通过与发表的关于天然热单胞和梭状芽孢杆菌木聚糖酶的数据比较来评估NI-BX6和NI-BX7的嗜热性。
在温度高至85℃时仍有很高活性的突变体NI-BX6和NI-BX7优于具有低的多的最适温度43℃的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(CaX)(Zappe et al.1987，Zappe et al.1990)。
没有关于褐色热单胞木聚糖酶TfxA的温度曲线的数据。关于褐色热单胞的发酵上清的嗜热性有发表的数据可用(Casimir-Schenkel et al.1992)，这个上清包括6个木聚糖酶，TfxA是其中之一。根据分析褐色热单胞的发酵上清的描述的方法(Casimir-Schenkel et al.1992)，测定温度对NI-BX6和NI-BX7活性的影响．这包括在溶于50mM磷酸钠缓冲液(pH7)的木聚糖中加入突变体木聚糖酶并在70，80和90℃精确保温10分钟。
数据显示嵌合的芽孢杆菌木聚糖酶表现出比褐色热单胞木聚糖酶上清更高的嗜热性，并因此很可能高于TfxA(表6)。
这个实施例显示了出人意料的结果，即在嵌合修饰中短片段的插人可以使木聚糖酶的耐热性提高得远远超过作为短片段来源的嗜热木聚糖酶。
表6.pH7.0时温度对相对酶活性的影响 *70℃的酶活性计算为100％。
**Casimir-Schenkel et al.1992发表的数据，在此引为参考文献。
与野生型的酶相比，除了酶活性发挥作用的更高的温度外，一些新的突变体还获得了更高的酶活性。一些NI-BX木聚糖酶(NI-BX6，NI-BX7)在其相应的最佳温度(75℃)时的相对活性四倍于野生型BcX在最佳温度(55℃)时的相对活性(参见图6)。
总之，成功地提高了真菌木霉木聚糖酶嗜热性的修饰大致可以用于细菌环状芽孢杆菌木聚糖酶。
实施例8修饰的木霉木聚糖酶的pH/活性曲线这是为了测定不同的pH对木聚糖酶水解可溶性木聚糖的酶活性的影响。除了改变温育温度和时间外，测定方法与标准分析法相同．将木霉酶(15μg/mL)和溶于pH4-8的50mM柠檬酸钠缓冲液的可溶性木聚糖在65℃共同温育，30分钟后，用HBAH测定从木聚糖释放出来的还原糖的量并以最佳pH时的值为100％计算出相对活性。
pH对不同NI-TX木聚糖酶的酶活性的影响如图7所示。
天然TrX，NI-TX1，NI-TX5，NI-TX6显示相同的pH/活性曲线，在高至pH5.5时具有很高的活性，在pH6时活性显著下降。
在突变体NI-TX2，NI-TX3和NI-TX8中用Tfx(1-29)的取代导致在pH6.0时仍保持全部活性，并在pH7时有明显的活性。这表示比天然TrX增加了1个pH单位。突变体NI-TX9显示了与NI-TX8相同的pH/活性曲线，因此说明上游的CaX序列可以用三肽GRR替换。
具有双重突变(N10H N11D)的类似物NI-TX10与其前体NI-TX1相比，酶活性的pH上限提高了0.5pH单位。NI-TX11，NI-TX12和NI-TX13提高了0.6pH单位。
实施例9修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的pH曲线测试方法与实施例8中的修饰的木霉木聚糖酶的测试方法相同。将环状芽孢杆菌木聚糖酶与溶于柠檬酸钠缓冲液(pH4-8)和硼酸钠缓冲液(pH9.5和10)的可溶性木聚糖在65℃保温。如图8所示，在高至pH6.0时天然BcX保留完整活性。
在突变体NI-BX1，NI-BX2，NI-BX3，NI-BX5，NI-BX6，和NI-BX7中用Tfx(1-33)的长序列的取代使酶活性延伸到超过pH7.0(图8)，这说明比BcX提高了1.5-2pH单位。
实施例10修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的pH/活性曲线与Campbell等的木聚糖酶的pH/活性曲线的比较根据实施例8中描述的方法测定并比较了NI-BX木聚糖酶与Campbell等现有技术中改进最大的木聚糖酶TS19a的pH范围，结果如图8所示。NI-BX木聚糖酶的最佳pH比TS19a的最佳pH提高了1-1.5个单位，而TS19a本身只比天然BcX稍有提高(0.5pH单位)。这个结果说明本发明的木聚糖酶的性能优于Campbell等的木聚糖酶。
实施例11修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的pH/活性曲线与天然的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌和褐色热单胞木聚糖酶的pH/活性曲线的比较因为NI-BX木聚糖酶的N-末端结构域由丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(CaX)和褐色热单胞的木聚糖酶TfxA的短序列组成，所以将修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的pH范围和这两个天然的木聚糖酶的发表数据进行了比较。
在65℃，pH高至7.0时有最大活性(图8)的NI-BX突变体木聚糖酶，比43℃最适pH6.0的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(CaX)(Zappe et al.1987，Zappe et al.1990)有更高的最大pH。
对褐色热单胞木聚糖酶TfxA来说，其pH范围已经被披露(Wilson et al，PCT/1995)。为了比较研究，根据测定TfxA时描述的方法(Wilson et al，PCT/1995)测定pH对NI-BX木聚糖酶的酶活性的影响。这包括将木聚糖酶加入到溶于pH8-10的0.05M甘氨酸钠缓冲液的木聚糖中并在50℃保温30分钟。如图9所示，芽孢杆菌木聚糖酶NI-BX1，NI-BX2，NI-BX3，NI-BX6，和NI-BX7都显示最佳pH为9，而TfxA的最佳pH为8。
这个实施例显示了出人意料的结果，即本发明的木聚糖酶比用于提供氨基酸短序列的两个木聚糖酶都具有较高的pH范围。
实施例12修饰的木霉木聚糖酶的热稳定性这是为了测定在没有木聚糖存在的情况下，在一系列温度中贮存的木聚糖酶的耐性。下列参数通用于NI-TX和NI-BX木聚糖酶。将在分析缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH5.5或4.5)中的木聚糖酶(150μg/mL)在一系列温度下温育。以固定的间隔分部取样。冷却至20℃后，通过实施例3的HBAH分析测定在40℃时被加热样品的残留酶活性。以“0分钟”温育样品的酶活性为参照将测得的酶活性标准化。
图10显示在53℃时嵌合木聚糖酶NI-TX5，NI-TX10，和NI-TX11的贮存稳定性高于天然的TrX。以NI-TX5为例，用Tfx的SMEL四肽序列替换(26-29)区使其在温育60分钟后仍保留全部的酶活性。
在大肠杆菌中表达的NI-TX1，Tv(3-190)，和TrX与天然的TrX相比热稳定性没有改进。
在更高的温育温度68℃时，天然的TrX，NI-TX1和NI-TX5在不到10分钟内丧失全部酶活性(图11)。
在同样的温度时，嵌合木聚糖酶NI-TX2在10分钟后保留了40％的酶活性。
嵌合木聚糖酶NI-TX8在60分钟后保留了55％的活性，因此说明它对贮存温度的耐性比天然的TrX提高了约15℃。
总之，在NI-TX2，NI-TX8，和NI-TX9中的嵌合修饰，即用Tfx(1-29)序列替换木霉木聚糖酶的(1-29)区，用丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(23-31)序列在(-10)至(-2)位置和用精氨酸在(-1)位置，或用三肽GRR进行上游延伸，进一步提高了热稳定性。
实施例13修饰的芽孢杆菌木聚糖酶的热稳定性将修饰的芽孢杆菌木聚糖酶NI-BX和BcX在70℃和pH5.5温育(图12)。不出所料天然木聚糖酶BcX在不到10分钟内丧失全部酶活性，相反，突变体NI-BX1在20到30分钟后保留大部分活性，这说明可以通过用Tfx(1-31)序列替换BcX(1-22)序列来提高环状芽孢杆菌木聚糖酶的热稳定性。在NI-BX3，NI-BX5，NI-BX6，和NI-BX7中，用丙酮丁醇梭状芽孢杆菌xynB(23-29)序列在(-10)至(-4)位置，用甘氨酸在(-3)位置和用精氨酸在(-2)和(-1)位置或用三肽GRR进行N-末端延伸可进一步提高热稳定性。对NI-BX6和NI-BX7来说，热稳定性比天然的BcX酶提高了约15℃。因此成功地提高了真菌木霉木聚糖酶热稳定性的修饰大致可以用于细菌环状芽孢杆菌木聚糖酶。
实施例14修饰的木霉木聚糖酶在纸浆处理中性能的评估上面实施例3至实施例13中描述的分析方法包括可溶性木聚糖的水解并且这个方法在NI-TX和NI-BX系列中嗜热的修饰木聚糖酶的鉴定中是成功的。但是，在漂白过程的纸浆预处理中，木聚糖酶将与纸浆中的不溶性木聚糖相互作用。因此证实用可溶性木聚糖底物鉴定到的性能增强也可以在纸浆处理中观察到是很重要的。因此，测定了修饰的木聚糖酶在漂白前的褐纸浆处理中的性能。
将天然的和修饰的木聚糖酶样品送到Iogen Corporation of Ottawa，Canada以进行在纸浆上的测试，Iogen制造并向纸浆工业提供木聚糖酶并发展了测试技术以评价木聚糖酶在处理纸浆中的性能。测试方法包括在纸浆中加入酶并维持一段特定的时间，然后测定酶对随后的纸浆可漂白性的影响。测试是用商品化的Kappa number 25.6的软木牛皮纸纸浆进行的。
木霉木聚糖酶的Iogen纸浆测试结果如图13所示，在pH6.0时(天然TrX在处理纸浆时的最佳pH)，在高至52℃时仍有良好的性能。在pH6.5时天然TrX对纸浆没有活性。
在温度高于40℃时，大肠杆菌表达的具有一个单一点突变Q162H的NI-TX1对纸浆没有作用。相反，在pH6.5时，突变体NI-TX5，NI-TX2和NI-TX8可以在相应地高至60，61，和65℃时起作用。
虽然酶在纸浆中耐受的绝对温度低于在可溶性木聚糖的水解中的温度，但是修饰的木聚糖酶在纸浆处理中温度(+8至13℃)和pH(+0.5单位)的改进与实施例4和实施例8中描述的在木聚糖水解中的嗜热性和嗜碱性的改进是一致的。
基于这些初步测试，这些酶在纸浆处理中可耐受的温度和pH范围是令人鼓舞的。使用不同的纸浆和处理技术更进一步地测试温度和pH范围将有可能提高修饰的木聚糖酶对纸浆起作用的温度和pH范围。
实施例15修饰的芽孢杆菌木聚糖酶在纸浆处理中性能的评估Iogen Corporation还测试了环状芽孢杆菌木聚糖酶在纸浆处理中的性能(图14)。
在pH8.0时，天然BcX在温度高于40℃时性能很差。当pH降到7时，BcX只能在最高不超过50℃时有作用。
相反，突变体NI-BX1在pH8.0，温度高至75℃时仍有活性。
虽然NI-BX1酶在纸浆中耐受的绝对温度低于在可溶性木聚糖的水解中的温度，但是修饰的木聚糖酶在纸浆处理中温度(+28℃)和pH(+1单位)的改进与实施例5和实施例9中描述的在木聚糖水解中的温度耐性和pH范围的改进是一致的。
基于这些初步测试，这些酶在纸浆处理中可耐受的温度和pH范围是令人鼓舞的。使用不同的纸浆和处理技术更进一步地测试温度和pH范围将有可能提高修饰的木聚糖酶对纸浆起作用的温度和pH范围。
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演示并描述了本发明的优选实施方案后，本发明由所附的权利要求书的范围限定。
序列表(1)一般信息(i)申请者宋L荣，矢口诚，石川和彦(ii)发明名称提高木聚糖酶嗜热性，嗜碱性和热稳定性的修饰(iii)序列数54(iv)通讯地址(A)收信人Fitzpatric，Cella，Harper，和Scinto(B)街道277 Park Ave。
(C)城市纽约市(D)州纽约州(E)国家美国(F)邮政编码10172-0194(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)归档日期IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申请数据(A)申请号US 08/709,912(B)申请日1996年9月9日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Olsen Mr，Warren E(B)登记号27290(C)卷号/文档号1039.2000(viii)电讯信息(A)电话(212)758-2400(B)电传(212)758-2982
(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度184个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体黑曲霉，awamori变种(x)出版信息(A)作者Moat Dr，JDr Roga，MDr Verbakel，JStam，HSantos da silva，MJEgmond，MRHagemans，M.L.DGorcom，R.F.M.V.
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Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys Thr100 105 110Asp Thr Arg Ile Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr115 120 125Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr130 135 140Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gln His Gly Phe Gly Asn Ser145 150 155 160Asp Phe Asn Tyr Gln Val Met Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala GlySer Ala Ser Val Thr Ile Ser Ser180(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度185个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体塔宾曲霉(x)出版信息(A)作者de Graaff，L.H.
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Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Val Gln Asn Tyr Asn Gln Asn Leu Gly Asp1 5 10 15Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Thr Phe Ser Met Tyr Trp Glu Asp20 25 30Gly Val Ser Ser Asp Phe Val Val Gly Leu Gly Gly Trp Thr Thr Gly35 40 45Ser Ser Asn Ala Ile Thr Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Gly Ser50 55 60Ala Ser Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Val Asn Tyr Pro Gln Ala Glu65 70 75 80Tyr Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala85 90 95Thr Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys100 105 110Thr Asp Thr Arg Ile Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe115 120 125Thr Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val130 135 140Thr Val Ala Asn His phe Asn Phe Trp Ala His His Gly Phe His Asn145 150 155 160Ser Asp Phe Asn Tyr Gln Val Val Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala165 170 175Gly Ser Ala Ala Val Thr Ile Ser Ser180 185
(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度185个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体环状芽孢杆菌(x)出版信息(A)作者Yang，R.C.A.
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Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asp Arg Thr Thr Phe Thr Gln Tyr115 120 125Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Thr Gly Ser Asn Ala Thr Ile130 135 140Thr Phe Thr Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn Leu145 150 155 160Gly Ser Asn Trp Ala Tyr Gln Val Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser165 170 175Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val Trp180 185(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)长度201个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体短小芽孢杆菌(x)出版信息(A)作者Fukusaki，EPanbangred，WShinmyo，AOkada，H(C)杂志FEBS Letters(D)卷号171(F)页数197-201(G)日期1984(xi)序列描述SEQ ID NO4Arg Thr Ile Thr Asn Asn Glu Met Gly Asn His Ser Gly Tyr Asp Tyr1 5 10 15Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Asn Asn Gly20 25 30
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(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)长度211个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体丙酮丁醇棱状芽孢杆菌P262(B)株系Xyn B(x)出版信息(A)作者Zappe，HJones，W.A.
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Ile Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Ile Asn Gln Pro Ser Ile Gln130 135 140Gly Asn Thr Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Thr Lys Arg145 150 155 160Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Lys His Phe Ala Ala Trp Glu Ser165 170 175Lys Gly Met Pro Leu Gly Lys Met His Glu Thr Ala Phe Asn Ile Glu180 185 190Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Lys Ala Asp Val Asn Ser Met Ser Ile Asn195 200 205Ile Gly Lys210(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)长度206个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)起源(A)有机体Clostridium stercorarium(B)株系Xyn A(x)出版信息(A)作者Sakka，KKojima，YKondo，TKarita，SOhmiya，KShimada，K(C)杂志Biosci.Biotech，Biochem(D)卷号57(F)页数273-277(G)日期1993(xi)序列描述SEQ ID NO7
Gly Arg Ile Ile Tyr Asp Asn Glu Thr Gly Thr His Gly Gly Tyr Asp1 5 10 15Tyr Glu Leu Trp Lys Asp Tyr Gly Asn Thr Ile Met Glu Leu Asn Asp20 25 30Gly Gly Thr Phe Ser Cys Gln Trp Ser Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe35 40 45Arg Lys Gly Arg Lys Phe Asn Ser Asp Lys Thr Tyr Gln Glu Leu Gly50 55 60Asp Ile Val Val Glu Tyr Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser65 70 75 80Tyr Leu Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Phe Leu Val Glu Tyr Tyr85 90 95Ile Val Glu Ser Trp Gly Ser Trp Arg Pro Pro Gly Ala Thr Pro Lys100 105 110Gly Thr Ile Thr Gln Trp Met Ala Gly Thr Tyr Glu Ile Tyr Glu Thr115 120 125Thr Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile Asp Gly Thr Ala Thr Phe Gln Gln130 135 140Tyr Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val145 150 155 160Thr Glu His Phe Lys Gln Trp Glu Arg Met Gly Met Arg Met Gly Lys165 170 175Met Tyr Glu Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Tyr180 185 190Ala Asn Val Tyr Lys Asn Glu Ile Arg Ile Gly Ala Asn Pro195 200 205
(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)长度211个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体产黄瘤胃球菌(x)出版信息(A)作者Zhang，JFlint，H.J.
(C)杂志EMBL数据库入藏号Z11127(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO8Ser Ala Ala Asp Gln Gln Thr Arg Gly Asn Val Gly Gly Tyr Asp Tyr1 5 10 15Glu Met Trp Asn Gln Asn Gly Gln Gly Gln Ala Ser Met Asn Pro Gly20 25 30Ala Gly Ser Phe Thr Cys Ser Trp Ser Asn Ile Glu Asn Phe Leu Ala35 40 45Arg Met Gly Lys Asn Tyr Asp Ser Gln Lys Lys Asn Tyr Lys Ala Phe50 55 60Gly Asn Ile Val Leu Thr Tyr Asp Val Glu Tyr Thr Pro Arg Gly Asn65 70 75 80Ser Tyr Met Cys Val Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Met Glu Tyr85 90 95Tyr Ile Val Glu Gly Trp Gly Asp Trp Arg Pro Pro Gly Asn Asp Gly100 105 110Glu Val Lys Gly Thr Val Ser Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Asp Ile Arg115 120 125Lys Thr Met Arg Tyr Asn Gln Pro Ser Leu Asp Gly Thr Ala Thr Phe130 135 140Pro Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Thr Ser Gly Ser Ala Asn Asn Gln145 150 155 160
Thr Asn Tyr Met Lys Gly Thr Ile Asp Val Ser Lys His Phe Asp Ala165 170 175Trp Ser Ala Ala Gly Leu Asp Met Ser Gly Thr Leu Tyr Glu Val Ser180 185 190Leu Asn Ile Glu Gly Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Ala Asn Val Lys Ser195 200 205Val Ser Val210(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)长度197个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)起源(A)有机体群交裂褶菌(B)株系木聚糖酶A(x)出版信息(A)作者Oku，TYaguchi，MParse，MJurasek，L(C)杂志Canadian Fed.Biol.Soc.annual meeting(F)页数摘要#676(G)日期1988(xi)序列描述SEQ ID NO9Ser Gly Thr Pro Ser Ser Thr Gly Thr Asp Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ser1 5 10 15Trp Trp Thr Asp Gly Ala Gly Asp Ala Thr Tyr Gln Asn Asn Gly Gly20 25 30Gly Ser Tyr Thr Leu Thr Trp Ser Gly Asn Asn Gly Asn Leu Val Gly35 40 45Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ala Ala Ser Arg Ser Ile Ser Tyr Ser50 55 60Gly Thr Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp65 70 75 80
Thr Arg Ser Ser Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr Gly Ser85 90 95Tyr Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ser His Lys Gly Ser Val Thr Cys Asn100 105 110Gly Ala Thr Tyr Asp Ile Leu Ser Thr Trp Arg Tyr Asn Ala Pro Ser115 120 125Ile Asp Gly Thr Gln Thr Phe Glu Gln Phe Trp Ser Val Arg Asn Pro130 135 140Lys Lys Ala Pro Gly Gly Ser Ile Ser Gly Thr Val Asp Val Gln Cys145 150 155 160His Phe Asp Ala Trp Lys Gly Leu Gly Met Asn Leu Gly Ser Glu His165 170 175Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Thr Ala180 185 190Thr Ile Thr Val Thr195(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)长度191个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体变青链霉菌(B)株系Xyn B(x)出版信息(A)作者Shareck，FRoy，CYaguchi，MMorosoli，RKluepfel，D(C)杂志Gene(D)卷号107(F)页数75-82(G)日期1991
(xi)序列描述SEQ ID NO10Asp Thr Val Val Thr Thr Asn Gln Glu Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr1 5 10 15Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Ser Gln Gly Thr Val Ser Met Asn Met Gly20 25 30Ser Gly Gly Gln Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val35 40 45Ala Gly Lys Gly Trp Ala Asn Gly Gly Arg Arg Thr Val Gln Tyr Ser50 55 60Gly Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp65 70 75 80Thr Ser Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Thr85 90 95Tyr Arg Pro Thr Gly Glu Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly100 105 110Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Va1 Asn Lys Pro Ser Val Glu115 120 125Gly Thr Arg Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg130 135 140Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg145 150 155 160Ala Gly Met Pro Leu Gly Asn Phe Ser Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr165 170 175Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Thr Ser Ser Ile Asn Val Gly Gly180 185 190
(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)长度191个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体变青链霉菌(B)株系Xyn C(x)出版信息(A)作者Shareck，FRoy，CYaguchi，MMorosoli，RKluepfel，D(C)杂志Gene(D)卷号107(F)页数75-82(G)日期1991(xi)序列描述SEQ ID NO11Ala Thr Thr Ile Thr Thr Asn Gln Thr Gly Thr Asp Gly Met Tyr Tyr1 5 10 15Ser Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn Gly20 25 30Gly Gly Ser Tyr Ser Thr Gln Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Val Ala35 40 45Gly Lys Gly Trp Ser Thr Gly Asp Gly Asn Val Arg Tyr Asn Gly Tyr50 55 60Phe Asn Pro Val Gly Asn Gly Tyr Gly Cys Leu Tyr Gly Trp Thr Ser65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Ser Tyr Arg85 90 95Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ser Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Gln Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu Gly Thr115 120 125
Lys Thr Phe Gln Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Val Thr Ser130 135 140Gly Ser Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg145 150 155 160Ala Gly Met Asn Met Gly Gln Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr165 170 175Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ile Thr Val Ser Gly180 185 190(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)长度189个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体链霉菌菌株36a(x)出版信息(A)作者Nagashima，MOkumoto，YOkanishi，M(C)杂志Trends in Actinomycetologia(F)页数91-96(G)日期1989(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Thr Thr Ile Thr Asn Glu Thr Gly Tyr Asp Gly Met Tyr Tyr Ser1 5 10 15Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn Gly Gly20 25 30Gly Ser Tyr Ser Thr Arg Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Val Ala Gly35 40 45Lys Gly Trp Ala Asn Gly Gly Arg Arg Thr Val Arg Tyr Thr Gly Trp50 55 60Phe Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Gly Cys Leu Tyr Gly Trp Thr Ser65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Ser Tyr Arg85 90 95
Pro Thr Gly Glu Thr Arg Gly Thr Val His Ser Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu Ala Pro115 120 125Ala Ala Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Val Thr Ser130 135 140Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg Ala Gly145 150 155 160Met Asn Met Gly Asn Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr Glu Gly165 170 175Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Thr Val Ser Gly180 185(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)长度189个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体褐色热单胞(B)株系Tfx A(x)出版信息(A)作者Irwin，DJung，E.D.
Wilson，D.B.
(C)杂志Appl.Environ.Microbiol.
(D)卷号60(F)页数763-770(G)日期1994(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Val Thr Ser Asn Glu Thr Gly Tyr His Asp Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Phe Trp Thr Asp Ala Pro Gly Thr Val Ser Met Glu Leu Gly Pro Gly20 25 30
Gly Asn Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly35 40 45Lys Gly Trp Ala Thr Gly Gly Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Ala Ser50 55 60Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg85 90 95Pro Thr Gly Thr Tyr Met Gly Thr Val Thr Thr Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr115 120 125Arg Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Thr Ser130 135 140Gly Thr Ile Thr Ala Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg His Gly145 150 155 160Met His Leu Gly Thr His Asp Tyr Met Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr165 170 175Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Leu Gly Thr Ser180 185(2)SEQ ID NO14信息(i)序列特征(A)长度190个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体Thrichoderma harzianum(x)出版信息(A)作者Yaguchi，M
Roy，CWatson，D.C.
Rollin，FTan，L.U.L.
Senior，D.J.
Saddler，J.N.
(C)杂志Xylan and Xylanase(F)页数435-438(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO14Gln Thr Ile Gly Pro Gly Thr Gly Tyr Ser Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Ala Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Gly Gly20 25 30Gly Ser Phe Thr Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Ile Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Ser His Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190
(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)长度178个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体Trichoderma reesei(B)株系Xyn I(x)出版信息(A)作者Torronene，AMach，R.L.
Messner，R.
Gonzalez，R.
Kalkkinen，AKubicek，，C.P.
(C)杂志Biotechnology(D)卷号10(F)页数1461-1465(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gln Asn Tyr Gln Thr Gly Gly Gln Val Ser1 5 10 15Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Val Asn Trp Asn Thr Gln Asp20 25 30Asp Phe Val Val Gly Val Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Ala Pro Ile35 40 45Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Val Asn Ser Gly Thr Gly Leu Leu Ser50 55 60Val Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Met Glu65 70 75 80Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gln Gly Thr Val Lys Gly Thr Val Thr85 90 95Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg Val Asn Glu100 105 110
Pro Ser Ile Gln Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gln Tyr Ile Ser Val Arg115 120 125Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Gln Asn His Phe Asn130 135 140Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gln Met Met Asn Tyr Gln Val145 150 155 160Val Ala Val Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Gln Ser Val165 170 175Ser Asn(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)长度190个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体Trichoderma reesei(B)株系Xyn II(x)出版信息(A)作者Torronene，AMach，R.L.
Messner，RGonzalez，RKalkkinen，NHarkki，AKubicek，C.P.
(C)杂志Biotechnology(D)卷号10(F)页数1461-1465(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO16Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly
20 25 30Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)长度190个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假设无(iv)反义否(v)片段类型内部的(vi)最初来源(A)有机体绿色木霉(x)出版信息(A)作者Yaguchi，MRoy，C
Ujie，MWatson，D.C.
Wakarchuk，W.
(C)杂志Xylan and Xylanase(F)页数149-154(G)日期1992(xi)序列描述SEQ ID NO17Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Phe Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly20 25 30Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Thr His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190
(2)SEQ ID N018信息(i)序列特征(A)长度573个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学环状(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆pTvX(3-190)(xi)序列描述SEQ ID NO18CTAGCATAGG ACCAGGAACC GGTTTCAACA ACGGTTACTT TTACAGCTAT TGGAACGATG 60GCCATGGTGG TGTTACCTAT ACAAACGGGC CCGGAGGCCA ATTTAGCGTC AATTGGTCTA120ACTCCGGAAA CTTCGTAGGT GGAAAAGGTT GGCAACCCGG GACCAAAAAT AAGGTGATCA180ACTTCTCTGG ATCTTATAAT CCGAATGGGA ATTCATACTT AAGCGTCTAT GGCTGGTCTA240GAAACCCACT GATTGAATAT TACATTGTCG AAAATTTCGG TACCTACAAT CCGAGTACCG300GCGCCACAAA ATTAGGCGAA GTCACTAGTG ATGGATCCGT ATATGATATC TACCGTACCC360AACGCGTTAA TCAGCCATCG ATCATTGGAA CCGCCACCTT TTATCAGTAC TGGAGTGTTA420GACGTACGCA TCGGAGCTCC GGTTCGGTTA ATACTGCGAA TCACTTTAAT GCATGGGCAC480AGCAAGGGTT AACCCTAGGT ACAATGGATT ATCAAATCGT AGCGGTGGAA GGCTACTTCT540CGAGTGGTTC CGCTAGTATT ACAGTGAGCT AAA 573(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)长度579个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学环状(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆pXYbc(viii)在基因组中的位置
(C)单位bp(xi)序列描述SEQ ID NO19GCTAGCACAG ATTACTGGCA AAACTGGACA GACGGTGGCG GTATCGTTAA TGCCGTGAAC 60GGCTCCGGAG GCAACTACAG CGTGAATTGG TCTAATACTG GGAACTTCGT AGTCGGAAAA120GGTTGGACGA CAGGATCCCC GTTCCGTACG ATCAACTACA ACGCTGGCGT TTGGGCCCCG180AATGGTAACG GTTACCTGAC ACTGTATGGC TGGACGCGTT CGCCACTGAT TGAATATTAC240GTTGTCGACT CTTGGGGAAC GTACCGTCCG ACTGGAACCT ACAAAGGCAC AGTCAAAAGC300GATGGTGGTA CCTATGACAT CTACACCACC ACAAGATACA ACGCACCTTC CATCGATGGC360GATCGGACCA CCTTTACTCA GTATTGGAGT GTTAGACAAT CTAAGCGGCC GACTGGTTCG420AACGCCACCA TTACGTTCAC CAATCACGTG AATGCATGGA AATCCCACGG TATGAACCTA480GGTTCTAATT GGGCTTATCA AGTAATGGCG ACCGAAGGCT ACCAGAGCTC TGGTTCTTCC540AACGTTACAG TGTGGTAAAG ATCTTGAAGC TTGGGACGT 579(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX-162H-1(xi)序列描述SEQ ID NO20TGGGCACAGC ACGGGTTAAC C21(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”
(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX-162H-2(xi)序列描述SEQ ID NO21CTAGGGTTAA CCCGTGCTGT GCCCATGCA 29(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征(A)长度65个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx-1(xi)序列描述SEQ ID NO22CTAGCCACGC GGCCGTAACT TCAAATGAAA CCGGTTATCA TGACGGCTAT TTCTACAGCT 60TCTGG 65(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx-2(xi)序列描述SEQ ID NO23ACCGATGCAC CGGGAACTGT GTCCATGGAG CTCGGGCC 38
(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx-3(xi)序列描述SEQ ID NO24TCATGATAAC CGGTTTCATT TGAAGTTACG GCCGCGTGG 39(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)长度56个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx-4(xi)序列描述SEQ ID NO25CGAGCTCCAT GGACACAGTT CCCGGTGCAT CGGTCCAGAA GCTGTAGAAA TAGCCG 56(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”
(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx(1-6)-1(xi)序列描述SEQ ID NO26CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGGCAGTAAC ATCAAATGAA A41(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx(1-6)-2(xi)序列描述SEQ ID NO27CCGGTTTCAT TTGATGTTAC TGCCATCTGC AGCCTCCTTA G41(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx-1f(xi)序列描述SEQ ID NO28CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGCAAACAAT ACAACCAGGA A41(2)SEQ ID NO29信息
(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx-8f(xi)序列描述SEQ ID NO29CCGGTTCCTG GTTGTATTGT TTGCATCTGC AGCCTCCTTA G 41(2)SEQ ID NO30信息(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX-26SMEL-1(xi)序列描述SEQ ID NO30CATGGTGGTG TGAGCATGGA GCTCGGGCC 29(2)SEQ ID NO31信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无
(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX-28E/29L-1(xi)序列描述SEQ ID NO31CGAGCTCGTA GGTCACACCA C 21(2)SEQ ID NO32信息(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX-27M/29L-1(xi)序列描述SEQ ID NO32CATGGAGGCG TCACAATGAC TCTGGGGCC 29(2)SEQ ID NO33信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX-27M/29L-2(xi)序列描述SEQ ID NO33CCAGAGTCAT TGTGACGCCT C 21(2)SEQ ID NO34信息(i)序列特征
(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX-27M-1(xi)序列描述SEQ ID NO34CATGGAGGCG TCACAATGAC TAATGGGCC 29(2)SEQ ID NO35信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX-27M-2(xi)序列描述SEQ ID NO35CATTAGTCAT TGTGACGCCT C 21(2)SEQ ID NO36信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否
(vii)最近来源(B)克隆Tf-(-1)R-1(xi)序列描述SEQ ID NO36CTAGCGCAAG AGCAGTAACA AGTAACGAGA30(2)SEQ ID NO37信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tf-(-1)R-2(xi)序列描述SEQ ID NO37CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTCTTGCG30(2)SEQ ID NO38信息(i)序列特征(A)长度47个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆CaTf-(-1)R-1(xi)序列描述SEQ ID NO38CTAGCGCATT CAACACACAG GCCGCTCCTC GAGCTGTCAC CAGCAAC 47(2)SEQ ID NO39信息(i)序列特征(A)长度51个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆CaTf-(-1)R2(xi)序列描述SEQ ID NO39CCGGTCTCGT TGCTGGTGAC AGCTCGAGGA GCGGCCTGTG TGTTGAATGC G 51(2)SEQ ID NO40信息(i)序列特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆GRR-Tf(1-6)-1(xi)序列描述SEQ ID NO40ACTCTGCAGA TGGGAAGAAG GGCCGTAACT TCAAAATGAAA CCGGTTATCA TGAC 54(2)SEQ ID NO41信息(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源
(B)克隆Uni-PCR-1r(xi)序列描述SEQ ID NO41GAAAAGTGCC ACCTGACGTC CCAAGCTT 28(2)SEQ ID NO42信息(i)序列特征(A)长度73个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX10HD-2(xi)序列描述SEQ ID NO42CCGGTTTCCA CGACGGTTAC TTTTACAGCT ATTGGAACGA CGGCCATGGA GGAGTAACTT60ACACCAATGG GCC 73(2)SEQ ID NO43信息(i)序列特征(A)长度65个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX10HD-1(xi)序列描述SEQ ID NO43CATTGGTGTA AGTTACTCCT CCATGGCCGT CGTTCCAATA GCTGTAAAAG TAACCGTCGT60GGAAA65(2)SEQ ID NO44信息(i)序列特征
(A)长度49个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TX10HD/N-1(xi)序列描述SEQ ID NO44GAAACCGGTT ACCACRACGG TTACTTTTAC AGCTATTGGA ACGATGGCC49(2)SEQ ID NO45信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆TrX1f(xi)序列描述SEQ ID NO45CTAGCTAAGG AGGCTGCAGA TGCAAACAAT ACAACCAGGA A41(2)SEQ ID NO46信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否
(vii)最近来源(B)克隆TrX8f(xi)序列描述SEQ ID NO46CCGGTTCCTG GTTGTATTGT TTGCATCTGC AGCCTCCTIA G41(2)SEQ ID NO47信息(i)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx-2b(xi)序列描述SEQ ID NO47ACCGATGCCC CGGGAACTGT GAGTATGGAG CTCGGCC37(2)SEQ ID NO48信息(i)序列特征(A)长度63个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tfx-4b(xi)序列描述SEQ ID NO48CCGGGGCCGA GCTCCATACT CACAGTTCCC GGGGCATCGG TCCAGAAGCT GTAGAAATAG60CCG 63(2)SEQ ID NO49信息(i)序列特征
(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tf-(-1)K-1(xi)序列描述SEQ ID NO49CTAGCGCAAA AGCAGTAACA AGTAACGAGA 30(2)SEQ ID NO50信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tf-(-1)K-2(xi)序列描述SEQ ID NO50CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTTTTGCG 30(2)SEQ ID NO51信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否
(vii)最近来源(B)克隆Tf-(-1)D-1(xi)序列描述SEQ ID NO51CTAGCGCAGA TGCAGTAACA AGTAACGAGA30(2)SEQ ID NO52信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Tf-(-1)E-2(xi)序列描述SEQ ID NO52CCGGTCTCGT TACTTGTTAC TGCTTCTGCG30(2)SEQ ID NO53信息(i)序列特征(A)长度61个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆CaTf-PCR-1(xi)序列描述SEQ ID NO53CCCGCTAGCG CATTCAACAC ACAAGCARGT SSAAGGGCCG TAACTTCAAA TGAAACCGGT60T61(2)SEQ ID NO54信息(i)序列特征
(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义否(vii)最近来源(B)克隆Xy-14a(xi)序列描述SEQ ID NO54ATTCGGGGCC CAAACGCCAG CGTTGTAGTT GATCGTACG 39
权利要求
1.一种修饰的木聚糖酶，选自如下一组木霉、曲霉、链霉菌和芽孢杆菌的家族11木聚糖酶，其在根据里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸编号的位置14或其它木聚糖酶的在氨基酸对比时相应的位置上具有酪氨酸或苯丙氨酸，所说的木聚糖酶已经被修饰以展示增强的嗜热性，嗜碱性或热稳定性，所作的修饰是将所说的木聚糖酶的N-末端区的一段氨基酸序列用褐色热单胞木聚糖酶A的一段对比相应的氨基酸序列取代以形成一个嵌合木聚糖酶。
2.根据权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中家族11木聚糖酶选自如下一组里氏木霉木聚糖酶I，里氏木霉木聚糖酶II，哈茨木霉木聚糖酶，绿色木霉木聚糖酶，环状芽孢杆菌木聚糖酶A，枯草芽孢杆菌木聚糖酶A，黑曲霉木聚糖酶A，川地曲霉木聚糖酶C，塔宾曲霉木聚糖酶A，变青链霉菌木聚糖酶B和变青链霉菌木聚糖酶C。
3.根据权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中包括氨基酸1-29的氨基酸序列用褐色热单胞木聚糖酶A的相应对比的氨基酸序列取代。
4.根据权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中所说的木聚糖酶选自NI-TX2，NI-TX3，NI-TX4，NI-TX5，NI-TX7，NI-TX8，NI-TX9，NI-BX1，NI-BX2，NI-BX3，NI-BX4，NI-BX5，NI-BX6或NI-BX7。
5.根据权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸1-29或另外一个家族11木聚糖酶的相应对比的序列用另外一个家族11木聚糖酶的相应对比的氨基酸序列取代。
6.根据权利要求5的修饰的木聚糖酶，其中里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸1-29或另外一个家族11木聚糖酶的相应对比的序列用褐色热单胞木聚糖酶A的相应对比的氨基酸序列取代。
全文摘要
本发明涉及生产在纸浆的漂白中有卓越性能的木聚糖酶，更具体地说，本发明涉及比天然木聚糖酶显示更高的嗜热性，嗜碱性和热稳定性的修饰的家族11木聚糖酶。修饰的木聚糖酶包含下述三种类型的修饰中的任何一种(1)改变里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II的氨基酸10，27，和29或另外一个家族11木聚糖酶的相应的氨基酸；(2)用来自另外一个木聚糖酶的氨基酸取代N－末端区的氨基酸；(3)N－末端的多至10个氨基酸的上游延伸。
文档编号D21C9/10GK1550548SQ20041003518
公开日2004年12月1日 申请日期1997年9月9日 优先权日1996年9月9日
发明者宋·L·荣, 宋 L 荣, 彦, 矢口诚, 石川和彦 申请人:加拿大国立研究院