专利名称：一种农药降解酶制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及稳定酶制剂活性的技术领域，具体地说是一种农药降解酶制剂。
背景技术：
农药污染所导致的环境安全及食品安全问题是农业生产和人类健康面临的重大问题。在我国，由于农药使用的不规范，农产品及环境都遭受到了严重的农药污染。农药污染所导致的环境安全及食品安全等问题越来越受到关注，正成为政府和广大消费者关注的焦点之一。 相关报导显示我国农产品的农药残留严重，居民日常膳食中的各类农药摄入量，高于美国、日本和欧盟等发达国家数十倍。残留农药可以改变人体荷尔蒙，使女性内分泌紊舌L男性少精，精子成活率低；残留农药进入人体，一部分通过肾肝转化或排出，增加机体工作量引起病变；一部分和血液的血红蛋白结合，降低其供氧能力。世界卫生组织公布的调查报告表明，残留农药在人体内长期蓄积滞留会引发慢性中毒，以致诱发许多慢性病症。如心脑血管病、糖尿病、癌症等，农药残留甚至通过胚胎和乳汁转移给下一代，并能够导致“三致”:致癌、致畸、致突变，有时直接导致食用者死亡。环境激素是全世界公认的造成生物异常生长发育的主要凶手。在国际组织确定的70种环境激素中，农药就有40种。由于农药的使用，蔬菜瓜果等农产品经过清洗后的水流入土壤之中，农药污染物仍未被最终降解，又可能通过其它途径进入人体。农药降解酶通过酶促反应原理水解磷酸酯键，降解农药残留，是目前解决农药残留问题的最有效技术手段，具有安全、高效、无二次污染等特点。农药降解酶制剂的稳定性问题是其研制过程中的关键问题。酶是一种生物活性物质，受温度、PH值影响较大，如果配方体系不佳，酶很容易失去活性。所以，研制稳定的农药降解酶制剂配方，是农药降解酶发挥作用的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种农药降解酶制剂。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为—种农药降解酶制剂，农药降解酶制剂由农药降解酶剂、稳定剂、表面活性剂、保护剂和水组成，其按体积百分比计，10% -20%的农药降解酶剂、O. 1% -O. 2%的稳定剂、1% -5%的表面活性剂、30% -80%的保护剂余量为水。所述农药降解酶剂为在LB培养基中培养后的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 1529的基因工程菌株发酵培养破碎。所述农药降解酶剂为将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C，溶氧量20-30%，培养10-15小时，而后按体积比1% -5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在37°C，溶氧量20-30%，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C _25°C，诱导表达15-22个小时，将上述所得发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/10-1/20发酵液体积的O.1mol/LpH7. O的磷酸盐缓冲液回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，加入液氮的高度高于菌体表面O. 5-lcm，待液氮挥发干净后将菌体真空冷冻干燥，将冻干后的菌体用O.1mol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，10000-12000Rpm离心10-20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。、
所述稳定剂为聚六亚甲基胍；表面活性剂为椰油酰胺丙基甜菜碱；保护剂为甘油。所述发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2% -3%、酵母粉2% -3%、甘油2% -3%,K2HPO4 O. 25%,KH2PO4 O. 016%,NaCl O. 05%、MgSO4 ·H2O O. 025%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。所述LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。所述回溶菌体离心收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，加入液氮的高度高于菌体表面O. 5-lcm，待液氮挥发干净后将菌体真空冷冻干燥，其真空度30pa，冻干温度_50°C，冻干时间8-12h。所述农药降解酶制剂用于降解有机磷农药的残留。本发明所具有的优点1.本发明的农药降解酶制剂酶活性高，可以有效降解有机磷农药残留，保障食品安全。2.本发明的农药降解酶制剂具有优良的稳定性，酶不易失活。3.本发明的农药降解酶制剂降解效果迅速。4.本发明的农药降解酶制剂安全高效、无毒副作用。本发明制剂在4°C条件下保存，6个月内酶活损失不高于10%;在室温下保存，6个月内酶活性损失不高于30%。同时本发明的农药降解酶制剂能够降解有机磷农药残留。
具体实施例方式实施例1农药降解酶制剂由农药降解酶剂、聚六亚甲基胍、椰油酰胺丙基甜菜碱、甘油和水组成，其按体积百分比计，20 %的农药降解酶剂(酶活力为11500U) ,0.1%的聚六亚甲基胍、I %的椰油酰胺丙基甜菜碱、75 %的甘油，余量为灭菌蒸馏水。所述农药降解酶剂，将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 1529的基因工程菌株接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基，培养温度37°C，溶氧量20%，培养时间10个小时。LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨I %、酵母粉O. 5%、氯化钠I %，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50 μ g的氨苄青霉素。所述基因工程菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 1529，另参见申请号200510086957. 3中的相关记载。而后按体积比1%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在37°C，溶氧量20%，培养2小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到25°C，诱导表达20个小时后将发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/10发酵液体积的O.1mol/LpH 7. O的磷酸盐缓冲液(称取Na2HPO4 ·2Η20 10. 86g，NaH2PO4 · H2O 5. 38g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O.1cm,向容器中加入液氮破碎菌体，液氮的高度高于菌体表面O. 5cm，待液氮挥发干净后将菌体置于真空冷冻干燥机冷冻干燥，其中真空冷冻干燥真空度30pa，冻干温度_50°C，冻干时间12h，将冻干后的菌体用O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，IOOOORpm离心20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨2%、酵母粉2%、甘油2 %、K2HPO4O. 25 %,KH2PO4 0. 016%, NaCl 0. 05%, MgSO4 · H2O 0. 025%，蒸馏水，121°C灭菌 20 分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50 μ g的氨苄青霉素。上述农药降解酶制剂的酶活力的测定将上述制剂在4°C或者室温放置，而后分别测定其酶活稳定性，吸取980 μ I O. lmol/L ρΗ7· O的磷酸盐缓冲液，10 μ I 10mg/mL的对硫磷溶液(称取对硫磷标准品IOOmg,用乙醇溶解并定容至IOmL),充分混勻,加入10 μ I上述农药降解酶剂，30°C反应I分钟，用20 μ I 6mol/L的HCl终止反应，吸取0. 5ml加入4. 5mL0. 05mol/LpH10. O的NaOH-甘氨酸缓冲液(甘氨酸3. 78g，氢氧化钠1. 28g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。上述缓冲液的pH值应使用酸度计加以校正。)，充分混匀，于410nm波长下测定产物对硝基苯酚的吸光度，通过标准曲线，计算酶活力。酶活力单位(U)定义为在30°C, pH 7. O的条件下，I分钟降解I μ g甲基对硫磷所需要的酶量定义为一个酶活力单位U。测定结果参见表1，由上述测定酶活力可知制备所得制剂能够降解有机磷农药残留。表I酶活稳定性
权利要求
1.一种农药降解酶制剂，其特征在于农药降解酶制剂由农药降解酶剂、稳定剂、表面活性剂、保护剂和水组成，其按体积百分比计，10% -20%的农药降解酶剂、O. 1% -O. 2%的稳定剂、I % _5%的表面活性剂、30% -80%的保护剂余量为水。
2.按权利要求1所述的农药降解酶制剂，其特征在于所述农药降解酶剂为在LB培养基中培养后的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo. 1529的基因工程菌株发酵培养破碎。
3.按权利要求1所述的农药降解酶制剂，其特征在于所述农药降解酶剂制备为将基因工程菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C，溶氧量20-30%，培养10-15小时，而后按体积比1% _5%的接种量将培养液接种于含氨苄青霉素的发酵培养基，在37°C，溶氧量20-30%，培养2-4小时后向发酵培养培养基中加入终浓度为25mmol/L的乳糖后，将培养温度降到22°C -25°C，诱导表达15-22个小时，将上述所得发酵液以5000rpm离心10分钟收集菌体，并加入1/10-1/20发酵液体积的O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶菌体，5000rpm离心10分钟重新收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O.1-ο. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，加入液氮的高度高于菌体表面O. 5-lcm，待液氮挥发干净后将菌体真空冷冻干燥，将冻干后的菌体用O. lmol/L pH 7. O的磷酸盐缓冲液回溶至原发酵液体积，10000-12000Rpm离心10-20分钟收集上清液，即为农药降解酶剂。
4.按权利要求1所述的农药降解酶制剂，其特征在于所述稳定剂为聚六亚甲基胍；表面活性剂为椰油酰胺丙基甜菜碱；保护剂为甘油。
5.按权利要求3所述的农药降解酶制剂，其特征在于所述发酵培养为按重量百分比计，蛋白胨 2%-3%、酵母粉 2%-3%、甘油 2%-3%、K2HP04 O. 25%,KH2PO4 O. 016%,NaClO.05%,MgSO4 · H2O O. 025%，余量为蒸馏水，121°C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的发酵培养基为每毫升发酵培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。
6.按权利要求3所述的农药降解酶制剂，其特征在于所述LB液体培养基为按重量百分比计，胰蛋白胨I %、酵母粉O. 5 %、氯化钠I %，余量为蒸馏水，121 °C灭菌20分钟；含氨苄青霉素的LB液体培养基为每毫升LB液体培养基中添加50-75 μ g的氨苄青霉素。
7.按权利要求3所述的农药降解酶制剂，其特征在于所述回溶菌体离心收集菌体，将收集的菌体平铺于铁制或钢制容器中，菌体厚度O. 1-0. 2cm,向容器中加入液氮破碎菌体，加入液氮的高度高于菌体表面O. 5-lcm，待液氮挥发干净后将菌体真空冷冻干燥，其真空度30pa，冻干温度_50°C，冻干时间8-12h。
8.按权利要求1所述的农药降解酶制剂，其特征在于所述农药降解酶制剂用于降解有机磷农药的残留。
全文摘要
本发明涉及稳定酶制剂活性的技术领域，具体地说是一种农药降解酶制剂。农药降解酶制剂由农药降解酶剂、稳定剂、表面活性剂、保护剂和水组成，其按体积百分比计，10％-20％的农药降解酶剂、0.1％-0.2％的稳定剂、1％-5％的表面活性剂、30％-80％的保护剂余量为水。本发明制剂在4℃条件下保存，6个月内酶活损失不高于10％；在室温下保存，6个月内酶活性损失不高于30％。同时本发明农药降解酶制剂能够降解有机磷农药残留。
文档编号A62D3/02GK102994488SQ201110431638
公开日2013年3月27日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者谢建飞, 石元亮, 卢宗云, 张惠文, 李鹏程, 邢云鹏 申请人:辽宁中科生物工程有限公司