专利名称：一种高密度固定生物功能分子的材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物检测、组织工程以及高分子材料领域，特别是涉及一种能高密度 固定生物分子同时排斥非特异蛋白吸附的生物功能表面的制备方法。
背景技术：
利用生物学原理将蛋白质、细胞生长因子、酶、多肽等生物活性物质固定在材料表 面上，可以有效提高材料的多种生物学功能(如抗凝血性能、与抗体结合的活性以及对细 胞的黏附性等)，这在生物检测、组织工程、蛋白质分离纯化、人工植入材料等多种生物医用 领域中有着重要的应用价值(Pascal J. et al. Angew. Chem. Int. Ed.，2008，47 :9618_9647 ； Chen H. et al. Prog. Polym. Sci.，2008，33 1059-1087)。例如固定肝素可赋予表面抗凝 血功能以提高其血液相容性；固定纤连蛋白、胶原蛋白等细胞外基质蛋白可以有效地促进 表面细胞的黏附和繁殖。但是，在使材料表面固定尽可能多生物活性分子的同时，表面还必 须具有排斥非特异性蛋白质的吸附的能力。这是因为在生物传感器、生物芯片等生物检测 领域，由非特异性蛋白质造成的背景噪音是阻碍检测准确性的主要因素；而在人工植入材 料，组织工程支架等领域，也必须尽可能减少非特异性蛋白质吸附造成的诸如血栓形成、细 菌黏附、炎症等不良反应。目前这类生物功能表面的制备策略一般是将生物惰性表面与生物活性分子固定 化相结合。如 Xu 等人(Xu et al. Biomacromolecules，2009，10 1665-1674)在表面接枝 了具有优异排斥非特异性蛋白质吸附功能的P0EGMA，并将其侧链末端的羟基进行活化，进 而固定了免疫球蛋白(IgG)用于制备高信噪比的生物传感器。Tugulu等人(Tugulu et al. Biomaterials, 2007, 28 :2536_2546)在表面接枝了 P0EGMA，经过羟基活化后固定了细 胞黏附多肽，有效地促进了细胞在表面的黏附铺展。然而，这些制备方法都需要经历对官能 团活化的过程，无法直接固定生物分子，反应过程比较复杂；活性基团的转化效率不高，进 而导致固定生物分子的数量不是很多，不能最大程度实现其生物学功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前生物活性表面制备方法所存在的反应过 程复杂、固定生物分子密度不高的问题，提供一种操作简单、可以高密度固定生物分子并同 时排斥非特异性蛋白吸附的表面改性方法。本发明解决其技术问题采用以下的技术方案本发明提供的高密度固定生物功能分子材料的制备方法，其包括以下步骤(1) POEGMA改性表面的制备将固定有引发剂的材料表面，在氮气保护下置于含有催化剂/配体体系和OEGMA 单体的溶液中进行ATRP反应，反应温度为0 45°C，反应时间为0. 5 6小时，得到POEGMA 改性表面；POEGMA为聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯的英文缩写，OEGMA为甲基丙烯酸寡聚乙 二醇酯的的英文缩写，ATRP为原子转移自由基聚合的英文缩写。
所述固定有引发剂的材料可以采用单晶硅或玻璃；该引发剂为α-溴丁酰溴， α -溴代异丁酰溴，或α -溴代丙酰溴。所述的催化剂/配体体系可以采用溴化亚铜/五甲基二亚乙基三胺，或溴化铜/ 抗坏血酸。 所述的OEGMA单体溶液为水溶液，甲醇溶液，或水和甲醇的混合溶液。(2) NHSMA 的制备在反应装置中，先按1 1 1. 2 1的摩尔比将甲基丙烯酰氯缓慢滴入到NHS的 溶液中，在三乙胺存在的条件下搅拌反应，反应温度为0 35°C，反应时间为1 12小时， 得到NHSMA的单体溶液；再将该单体溶液经过重结晶得到白色晶体NHSMA ；所述NHSMA为甲 基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的英文缩写，所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的英文缩写。所述的NHS溶液为N-羟基琥珀酰亚胺的三氯甲烷溶液，按W/V计，三乙胺用量为 所述溶液的10 25%。(3) P0EGMA-PNHSMA 改性表面的制备将所得的POEGMA改性表面置于含有催化剂/配体体系和所得的NHSMA的单 体溶液中进行二次ATRP反应，反应温度为70 100°C，反应时间为2 6小时，得到 P0EGMA-PNHSMA 改性表面。所述的催化剂/配体体系可以采用溴化铜/五甲基二亚乙基三胺，或溴化亚铜/
五甲基二亚乙基三胺。所述的NHSMA单体溶液为苯甲醚溶液或二甲基亚砜溶液。(4) P0EGMA-PNHSMA改性表面固定生物活性分子将所得的P0EGMA-PNHSMA改性表面置于含有生物活性分子的溶液中进行反应，温 度控制在0 40°C，反应时间为2 24小时，反应结束后，将所述表面置于钝化剂(EG)2NH2 的溶液中对未反应的NHS基团进行钝化，钝化温度为室温，反应时间为2 12小时。该步 骤完成后，将P0EGMA-PNHSMA改性表面从溶液中取出，分别用乙醇或水溶剂进行清洗，得到 固定有生物素、胶原蛋白和肝素生物活性分子的生物功能表面。所述的生物活性分子为生物素酰阱、纤连蛋白、胶原蛋白、肝素、赖氨酸或其他含 有氨基的生物分子。所述的生物活性分子的溶液为乙醇溶液、乙酸溶液、磷酸盐缓冲溶液或 其他可以溶解相应生物活性分子的溶液。所述的(EG)2NH2的溶液为乙醇溶液。经过上述步骤，最终得到高密度固定生物功能分子材料，该材料表面具有不吸附 非特异蛋白的功能。本发明与现有技术相比具有以下主要的优点本发明提供的方法为直接表面引发聚合制备生物活性表面的方法，不需要中间的 基团活化过程。与现有技术相比，本发明具有以下突出特点1.利于保持固定生物分子的活性与传统的活化官能团而后固定生物分子的方 法相比，本方法可以固定更高密度的生物活性分子，同时POEGMA作为间隔层的存在即可以 排斥非特异性蛋白吸附，又能提供一个亲水环境，从而有利于保持固定生物分子的活性。2.操作简单、易行可以通过改变二次ATRP的聚合条件，以方便地调控材料表面 的物理和化学特性。
3.适用性较广可以用于固定任何含有氨基的生物活性分子并有效地实现其生 物功能，适用于如生物检测、组织工程、蛋白质分离纯化等许多生物医用领域。例如，在利用 本方法得到的活性表面固定生物素后，可以选择性结合亲和素；在POEGMA改性表面细胞没 有出现黏附现象(见图1)，而在表面固定胶原蛋白后，可以有效促进细胞黏附铺展(见图 2)；在表面固定肝素后，可以特异性结合抗凝因子ATIII (见图3)，得到具有抗凝血功能的 表面等。从图3可以看出，POEGMA改性表面的ATIII吸附量为0. 0129ug/cm2，而固定肝素 后表面的ATIII吸附量为0. 0942ug/cm2，即固定后的表面ATIII吸附量增加了 10倍。
图1为POEGMA改性表面细胞的黏附，生长情况。图2为固定了胶原蛋白表面细胞的黏附，生长情况。图3为POEGMA改性表面及固定了肝素后表面对抗凝因子ATIII的吸附情况
具体实施例方式本发明提供一种高密度固定生物功能分子同时排斥非特异性蛋白质吸附的生物 功能表面的制备方法。在材料表面固定引发剂后，在配体/催化剂和单体OEGMA的存在 下，通过ATRP技术在材料表面接枝P0EGMA，而后利用二次引发ATRP在POEGMA末端接枝 PNHSMA。利用PNHSMA所含有的大量NHS基团高密度地固定含有氨基的生物活性分子(如 蛋白质、多糖、酶等)，最终实现其生理功能。下面通过实施例，对本发明作进一步阐述，但并不限定本发明。实施例1将2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3gNHS和3. 3mL三乙 胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完毕后，在室温下反应4小时。反应液用饱和的冰盐水清 洗，并用无水硫酸镁对有机相进行干燥。过滤沉淀，将溶剂浓缩后在0. SmL乙酸乙酯和6mL 正己烷的混合溶液中重结晶得到单体NHSMA。在氮气氛围下，将7. 93g 0EGMA,312mg的2，2_联吡啶和143mg溴化亚铜溶解于 15mL甲醇和水(4 1)的混合溶液中。将上述溶液超声5min后转移到表面固定有α-溴 丁酰溴引发剂的硅片，室温下反应2h后用溴化铜/联吡啶停止反应，并用大量的水和乙醇 对表面进行清洗，后用氮气吹干，处理后的表面固定了 P0EGMA。将上述表面置于含有14mg 溴化亚铜，0. 92g NHSMA, 42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反应在90°C下进行2h.反应结束 后用大量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)对硅片进行清洗并在真空箱中烘干。将上述表面置于lmg/mL生物素酰胼的乙酸钠溶液(pH 5. 5)当中，并在室温下反 应过夜。反应结束后用乙酸钠溶液、水、乙醇清洗表面，并将该膜片置于0. IM(EG)2NH2的乙 醇溶液中以将表面残余的活性酯基团进行钝化。即可得到高密度固定生物素的生物活性表 面。实施例2将2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3g NHS和3. 3mL三 乙胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完毕后，在室温下反应4小时。反应液用饱和的冰盐水 清洗，并用无水硫酸镁对有机相进行干燥。过滤沉淀，将溶剂浓缩后在0. SmL乙酸乙酯和6mL正己烷的混合溶液中重结晶得到单体NHSMA。 在氮气氛围下，将7. 93g (^6獻，31211^的2，2-联吡啶和143mg溴化亚铜溶于15mL 甲醇和水(1 1)的混合溶液中。将上述溶液超声5min后转移到表面固定α-溴丁酰溴引 发剂的硅片，室温下反应2h后并用大量的水和乙醇对表面进行清洗，后用氮气吹干。将上 述表面置于含有14mg溴化亚铜，0. 92g NHSMA, 42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反应在70°C 下进行3h.反应结束后用大量的DMF对硅片进行清洗并在真空箱中烘干。
将4wt %胶原蛋白的乙酸溶液用2. OM氢氧化钠溶液将pH调至8. 0得到胶原蛋白 溶液。将上述表面置于胶原蛋白溶液中于4°C反应过夜。反应结束后用水、乙醇清洗表面， 并将该膜片置于0. IM(EG)2NH2的乙醇溶液中以将残余的活性酯基团进行钝化。即可得到高 密度固定胶原蛋白的生物活性表面。实施例3将2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3g NHS和3. 3mL三 乙胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完毕后，在室温下反应4小时。反应液用饱和的冰盐水 清洗，并用无水硫酸镁对有机相进行干燥。过滤沉淀，将溶剂浓缩后在0. SmL乙酸乙酯和 6mL正己烷的混合溶液中重结晶得到单体NHSMA。在氮气氛围下，将7. 93g (^6獻，31211^的2，2-联吡啶和143mg溴化亚铜溶于15mL 甲醇和水(2 1)的混合溶液中。将上述溶液超声5min后转移到表面固定α-溴丁酰溴引 发剂的硅片，室温下反应2h后用大量的水和乙醇对表面进行清洗，后用氮气吹干。将上述 表面置于含有14mg溴化亚铜，0. 92g NHSMA, 42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反应在100°C 下进行4h。反应结束后用大量的DMF对硅片进行清洗并在真空箱中烘干。将膜片置于lOmg/mL的肝素的磷酸盐缓冲溶液(pH = 8. 0)中室温反应24h。反应 结束后用磷酸盐缓冲溶液、水、乙醇清洗表面，并将该膜片置于0. IM(EG)2NH2的乙醇溶液中 以将残余的活性酯基团进行钝化。即可得到高密度固定肝素的生物活性表面。实施例4将2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3gNHS和3.3mL三乙 胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完毕后，在室温下反应4小时。反应液用饱和的冰盐水清 洗，并用无水硫酸镁对有机相进行干燥。过滤沉淀，将溶剂浓缩后在0. SmL乙酸乙酯和6mL 正己烷的混合溶液中重结晶得到单体NHSMA。在氮气氛围下，将7. 93g (^6獻，31211^的2，2-联吡啶和143mg溴化亚铜溶于15mL 甲醇和水(2 1)的混合溶液中。将上述溶液超声5min后转移到表面固定α -溴丁酰溴 引发剂的硅片，室温下反应4h后用大量的水和乙醇对表面进行清洗，后用氮气吹干。将上 述表面置于含有14mg溴化亚铜，0. 92gNHSMA,42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反应在100°C 下进行6h。反应结束后用大量的DMF对硅片进行清洗并在真空箱中烘干。将膜片置于0. lmg/mL的RGD多肽的柠檬酸盐缓冲溶液(pH = 8. 0)中室温反应 24h。反应结束后用柠檬酸盐缓冲溶液、水、乙醇清洗表面，并将该膜片置于0. IM(EG)2NH2W 乙醇溶液中以将残余的活性酯基团进行钝化。即可得到高密度固定RGD的生物活性表面。实施例5将2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3g NHS和3. 3mL三 乙胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完毕后，在室温下反应4小时。反应液用饱和的冰盐水清洗，并用无水硫酸镁对有机相进行干燥。过滤沉淀，将溶剂浓缩后在0. SmL乙酸乙酯和6mL正己烷的混合溶液中重结晶得到单体NHSMA。在氮气氛围下，将7. 93g (^6獻，31211^的2，2-联吡啶和143mg溴化亚铜溶于15mL 甲醇和水(1 1)的混合溶液中。将上述溶液超声5min后转移到表面固定α -溴丁酰溴 引发剂的硅片，室温下反应3h后用大量的水和乙醇对表面进行清洗，后用氮气吹干。将上 述表面置于含有14mg溴化亚铜，0. 92g NHSMA, 42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反应在90°C 下进行4h。反应结束后用大量的DMF对硅片进行清洗并在真空箱中烘干。将膜片置于0. lmg/mL的RGD多肽的柠檬酸盐缓冲溶液(pH = 8. 0)中室温反应 24h。反应结束后用柠檬酸盐缓冲溶液、水、乙醇清洗表面，并将该膜片置于0. IM(EG)2NH2W 乙醇溶液中以将残余的活性酯基团进行钝化。即可得到高密度固定RGD的生物活性表面。实施例6将2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3g NHS和3. 3mL三 乙胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完毕后，在室温下反应4小时。反应液用饱和的冰盐水 清洗，并用无水硫酸镁对有机相进行干燥。过滤沉淀，将溶剂浓缩后在0. SmL乙酸乙酯和 6mL正己烷的混合溶液中重结晶得到单体NHSMA。在氮气氛围下，将7. 93g OEGMA,312mg的2，2-联吡啶和143mg溴化亚铜溶于15mL 甲醇和水(2 1)的混合溶液中。将上述溶液超声5min后转移到表面固定α -溴丁酰溴 引发剂的硅片，室温下反应4h后用大量的水和乙醇对表面进行清洗，后用氮气吹干。将上 述表面置于含有14mg溴化亚铜，0. 92g NHSMA, 42 μ LPMDETA的6mL苯甲醚中，反应在100°C 下进行6h。反应结束后用大量的DMF对硅片进行清洗并在真空箱中烘干。将膜片置于0. lmg/mL的纤连蛋白的磷酸盐缓冲溶液(pH = 7. 4)中0°C反应24h。 反应结束后用磷酸盐缓冲溶液、水、乙醇清洗表面，并将该膜片置于0. IM(EG)2NH2的乙醇溶 液中以将残余的活性酯基团进行钝化。即可得到高密度固定纤连蛋白的生物活性表面。
权利要求
一种高密度固定生物功能分子的材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)POEGMA改性表面的制备将固定有引发剂的材料表面，在氮气保护下置于含有催化剂/配体体系和OEGMA单体的溶液中进行ATRP反应，反应温度为0～45℃，反应时间为0.5～6小时，得到POEGMA改性表面；POEGMA为聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯的英文缩写，OEGMA为甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯的的英文缩写，ATRP为原子转移自由基聚合的英文缩写；(2)NHSMA的制备在反应装置中，先按1∶1～1.2∶1的摩尔比将甲基丙烯酰氯缓慢滴入到NHS的溶液中，在三乙胺存在的条件下搅拌反应，反应温度为0～35℃，反应时间为1～12小时，得到NHSMA的单体溶液；再将该单体溶液经过重结晶得到白色晶体NHSMA；所述NHSMA为甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的英文缩写，所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的英文缩写；(3)POEGMA-PNHSMA改性表面的制备将所得的POEGMA改性表面置于含有催化剂/配体体系和所得的NHSMA的单体溶液中进行二次ATRP反应，反应温度为70～100℃，反应时间为2～6小时，得到POEGMA-PNHSMA改性表面；(4)POEGMA-PNHSMA改性表面固定生物活性分子将所得的POEGMA-PNHSMA改性表面置于含有生物活性分子的溶液中进行反应，温度控制在0～40℃，反应时间为2～24小时，反应结束后，将所述表面置于钝化剂(EG)2NH2的溶液中对未反应的NHS基团进行钝化，钝化温度为室温，反应时间为2～12小时；经过上述步骤，最终得到高密度固定生物功能分子材料，该材料表面具有不吸附非特异蛋白的功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述固定有引发剂的材料为单晶硅或玻 璃；该引发剂为α “溴丁酰溴、α “溴代异丁酰溴或α “溴代丙酰溴。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的催化剂/配体体系为溴 化亚铜/五甲基二亚乙基三胺或溴化铜/抗坏血酸；步骤(3)所述的催化剂/配体体系为 溴化铜/五甲基二亚乙基三胺，或溴化亚铜/五甲基二亚乙基三胺。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的OEGMA单体溶液为水溶液，甲醇溶 液，或水和甲醇的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的NHS溶液为N-羟基琥珀酰亚胺的 三氯甲烷溶液，按W/ν计，三乙胺用量为所述溶液的10 25%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的NHSMA单体溶液为苯甲醚溶液或 二甲基亚砜溶液。
7.根据权利要求1所述的改性方法，其特征在于所述的生物活性分子为生物素酰阱、 纤连蛋白、胶原蛋白、肝素、赖氨酸或其他含有氨基的生物分子。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物活性分子的溶液为乙醇溶液、 乙酸溶液、磷酸盐缓冲溶液或其他可以溶解相应生物活性分子的溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的(EG)2NH2的溶液为乙醇溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑷完成后，将P0EGMA-PNHSMA改性 表面从溶液中取出，分别用乙醇或水溶剂进行清洗，得到固定有生物素、胶原蛋白和肝素生物活性分子的生物功能表面 。
全文摘要
本发明涉及具有生物活性功能表面的制备方法，该方法是通过原子转移自由基聚合(ATRP)技术在材料表面接枝具有优良排斥非特异性蛋白质吸附能力的聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯(POEGMA)；而后利用二次引发ATRP在POEGMA末端接枝聚甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(PNHSMA)，利用PNHSMA侧链所含有的大量活性酯基团可以高密度地固定含氨基的生物分子。本发明提供的生物活性功能表面可以显著提高生物分子在表面的接枝密度，同时减少由非特异性蛋白质吸附造成的不良影响，有效地保持了固定的生物分子的活性；可以固定多种生物分子，适用于较广的生物医用领域。
文档编号C04B41/48GK101810888SQ20101012690
公开日2010年8月25日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者于谦, 张燕霞, 陈红 申请人:武汉理工大学