专利名称：一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域的一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌株及其应用。
背景技术：
森林和草原火灾、火山爆发及微生物的内源合成等均会产生多环芳烃，未开采的 煤、石油中也含有大量的多环芳烃。随着工业生产的发展，多环芳烃大大地增加，每年因 人类的活动会有成千上万吨的多环芳烃释放到地球环境系统中，远远超过了环境的自净能 力。多环芳烃最突出的特性是具有强致癌性、致畸性及致突变性。多环芳烃具有较高的亲 脂性，可以通过食物链进入人体，对人类健康和生态环境具有很大的潜在危害，已引起各国 环境科学家的极大重视。因此，加快降解环境中的多环芳烃成为新的研究热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌株及其应用。本发明提供的微杆菌(Microbacterium sp.)LU1，其保藏号为CGMCC No. 3581。本发明提供了一种菌剂，其活性成分为微杆菌(Microbacterium sp. ) LUl CGMCCNo. 3581。本发明中提供的菌株微杆菌(Microbacteriumsp.)LUl CGMCC No. 3581 于 2010 年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。上述菌剂的制备方法可为将微杆菌(Microbacterium sp. )LU1 CGMCC No. 3581在 如下培养基中在30°C进行培养，收集培养容器内的所有物质获得菌剂；1 升所述培养基的组成如下0. 5-1. 5g NH4CUO. 05-0. 15g MgSO4 · 7H20、 0. 01-0. IgCaCl2 · 2Η20、0· 05-0. 15g 酵母膏、1. 5_2g KH2PO4U. 5_2g Na2HP04、0. 05-0. 15ml 维生素混合液、0. 5-1. 5ml微量金属混合液、以及0. 5-1. 5mg苯并[b]荧蒽，其余为水；所 述维生素混合液的组成为50-150 μ g/L对氨基苯酸、10-100 μ g/L叶酸、50-150 μ g/L硫 辛酸、150-250 μ g/L 烟酸、50-150 μ g/L 维生素 B2、150-250 μ g/L 硫胺素、50-150 μ g/L 泛 酸、450-550 μ g/L维生素Β6、50-150μ g/L维生素B12、以及15-25 μ g/L生物素，其余为 水；所述微量金属混合液的组成为1. 5-2. 5mg/L FeSO4 · 7Η20、0· 01-0. 05mg/LMnCl2 · 4H20、 0. 15-0. 25mg/L CaCl2 · 6Η20、0· 01-0. 03mg/L NiCl2 · 6Η20、0· 02-0. 03mg/LNa2Se03 · 5H20、 0. 5-1. 5mg/L EDTA、0. 05-0. 15mg/L ZnSO4 · 7H20、0. 1-0. 5mg/L H3B03、0. 005—0· 015mg/L CuCl2 · 2H20、0. 01-0. 05mg/L NaMoO4 · 2H20、0. 01-0. 05mg/L Na2MoO4 · 2H20 和 0. 15-0. 25mg/ L CoCl2 · 6H20，其余为水。上述1升所述培养基的组成优选为lg NH4CUO. Ig MgSO4 · 7H20、 0. 05gCaCl2 · 2Η20、0· Ig 酵母膏、1. 86g KH2PO4U. 69g Na2HP04、0. Iml 维生素混合液、Iml 微量金属混合液、以及Img苯并[b]荧蒽，其余为水；所述维生素混合液的组成为100yg/L 对氨基苯酸、50 μ g/L叶酸、100μ g/L硫辛酸、200μ g/L烟酸、100μ g/L维生素Β2、200μ g/ L硫胺素、100 μ g/L泛酸、500 μ g/L维生素B6、100 μ g/L维生素B12、以及20 μ g/L生物素， 其余为水；所述微量金属混合液的组分为2. Omg/L FeSO4 · 7Η20、0· 03mg/L MnCl2 · 4H20、 0. 2mg/L CaCl2 · 6Η20、0· 02mg/L NiCl2 · 6Η20、0· 026mg/LNa2Se03 · 5Η20、1· Omg/L EDTA, 0. lmg/L ZnSO4 · 7H20、0. 3mg/L H3B03、0. 01mg/LCuCl2 · 2H20、0. 03mg/L NaMoO4 · 2H20、 0. 033mg/L Na2MoO4 · 2H20 禾口 0. 2mg/LCoCl2 · 6H20，其余为水。所述培养的条件为培养温度为30°C，培养转速为300r/min，培养时间为两周。上述培养为放置在恒温振荡培养箱中培养。上述的菌剂或上述菌株在去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的应用，所述多环芳 烃选自下述16种中的至少一种萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并[b]荧 蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并蒽和苯并[ghi]茈。上述的菌剂或上述菌株在降解低分子量多环芳烃的应用，所述低分子量多环芳烃 优选为菲。本发明提供的菌株去除多环芳烃的实验结果显示，微杆菌对低环的多环芳烃如萘 (NAP)、苊烯(ANY)、苊(ANE)、芴(FLE)、菲(PHE)和蒽(ANT)和高环的多环芳烃苯并[k]荧 蒽(BkF)的去除明显；微杆菌还可以降解低分子量多环芳烃，如菲，微杆菌对菲的矿化速率 约为0. 3/天。
图1为微杆菌对水体中16种多环芳烃的降解情况图2为微杆菌对菲矿化产生累积二氧化碳随时间的变化
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、去除和/或降解多环芳烃的菌株的分离及鉴定一、分离取北京焦化厂污染土壤，接种到灭菌的液体培养基中(接种量为Ig 土/100ml培 养液)，在控温摇床中振荡培养(30°C )。1升液体培养基成分为lg NH4CUO. IgMgSO4 ·7Η20、 0. 05g CaCl2 · 2Η20、0· Ig 酵母膏、1· 86g KH2PO4U. 69g Na2HP04、0. Iml 维生素混合液、 Iml微量金属混合液、以及Img苯并[b]荧蒽，其余为水。其中，维生素混合液的组分 为对氨基苯酸(100 μ g/L)、叶酸(50 μ g/L)、硫辛酸(100 μ g/L)、烟酸(200 μ g/L)、 维生素 B2 (100 μ g/L)、硫胺素(200 μ g/L)、泛酸(100 μ g/L)、维生素 B6 (500 μ g/L)、 维生素B12(100yg/L)、以及生物素(20 μ g/L)，其余为水；微量金属混合液的组分为 FeSO4 ·7Η20(2· 0mg/L) ,MnCl2 ·4Η20(0· 03mg/L)、CaCl2 ·6Η20(0· 2mg/L) ,NiCl2 ·6Η20(0· 02mg/ L)、Na2SeO3 · 5H20(0. 026mg/L)、EDTA (1. Omg/L)、ZnSO4 · 7H20(0. lmg/L)、H3BO3 (0. 3mg/ L)、CuCl2 · 2H20(0. Olmg/L)、NaMoO4 · 2H20(0. 03mg/L)、Na2MoO4 · 2H20(0. 033mg/L)禾口 CoCl2 ·6Η20(0. 2mg/L)，其余为水。培养一周后，用接种环从培养液中取1环在灭菌的固体培
4养基上划线。固体培养基成分如下:lg/LNH4Cl、0. lg/L MgSO4 ·7Η20、0. 05g/L CaCl2 · 2H20、
1.86g/L KH2P04、1.69g/LNa2HP04、17g/L 琼脂、lmg/L 苯并[b]荧蒽。在 30°C培养箱中培养 一周，然后取单菌落在新鲜的固体培养基上划线，如此反复几次，直至固体培养基上为纯菌 落。二、鉴定1、分子水平鉴定挑一环纯菌落接种于5ml新鲜配置的灭菌LB培养基中，在37 °C恒温摇床 振荡培养一天，然后用蛋白酶K法提取该菌落的DNA，以提取的DNA为模板，用细 菌 16SrRNA 基因的通用引物进行扩增(F27 :5，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，，R1492 5，-TACGYTACCTTGTTACGACT-3，)，50 μ 1 反应体系包括1. 5mmol/L Mg2+, 50mmol/LKCl, 0. 2mmol/L dNTPs，1 μ mol/L 引物，0. 5-1. OU Taq DNA 聚合酶，IO2-IO5 拷贝模板 DNA。扩增 产物为送上海英俊生物技术公司进行测序，测序结果见附表中的序列，该序列为该菌16S rRNA的基因序列。将得到的碱基序列在GenBank内进行同源序列搜索，结果显示该菌与类 似氧化微杆菌(Microbacteriumparaoxydans)的同源性最高，可达99. 9%。2、特征鉴定观察分离出的单菌落，菌落形态为黄色，表面光滑半透明，边缘整齐，有光泽，经革 兰氏染色鉴定革兰氏阳性菌，呈不规则的杆状。接触酶、硝酸盐还原、酪素水解、酪氨酸水解 等试验呈阳性，氧化酶、脲酶、V-P、明胶液化、柠檬酸盐利用、丙二酸利用、淀粉水解、反硝化 等试验结果呈阴性。在一周培养时间内，在2%、5%和7%氯化钠条件下有生长，但在10% 氯化钠条件下无生长；在30°C和37°C时有生长，在4°C和42°C时无生长。根据上述鉴定确定该菌株LUl为微杆菌(Microbacterium sp.)，并于2010年1月 18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.3581。实施例2、去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂的制备将上述微杆菌(Microbacterium sp. ) LUl接种到实施例1所述液体培养基中(以
2.5L三角瓶为培养容器，内盛IL培养液，用无菌棉花塞住瓶口 )，在恒温振荡培养箱中以 300r/min转速振荡培养两周，培养温度为30°C。收集培养容器中的所有物质即为去除多环 芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂。实施例3、去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌株的应用1、菌株对混合多环芳烃的去除通过序批实验，研究由实施例1获得的微杆菌(Microbacterium sp. ) LUl CGMCCNo. 3581对16种多环芳烃的降解情况。采用气相色谱_质谱仪检测，实验在20ml顶 空瓶中进行，时间为三周，每三天取一次样(用相同体积正己烷从培养液中提取多环芳烃， 取Iml提取液在气相色谱_质谱仪上进行检测)。将由实施例1 中获得的微杆菌(Microbacterium sp.)LUl CGMCC No. 3581 按 IO7CFU的量接种到含有IOml培养液1的20ml顶空瓶中进行培养，1升所述培养液1为将 实施例1所述液体培养基中的Img苯并[k]荧蒽更换为人工配制16种多环芳烃混合物， 其中各多环芳烃在所述培养液1中的浓度为萘5. 90mg/L、苊烯0. 01mg/L、苊5. 06mg/L、
5芴 3. 19mg/L、菲 0. 77mg/L、蒽 0. 13mg/L、荧蒽 0. 43mg/L、芘 0. 68mg/L、苯并蒽 0. 01mg/L、屈 0. 02mg/L、苯并(b)荧蒽 0. 67mg/L、苯并(k)荧蒽 0. 23mg/L、苯并(a)芘 0. 03mg/L、茚并(1， 2,3-cd)芘0. 14mg/L、二苯并蒽0.03mg/L、苯并(ghi)茈mg/L。制备多环芳烃混合物时，将 溶解在正己烷中浓度为lppm(mg/L)的各种多环芳烃，取不同量混合在一起，然后加入培养 液。为防止多环芳烃挥发，封闭瓶口，每周向瓶中加一次氧气(空气)。每个瓶分三次共加入15mL正己烷，每次在摇床上以180r/min震荡萃取半小时，将 三次的萃取液转移至同一瓶中，混合均勻后，取875yL萃取液加125yL 2ppm(mg/L)内标 2-氟联苯和对_三联苯于棕色上样品中，采用气相色谱_质谱仪(安捷伦GC6890/5973MSD， HP-5石英毛细管色谱柱30m X0. 32mm, ID 0. 25 μ m液膜厚)测定。测定条件为载气为 高纯He，柱前压0.03MPa，线速度37cm/s.进样口温度30(TC，不分流进样方式。初始温度 60°C，以5°C/min速度升温至300°C，保留20min至样品完全流出。质谱条件为EI电离 源70eV，质量范围45 600amu，倍增器电压1288V，离子源温度230°C，采用选择离子模式 (SIM)。在该检测条件下，16种多环芳烃的保留时间分别为(分钟)萘8. 67、苊烯15. 23、 苊 16. 04、芴 18. 42、菲 22. 81、蒽 23. 04、荧蒽 28. 35、芘 29. 34、苯并蒽 35. 06、屈 35. 21、苯并 (b)荧蒽 39. 8、苯并(k)荧蒽 39. 93、苯并(a)芘 41. 28、茚并(1, 2,3-cd)芘 46. 78、二苯并 蒽47. 06、苯并(ghi)茈)47. 96。采用内标法定量。每三天取一次样，经计算，将每次取样后检测的各多环芳烃的浓度做图，如图1所 示，纵坐标的单位PPb表示yg/L，图1中每一组柱状图从左到右依次代表对应的一种多环 芳烃在0、3、6、9、12、15、21天的浓度。其中萘(NAP)在0、3、6、9、12、15、21天的浓度分别 为 5. 90,6. 04,5. 78,5. 16,4. 04,3. 19 和 1. 44 μ g/L ；苊烯(ANY)在 0、3、6、9、12、15、21 天 的浓度分别为 0. 012,0. 014,0. 016,0. 013,0. 010,0. 008 和 0. 005 μ g/L ；苊(ANE)在 0、3、 6、9、12、15、21 天的浓度分别为 5. 06,5. 05,4. 75,4. 29,3. 95,3. 24 和 2. 12 μ g/L ；芴(FLE) 在 0、3、6、9、12、15、21 天的浓度分别为 3. 19,3. 16,2. 98,2. 71,2. 57,2. 14 和 1. 62 μ g/ L;菲(PHE)在 0、3、6、9、12、15、21 天的浓度分别为 0. 77、0. 75、0. 71、0. 64、0. 76、0. 66 和 0. 57 μ g/L ；蒽(ANT)在 0、3、6、9、12、15、21 天的浓度分别为 0. 13,0. 10,0. 08,0. 08,0. 06、 0. 04 和 0. 03 μ g/L ；苯并[k]荧蒽(BkF)在 0、3、6、9、12、15、21 天的浓度分别为 0. 23,0. 52、 0. 50,0. 50,0. 23,0. 02和0. 01 μ g/L。实验结果表明，微杆菌对低环的多环芳烃如萘(NAP)、 苊烯(ANY)、苊(ANE)、芴(FLE)及蒽(ANT)和高环的多环芳烃苯并[k]荧蒽(BkF)的去除 明显。观察发现，在培养期间，培养液逐渐变得浑浊，可以判断微杆菌在培养液中不断生长。2、菌株对菲的降解以14C标记的菲(Sigma，美国)为代表，研究了微杆菌对低分子量多环芳烃的矿 化。实验在根据已有研究设计制作的呼吸测定器中进行。使用40mL安培瓶上，在瓶盖内下 方固定一个2mL的GC样品瓶，内装ImL左右lmol/L的氢氧化钠溶液，以吸收在降解过程中 产生的14C02。将由实施例1中获得的微杆菌(Microbacterium sp. )LU1 CGMCC No. 3581按 IO7CFU接种到含有20ml培养液2的40ml安培瓶中。1升所述培养液2成分为Ig NH4Cl, 0. Ig MgS04 · 7Η20、0· 05g CaCl2 · 2Η20、1· 86g KH2PO4U. 69g Na2HPO4Uml 微量金属混合液、 0. 2mg菲和0. 03mg 14C菲(即菲中14C的浓度)。实验进行两周，每天从呼吸测定器中取一 次样(取样后，添加新鲜氢氧化钠)。样品溶液与4ml 14C闪烁液混合，然后在闪烁计数仪 (Liquid Scintillation Counter LS 6500，Beckman，美国)上测定，所得结果按公式换算成14C的浓度值(二氧化碳中14C的浓度)。设置不加微杆菌的对照。图2显示14C菲矿化 累积14C 二氧化碳随时间的变化。〇代表对照组， 代表微杆菌组，按照一级反应动力学计 算(C = Cc^kt)，微杆菌对菲的矿化速率约为0. 3/天。
权利要求
微杆菌(Microbacterium sp.)LU1，其保藏号为CGMCC No.3581。
2.—种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌剂，其活性成分为权利要求1中的微杆 菌(Microbacterium sp.)LUl CGMCC No. 3581。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述菌剂的制备方法为将微杆菌 (Microbacterium sp. )LU1 CGMCC No. 3581在如下培养基中在30°C进行培养，收集培养容 器内的所有物质获得菌剂；1 升所述培养基的组成如下0. 5-1. 5g NH4CUO. 05-0. 15g MgSO4 · 7H20、 0· 01-0. IgCaCl2 · 2Η20、0· 05-0. 15g 酵母膏、1.5-2· Og KH2PO4U. 5-2. Og Na2HPO4, 0. 05-0. 15ml维生素混合液、0. 5-1. 5ml微量金属混合液、以及0. 5-1. 5mg苯并[b]荧蒽， 其余为水；所述维生素混合液的组成为50-150yg/L对氨基苯酸、10-100yg/L叶酸、 50-150 μ g/L 硫辛酸、150-250 μ g/L 烟酸、50-150 μ g/L 维生素 B2、150-250 μ g/L 硫胺素、 50-150 μ g/L 泛酸、450-550 μ g/L 维生素 Β6、50_150 μ g/L 维生素 B12、以及 15-25 μ g/L 生 物素，其余为水；所述微量金属混合液的组成为1. 5-2. 5mg/L FeSO4 · 7H20、0. 01-0. 05mg/ LMnCl2 · 4Η20、0· 15-0. 25mg/L CaCl2 · 6Η20、0· 01-0. 03mg/L NiCl2 · 6Η20、0· 02-0. 03mg/ LNa2SeO3 · 5Η20、0· 5-1. 5mg/L EDTA、0. 05-0. 15mg/L ZnSO4 · 7Η20、0· 1-0. 5mg/L H3BO3, 0. 005-0. 015mg/L CuCl2 · 2H20、0. 01-0. 05mg/L NaMoO4 · 2H20、0. 01-0. 05mg/LNa2Mo04 · 2H20 和 0. 15-0. 25mg/L CoCl2 · 6H20，其余为水。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于1升所述培养基的组成如下 IgNH4CUO. Ig MgSO4 · 7Η20、0· 05g CaCl2 · 2Η20、0· Ig 酵母膏、1. 86g KH2PO4U. 69gNa2HP04、 0. Iml维生素混合液、Iml微量金属混合液、以及Img苯并[b]荧蒽，其余为水；所述维生 素混合液的组成为100 μ g/L对氨基苯酸、50 μ g/L叶酸、100 μ g/L硫辛酸、200 μ g/L烟 酸、100 μ g/L 维生素 Β2、200 μ g/L 硫胺素、100 μ g/L 泛酸、500 μ g/L 维生素 B6、100 μ g/ L维生素B12、以及20 μ g/L生物素，其余为水；所述微量金属混合液的组分为2. 0mg/L FeSO4 · 7Η20、0· 03mg/L MnCl2 · 4Η20、0· 2mg/LCaCl2 · 6Η20、0· 02mg/L NiCl2 · 6Η20、0· 026mg/L Na2SeO3 · 5Η20、1· 0mg/L EDTA、0. lmg/LZnS04 · 7Η20、0· 3mg/L Η3Β03、0· Olmg/L CuCl2 · 2H20、 0. 03mg/L NaMoO4 · 2H20、0. 033mg/L Na2MoO4 · 2H20 禾口 0. 2mg/L CoCl2 · 6H20，其余为水。
5.根据权利要求2-4中任一所述的菌剂，其特征在于所述培养的条件为培养温度为 30°C，培养转速为300r/min，培养时间为两周。
6.权利要求1所述的菌株在去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的应用，所述多环芳烃 选自下述16种中的至少一种萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并[b]荧蒽、 苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并蒽和苯并[ghi]茈。
7.权利要求2-5中任一所述的菌剂在去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的应用，所述 多环芳烃选自下述16种中的至少一种萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并蒽、屈、苯并 [b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并蒽和苯并[ghi]茈。
8.权利要求1所述的菌株在矿化低分子量多环芳烃的应用。
9.权利要求2-5中所述的菌剂在矿化低分子量多环芳烃的应用
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于所述低分子量多环芳烃为菲。
全文摘要
本发明公开了一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃菌株及其应用。本发明提供了微杆菌(Microbacterium sp.)LU1，其保藏号为CGMCC No.3581，本发明提供了一种菌剂，其活性成分为微杆菌(Microbacterium sp.)LU1 CGMCC No.3581。本发明提供的菌株去除多环芳烃的实验结果显示，微杆菌对低环的多环芳烃如萘(NAP)、苊烯(ANY)、苊(ANE)、芴(FLE)、菲(PHE)及蒽(ANT)和高环的多环芳烃苯并[k]荧蒽的去除明显；微杆菌还可以矿化低分子量多环芳烃，如菲，微杆菌对菲的矿化速率约为0.3/天。
文档编号A62D3/02GK101899406SQ20101016191
公开日2010年12月1日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者卢晓霞, 吴淑可, 吴蔚, 廖晓勇, 李秀利, 陈超琪, 马杰 申请人:北京大学