专利名称：：氨基酸延长的胰岛素的制作方法氨基酸延长的胰岛素发明领域本发明涉及与氨基酸低聚体连接的胰岛素。
背景技术：
：很多肽和蛋白药物作为药物候选物是有吸引力的，因为他们具有高生物活性和受体选择性。肽和蛋白药物一般是通过注射给药的，并且可导致低的患者配合性。因此需要另外的递送途径。通过肺或口服途径递送是可能的，但是由于低的生物利用度而很复杂，低的生物利用度是由于在相关器官中高的蛋白酶解活性，以及经由相关组织的低吸收。此外，在人体中，肽和蛋白药物经常通过蛋白酶解活性或者通过经由肾或肝脏的消除而快速从循环中消除。因此，一般希望或者必须通过配制或衍生化来操控药物以达到合适的体内半衰期。本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点或者提供有用特征。本发明的一个方面是改善胰岛素经由人组织的吸收。本发明的另一个方面是改善胰岛素的体内半衰期。本发明的另一个方面是提供具有令人满意物理稳定性的胰岛素。本发明的另一个方面是提供具有令人满意化学性质的胰岛素。本发明的另一个方面是提供具有令人满意蛋白酶解稳定性的胰岛素。本发明的另一个方面是提供具有令人满意溶解性的胰岛素。定义本文中的术语"胰岛素"包括来自任何物种的胰岛素，例如猪胰岛素、牛胰岛素和人胰岛素及其复合物例如锌复合物，包括二聚体和低聚体，例如其六聚体。此外，本文中的术语"胰岛素"包括所谓的"胰岛素类似物"。胰岛素类似物是，相对于天然人胰岛素分子，具有A和/或B氨基酸链的一个或多个突变、取代、删除和/或添加的胰岛素分子。更具体来说，一个或多个氨基酸残基可能已经与另外的氨基酸残基交换，和/或一个或多个氨基酸残基可能已经被删除，和/或一个或多个氨基酸残基可能已经被添加，条件是所述胰岛素类似物具有足够的胰岛素活性。胰岛素类似物优选是这样的，其中一个或多个天然存在的氨基酸残基，优选l、2或3个天然存在的氨基酸残基已经被另一可编码氨基酸残基替代。因此，B链的第28位可以从天然Pro残基修饰为Asp、Lys或lie中的一个。在另一个实施方案中，在B29位的Lys修饰为Pro;此外，在A21位的Asn可以修饰为Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val,特别是修饰为Gly、Ala、Ser或Thr，并且优选修饰为Gly。此外，在B3位是Asn可以修饰为Lys。胰岛素类似物的另外实例是desB30人胰岛素和desBl人胰岛素。胰岛素类似物的实例描述于下列专利及其同族专利中US5,618,913、EP254,516、EP280,534、US5,750,497和US6,011,007。具体胰岛素类似物的实例是门冬氨胰岛素(即AspB28人胰岛素)和赖脯胰岛素(即LysB28，ProB"人胰岛素)。在本发明的一个方面，术语胰岛素类似物不包括具有A和/或B链的添加的胰岛素分子，这是指A链由不超过21个氨基酸残基构成，而B链由不超过30个氨基酸残基构成。在本发明的另一个方面，术语胰岛素类似物不包括这样的胰岛素分子，其中与人胰岛素相比，超过6个氨基酸残基，优选不超过4个氨基酸残基，甚至更优选不超过2个氨基酸残基被交换。在本发明的另一个方面，术语胰岛素类似物不包括这样的胰岛素分子，其中与人胰岛素相比，超过2个氨基酸残基，优选不超过1个氨基酸残基已经被删除。在本文中，术语"胰岛素残基"包括如上所定义的胰岛素，其中氢原子已经被从氨基上除去和/或羟基已经被从羧基上除去。在本文中，使用已知且常用的1或3字母代码来表示氨基酸。术语"氨基酸残基"包括氢原子已经被从氨基上除去和/或羟基已经被从羧基上除去的氨基酸。在本文中，氨基酸优选是可编码(a)氨基酸。在本文中，术语"低聚体"包括单体(氨基酸残基)的重复单位。低聚体中单体的数目可以多至800。在本文中，术语"氨基酸低聚体"包括相当均匀序列的氨基酸，优选可编码(a)氨基酸的链。这样的氨基酸低聚体的实例是例如甘氨酸的同型低聚体，或者二肽或三肽的重复单位。在本文中，术语"氨基酸低聚体残基，，包括氢原子已经被从氨基上除去和/或羟基已经被从羧基上除去的氨基酸低聚体，即低聚体的单体。在本文中，术语"可编码氨基酸"包括可通过核普酸三联体("密码子")编码的氨基酸。在体内，人胰岛素是作为由具有24个氨基酸的前肽构成的单链前体前胰岛素(前胰岛素原)合成的，接着是下列构造的含有86个氨基酸的前胰岛素前肽-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A,其中A和B分别是胰岛素的A链和B链，C是具有31个氨基酸的连接肽，并且其中在Cys残基之间具有3个二硫化物桥。在本文中，术语单链胰岛素包括分子前肽-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A,其中A和B链分别对应于所关注胰岛素类似物的A和B链。在本文中，所述连接肽还可以称为C肽。本文所用术语"治疗"的意思是为了抗击疾病、障碍或病症而对患者进行预防、管理和照料。该术语包括预防疾病，延迟疾病、障碍或病症的进展，緩解或减轻症状和并发症，和/或疾病、障碍或病症的治愈或排除。待治疗的患者优选是哺乳动物，特别是人。在本文中，术语"疏水性，，是用作相对于人胰岛素的疏水性，并且是通过描述为"测定V"的HPLC来测定的。发明概述本发明涉及连接有一个或多个氨基酸低聚体的胰岛素，在本文中，这样的产物称为延长胰岛素(extendedinsulin)。所述延长胰岛素的生物物理性质例如极性、溶解性和大小得以调节。本发明延长胰岛素的生物物理性质可以通过改变所连接的低聚体中的氨基酸类型以及低聚体长度来精细地调节。本发明延长胰岛素的这些改变的生物物理性质导致在对患者给药后延长的作用特征，并且适于口服给药或经肺给药。优选实施方案的描述已经意料不到地发现，通过胰岛素的A-链或B-链的C-末端(和B-链的N-末端)的氨基酸低聚体的长延长-本发明的延长胰岛素-具有令人关注的特征a)它们具有高度保留的胰岛素受体亲和力，和b)它们在体内给药后表现出延长的作用特征。正式地，本发明延长胰岛素是由如上所定义的胰岛素和一个或多个氨基酸低聚体构建的。在本发明的延长胰岛素中，氨基酸低聚体的一个末端经由肽键与胰岛素残基连接，但是所述氨基酸低聚体的另一个末端不与胰岛素残基连接。氨基酸低聚体可以例如通过重组方法与胰岛素残基连接。这样的方法自身是已知的，并且它们是例如下述方法。本发明延长胰岛素可以例如这样产生将编码本发明延长胰岛素的DNA序列在合适的宿主细胞中通过众所周知的技术例如在US专利6500645中公开的技术来表达。本发明延长胰岛素作为包含C-肽或连接B链C-末端与A链N-末端的肽键的单链胰岛素表达，或者作为还包含单链胰岛素的前体分子来表达，该单链胰岛素在B-链上也含有N-末端前体延长部分。该N-末端前体延长部分可以具有提高直接表达的产物的产量的功能，并长度可以最高达到15个氨基酸残基。在从培养培养液中分离后，N-末端前体延长部分将在体外被切除，并因此具有紧接着B-链N-末端的切割位点(Lys或Arg)。适于本发明的类型的N-末端前体延长部分公开在U.S.专利5,395,922和欧洲专利765,395A中。这样的前体延长部分的一个实例是EEAEAEAPK。前体延长部分通过蛋白酶解，例如通过胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶而从前体单链胰岛素上被切割下来。该切割还切掉C-肽(或者，如果没有C-肽，切掉A链的N-末端(例如Al)与B链的C-末端(例如B30)之间的键)，并且由此将前体单链胰岛素转化成成熟双链胰岛素分子。本发明延长胰岛素不含有这样的前体延长部分，并且本发明延长胰岛素是所有成熟的双链胰岛素分子。可以通过已经建立的标准方法合成制备编码各延长胰岛素多肽的多核苦酸序列，例如Beaucage等人，(1981)TetrahedronLetters21:1859-1869所描述的亚磷酰胺法(phosphoamiditemethod)或者Matthes等人(1984)EMBOJournal2:801-805描述的方法。根据亚磷酰胺法，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪上合成，纯化、复制(duplexed)并连接以形成合成的DNA构建体。目前优选的制备DNA构建体的优选方法是聚合酶链式反应(PCR)。多核苦酸序列也可以是混合的基因组、cDNA和合成来源的。例如，编码前导肽的基因组或cDNA序列可以连4^到编码A和B链的基因组或cDNA序列上，之后，可以通过插入编码期望氨基酸序列的合成寡核苷酸在位点将DNA序列修饰，用于根据众所周知的方法进行同源重组，或者优选通过适当寡核苦酸的PCR来产生。能够在选择的微生物或宿主细胞中复制并且携带编码延长胰岛素多肽的多核苷酸序列的重组载体可以是是自动复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或者人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的工具。或者，载体可以是在被引入宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其整合的染色体共同复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒，或者共同含有将被引入宿主细胞基因组的总DNA的两个或者更多个载体或质粒，或者可以使用转座子。载体可以是线性的或者闭环质粒，并且优选含有能够使载体稳定整合到宿主细胞基因组中并且载体不依赖基因组进行自动复制的元件。在一个实施方案中，重组表达载体能够在酵母中复制。实现载体在酵母中复制的序列的实例是酵母质粒2pm复制基因REP1-3以及复制起始点。载体可以含有一个或多个选择性标记，其能够容易选择被转化的细胞。选择性标记是其产物提供生物杀灭剂或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型原养等的基因。细菌选择性标记的例子是来自枯草芽胞杆菌(S(2"'〃wssw6/77/s)或J也衣芽孑包4干菌(Bac7'〃ws/z'c/zem/orm^s)的<ab/基因,或者提供抗生素抗性例如青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于丝状真菌宿主细胞中的选择行标记包括am必(乙酰胺酶)、"rgS(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、"K7(乳清酸核苷-5，-磷酸酯脱羧酶)和fr;C(邻氨基苯曱酸酯合成酶)。酵母宿主细胞的适当标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。酵母的非常适当选择性标记是粟酒裂殖酵母(Sc/nzcwacc/zaro附yc^/wm6e)TPI基因(Russell(1985)Gene40:125-130)。在载体中，多核香酸序列被可操作地连接到适当的启动子序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，其包括突变、截短和杂合的启动子，并且可以从对于宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因获得。用于指导细菌宿主细胞中的转录的适当启动子的实例是从大肠杆菌(￡".co//)乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(5^ep"wyc^coe/z'co/or)琼脂糖酶基因(^gj)、枯草芽孢杆菌(Sac/〃船w^7&)果聚糖蔗糖酶基因0"c^)、地衣芽孢杆菌(^c/〃ws/zc/zem/b^m力a-淀粉酶基因O附y丄)、嗜热芽孢杆菌(Ba"'〃wsWearaf/2^mo//n7ws)麦芽糖淀粉酶基因(am少M)、解淀粉芽孢杆菌(Sac"/wamy/o/^rwe/a"'e"s)a-淀粉酶基因("wy2)和地衣芽孢杆菌0^"〃M/,c/zemybr脂力青霉素酶基因(/7e"尸)的启动子。用于指导在丝状真菌宿主细胞中转录的适当启动子的实例是从米曲霉(JwergW/wsor少zae)TAKA淀并分酶、米黑才艮毛霉(W/z/zomwcorm/e/z"')天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A^erg/〃w中性a-淀粉酶和黑曲霉(A^erg/〃M酸稳定a-淀粉酶基因获得的启动子。在酵母宿主中，可以4吏用的启动子是酉良酒酵母(Sacc/wramycwcerevzw'"e)Mal、TPI、ADH或PGK启动子。多核香酸构建体还典型地可操作地连接到适当的终止子上。在酵母中，适当的终止子是TPI终止子(Alber等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)。分别用于连接编码所需胰岛素多肽、启动子和终止子的多核苷酸序列并将它们加入到含有在选择的宿主中复制所必需信息的适当载体中的程序对于本领域技术人员是众所周知的。能够理解，可以通过首先制备含有编码本发明单链胰岛素的整个DNA序列的DNA构建体，随后将该片段插入到适当的表达载体，或者或通过连续插入含有单独元件的遗传信息(例如信号肽、原肽、连接肽、A链和B链)随后进行连接而构建所述载体。将含有这样的多核苷酸序列的载体弓1入到宿主细胞中，以便载体被保持为染色体整合物，或者作为自复制染色体外载体。术语"宿主细胞，，包括亲代细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生的突变而与亲代细胞并不一致。宿主细胞可以是单细胞微生物例如原核细胞或非单细胞微生物例如真核细胞。可以使用的单核细胞是细菌细胞例如革兰氏阳性细胞，其包括但不限于芽孢杆菌属(Sac,7/M)细胞、链霉菌属(&^^om_ycw)细胞或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(￡.co/O和假单胞菌(尸w^fomo"a^sp)。真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在优选的实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。用于本发明的酵母生物体可以是任何适当的酵母生物体，通过培养，其产生大量本发明的单链胰岛素。适当的酵母生物体的实例是选自下列的菌林酉良酒酵母(5^cc/zaramycwcerev/s/^e)、Sacc/zaramycesA:/w_yven'、粟酒裂歹直酵母(iSc/n'zc^acc/zarom少c^;om6e)、S"cc/on9^ycesrn^rww、乳酉交克鲁维斯酵母(A7w少veramyces/acto)、汉逊酵母(Z/a朋e肌/(2po/，orp/za)、毕赤酵母(尸/c/z/a;(3WonV)、曱醇毕赤酵母(尸/c/z/ame"<3/7o//c")、尸/c/naA/i(yven、耶罗维亚酵母(7^raw/a/^3/(y"ca)、假丝酵母属(C"m/z^^.)物种、产朊假丝酵母(Q7"d,tfo、C""t/W(3cac⑧/'、地霉属(Geo/77'c/zwms/.)4勿种禾口Geo/rzc/zwm/en7ewf(37w。酵母细胞的转化可以例如通过形成原生质体随后以本身已知的方式进行转化而实现。用于培养细胞的培养基可以是任何适于酵母生物体生长的传统培养基。可以从培养基中回收分泌的胰岛素多肽(其大比例将以正确处理的形式存在于培养基中)，这通过传统的程序，包括通过离心从培养基分离酵母细胞，通过离子交换基质或反相吸附基质进行过滤或捕获胰岛素前体，通过盐例如石克酸铵沉淀上清液或滤液的蛋白质组分，随后通过各种层析程序例如离子交换层析、亲和层析等进行纯化。在一个实施方案中，本发明的一些延长胰岛素的半衰期得到改善，使得它们适于每周一次给药。在一个实施方案中，本发明的使得它们适于每两天一次给药。在一个实施方案中，本发明的使得它们适于每天一次给药。在一个实施方案中，本发明的使得它们适于每天两次给药。在一个实施方案中，本发明的使得它们适于每天三次给药。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<25。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<20。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<15。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<10。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<5。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<1。一些延长胰岛素的半衰期得到改善，一些延长胰岛素的半衰期得到改善，一些延长胰岛素的半衰期得到改善,一些延长胰岛素的半衰期得到改善,在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<0.5。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<0.1。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<0.05。在另一个实施方案中，本发明延长胰岛素的疏水性<0.01。药物组合物本发明化合物，即延长胰岛素可以例如皮下给药、口服给药或经肺给药。对于皮下给药，类似已知的胰岛素制剂，配制本发明的延长胰岛素。此外，对于皮下给药，类似已知胰岛素的给药，给药本发明的延长胰岛素，并且通常医生了解该程序。对于口服给药，类似口服给药的其他药物的制剂，配制本发明的延长胰岛素。此外，对于口服给药，类似已知口服药物的给药，给药本发明的延长胰岛素，并且通常医生了解该程序。对于经肺给药产品，给出下列细节本发明的延长胰岛素可以通过以有效提高循环胰岛素水平和/或降低循环葡萄糖水平的剂量进行吸入给药。这类给药能够有效治疗病症例如糖尿病或高血糖症。获得胰岛素的有效剂量需要给药超过大约0.5pg/kg到大约50(ig/kg本发明延长胰岛素的吸入剂量。有知识的从业者通过考虑多种因素包括胰岛素水平、血液葡萄糖水平、患者的身体条件、患者的肺部状态等能够确定治疗有效量。根据本发明，可以通过吸入递送本发明的延长胰岛素，以达到其吸收。通过吸入给药可带来与胰岛素的皮下给药相差不大的药物动力学。本发明延长胰岛素的吸入导致循环胰岛素水平增加，之后是血糖水平的下降。当对类似的粒度和类似的肺沉积水平进行比较时，不同的吸入装置典型地提供类似的药物动力学。根据本发明，可以通过任何多种本领域中已知的用于通过吸入给药治疗药物的吸入装置递送本发明的延长胰岛素。这些装置包括计量式吸入器、雾化器、干粉发生器、喷雾器等。优选地，通过干粉吸入器或喷雾器递送本发明延长胰岛素。存在多种用于给药本发明的延长胰岛素的吸入装置的期望部件。例如通过吸入装置的递送有利地是可靠的、可再现的和精确的。吸入装置应当递送小颗粒，例如低于大约lO)iim,例如大约l-5jim,用于达到非常适合呼吸。适于实施本发明的商业可以获得的吸入装置的具体实例是Turbohaler(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、Spiros吸入器(Dura)、InhaleTherapeutics所销售的装置、AERxTM(Aradigm)、Ultmvent⑧喷雾器(Mallinckrodt)、Acorn11⑧喷雾器(MarquestMedicalProducts)、Ventolin计量施吸入器(Glaxo)、Spinhaler⑧粉末吸入器(Fisons)等。本领域技术人员应当认识到，本发明延长胰岛素的制剂，所递送制剂的量以及单次剂量给药的持续时间依赖于所采用的吸入装置类型。对于某些气雾剂递送系统，例如喷雾器，给药的频率和系统激活的时间长度将主要依赖于气雾剂中延长胰岛素的浓度。例如，对于在喷雾器溶液中较高浓度的本发明延长胰岛素，可以使用较短的给药时间段。装置例如计量剂量吸入器能够产生较高的气雾剂浓度，并且能够运行较短的时间以递送期望量的本发明延长胰岛素。装置例如粉末吸入器递送活性药物，直到从该装置排出给定量的药物。在这种类型的吸入器中，给定量的粉末中本发明胰岛素延长胰岛素的量决定了单次给药中所递送的剂量。在通过吸入装置递送的制剂中本发明延长胰岛素的粒度对于胰岛素进入肺部，优选进入下呼吸道或肺泡的能力是至关重要的。优选地，本发明的延长胰岛素被这样配制，使得至少大约10%所递送的延长胰岛素沉积在肺中，优选大约1020%,或者更多。已知对于口呼吸的人肺部沉积的最大效率是通过使用大约2)im大约3的粒度获得的。当粒度超过大约5时，肺部沉积显著降低。低于大约1pm的粒度造成肺部沉积降低，并且难以递送治疗有效足够量的颗粒。因此，通过吸入所递送的本发明延长胰岛素的颗粒具有优选低于大约lO)nm的粒度，更有选在大约1)im大约5|im的范围内的粒度。对本发明延长胰岛素的制剂进行选择，以在所选择的吸入装置中产生期望的粒度。有利地，为了作为干粉进行给药，本发明化合物被制成颗粒形式，其粒度低于大约10|iim,优选大约l至大约5|iim。优选的粒度能够有效地递送到患者的肺泡。优选地，干粉大部分由所产生的颗粒组成，大部分颗粒具有期望范围内的尺寸。有利地，至少大约50%的干粉是由直径低于大约10pm的颗粒制成的。可以通过喷雾干燥、研磨或临界点冷凝含有本发延长胰岛素和其他所需成分的溶液来制备这样的制剂。同样适于产生可以用于本发明的颗粒的其他方法是本领域中已知的。通常从容器中的干粉制剂分离这些颗粒，接着经由载体气流转运到患者的肺中。典型地，在目前的干粉吸入器中，用于破碎固体的力完全是由患者的吸入提供的。一种合适的干粉吸入器是由Astra生产的TurbohalerTM(S0dertalje,Sweden)。在另一类型的吸入器中，患者的吸入所产生的气流驱动了叶轮马达，这解聚了单体胰岛素类似物颗粒。DuraSpirosTM吸入器是这样的装置。用于从干粉吸入器给药的本发明延长胰岛素的制剂典型地包括含有本发明延长胰岛素的精细分开的干粉，但粉末还可以包含填充剂、载体、赋形剂、其他添加剂等。在本发明延长胰岛素的干粉制剂中可i,为;辅助加工制剂，为了对制剂提供^利的粉末性质，为了辅助从吸入装置分散粉末，为了稳定制剂(例如抗氧化剂或緩沖剂)，为了为制剂提供味道等。有利地，添加剂并不负面影响患者的气道。本发明延长胰岛素可以在分子水平上与添加剂混合，或者固体制剂可以包括本发明延长胰岛素的颗粒，所述本发明延长胰岛素的颗粒与添加剂混合或者涂布在颗粒上。典型的添加剂包括单糖、双糖和多糖；糖醇和其他多元醇例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、乳糖醇、麦芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、淀粉或其组合；表面活性剂例如山梨糖醇、二磷酯酰胆石咸或卵磷脂；等。典型地，添加剂例如填充剂以有效达到上述目的的量存在，通常占制剂的大约50重量％大约90重量％。在制剂中还可以包含其它他本领域中已知用于蛋白质例如胰岛素类似物蛋白质制剂的试剂。可以通过迫使本发明延长胰岛素的悬浮液或溶液在压力下通过喷嘴而产生包含本发明延长胰岛素的喷雾。可以对喷嘴尺寸和结构、所采用的压力以及液体供给速度进行选择以达到期望的输出和粒度。可以产生电喷射，例如通过与毛细管或喷嘴供给连接的电场。有利地，通过喷雾器递送的本发明延长胰岛素的颗粒具有低于大约10|iim的粒度，优选在大约lpm至大约5^im的范围内。适用于喷雾器的本发明延长胰岛素的制剂典型地在水溶液中包含本发明延长胰岛素，其浓度为每毫升溶液大约1mg至大约500mg本发明延长胰岛素。制剂可以包含试剂例如赋形剂、緩冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂以及优选锌。制剂还可以包含赋形剂或者用于稳定本发明胰岛素的试剂，例如緩沖剂、还原剂、填充蛋白质(bulkprotein)或糖类。可以用于配制本发明胰岛素的填充蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。可以用于配制本发明胰岛素的典型糖类包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。本发明胰岛素制剂还可以包含表面活性剂，其降低或者防止在形成气雾剂中由于溶液的雾化而造成的表面诱导的本发明胰岛素聚合。可以采用各种传统的表面活性剂，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制剂的大约0.001至大约4重量％之间。用于本发明的特别优选的表面活性剂是聚氧化乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本领域中已知用于配制蛋白例如胰岛素类似物蛋白的另外的物质也可以包括在制剂中。本发明的延长胰岛素可以通过喷雾器，例如喷射式喷雾器或超声喷雾器来给药。通常，在喷射式喷雾器中，使用压缩空气源来经由孔口产生高速空气喷射。当气体扩散出喷嘴时，产生了低压区域，这将本发明延长胰岛素的溶液经由与液体贮库连接的毛细管抽出。从毛细管抽出的液流在离开管时被剪切成不稳定的液丝和液滴，产生喷雾。可采用多种构造、流速和挡板类型来从给定的喷射式喷雾器获得所需性能特征。在超声喷雾器中，使用高频电能来产生振动机械能，通常采用压电转换器。将该能量直接或经由耦合液体传递给本发明胰岛素制剂，产生包含本发明胰岛素的气雾剂。有利地，通过喷雾器递送的本发明延长胰岛素颗粒具有小于约10|Lim，优选约1pm至约5(im的粒度。适于通过喷射式喷雾器或超声喷雾器使用的本发明延长胰岛素制剂包括在水溶液中的本发明延长胰岛素，其中本发明延长胰岛素的浓度为约1mg至约20本发明延长胰岛素每ml溶液。制剂可以包括试剂例如赋形剂、緩沖剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂以及优选锌。制剂还可以包含赋形剂或者用于稳定本发明胰岛素的试剂，例如緩冲剂、还原剂、填充蛋白质(bulkprotein)或糖类。可以用于配制本发明胰岛素的填充蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。可以用于配制本发明胰岛素的典型糖类包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。本发明胰岛素制剂还可以包含表面活性剂，其降低或者防止在形成气雾剂中由于溶液的雾化而造成的表面诱导的本发明胰岛素聚合。可以采用各种传统的表面活性剂，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量通常在制剂的大约0.001至大约4重量％之间。用于本发明的特别优选的表面活性剂是聚氧化乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本领域中已知用于配制蛋白例如胰岛素类似物蛋白的另外的物质也可以包括在制剂中。在计量剂量吸入器(MDI)中，推进剂、本发明延长胰岛素和任何赋形剂或其他添加剂作为包括液化压缩气体的混合物包含在罐中。启动计量阀门释放出作为气雾剂的混合物，所述混合物优选包含粒度为小于约10优选为约1|Lim至约5pm的颗粒。所需气雾剂粒度可以通过采用由本领域技术人员已知的各种方法，包括喷磨、喷雾干燥、临界点冷凝等产生的本发明胰岛素制剂来获得。优选的计量剂量包括由3M或Glaxo生产的并且采用六氟烃推进剂的那些。用于通过计量剂量吸入器装置使用的本发明延长胰岛素的制剂一般包括细分散的粉末，所述粉末包含本发明的延长胰岛素作为在非水介质中的悬浮液，例如借助于表面活性剂悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于该目的的任何常规材料，例如氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟曱烷、二氯二氟曱烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷烃-134a)、HFA-227(氢氟烷烃-227)等。优选地，推进剂是氢氟烃。可以选择表面活性剂来稳定作为在推进剂中的悬浮液的本发明延长胰岛素，以保护活性剂不发生化学降解等。合适的表面活性剂包括脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在某些情况下，使用溶剂例如乙醇的溶液气雾剂是优选的。本领域中已知用于配制蛋白例如胰岛素类似物蛋白的另外的物质也可以包括在制剂中。本领域技术人员应当认识到，本发明方法可以通过经由本文没有描述的装置来经肺给药本发明延长胰岛素来实现。本发明还涉及包括本发明延长胰岛素，并且适于通过吸入给药的药物组合物或制剂。根据本发明，本发明的延长胰岛素可以用于制备适于通过吸入给药的制剂或药物。本发明还涉及制备包含本发明延长胰岛素的呈适于通过吸入给药的形式的制剂的方法。例如，可以使用常规技术，通过几种方法来生产干粉制剂。可以通过微粉化、研磨、喷雾干燥等来制备具有适于在下呼吸道中达到最大沉积的粒度范围的颗粒。并且可以通过将本发明延长胰岛素溶解在具有适当pH，包括緩冲剂或其他赋形剂的合适的溶剂例如水中来制备。因此，在一个实施方案中，本发明涉及给药本发明延长胰岛素的方法，所述方法包括通过肺装置给有此需要的患者施用有效量的所述化合物；并且优选地，所述化合物经由患者的嘴吸入。本发明的另一个目的是提供包含本发明延长胰岛素的药物制剂，其中本发明延长胰岛素以0.1mg/ml至500mg/ml的浓度存在，并且其中所述制剂具有2.0至10.0的pH。所述制剂还可以包含蛋白酶抑制剂、緩冲系统、防腐剂、张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，所述药物制剂是水制剂，即包含水的制剂。这样的制剂通常是溶液或悬浮液。在本发明的另一个实施方案中，药物制剂是水溶液。术语"水制剂"定义为包含至少50%(重量/重量)水的制剂。同样，术语"水溶液"定义为包含至少50%(重量/重量)水的溶液，并且术语"水悬浮液"定义为包含至少50%(重量/重量)水的悬浮液。在另一个实施方案中，药物制剂是冷冻干燥制剂，其中在使用之前医生或患者加入溶剂和/或稀释剂。在另一个实施方案中，药物制剂是在溶解之间没有任何溶解的干燥制剂(例如冻干或喷雾干燥的)。在另一个方面，本发明涉及包含本发明延长胰岛素和緩冲剂的水溶液，其中所述延长胰岛素以0.1mg/ml或更高的浓度存在，并且其中所述制剂具有约2.0至约10.0的pH。用于口服给药的制剂可通过任何已知方法来制备，并且这样的制剂可包含一种或多种选自下列的物质调味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供药物美观和适口制剂。片剂可以含有与适于制备片剂的无毒可药用赋形剂混合的活性组分。这些赋形剂可以是例如惰'性稀释剂例如甘露醇、麦芽糖糊精、高岭土、碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸4丐或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉；粘合剂，例如淀粉、明胶、聚酯或阿拉伯胶；和润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术将其包衣以延迟治疗活性多肽的崩解或释放。可以根据药物化学中众所周知的方法制备和给药本发明的口服给药制剂,参见Remington'sPharmaceuticalSciences,17thed.(A.Osoled.,1985)。在本发明的一个方面，本发明的药物制剂可以通过固体剂型例如片剂和胶嚢来给药。片剂可以通过湿法制粒、干法制粒、直接压片或熔化制粒来制备。本发明片剂可以使用常规制片技术来制备。一般制备方法涉及将延长胰岛素、水溶性稀释剂、亲水性粘合剂和任选一部分崩解剂混合。然后将混合物与亲水性粘合剂水溶液或亲水性粘合剂与表面活性剂的水溶液制粒，并且如果需要的话进行研磨。将颗粒干燥，并且降至合适的尺寸。将任何其他组分例如润滑剂(例如硬脂酸镁)和另外的崩解剂加到颗粒中，并且混合。然后将该混合物压缩成合适的尺寸，并且使用常规制片机例如旋转旋转压片机制片。可以通过本领域众所周知的技术将片剂进行膜包衣。用于口服使用的制剂还可以作为硬或软明胶胶嚢递送，其中将活性组分与惰性固体稀释剂例如甘露醇、麦芽糖糊精、碳酸钙、碳酸钠、乳糖、高岭土、磷酸4丐或磷酸钠混合，或者作为软明胶胶嚢递送，其中将活性组分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。用于本发明的胶嚢可以使用常规方法来制备。制备方法一般包括将治疗活性肽、藻酸盐、水溶性稀释剂、亲水性粘合剂以及任选一部分崩解剂混合。然后将该混合物用亲水性粘合剂水溶液或亲水性粘合剂与表面活性剂的水溶液制粒，并且如果需要的话进行研磨。将颗粒干燥，并且降至合适的尺寸。将任何其他组分例如润滑剂加到颗粒中，并且混合。然后使用常规胶嚢填充机器将使得混合物填充到适当尺寸的硬壳明胶胶嚢中。在本发明的另一个实施方案中，緩沖剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰基甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氬钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟基甲基)-氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、麦黄酮、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体緩冲剂中的每一种构成了本发明的另外的实施方案。在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含可药用防腐剂。防腐剂以足以获得保护作用的量存在。药物制剂中防腐剂的量是本领域技术人员众所周知的，并且可以由例如本领域中的文献和/或例如市售产品中防腐剂的已知量确定。这些具体防腐剂中的每一种构成了本发明的另外的实施方案。防腐剂在药物组合物中的应用是本领域技术人员众所周知的。方便起见，请参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含螯合剂。螯合剂在药物组合物中的应用是本领域技术人员众所周知的。方便起见，请参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含稳定剂。本文所用术语"稳定剂"是指加到含有多肽的药物制剂中以稳定肽，例如增加这样的制剂的储存期和/或使用时间的化学物质。稳定剂在药物组合物中的应用是本领域技术人员众所周知的。方便起见，请参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含表面活性剂。本文所用术语"表面活性剂"是指由水溶性(亲水性)部分、头以及脂溶性(亲脂性)部分构成的任何分子或离子。表面活性剂优选在界面聚集，在界面，亲水性部分朝向水(亲水相)，亲脂性部分朝向邮或疏水相(即玻璃、空气、油等)。表面活性剂开始形成胶束的浓度称为临界胶束浓度或CMC。此外，表面活性剂降低液体的表面张力。表面活性剂还称为两亲化合物。术语"洗涤剂，，是常用于表面活性剂的同义词。表面活性剂在药物组合物中的应用是本领域技术人员众所周知的。方便起见，请参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含蛋白酶抑制剂。其他组分也可以存在于本发明延长胰岛素药物制剂中。这样的另外组分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、增量剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油性载体、蛋白(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白)和两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸和组氨酸)。当然，这样的另外组分对于本发明药物制剂的整个稳定性应当没有不利影响。更精确地，本发明还涉及下列实施方案a)本文所述的方法，其中本发明的延长胰岛素递送到患者的下气道中。b)本文所述的方法，其中本发明的延长胰岛素沉积在肺泡中。C)本文所述的方法，其中本发明的延长胰岛素作为药物制剂给药，所述药物制剂在可药用载体中包含本发明的延长胰岛素。d)本文所述的方法，其中所述制剂选自在水介质中的溶液以及在非水介质中的悬浮液。e)本文所述的方法，其中所述制剂作为气雾剂给药。f)本文所述的方法，其中制剂呈干粉形式。g)本文所述的方法，其中制剂具有小于约IO微米的粒度。h)本文所述的方法，其中制剂具有约1至约5微米的粒度。i)本文所述的方法，其中所述制剂具有约2至约3微米的粒度。j)本文所述的方法，其中至少约10%的递送的本发明延长胰岛素沉积在肺中。k)本文所述的方法，其中本发明的延长胰岛素从适于经肺给药并且能够将胰岛素类似物沉积在患者肺中的吸入装置中递送。l)本文所述的方法，其中装置选自雾化器、计量剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器。m)本文所述的方法，其中所述装置是干粉吸入器。n)本文所述的方法，其中所述装置是雾化器。o)本文所述的方法，其中所述装置是计量剂量吸入器。p)本文所述的方法，其中所述装置是喷雾器。q)本文所述的方法，其中启动所述装置施用了约3pg/kg至约20|Lig/kg本发明延长胰岛素，优选约7^ig/kg至约14pg/kg本发明延长胰岛素。r)本文所述的方法，其中所述本发明延长胰岛素是在本文任何实施例中具体提及的任何胰岛素。s)用于治疗糖尿病的本文所述方法，所述方法包括通过经肺方法给有此需要的患者施用有效剂量的本发明延长胰岛素。t)本文所述的方法，其中本发明的延长胰岛素是本文中具体提及的任何本发明具体延长胰岛素，尤其是在本文具体实施例中的具体延长胰岛素。虽然关于方法具体描述了上述实施方案，但是它们也类似地适用于待使用的产品或制剂。本发明的优选特征总而言之，本发明的特征如下1.延长胰岛素，所述延长胰岛素是通过酰胺键，优选通过肽键与一个或多个氨基酸低聚体残基连接的胰岛素残基(如上所定义)，所述氨基酸低聚体残基包含至少5个氨基酸残基，优选至少10个氨基酸残基，更优选至少15个氨基酸残基，并且不超过800个氨基酸残基，优选不超过300个氨基酸残基，优选不超过100个氨基酸残基，优选不超过50个氨基酸残基。2.前一子句的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体残基由可编码氨基酸残基组成。3.前一子句的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体残基不包含赖氨酸残基。4.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体残基由选自Gly、Glu、Pro和Ser残基的氨基酸残基组成。这些氨基酸残基可相同或不同，并且可以以任何顺序排列。5.前述子句任一项的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体残基由Gly残基组成。6.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体残基中Gly残基的量是至少80%(重量/重量)。7.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体残基中Gly残基的量是至少80%(按数量计)。8.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体中Gly残基的量是至少85%(按数量计)。9.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体残基中Gly残基的量是至少90%(按数量计)。10.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体残基中Gly残基的量是至少95%(按数量计)。11.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体残基是(Gly)n、(Gly-Pro-Pro)n、(Pro-Pro-Gly)n、(Gly-Ser)n、(Ser-Gly)n、(Gly-Glu)n或(Glu-Gly)n,其中n为给出氨基酸残基的适当数目的整数。12.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体残基在胰岛素的一个位置Bl、A21、B29或B30上与氨基酸残基连接，条件是所述氨基酸位于在低聚体残基的连接位点前面的末端位置上。如果所迷Bl、A21、B29或B30位上的氨基酸不位于末端位置，则氨基酸低聚体残基在一个下述位置连接氨基酸残基胰岛素的B0、B(-l)、A22、A23、B31或B32位。13.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中连接在B链的C-末端上的任何低聚体的末端都是精氨酸残基。14.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体残基在胰岛素的一个位置B29或B30上与氨基酸残基连接，条件是所述氨基酸位于在低聚体残基的连接位点前面的末端位置上，并且其中所述低聚体的末端是精氨酸残基。15.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中所述胰岛素残基包含不超过51个氨基酸残基。16.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中所述胰岛素残基是具有一个或多个下列任选修饰的人胰岛素A14:E或D;A21:G、A或Q;B3:Q、S或T;B25:H;B28:D或E;B30:des(即desB30)。17.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中所述胰岛素残基是人胰岛素、desB30人胰岛素、门冬氨胰岛素、A21Gly人胰岛素、A21GlydesB30人月夷岛素、Lispro或glulisine的残基。18.前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中所述胰岛素残基上仅连接一个低聚体残基。19.除最后一个前述子句之外的前述可能子句任一项的延长胰岛素，其中所述胰岛素残基上恰好连接着两个低聚体残基。本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过参照整体并入本文，达到将通过参照所并入本文的参考文献单独和具体地描述、并将其在本文中整体列出的相同程度(达到法律允许的最大程度)。本文所使用的所有标题(heading)和亚标题(sub-heading)仅是为了方便，而不应该以任何方式构成对本发明的限制。除非以其他方式说明，使用本文所提供的任何和全部实施例或示范性语言(例如"例如")仅仅是为了更好地举例说明本发明，而不会对本发明的范围造成限制。说明书中的所有语言都不应当被认为表示实施本发明所必需的任何非要求保护成分。在本文中引用和并入专利文件仅仅是为了方便而进行的，并不会反应任何有效性、专利性和/或这些专利文件的可实施性。本文所提到的文献不承认它们构成现有技术。在本文中，词语"包含"需要被宽广地解释为意味着"包括"、"含有"或"包含"(EPO审查指南C4.13)。本发明包括所使用法律允许的所附权利要求中所引用的对象的所有修饰和等同。提供下列实施例是为了举例说明，而不是限制。一屏殳方法构建表达载体、转化酵母细胞以及表达本发明的胰岛素前体所有的表达质粒都是C-POT型的，这与EP171142中所描述的类似，其特4正在于含有粟酒裂殖酵母(Sc/zz'zcw"cc/zaramycM/wm6e)丙4唐石舞酸异构酶基因(POT)用于质粒选择和在酿酒酵母(S.中稳定化的目的。这些质粒还含有酿酒酵母(S.丙糖磷酸异构酶启动子和终止子。这些序列与质粒pKFN1003(WO90/10075中所描述的)的相应序列类似，并且是除了编码前导肽和胰岛素产物融合蛋白的EcoRI-;^al片段之外的全部序列。为了表达不同的融合蛋白，仅仅将pKFN1003的EcoRI-A^al片段替换为感兴趣的编码前导肽-胰岛素融合蛋白的￡c0jR/-A7)"I片段。可以根据标准技术使用合成的寡肽和PCR合成这些5"coRKWal片段。通过转化宿主菌株酿酒酵母(S.ce"vzw^)菌林MT663(M4ra/M4ra^/^-3/>印4-3///W/7nWCir+)而制备酵母转化体。在提交WO92/11378时，将酵母菌林MT663保藏在DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen,并提供了保藏号DSM6278。将MT663在YPGaL(1%Bacto酵母提取物、2%Bacto蛋白胨、2%半乳糖、1%乳酸盐)上生长，达到600nm处的O.D.为0.6。通过离心收集100ml培养物，使用10ml水进行洗涤，重离心并重悬浮在10ml含有1.2M山梨醇、25mMNa2EDTApH=8.0和6.7mg/ml二石克苏糖醇的溶液中。将悬浮液在30。C下培养15分钟，离心，并将细胞重悬浮在10ml含有1.2M山梨醇、10mMNa2EDTA、0.1M柠檬酸钠pH05.8和2mgNovozym234的溶液中。将悬浮液在30。C培养30分钟，通过离心收集细胞，在10ml1.2M山梨醇和10mlCAS(1.2M山梨醇、10mMCaCl2、10mMTrisHCl(pH=7.5)中进行洗涤，并重悬浮在2mlCAS中。为了进行转化，将1mlCAS-悬浮的细胞与大约O.lmg质粒DNA混合，并在室温保持15分钟。加入1ml(20%聚乙二醇4000、10mMCaCl2、10mMTrisHClpH=7.5),并将该混合物在室温再保持30分钟。对混合物进行离心，并将沉淀重悬浮在O.lmlSOS(1.2M山梨醇，33%v/vYPD,6.7mMCaCl2)中，并在30。C培养2小时。接着离心悬浮液，并将沉淀重悬浮在0.5ml1.2M山梨醇中。接着，在52。C加入6ml含有1.2M山梨醇+2.5%琼脂的顶层琼脂(Sherman等人(1982)MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratory中的SC培养基)，并将悬浮液倒在含有相同琼脂固化、含有山梨醇的培养基的平板的顶部。将用表达质粒转化的酿酒酵母(S.菌林MT663于3CTC在YPD中生长72小时。延长的胰岛素前体(单链前体)在B-链末端具有以下延长部分EEAEAEAPK，并且含有以下C-肽DGK。通过固定在Sepharose(EC3.4.21.50)上的Achromobacterlyticus赖氨酸特异性蛋白酶(ALP)将延长的胰岛素前体转化成相应的双链desB30胰岛素类似物。对于每种胰岛素类似物前体，将3ml酵母培养物上清液转移到一个新的管中，并且转移到新的管中，加入666pl溶解在0.2MNaHC03pH9.1中的ALP。该溶液具有大约8.1的pH值，其在该酶的pH最佳范围内，并且将该混合物在轻微搅拌下培养1.5小时。本发明延长胰岛素的制备、纯化和表征如上所述制备多种胰岛素前体，并从培养基中分离和纯化。测试这些延长胰岛素的生物胰岛素活性，其中是通过如下所述，测定相对于人胰岛素，对人胰岛素受体的结合亲和力来进行测试的。在纯化之前评估胰岛素的结合亲和力可能是有利的。这可通过分析培养物上清液来进行。可以通过采用下列本领域中典型的方法中的一种或者更多种来纯化本发明的延长胰岛素。如果需要，在梯度、pH、盐、浓度、流速、柱等方面，这些程序可以被改动。根据多种因素例如杂质特征、所关注胰岛素的溶解度等，本领域技术人员容易认识到并进行这些改动。在酸性HPLC或脱盐之后，通过将纯级份冷冻干燥来分离化合物。在中性HPLC或离子交换色谱之后，将化合物脱盐，在等电pH沉淀，或通过酸性HPLC纯化。典型纯化方法HPLC系统是由以下部件构成的Gilson系统Model215液体控制器，Model322-H2泵，和Model155UV检测器。检测通常在210nm和280nm进行。AktaPurifierFPLC系统(AmershamBiosciences)是由以下部件构成的ModelP-900泵，ModelUV-900UV检测器，ModelpH/C-900pH和电导检测器，ModelFrac-950级份收集器。UV检测通常在214nm、254nm和276nm进行。酸性HPLC:柱Macherey-NagelSP250/21Nucleusil300-7C4流速8ml/min,緩冲液A:0.P/。TFA在乙腈中的溶液緩冲液B:0.P/。TFA在水中的溶液梯度0,0-5.0min:10%A5.00-30.0min:10%A至90%A30.0—35.0min:90%A35.0—40.0min:100%A中性HPLC:柱Phenomenex,Jupiter,C45,250x10,00mm,300A流速6ml/min緩沖液A:5mMTRIS，7,5mM(NH4)2S04,pH=7,3，20%CH3CN緩冲液B:60%CH3CN,40%水梯度0-5min:10%B,5-35min:10-60%B35-39min:60%B,39-40min:70%B40-43.5min:70%B离子交换色谱柱RessourceQ,6ml流速6ml/min緩沖液A:0.09%NH4HCO3,0.25%NH4OAc,42.5。/o乙醇pH8.4緩沖液B:0.09%NH4HCO3，2.5%NH4OAc,42.5。/。乙醇pH8.4梯度100%A至100%B，30倍柱体积期间脱盐柱HiPrep26/10流速10ml/min,64咅柱体积緩沖液10mMNH4HCO3已经如上所述制备了下列本发明胰岛素实施例l.A22-27GdesB30人胰岛素hGIVEQCCTSICSLYQLENYCNGGGGGGohSSI/ssh-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-ohMALDI-MS(基质:芥子酸)；m/z:6048.8,计算值6050。实施例2.A22-33GdesB30人胰岛素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>DGK-单链前体MALDI-MS(基质芥子酸)；m/z:7628,计算值7629。实施例3.A22-39GdesB30人胰岛素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>MALDI-MS(基质芥子酸)；m/z:6765，计算值6734。实施例4.A22-45GdesB30人胰岛素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>MALDI-MS(基质芥子酸)；m/z:7074，计算值7075。实施例5.A21QA22-39[GPP]6desB30人胰岛素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>MALDI-MS(基质芥子酸)；m/z:7228,计算值7228,实施例6.A21QA22-39[GS]9desB30人胰岛素h<3iveqcctsicslyqlenyc66§6§6s6s6§6s6§6S6Sohh-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-ohMALDI-MS(基质芥子酸)；m/z:707，计算值7017<实施例7.A21QA22-39[GE]9desB30人胰岛素hoiveqcctsicslyqlenyc66色6色6e6&g色6色6e6色6E"(iiss'h-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-ohMALDI-MS(基质芥子酸)；m/z:7394，计算值7395,实施例8.A21Q,A22画A45G,desB30人胰岛素hGIVEQCCTSICSLYQLENYCQGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG'h-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK-°hMALDI-MS(基质芥子酸)；m/z:7060,计算值7090'实施例9.A21Q，A22陽A51G，desB30人胰岛素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>s-shGIVEQCCTSICSLYQLENYc6666d66666666。hssi/ssh666666666666fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpk-ohMALDI-MS(单链前体B-链N-末端延长部分EEAEAEAPK,C-肽:DGK.基质芥子酸)；m/z:9012,计算值9011。实施例13.A21Q,A22-A45G，B(-18)-(-l)G,desB30人胰岛素'GIVEQCCTSICSLYQLENYCQGGGGGGGGGGGGMALDI-MS(单链前体B-链N-末端延长部分EEAEAEAPK,C-肽DGK.基质芥子酸)；m/z:9354，计算值9353。实施例14.A14E,A21Q,A22-A45G,B(-6)國(-l)G,B25H,desB30人胰岛素s-shgiveqcctsicsLEQLEN丫c666666666666666666666d666。hh666666fvnqhlcgshlvealylvcgergfAytpk.ohMALDI-MS(单链前体B-链N-末端延长部分EEAEAEAPK,C-肽:DGK.基质芥子酸)；m/z:8598,计算值8596。实施例15.A14E,A21Q,A22-A45G,B(-12)-(-l)G,B25H,desB30人胰岛素<image>imageseeoriginaldocumentpage29</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>h-fvnqhlcgshlvealylvcgergfAytpk。hMALDI-MS(基质芥子酸)；m/z:7390,计算值7388。实施例19.A14E，A21Q,A22-A57G，B25H,desB30人胰岛素s-shgivEQccpTsicsLiQLENYcp66666666d6d6666666666666666d666666666'。Hss"-fvnqhlcgshlvealylvcgergfAytpk.。h实施例20.A14E，A21Q,A22-A62G,B25H,desB30人胰岛素s-s"-fvnqhlcgshlvealylvcgergfAytpk-w可类似地制备的其他优选的本发明胰岛素包括A21GA22-27GdesB30人胰岛素A21GA22-33GdesB30人胰岛素A21GA22-39GdesB30人胰岛素A21GA22-45GdesB30人胰岛素A21GA22-51GdesB30人胰岛素A21GA22-57GdesB30人胰岛素A21GA22-61GdesB30人胰岛素A21QA22-27GdesB30人胰岛素A21QA22-33GdesB30人胰岛素A21QA22-39GdesB30人胰岛素A21QA22-45GdesB30人胰岛素A21QA22-51GdesB30人胰岛素A21QA22-57GdesB30人胰岛素A21QA22-61GdesB30人胰岛素Al4EA21GA22画27GB25HdesB30人胰岛素A14EA21GA22-33GB25HdesB30人胰岛素A14EA21GA22-39GB25HdesB30人胰岛素A14EA21GA22-45GB25HdesB30人胰岛素A14EA21GA22-51GB25HdesB30人胰岛素A14EA21GA22誦57GB25HdesB30人胰岛素A14EA21GA22画61GB25HdesB30人胰岛素Al4EA21QA22-27GB25HdesB30人胰岛素A14EA21QA22誦33GB25HdesB30人胰岛素A14EA21QA22-39GB25HdesB30人胰岛素A14EA21QA22-45GB25HdesB30人胰岛素A14EA21QA22-51GB25HdesB30人胰岛素A14EA21QA22-57GB25HdesB30人胰岛素A14EA21QA22-61GB25HdesB30人胰岛素A21GA22-39[GPP]6desB30人胰岛素A14E,A21GA22-39[GPP]6B25H,desB30人胰岛素A21GA22-39[GPP]9desB30人胰岛素A14E,A21GA22-39[GPP]9B25H，desB30人胰岛素A21GA22-39[GS]9desB30人胰岛素A14E，A21GA22-39[GS]9B25H,desB30人胰岛素A21GA22-39[GE]9desB30人胰岛素A14E,A21GA22-39[GE]9B25H,desB30人胰岛素A14E,A21Q,A22-39[GPP]6B25H，desB30人胰岛素A21Q,A22-39[GPP]9desB30人胰岛素A14E,A21QA22-39[GPP]9B25H,desB30人胰岛素A21Q,A22-39[GS]9desB30人胰岛素A14E,A21Q,A22-39[GS]9B25H,desB30人胰岛素A21Q,A22-39[GE]9desB30人胰岛素A14E,A21Q,A22-39[GE]9B25H,desB30人胰岛素实施例21.图1中给出了大鼠气管内滴注上面实施例8的胰岛素的结果。药理方法测定(I)本发明胰岛素的胰岛素受体结合可通过SPA测定(闪烁亲近测定)微量滴定板抗体捕获分析来测定本发明胰岛素对于人胰岛素受体的亲和力。将SPA-PVT抗体-结合珠，抗小鼠试剂(AmershamBiosciences,CatNo.PRNQ0017)与25ml结合緩沖液(IOOmMHEPESpH7.8;100mM氯化钠，10mMMgS04,0.025%Tween-20)混合。用于单PackardOptiplate的试剂混合物(PackardNo.6005190)由以下成分组成2.4(il1:5000稀释的纯化的重组人胰岛素受体-(负)外显子11，相当于5000cpm每100(al试剂混合物的一定量的A14Tyr[125I]-人胰岛素贮备液，12pi1:1000稀释的F12抗体，3mlSPA-珠以及结合緩冲液至总共12ml。然后加入总共100(il,并且将合适的样本进行系列稀释。然后向稀释液中加入100pi试剂混合物，并且将样本在轻微摇动下培养16小时。通过离心1分钟来分离各相，并且将平板在Topcounter中计数。在GraphPadPrism2.01(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)中使用非线性回归算法来将结合数据拟合。32<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>测定(II)本发明胰岛素相对于人胰岛素的效力使用Wistar大鼠来测定在静脉内快速浓注之后本发明胰岛素降低血糖的效力。给药本发明胰岛素或人胰岛素之后，检测血糖浓度。测定0mo在猪中测定本发明胰岛素的T50%丁50%是当50%的注射量的受试胰岛素的A14Tyr[125I]标记的衍生物已经从注射位点消失时的时间，是用外置"计数器测定的。遵循实验室动物养护原则，使用特定无病原体的LYYD非糖尿病雌性猪，DanishLandrace,Yorkshire和Duroc杂交品种(Holmenlund,Haarloev,Denmark)来进行药动学和药效学实"睑。猪是意识清醒的，4-5月龄，并且重70-95kg。在实验之前将动物禁食过夜18小时。将在TyrA14上用1251标记的延长胰岛素的制剂按照现有技术描述的方法给猪皮下注射(Ribel，U.,J0rgensen,K,Brange,J,和Henriksen,U.用于人中皮下胰岛素吸收模型的猪.Serrano-Rios,MandLefdbvre,P.J.891-896.1985.Amsterdam;NewYork;Oxford,ElsevierSciencePublishers.1985(ConferenceProceeding))。在实验开始时，将60nmol剂量的本发明延长胰岛素(受试化合物)和60nmol胰岛素(都是在TyrA14上1251标记的)在每头猪颈部的两个单独位点注射。使用传统外置Y-计数方法的变型(Ribel,U.胰岛素类似物的皮下吸收.Berger,M.andGries,F.A.70-77(1993).Stuttgart;NewYork,GeorgThimeVerlag(ConferenceProceeding))来冲企测》文射性标记/人皮下注射位点的消失。在该改善方法中，能够使用无线手提式装置在几天内连续测定放射性从皮下贮库的消失(ScancysLaboratorieteknik,V^rl0se，DK-3500,Denmark)。以l分钟的间隔进行测定，并且将计数值针对背景活性进行校正。测定(IV)给大鼠经肺递送延长胰岛素通过滴注法对肺部给药测试物质。简言之，将雄性Wistar大鼠(大约250g)在大约60ml芬太尼/dehydrodenzperidolZ-多美康中进行麻醉，其是以6.6ml/kg皮下启动剂量提供的，并且随后以30分钟的间隔提供3次维持剂量的3.3ml/kgsc。在诱导麻醉之后10分钟，从尾部静脉获得基础样品(t=-20分钟)，接着在给药测试物质之前立即获得基础样品(1=0)。在1=0时，将测试物质气管内给药到一个肺中。将具有圆末端的特殊导管固定在含有200^1空气和测试物质(lml/kg)的注射器上。通过孔，将套管引入到气管内，并向前进入主要支气管之一-刚刚通过分叉(bifurcature)。在插入的过程中，从外部对颈部进行触诊，以确认气管内的定位。随后注射注射器的内含物，接着停顿2秒。之后，将套管緩慢向后拉。在测试的过程中，将大鼠保持麻醉(血液样品持续最高达到4小时)，并在实验后进行安乐死。测定(V)本发明延长胰岛素的疏水性通过以下方法测定本发明延长胰岛素相对于人胰岛素的疏水性(疏水性指数)k'rel:在LiChrosorbRP18(5pm,250x4mm)HPLC柱上，于40。C使用A)和B)的混合物作为洗脱剂进行等度洗脱，A)0.1M磷酸钠緩沖液，pH7.3,含有10%乙腈，和B)50o/。乙腈在水中的混合物。通过洗脱液在214nm的UV吸收来一全测洗脱。通过注射0.1mM硝酸钠来确定空白时间t0。通过改变A与B溶液的比例来将人胰岛素的保留时间t人调节至至少2t0。kW=(t胰岛素-t。)/(t人画to)。权利要求1.延长胰岛素，所述延长胰岛素是通过酰胺键，优选通过肽键与一个或多个氨基酸低聚体残基连接的胰岛素残基，所述氨基酸低聚体残基包含至少5个氨基酸残基，优选至少10个氨基酸残基，并且不超过800个氨基酸残基，优选不超过300个氨基酸残基，优选不超过100个氨基酸残基，优选不超过50个氨基酸残基。2.前述权利要求的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体残基由可编码氨基酸残基组成。3.前述权利要求的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体残基由选自Gly、Glu、Pro和Ser残基的氨基酸残基组成。4.前述权利要求的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体中Gly残基的量是至少80%(重量/重量)。5.前述权利要求的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体由Gly残基组成。6.前述可能权利要求任一项的延长胰岛素，其中所述氨基酸低聚体是(Gly)n、(Gly-Pro曙Pro)n、(Pro-Pro-Gly)n、(Gly-Ser)n、(Ser-Gly)n、(Gly-Glu)n或(Glu-Gly)n，其中n为给出氨基酸残基的适当数目的整数。7.前述可能权利要求任一项的延长胰岛素，其中氨基酸低聚体残基在胰岛素的一个位置Bl、A21、B29或B30上与氨基酸残基连接，条件是所述氨基酸位于在低聚体的连接位点前面的末端位置上。8.前述可能权利要求任一项的延长胰岛素，其中胰岛素是具有一个或多个下列任选修饰的人胰岛素在A14位E或D;在A21位G、A或Q;在B3位Q、S或T;在B25位H;在B28位D或E;以及在B30位des。9.前述可能权利要求任一项的延长胰岛素，其中胰岛素是人胰岛素、desB30人胰岛素、门冬氨胰岛素、A21Gly人胰岛素、A21GlydesB30人胰岛素、Lispro或glulisine。10.本文中描述的任何新特征或特征组合。全文摘要与氨基酸低聚体连接的胰岛素具有令人满意的性质。文档编号C07K14/435GK101528773SQ200780039880公开日2009年9月9日申请日期2007年10月29日优先权日2006年10月27日发明者J·马库森,T·B·谢尔德森,T·霍格-詹森申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司