专利名称：具有高活性纤维素酶的浓缩洗涤剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有纤维素酶的颗粒状洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物是以浓缩形式存在的。即它们与普通的洗涤剂组合物相比具有较高的密度并含有较少量的无机填充盐。在本发明的洗涤剂组合物中，所说的纤维素酶包括通过本文叙述的C14CMC方法定义的高活性纤维素酶。该纤维素酶最好是一种特定的单一组分的内葡聚糖酶。
在本技术领域中，确实非常需要不仅具有良好的清洗性能，而且具有良好的软化织物的性能以及其他织物护理优点的洗涤剂组合物。
对于用于织物的纺织品清洗和降低粗糙度试剂来说，分散纤维素的酶即纤维素酶的功效已经被认识相当长的时间;GB-A-2，075，028、GB-A-2，095，275和GB-A-2，094，826公开了具有用于改进清洗性能的纤维素酶的洗涤剂组合物GB-A-1，368，599公开了用于降低含棉织物粗糙度的纤维素酶的应用;U.S.4，435，307叙述了由Humicola insolens及其馏分衍生的被称作ACXI的分解纤维素的酶作为降低粗糙度的洗涤剂添加剂的应用。
EP-A-0269168公开了含有纤维素酶的最佳洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物在弱碱性的PH值范围内配制，并提供了综合的织物清洗、织物柔软和织物护理性能。
在WO89109259中已经公开了用于降低含棉织物粗糙度的纤维素酶制剂，该纤维素酶制剂含有对于纤维素具有高内切酶活性和亲合力的内葡聚糖酶组分。
然而，纤维素酶的实际应用受到这样一个事实的阻碍，即纤维素酶制剂如在上述先有技术文献中公开的那些纤维素酶制剂为复杂的混合物，其中只有一部分在织物护理方面是有效的。因此，难以实现用于洗涤剂工业的纤维素酶的成本可行的工业生产，并且需要应用大量的这类纤维素酶制剂，以便达到所需的作用于织物的效果。
就洗涤剂的应用性而言，在纤维素酶生产方面的改进通常还未成为足以能辨认的。通过在EP-A-350098中公开的C14CMC方法可以规定与纤维素酶的洗涤剂应用相关的纤维素酶选择标准。现已发现，除去10%的固定化放射性标记的羧甲基纤维素之最小值可提供高活性的纤维素酶。在共同未决的丹麦专利申请No.1159/90(申请日1990年5月5日)中已经公开了本发明的属于高活性定义的优选的一类纤维素酶，其中披露了基本由同类的内葡聚糖酶组分组成的纤维素酶制剂，该同类的内葡聚糖酶组分对于引起抗部分纯化的43KD纤维素酶(由Humicola insolens DM1800衍生)的单无性繁殖抗体具有免疫反应性。
对于含纤维素物质的处理有利的是这种特定的内葡聚糖酶纤维素酶组分，这一发现使现在有可能成本可行地生产纤维素酶(例如通过使用重组DNA技术)，并允许仅用少量的纤维素酶制剂，并达到所需的作用于织物的效果。
另一方面，市场上正在销售新一代洗涤剂组合物，最好称之为“浓缩洗涤剂”，尽管它们已被给出各种商品名称，例如“Ultra”、“Supra”、“Micro”……。这类洗涤剂组合物的特性是，与普通的洗涤剂组合物相比，它们具有较高的密度，并且通过使用比普通洗涤剂组合物少得多的量的“浓缩”洗涤剂组合物，它们能够达到相同的效果。就其组成而言，通过较少量的无机填充盐便能最好地反映这一特性。这类“浓缩”洗涤剂组合物的效能最好是通过省去预洗循环并使用分散和扩散装置来达到，上述分散和扩散装置在主洗循环开始时被直接放入洗衣机转筒中。
本发明的目的是提供浓缩形式的洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物具有较高的密度并含有少量无机填充盐，它显示出最佳的纤维素酶效能。
在EP-A-381397中已揭示了低离子强度对酶的性能，特别是对脂肪酶的性能的作用。
然而，现已惊奇地发现，浓缩基质对本发明选择的酶的作用远远高于由现有技术纤维素酶(如在EP-A-381397中公开的)所预期的作用。
本发明的另一个目的是提供在洗衣机中处理织物的方法，该方法包括将本发明洗涤剂组合物以低浓度用于主洗循环中。
本发明涉及含有表面活性剂、助洗剂和酶，若需要还含有常用的添加剂的颗粒状洗涤剂组合物，其特征在于所说的酶包括纤维素酶制剂，按照C14CMC方法，这种纤维素酶制剂提供除去至少10%的固定化放射性标记的羧甲基纤维素，该制剂以25×10-6%(重量)的纤维素酶蛋白质存在于洗衣试验溶液中。
优选地，所说的纤维素酶化合物基本由同类的内葡聚糖酶组分组成，该同类的内葡聚糖酶组分对于引起抗部分纯化的约≈43KD纤维素酶(由Humicola insolens，DSM1800衍生)的单元性繁殖抗体具有免疫反应性，或是所说的≈43KD内葡聚糖酶的同系物。
该洗涤剂组合物为颗粒形式，其特征在于其密度高于普通洗涤剂组合物的密度。在20℃下测定时本发明组合物的密度范围为每升组合物550至950g，优选每升组合物650至850g。
就组成而言，通过无机填充盐的量便能最好地表示本发明组合物的“浓缩”形式。无机填充盐为粉末形式的洗涤剂组合物的常用成分。在普通的洗涤剂组合物中，该填充盐存在的量相当大，一般为组合物总重量的17-35%。
在本发明组合物中，所说的填充盐存在的量不超过组合物总重量的15%，优选不超过10%，最优选不超过5%。
无机填充盐(如在本发明组合物中所指的)选自碱金属和碱土金属的硫酸盐和氯化物。
优选的填充盐是硫酸钠。
表面活性剂在本发明洗涤剂组合物中可以使用各种各样的表面活性剂。美国专利3，664，961(于1972年5月23日颁布给Norris)中一般列举了阴离子、非离子、两性的和两性离子类，并给出了各种表面活性剂。
阴离子表面活性剂的混合物特别适合于本发明，特别是磺酸盐和硫酸盐表面活性剂的混合物，其重量比为5∶1至1∶2，优选为3∶1至2∶3，更优选为3∶1至1∶1。优选的磺酸盐包括烷基中具有9至15，特别是具有11至13个碳原子的烷基苯磺酸盐，和α-磺酸化脂肪酸甲酯，其中脂肪酸是由C12-C18脂肪源，特别是由C16-C18脂肪源衍生的。在每个例子中的阳离子是碱金属，最好是钠。优选的硫酸盐表面活性剂是烷基中具有12至18个碳原子的烷基硫酸盐任意地与乙氧基硫酸盐混合，该乙氧基硫酸盐在其烷基中具有10至20个碳原子，最好是具有10至16个碳原子，并且平均乙氧基化度为1至6。本发明优选的烷基硫酸盐的例子是牛脂烷基硫酸盐、椰子烷基硫酸盐和C14-15烷基硫酸盐。在每个例子中的阳离子也是碱金属阳离子，最好是钠。
用于本发明的一类非离子表面活性剂是环氧乙烷与疏水部分的缩合物，它提供了具有平均亲水-亲油平衡(HLB)度范围为8至17，优选9.5至13.5，更优选10至12.5的表面活性剂。所说的疏水(亲油)部分就其性质而言可以是脂族的或芳族的，并且它与任何特定的疏水基缩合的聚氧乙烯基的长度可容易地进行调节，以便产生在亲水和疏水部分之间具有所需平衡度的水溶性化合物。
特别优选的这类非离子表面活性剂是每摩尔醇含有3-8摩尔环氧乙烷的C9-C15伯醇乙氧基化物，特别是每摩尔醇含有6-8摩尔环氧乙烷的C14-C15伯醇和每摩尔醇含有3-5摩尔环氧乙烷的C12-C14伯醇。
另一类非离子表面活性剂包括下述通式的烷基聚葡糖苷化合物其中，z是由葡萄糖得到的部分，R是含有12至18个碳原子的饱和的疏水烷基;t是0至10和n是2或3;x是1.3至4，该化合物含有小于10%的未反应的脂肪醇和小于50%的短链烷基聚葡糖苷。这类化合物和其在洗涤剂中的应用被公开在EP-B0070077、0075996和0094118中。
下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂作为非离子表面活性剂也是适合的
其中，R1是H、C1-4烃基、2-羟乙基、2-羟丙基，或其混合物，R2是C5-31烃基，和Z是带有直接连到其链上的至少3个羟基的直链烃基的多羟基烃基，或其烷氧基化衍生物。优选R1是甲基，R2是直链C11-15烷基或链烯基，如椰子烷基或其混合物，且Z是在还原胺化反应中由糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖还原得到的。
另一类表面活性剂是半极性表面活性剂，例如氧化胺。适合的氧化胺选自单C8-C20，优选C10-C14N-烷基或链烯基氧化胺和二氧化亚丙基-1，3-二胺，其中保持N位置被甲基、羟乙基或羟丙基取代。
还有一类表面活性剂是两性表面活性剂，例如多胺基类表面活性剂。
阳离子表面活性剂也可以在本发明的洗涤剂组合物中使用，并且适合的季铵表面活性剂选自单C8-C16，优选C10-C14N-烷基或链烯基铵表面活性剂，其中保持N位置被甲基、羟乙基或羟丙基取代。
优选各类表面活性剂的混合物，更优选的是阴离子-非离子混合物。以及阴离子-非离子-阳离子混合物。特别优选的混合物描述在英国专利2040987和欧洲公开申请0087914中。洗涤剂组合物可含有1-70%(重量)的表面活性剂，但通常存在于本发明组合物中的表面活性剂的量为1%至30%，较优选10-25%(重量)。
助洗剂助洗剂物质一般是以本发明洗涤剂组合物的10至60%存在。本发明的组合物不含或基本不含含磷酸盐的助洗剂(本发明所定义的基本不含是组成量少于总洗涤剂助洗剂体系的1%)，并且本发明的助洗剂体系由水溶性助洗剂，水不溶性助洗剂，或其混合物组成。
水不溶性助洗剂可以是无机离子交换物质，一般是无机水合硅铝酸盐物质，更优选的是水合的合成沸石，如水合沸石A、X、B或HS。
优选的硅铝酸盐离子交换物质具有下述的通式的晶胞单元其中M是钙交换的阳离子，z和y至少为6，z与y的摩尔比为1.0至0.5，且X至少为5，优选为7.5至276，更优选10至264。所说的硅铝酸盐物质是以水合形式存在的，并且优选的是含有10至28%更优选的是含有18至22%的水的结晶体。
上述硅铝酸盐离子交换物质，其特征在于其粒度直径为0.1至10微米，优选为0.2至4微米。本文中的术语“粒度直径”代表所给出的离子交换物质的平均粒度直径，它是通过常规的分析技术，例如利用扫描电子显微镜的显微测定来测定的。所说的硅铝酸盐离子交换物质的另一个特征在于其钙离子交换能力至少为200mg当量CaCO3水硬度/g硅铝酸盐(以无水基准计算)，且通常的范围为300mg当量/g至352mg当量/g。本文的硅铝酸盐离子交换物质的再一个特征在于其钙离子交换速率，详细描述见GB-1，429，143。
在本发明实施中使用的硅铝酸盐离子交换物质是市场上可买到的，并且可以是天然存在的物质，但最好是合成衍生的物质。用于生产硅铝酸盐离子交换物质的方法详述在美国专利3，985，669中。用于本发明的优选的合成结晶硅铝酸盐离子交换物质是可买到的称作沸石A、沸石B、沸石X、沸石HS的物质及其混合物。在特别优选的实施方案中，所说的结晶的硅铝酸盐离子交换物质是沸石A，且具有如下通式其中X为20至30，优选27。具有通式Na86〔(AlO2)86(SiO2)106〕10.276H2O的沸石X以及具有通式Na6〔(AlO2)6(SiO2)6〕7.5H2O的沸石HS也是适合的。
另一种适合的水不溶性无机助洗剂物质是层状硅酸盐，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是一种由硅酸钠(Na2Si2O5)组成的层状硅酸盐晶体。高Ca++/Mg++结合容量主要是阳离子交换机制。在热水中，该物质变得更加可溶。
水溶性助洗剂可以是单体或低聚物羧酸盐螯合剂。
含有一个羧基的适合的羧酸盐包括乳酸、乙醇酸和其醚的衍生物(公开在比利时专利831，368、821，369和821，370中)。含有两个羧基的多羧酸盐包括琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基)双乙酸、马来酸、双乙醇酸、酒石酸、羟基丙二酸和富马酸的水溶性盐以及醚羧酸盐(描述在德国公开说明书2，446，686和2，446，687及美国专利3，935，257中)，以及亚硫酰羧酸盐(描述在比利时专利840，623中)。含有三个羧基的多羧酸盐包括，尤其是水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐和柠康酸盐以及琥珀酸盐的衍生物，如羧甲氧基琥珀酸盐(描述在英国专利1，379，241中)、乳氧基琥珀酸盐(描述在荷兰申请7205873中)和含氧多羧酸盐物质，如2-氧杂-1，1，3-丙烷三羧酸盐(描述在英国专利1，387，447中)。
含有四个羧基的多羧酸盐包括含氧二琥珀酸盐(公开在英国专利1，261，829中)、1，1，2，2-乙烷四羧酸盐、1，1，3，3-丙烷四羧酸盐和1，1，2，3-丙烷四羧酸盐。含有磺基取代基的多羧酸盐包括磺基琥珀酸盐衍生物(公开在英国专利1，398，421和1，398，422及美国专利3，936，448中)和磺化热解柠檬酸(描述在英国专利1，082，179中)。而含有膦基取代基的多羧酸盐公开在英国专利1，439，000中。
脂环和杂环多羧酸盐包括环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸盐、环戊二烯金属化物五羧酸盐、2，3，4，5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐、2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2，2，5，5-四氢呋喃-四羧酸盐、1，2，3，4，5，6-己烷六羧酸盐和多元醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。芳族多羧酸盐包括苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和苯二甲酸的衍生物(公开在英国专利1，425，343中)。
在上述多羧酸盐中，优选的多羧酸盐是每个分子含有多至三个羧基的羟基羧酸盐，特别是柠檬酸盐。
用于本发明组合物中的优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂如沸石A和水溶性羧酸盐螯合剂如柠檬酸的混合物。
对于本发明来说，能形成助洗剂体系部分的其他助洗剂物质包括无机物质例如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐和有机物质例如有机膦酸盐、氨基聚亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐。
其他适合的水溶性有机盐是均聚或共聚酸或其盐，其中，多羧酸含有通过不多于两个碳原子而相互分开的至少两个羧基。
这类聚合物公开在GB-A-1，596，756中。这类盐的例子是分子量为2000-5000的多羧酸盐及其与马来酐的共聚物，该共聚物分子量为20，000至70，000，特别是约40，000。
纤维素酶已经通过不同的分析方法定义了对于各种应用的酶的活性而且特别是纤维素酶的活性。这些方法均试图提供在使用性能方面所预期的实际评价或至少与使用性能相关的测定。如已详述于欧洲专利申请EP-A-350098中。许多方法特别是生产纤维素酶经常使用的这些方法与洗衣洗涤剂组合物中纤维素酶的使用性能没有密切的关系。这是由于各种其他的使用条件造成的，对于上述使用条件来说，这些活性的测定方法已被改进。
在EP-A-350098中所述的方法已经被改进，使对于洗衣洗涤剂组合物中的纤维素酶活性的评定成为并具有可预测性的相互关系。
因此，为了鉴别用于本发明的纤维素酶与并不构成本发明目的的纤维素酶，本发明使用在EP-A-350098中公开的方法。下文被称为C14CMC方法的筛选方法(该方法采用的是由EP-A-350098所公开的方法)可叙述如下原理用于筛选的C14CMC方法的原理是，在规定的纤维素酶浓度下，在洗涤溶液中，测定从织物底物中除去的固定化羧甲基纤维素(CMC)。使用C14放射性碳，通过某些CMC的放射性标记来测定除去的CMC。在纤维素酶处理之前和之后，简单计数在织物底物上的放射性C14的量便能评价纤维素酶的活性。
样品的制备CMC的制备按照表Ⅰ来制备放射性CMC储液。通过EP-A-350098所述的方法可得到放射性CMC。
织物底物织物底物是具有5cm×5cm大小的细棉织品布样。在其中心用0.35ml放射性标记的CMC储液接种，然后将该细棉织品污布风干。
CMC的固定为了在细棉织品布样上固定放射性标记CMC，使用由德国Original Haunau制造的瓶式去污力测试仪“Linitest Original Haunau”。该瓶式去污力测试仪的金属瓶用400ml硬水(4毫摩尔Ca++/升)充满，每个瓶可以使用13块布样之最大数目。然后，该瓶在瓶式去污力测试仪中，在从20至60℃的加热循环中保温40分钟。保温后，所说的布样在流动的自来水中漂洗1分钟。将它们挤压并使之风干至少30分钟。
按照EP-A-350098的方法，具有固定化的放射性CMC的布样品在没有洗涤时也可作为“空白样品”来测定。
样品的处理洗衣试验溶液按照表Ⅱ的组成来制备洗衣试验溶液。将其平衡至PH为7.5。该洗衣试验溶液是向其添加纤维素酶试验样品的基础物。在测定要添加的纤维素酶的量之前，应小心操作，通过添加水达到100%平衡而不稀释该洗衣试验溶液。添加的用于此筛选试验中的纤维素酶的量应当使在洗衣试验溶液中纤维素酶蛋白达到25×10-6%(重量)(在14.5℃下等于0.25mg/l)。
洗涤方法在洗衣模拟方法中，处理用放射性标记CMC如此接种的污布。该洗衣方法是在由德国Original Haunau制造的瓶式去污力测试仪“Linitest Original Haunau”中模拟的。将单块污布放入20cm3玻璃管形瓶中。该管形瓶用10ml洗衣试验溶液充满，然后将其密封，使之不漏液体。可将多达5个管形瓶放入每个瓶式去污力测试仪的瓶中。该瓶用水充满，水是用作洗衣模拟的热传递介质。洗衣模拟在20至60℃的加热循环中进行40分钟。
处理样品后，该管形瓶浸在冷水中，接着将每块污布从其管形瓶中取出，在烧杯中用流动的软水漂洗，将其挤压并使之风干至少30分钟。
测定为了测定除去的放射性标记CMC，使用闪烁计数器，例如LKB1210°Ultrabeta闪烁计数器。为了得到最精确的结果，应该遵循用于该特定的闪烁计数器的最佳操作的手控指令。例如，对于LKB 1210 Ultrabeta闪烁计数器来说，应当按照下列步骤进行。将要测定的污布放入用12ml闪烁剂液体(例如得自Packard的闪烁剂299)充满的塑料管形瓶中。然后使污布稳定至少30分钟。然后，将管形瓶放入LKB 1210Ultrabeta闪烁计数器中，并得到污布的相应的放射性计数。
为了测定仅仅由于纤维素酶而除去的CMC的量，必须测定已被同时接种但在没有纤维素酶存在的洗衣试验溶液中已被处理的污布。于是，可把纤维素酶的活性表示为除去的放射性标记CMC的百分数。该百分数通过下式计算除去的放射性CMC%＝ (XO-XC)/(XO) ×100其中XO是用没有纤维素酶存在的洗衣试验溶液处理的污布的放射性闪烁计数XC是用含有待评价的纤维素酶的洗衣试验溶液处理的污布的放射性闪烁计数统计依据，方法的确定为了提供正确的统计结果，应使用标准的统计分析。对于所给出的实例，由于使用LKB 1210 Ultrabeta闪烁计数器，现已发现对于每个放射性闪烁计数来说，可使用3个污布样品量值。为了通过内部的不同方法相互校核所得结果，推荐使用EP-A-350098的“空白样品”的测定和计算。这将能发现和消除错误。
结果分析所述筛选试验确实提供了一种快速、独特并且可靠的方法，用来鉴别满足本发明活性标准的纤维素酶与不是本发明部分的纤维素酶。
现已发现，按照上述的C14CMC方法，除去10%或更多的固定的放射性标记CMC表明，相应的纤维素酶满足了本发明的需要。
对本技术领域技术熟练的技术人员显而易见的是，除去的百分数高于10%表明相应的纤维素酶具有较高的活性。因此，可以预期，按照C14CMC方法，在洗衣试验溶液中的蛋白质浓度下，能提供除去高于25%或最好高于50%的放射性标记CMC的纤维素酶将达到此纤维素酶用于洗衣洗涤剂的更好的性能指标。
同样已预期到的是，用于C14CMC方法的较高浓度纤维素酶将会提供较高的除去百分数。然而，在纤维素酶浓度和由此得到的除去百分数之间不存在已经证实的线性关系。
此外还已预期到，对于C14CMC方法，使用较高浓度的纤维素酶将会提供较高的除去百分数。
表Ⅰ放射性C14标记CMC储液 (所有百分数都以溶液总重量计)
＊总的CMC含有非放射性和放射性CMC，而放射性CMC提供了放射性，该放射性足以使在所使用的闪烁计数器上清晰地读数。例如，放射性CMC可具有0.7毫居/g的活性并可被混合。
表Ⅱ洗衣试验溶液 (所有百分数都以溶液总重量计)<
>按照本发明，优选的纤维素酶是在丹麦专利申请1159/90中所述的那些纤维素酶。例如，用于本发明组合物中的纤维素酶制剂可基本由同类的内葡聚糖酶组分所组成，该同类的内葡聚糖酶组分对于引起抗高度纯化的43KD纤维素酶(由Humicola insolens，DSM1800衍生)的抗体具有免疫反应性，或是所说的43KD内葡聚糖酶的同系物。
应该强调的是，本发明的所有纤维素酶必须满足上述筛选试验的标准。然而，在丹麦专利申请1159/90中规定了其他标准，将其与本发明的筛选试验结合便能确定优选的纤维素酶。
优选用于本发明组合物中的纤维素酶制剂，除了满足筛选试验外，内葡聚糖酶组分显示的CMC内切酶活性为每毫克总蛋白量至少约50、优选至少约60、特别优选至少约90CMC内切酶单位。尤其优选的内葡聚糖酶组分显示的CMC内切酶活性为每毫克总蛋白量至少100CMC内切酶单位。
在本文中，术语“CMC内切酶活性”是指以内葡聚糖酶组分能将纤维素降解为葡萄糖、纤维素二糖和三糖的能力来表示的内葡聚糖酶活性，该活性的测定是在用本发明的纤维素酶制剂保温后，通过测定羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的降低来进行的，详述如下。
由CMC粘度的降低可测定CMC内切酶(内葡聚糖酶)活性，叙述如下在PH值为9时，在0.1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液中制备含有35g/l的CMC(Hercules 7 LFD)的底物溶液。将待分析的酶样品溶于相同的缓冲液中。10ml底物溶液与0.5ml酶溶液混合，并将其转移到在40℃下恒温的粘度计(如Haake VT 181，NV传感器，181rpm)中。混合后并再过30分钟尽快取粘度读数。在这些条件下使粘度降低至1/2的酶的量被定义为1单位CMC内切酶活性。
用本技术领域中技术熟练的技术人员已知的方法，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和用标记蛋白质的等电聚焦来分别测定用于本发明的纤维素酶制剂中的内葡聚糖酶组分的分子量和等电点(PI)。用这种方法测定的特定内葡聚糖酶组分的分子量是43KD，该种内葡聚糖酶的等电点为约5.1。
纤维素二糖水解酶的活性可以定义为对于纤维素二糖对硝基苯基的活性。该活性是以在37℃下PH值为7.0时每分钟释放的微摩尔硝基苯基来测定的。已发现本发明的内葡聚糖酶组分基本上没有纤维素二糖水解酶活性。
本发明纤维素酶制剂中的内葡聚糖酶组分最初是通过多种纯化方法分离的，即包括按照U.S.4，435，307进行的粗制H.insolens纤维素酶混合物的反相HPLC纯化。这种方法已经令人惊奇地导致分离出作为单一组分的43KD内葡聚糖酶，由于它的特别高的内葡聚糖酶活性而使其具有意想不到的优良性能。
除了筛选试验外，用于本发明组合物中的纤维素酶还可以进一步定义为具有内葡聚糖酶活性的酶(下文称之为“内葡聚糖酶”)，或具有内葡聚糖酶活性的酶的同系物，这些酶具有列于附加的顺序表ID＃2中的氨基酸顺序。
在本文中，术语“同系物”是指通过DNA编码的多肽，该DNA在某些特定条件下(如在5×SSC中预浸渍，在20%甲酰胺、5×Denhardt′s溶液、50mM磷酸钠、pH6.8及50μg变性声处理的小牛胸腺DNA的溶液中在40℃预杂交1h，接着在补加了100μM ATP的相同溶液中在40℃杂交18h)杂交到与为具有这种氨基酸顺序的内葡聚糖酶编码的DNA相同的探查物上。该术语包括上述顺序的衍生物，得到这些衍生物可通过将一个或多个氨基酸残基加到天然顺序的C-和N-端的一端或两端，在天然顺序的一个或多个位点上取代一个或多个氨基酸残基，在天然氨基酸顺序的一端或两端或在天然顺序中的一个或多个位点上消除一个或多个氨基酸残基，或在天然顺序中的一个或多个位点上插入一个或多个氨基酸残基。
本发明的内葡聚糖酶的生产可以通过Humicola物种如Humicola insolens，例如菌株DSM1800，按照关于用于专利程序目的的微生物保藏的国际承认的布达佩斯协定的条款(布达佩斯协定)，于1981年10月1日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，Mascheroder Weg 1B，D-3300 Braunschweig，FRG。
另一方面，除了筛选试验外，用于本发明的纤维素酶还可以进一步定义为具有列于附加的顺序表ID＃4中的氨基酸顺序的内葡聚糖酶，或显示内葡聚糖酶活性的酶(如上定义的)的同系物。所述内葡聚糖酶的生产可以通过Fusarium物种如Fusarium oxysporum，例如菌株DSM2672，按照布达佩斯协定的条款，于1983年6月6日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen，Mascheroder Weg 1B，D-3300 Braunschweig，FRG。
此外，预期的同系的内葡聚糖酶可以由能产生分解纤维素的酶的其他微生物，例如物种Trichoderma、Myceliophthora、Phanerochaete、Schizophyllum、Penicillium、Aspergillus及Geotricum衍生而来。
然而，对于本发明纤维素酶制剂的工业生产来说，优选使用重组DNA技术或其他技术，包括所涉及的微生物的发酵调整或突变，以确保所需的酶活性的过剩生产。这些方法和技术是本领域已知的，并且可由本领域中熟练的技术人员很容易地实施。
因此，内葡聚糖酶组分可以是通过一种方法生产的酶，该方法包括，在允许表达内葡聚糖酶组分或其前体的条件下的培养介质中，培养用重组DNA媒介物转化的宿主细胞，该媒介物携带着编码所述的内葡聚糖酶组分或所述的内葡聚糖酶组分前体的DNA顺序，以及编码功能的DNA顺序，这些功能允许表达编码内葡聚糖酶组分或其前体的DNA顺序，并从培养物中回收内葡聚糖酶组分。
含有由编码如上所述的内葡聚糖酶或酶的前体形式的DNA顺序的DNA组成包括具有列于附加的顺序表ID＃1或ID＃3中的DNA顺序的DNA组成或其变体。DNA顺序合适的变体的实例是不产生内葡聚糖酶的另一种氨基酸顺序的核苷酸取代物，但此核苷酸取代物却对应于引入此DNA组成的宿主生物体的密码子的使用，或者是产生不同的氨基酸顺序的核苷酸取代物，因此该核苷酸取代物可能产生不同的蛋白质结构，这种蛋白质结构可能会产生具有不同性质的内葡聚糖酶突变体而非天然酶。可能的变体的其他实例有在该顺序的一端插入一个或多个核苷酸，或在该顺序的一端或其内消除一个或多个核苷酸。
用于本发明的编码内葡聚糖酶的DNA组成可以通过已经确立的标准方法进行合成制备，例如，由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers在Tetrahedron Letters 22，1981，PP.1859-1869中所述的磷酰胺方法或由Matthes等人在EMBO Journal3，1984，PP.801-805中所述的方法。按照磷酰胺方法，例如在自动DNA合成仪中合成低聚核苷酸，将其提纯、退火、连接并在合适的媒介物中进行无性繁殖。
编码内葡聚糖酶或其前体的DNA组成的分离可以通过例如建立cDNA或建立产生纤维素酶的微生物(如Humicola insolens，DSM1800)的基因组库来进行，并通过常规方法筛选阳性无性繁殖，如通过使用低聚核苷酸探查物进行杂交，所用低聚核苷酸探查物是根据标准方法(参考Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd.Ed.Cold Spring Harbor，1989)以内葡聚糖酶的全部或部分氨基酸顺序为基础合成的，或通过选择可表达合适的酶活性(即上面定义的CMC内酶活性)的无性繁殖，或通过选择可产生带有抗天然纤维素酶(内葡聚糖酶)抗体的反应性蛋白质的无性繁殖。
最后，DNA组成可以是混合合成的与基因组的、混合合成的与cDNA或混合基因组的与cDNA的起源物，该起源物可按照标准方法通过连接合成的、基因组的或cDNA起源物(在适当的情况下)的片段进行制备，此片段对应于整个DNA组成的各个部分。DNA组成还可以通过使用特定的引发物进行聚合酶链反应来制备，例如在US4，683，202中或R.K.Saiki等人在Science 239，1988，pp.487-491中所描述的那样。
有上述DNA组成插入的重组表达媒介物包括任何可便于进行重组DNA方法的媒介物，媒介物的选择常常取决于媒介物被引入的宿主细胞。因此，媒介物可以是自动复制媒介物，即以染色体外实体形态存在的媒介物，该媒介物的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。另一方面，该媒介物可以在它被引入宿主细胞时被结合进入宿主细胞基因组中，并与其已被结合进入的染色体一起被复制。
在该媒介物中，编码内葡聚糖酶的DNA顺序应当可行地被连接到合适的启动子和终止密码子顺序上。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA顺序，并且可以由编码宿主细胞的同系或异系蛋白质的基因衍生得到。用于连接分别为内葡聚糖酶、启动子和终止密码子的编码的DNA顺序并将其插入合适的媒介物中的方法对于本领域中熟练的技术人员来说是已知的(参见，例如Sambrook等人，在所引的书中)。
用上述DNA组成或上述表达媒介物转化的宿主细胞可以属于例如Aspergillus物种，最好是Aspergillys oryzae或Aspergillus niger。真菌细胞可以通过一种方法来转化，该方法包括原生质体的形成和转化，接着按自身为已知的方式进行细胞壁的再生。Aspergillus用作宿主微生物被描述在EP 238023中(Novo Industri A/S的)，其内容在此引入作为参考。宿主细胞还可以是酵母细胞，例如Saccharomyces cerevisiae菌株。
另一方面，宿主生物可以是细菌，特别是Streptomyces和Bacillus及E.coli菌株。细菌细胞的转化可以按照常规方法进行。例如，正象Sambrook等人在Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989中所描述的。
合适的DNA顺序及媒介物结构的筛选也可以通过标准方法进行(参见Sambrook等人，在所引的书中)。
用于培养转化的宿主细胞的介质可以是适于所讨论的宿主细胞生长的任何常用介质。被表达的内葡聚糖酶可以便利地被分泌进入培养介质中，并且可以通过已知方法将其从培养介质中加以回收，这些方法包括通过离心或过滤从介质中分离出细胞，利用盐如硫酸铵沉淀介质的蛋白质组分，接着利用色谱方法如离子交换色谱法、亲合色谱法等。
通过使用如上说明的重组DNA技术、蛋白质提纯技术、发酵和突变技术或其他本领域已知的技术，提供高纯度的内葡聚糖酶是可能的。
在本发明组合物中上述纤维素酶的浓度应当是这样的，即释放在洗涤溶液中的酶蛋白质的量为每升洗涤溶液0.005至40mg，优选为每升洗涤溶液0.01至10mg。
任选组分本发明组合物通常将包括任选组分，它们一般构成了洗涤剂组合物的一部分。这种任选组分的实例有抗再沉积和污垢悬浮剂，荧光增白剂、漂白剂、漂白活化剂、抑泡剂、抗结块剂、染料和颜料，可以根据需要以各种量将它们加入。
适用于本发明的抗再沉积和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物，如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素以及均聚或共聚的聚羧酸或其盐。这类聚合物包括前面提到的作为助洗剂的聚丙烯酸酯和马来酐-丙烯酸共聚物，以及马来酐与乙烯、甲基乙烯基醚或异丁烯酸的共聚物，其中马来酐占共聚物至少20%(摩尔)。这些物质的用量通常为组合物的0.5%至10%(重量)，较优选0.75%至8%(重量)，最优选1%至6%(重量)。
优选的荧光增白剂为适当的阴离子，其实例有4，4′-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)茋-2∶2′-二磺酸二钠，4，4′-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)茋-2∶2′-二磺酸二钠，4，-4′-双-(2，4-二苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)茋-2∶2′-二磺酸二钠，4′，4″-双-(2，4-二苯胺基-S-三嗪-6-基氨基)茋-2-磺酸-钠，4，4′-双(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基氨基)-S-三嗪-6-基氨基)茋-2，2′-二磺酸二钠，4，4′-双-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)茋-2，2′-二磺酸二钠，4，4′-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨基)-S-三嗪-6-基氨基)茋-2，2′-二磺酸二钠和2-茋基-4″-(萘并-1′，2′∶4，5)-1，2，3-三唑-2″-磺酸钠。
可以使用任何颗粒无机过水合物漂白剂，其用量为组合物的3%至40%(重量)，较优选8%至25%(重量)，最优选12%至20%(重量)。这种漂白剂的优选实例有过硼酸钠-水合物和四水合物，过碳酸盐，及其混合物。
另一种优选单独混合的组分是过氧羧酸漂白剂前体，通常称为漂白活化剂，它优选以颗粒或结块形式被加入。合适的这类化合物的实例公开在英国专利1586769和2143231中，它们形成颗粒形式的方法被描述在欧洲公开专利申请0062523中。这类化合物的优选实例为四乙酰乙二胺和3，5，5-三甲基己酰氧基苯磺酸钠。
漂白活化剂一般用量为组合物的0.5%至10%(重量)，较优选1%至8%(重量)，最优选2%至6%(重量)。
另一种任选组分是抑泡剂，以硅氧烷和氧化硅-硅氧烷混合物为例。硅氧烷通常由烷基化聚硅氧烷物质提供，而硅一般以细碎形式使用，例如硅气凝胶和干凝胶以及各种疏水硅。这些物质可以以颗粒形式被加入，这些颗粒中的抑泡剂是便于释放地被结合在水溶的或水分散的非表面活性洗涤剂基本不渗透的载体中。用另一种方法，可将抑泡剂溶解或分散于液体载体中，并通过喷雾到一种或多种其他组分上而施用。
如上所述，有用的硅氧烷抑泡剂包括上文指出类型的烷基化硅氧烷和固体氧化硅的混合物。这类混合物是通过将硅氧烷添加到固体氧化硅的表面来制备的。优选的硅氧烷抑泡剂由疏水的硅烷化的(最好是三甲基硅烷化)氧化硅提供，这种硅的粒度在10毫微米至20毫微米范围内，其比表面积大于50m2/g，它与二甲基硅氧烷流体紧密地混合，此硅氧烷的分子量在约500至约200，000范围内且硅氧烷与硅烷化的氧化硅之重量比为约1∶1至约1∶2。
优选的硅氧烷泡沫抑制剂公开在Bartollota等人的美国专利3，933，672中。其他特别有用的抑泡剂是自乳化硅氧烷抑泡剂，其描述在德国专利申请DTOS2，646，126(于1977年4月28日公开)中。这种化合物的一个实例是DC-544，市场上可由Dow Corning买到，它是硅氧烷/乙二醇共聚物。
上述抑泡剂一般用量为组合物重量的0.001%至2%(重量)，优选0.01%至1%(重量)。泡沫抑制剂最好是以单独的颗粒体形式加入，这便能允许其中含有其他泡沫抑制物质，如C20-C24脂肪酸，微晶石蜡和环氧乙烷与环氧丙烷的高分子量共聚物，而它们对于基质的分散性无不利影响。制备这种泡沫抑制颗粒体的技术公开在上述Bartolotta等人的美国专利3，933，672中。
其他有用的聚合物是聚乙二醇，优选的是，分子量为1000至10000，较优选2000至8000，最优选约4000的那些聚乙二醇。这些聚合物的用量为0.20%至5%，较优选0.25%至2.5%(重量)。这些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸酯盐对于改善白度保持性、织物灰分沉积以及改善在过渡金属杂质存在下对泥土、蛋白质污垢和可氧化污垢的清洁性能是很有价值的。
用于本发明组合物的去污剂是常用的对苯二酸与乙二醇和/或丙二醇单元按各种排列的共聚物或三元共聚物。这类聚合物的实例公开在共同转让的美国专利4，116，885和4，711，730以及欧洲专利申请0272033中。根据EP-A-0272033，特别优选的聚合物具有下式
其中PEG为-(OC2H4)O-，PO为(OC3H6O)，且T为(pcOC6H4CO)。
某些聚合物如分子量一般为5000-20000，优选10000-15000的聚乙烯吡咯烷酮也形成有用的试剂，用以阻止洗涤过程中织物之间不稳定染料的转移。
织物柔软剂也可以加入本发明的洗涤剂组合物中。这些试剂可以是无机类型或有机类型的。无机柔软剂以绿土粘土为例，它被公开在GB-A-1，400，898中。有机织物柔软剂包括水不溶性叔胺，如公开在GB-A-1514276和EP-B-0011340中，这些叔胺与单C12-C14季铵盐的组合被公开在EP-B-0026527和EP-B-0026528中，双长链酰胺公开在EP-B-0242919中。织物柔软体系的其他有用的有机组分包括高分子量的聚环氧乙烷，如公开在EP-A-0299575和0313146中。
绿土粘土的量一般为5%至20%，优选8%至15%(重量)，使该物质以干混组分加到制剂的其余部分。有机柔软剂如水不溶性叔胺或双长链酰胺物质加入的量为0.5%至5%(重量)，通常为1%至3%(重量)，而高分子量的聚环氧乙烷物质和水溶性阳离子物质加入的量为0.1%至2%，通常为0.15%至1.5%(重量)。这些物质一般被加到组合物的喷雾干燥部分，不过在某些实例中，更适宜以干混颗粒将它们加入，或以熔融液体将它们喷雾到组合物的其他固体组分上。
除本发明特定的纤维素酶制剂之外的酶可以存在于本发明组合物中，如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。
制备方法本发明的组合物可以通过各种方法制备，包括干混合、喷雾干燥、附聚和粒化以及这些方法的任意组合。
优选的制备方法制备本发明组合物的优选方法包括在高速混合机和干混合机中喷雾干燥与附聚相组合。
含有相对不溶的阴离子表面活性剂的第一颗粒状组分被喷雾干燥，在与其余部分再混合之前将部分喷雾干燥产物转移并经过低浓度的非离子表面活性剂喷雾。第二颗粒状组分的制备是用碳酸钠作中和剂，在连续高速混合机如Lodige KM混合机中通过阴离子表面活性剂酸的干燥中和来进行的。然后将第一和第二组分以及其他干混合组分如羧酸盐螯合剂、无机过氧漂白剂、漂白活化剂、污垢悬浮剂、硅酸盐和酶一起进料到传送带上，由此它们被输送到水平旋转的滚筒，在滚筒内将香料及硅氧烷抑泡剂喷雾到该产物上。在极其优选的组合物中，采用另一滚筒混合步骤，该步骤中引入低浓度(近似为2%)的细碎晶状硅铝酸盐，以增加密度并改善颗粒的流动性能。
洗涤方法当将远远小于普通洗涤剂组合物的量的本发明组合物用于洗衣机的主洗循环时，本发明的浓缩洗涤剂组合物能够达到相同的效果。
因此，在本发明的另一实施方案中，同时提供了在洗衣机中洗涤织物的方法，其中对于主洗循环，本发明洗涤剂组合物的用量为15至170g。
通常，在欧洲的条件下，用于主洗循环的洗涤剂组合物的建议用量为80至140g，不需要预洗。
本发明的洗涤剂组合物最好直接送入转筒而不是间接地通过洗衣机的外壳。这可以极容易地实现，即通过在袋或贮存器中加入组合物，在洗涤循环开始时，随着搅拌、转筒内洗涤水的温升或浸没组合物，由此将其释放出来。该贮存器与要洗的织物一起放在转筒内。另一方法是，洗衣机本身可以调节以使组合物直接加入转筒，例如通过在入口盖中的悬浮装置。
含有包装在袋或贮存器中的洗涤剂组合物的产品通常以这样的方式进行设计，以便使整个贮存器保持在干燥状态下，以防止干燥时贮存器内东西的外流，但当将其暴露于洗涤环境之中通常是浸没在水溶液中时，该贮存器又要适宜释放它里面的东西。
贮存器一般是柔韧性的，如袋或盒。袋可以具有涂敷了不透水的保护性物质的纤维状结构，以便保持袋内的东西不变，如在欧洲公开专利申请0018678中所公开的。用另一方法，袋可以由水不溶性合成聚合物制成，并有封边或密封用来隔绝水溶液介质，如在欧洲公开专利申请0011500、0011501、0011502和0011968中所公开的。水易脆密封的一种简易形式包括一道处理的水溶性粘合剂和由不透水聚合物膜如聚乙烯或聚丙烯制成的密封一边的袋。
在各种袋或贮存器产品形式中，可以采用叠层层状产品，其中中心可变形层用组合物浸渍和/或涂敷，然后应用一个或多个外层以产生织物状的美学效果。这些层可以一起密封以便在使用过程中保持连接，或者可以分别与水接触以便促进涂敷或浸渍物质的释放。
另一种叠层形式包括一个模压或变形层用来提供一系列袋状贮存器，将洗涤剂组合物定量沉积到每个袋中，在第一层上覆盖第二层，并密封两层相接触的袋状贮存器之间的那些区域。组分以颗粒、糊或熔融形式沉积，叠层层在其被加入水中之前应当阻止袋状贮存器内的物质外流。这些层可以是独立的或者保持连在一起与水接触，唯一的要求是这种结构应当能够使袋状贮存器内的物质快速释放到溶液中去。每单位面积基体的袋状贮存器的数量是一个选择问题，但通常在每平方米500至25，000之间。
用于本发明的可变形叠层的合适的物质其中包括泡沫材料、纸和纺织与非纺织品。
然而，实施本发明洗涤方法的优选方法包括使用可重复使用的带有间隔层的配料装置，该装置可透过液体但不能透过固体组合物。
这类装置公开于欧洲专利申请
发明者A·C·贝克, R·A·A·瑟勒曼斯, A·布施 申请人:普罗格特·甘布尔公司