一种双加氧酶基因pbaAaAbAcAd及其编码的蛋白质和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种双加氧酶基因pbaAaAbAcAd及其编码的蛋白质和应用。本发明克隆的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd序列如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示。其编码的双加氧酶PbaAaAbAcAd能催化3-苯氧基苯甲酸生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚，催化4-苯氧基苯甲酸生成4-羟基苯甲酸和邻苯二酚。PbaAaAbAcAd基因可用于构建通过降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的转基因作物，也可用于土壤、水体中3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基残留的消除和化工产品的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。
【专利说明】—种双加氧酶基因pbaAaAbAcAd及其编码的蛋白质和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于应用环境微生物和农业领域,涉及一种双加氧酶基因pbaAaAbAcAd及其编码的蛋白质和应用。
【背景技术】
[0002]菊酯类农药降解的第一步是在菊酯水解酶的作用下生成3-苯氧基苯甲酸，然后再通过其它的酶系降解3-苯氧基苯甲酸。3-苯氧基苯甲酸是拟除虫菊酯杀虫剂在土壤中的降解产物，也是许多拟除虫菊酯在植物、昆虫和鸟类体内的代谢产物。3-苯氧基苯甲酸对真菌的毒性大于拟除虫菊酯，且与拟除虫菊酯不同，它可以在土壤中迁移，因此它在环境的危险性相对而言比菊酯大，而且具有二苯醚醛键的物质广泛存在于自然界中，如霉菌的次生代谢产物、木质素、甲状腺素、二苯呋喃等其他杀虫剂，它们对环境存在着潜在的威胁。Edward Topp等研究表明3-PBA在土壤中的半衰期达到180天,因此,这类物质作为微生物降解顽固化合物的典型也越来越受到人们的关注。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一个新的降解3-苯氧基苯甲酸和
4-苯氧基苯甲酸的角度双加氧酶基因pbaAaAbAcAd。
[0004]本发明的另一目的是提供该基因编码蛋白质。 [0005]本发明的又一目的是提供该基因及其编码的蛋白质的应用。
[0006]本发明的目的通过如下技术方案实现:
[0007]一个降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd,该基因由核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的大亚基基因pbaAa、SEQ ID N0.2所示的小亚基基因pbaAb、SEQ ID N0.3所示的电子传递体电子传递体铁氧还蛋白基因pbaAc和SEQ ID N0.4所示的电子传递体电子传递体还原酶基因PbaAd组成。
[0008]—个降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAc,该基因由核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的大亚基基因pbaAa、SEQ ID N0.2所示的小亚基基因pbaAb和SEQ ID N0.3所示的电子传递体电子传递体铁氧还蛋白基因pbaAc组成。
[0009]本专利所用的出发菌株为一株能够降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的细菌菌株Sphingobium wenxiniae JZ-1 (保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.1.7748)。菌株JZ-1降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的第一步反应是在一个角度双加氧酶的催化下生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚(3-苯氧基苯甲酸)以及4-羟基苯甲酸和邻苯二酚(4-苯氧基苯甲酸)。
[0010]降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd的获得是采用现代生物信息学手段获得(技术路线见图1~图2)。即通过比较已报道的9个角度双加氧酶核酸序列与JZ-1的全基因组信息，寻找JZ-1中的可能的3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸双加氧酶基因。首先提取JZ-1的总DNA，把总DNA进行基因组测序，组装，KEGG数据库比对。测序结果表明，野生株JZ-1基因组大小为4766968bp，99个scaffold，G + C含量为63.25%;预测有4887个基因，其中62个双加氧酶基因。
[0011]经过对已报道的9个角度双加氧酶大亚基核酸序列(DxnAl, Sphingomonas sp.Rffl,3426122;CarAa, Sphingomonas sp.CB3，AF060489;DfdAl, Terrabacter sp.YK3,22036072;DbfAl, Terrabacter sp.DBF63,AB054975;CarAal, Sphingomonassp.KAl, 113473718;CarAa, Pseudomonas stutzeri 0M1, AB001723;CarAa, Janthinobacterium sp.J3,75765412;C arAa, Pseudomonas sp.CA10, 2317678;PobA, P.pseudoalcaligenesP0B310)与JZ-1 (CGMCC N0.1.7748)的全基因组信息比对，发现JZ-1全基因组中有一个双加氧酶大小亚基和铁氧还蛋白蛋白类型的基因与9个角度双加氧酶大亚基核酸序列同源性较高，该大小亚基和Sphingomonas sp.RWl(购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ, DSM-N0.DSM-6014, www.dsmz.de)中的一个双加氧酶DxnAlA2同源性分别为66%和53%。该三个基因G+C为55.4%，明显不同于JZ-1全基因组G+C (63.2%)，并且三个基因两侧各有一个转座酶基因，说明该三个基因可能来自基因的水平转移。将包含该三个基因的3.4K片段(见图4)通过PCR从野生菌株中扩增出来酶连在pBBRlMCS-2构建重组载体，通过转化的方法导入到E.coli DH5a，获得了重组菌株E.coli DH5 a (pBBRAaAbAc)，通过三亲结合将该重组载体转到Sphingomonas sp.Rffl获得重组菌株获得重组菌株Sphingomonas sp.Rffl(pBBRAaAbAc)(技术流程见图 2)。检测了 Sphingomonas sp.Rffl (pBBRAaAbAc)对 3-苯氧基苯甲酸的降解情况，结果表明Sphingomonas sp.Rffl (pBBRAaAbAc)获得了降解3-苯氧基苯甲酸的能力，表明该基因确实为降解3-苯氧基苯甲酸的目标基因。另外，在pbaAaAbAc的下游发现了邻苯二酚的降解基因簇，与已报道的邻苯二酚代谢基因簇同源性较高(99%)。
[0012]为了获得PbaAaAbAc所需的合适的另一个电子传递体还原酶，将JZ-1全基因组序列与Sphingomonas sp.Rffl中的RedA2基因序列进行比对(见图3),找到一个还原酶基因，氨基酸序列与RedA2同源性为59%。通过重叠延伸PCR将该还原酶基因前面加上pET-29a(+)中的T7启动子和SD序列，连到pBBRlMCS_5上，构建重组载体pBBRAd,然后转到 E.coli BL21(DE3) (pBBRAaAbAc)中，检测了 E.coli BL21(DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd)对
3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的降解情况,结果表明E.coli BL21 (DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd)获得了 3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的降解能力。用液质联用检测了 JZ-1、Sphingomonas sp.Rffl (pBBRAaAbAc)和 E.coli BL21 (DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd)对 3-苯氧基苯甲酸的降解代谢产物(见图4)，以及E.coli BL21 (DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd)对4-苯氧基苯甲酸的降解代谢产物(见图5)。结果表明JZ_l、Sphingomonas sp.RffKpBBRAaAbAc)降解3-苯氧基苯甲酸生成3-羟基苯甲酸；E.coli BL21 (DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd)降解
3-苯氧基苯甲酸生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酚；Ε.coli BL21(DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd)降解4-苯氧基苯甲酸生成4-羟基苯甲酸和邻苯二酚。由此可以推测JZ-1降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的途径如图4。3-苯氧基苯甲酸在PbaAaAbAcAd的作用下生成3-羟基苯甲酸和邻苯二酹，与此类似的，4-苯氧基苯甲酸在PbaAaAbAcAd的作用下生成4-羟基苯甲酸和邻苯二酚，3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸不能被继续降解，而邻苯二酹可以在邻苯二酹邻位双加氧酶的作用下继续开环降解。JZ-1和Sphingomonas sp.Rffl(pBBRAaAbAc)检测不到中间产物邻苯二酚，可能是因为邻苯二酚的降解速度大于其产生速度。[0013]所述的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd编码的蛋白质PbaAaAbAcAd,其氨基酸序列分别为 SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8。
[0014]所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc编码的蛋白质pbaAaAbAc,氨基酸序列为SEQ IDN0.5, SEQ ID N0.6, SEQ ID N0.10
[0015]含有本发明所述的pbaAaAbAc基因或pbaAaAbAcAd基因的重组表达载体。
[0016]含有所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组表达载体优选pBBRAaAbAc:将包含所述的加氧酶基因pbaAaAbAc的核酸片段插入pBBRlMCS_2的HindIII和Sac I位点之间所得。
[0017]含有所述的双加氧酶基因PbaAaAbAc的重组表达载体优选pETAaAbAc:将包含所述的加氧酶基因pbaAaAbAc的核酸片段插入pET29a(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。
[0018]含有所述的双加氧酶基因pbaAd的重组表达载体优选pBBRAd:将包含所述的SEQID N0.4所示的电子传递体pbaAd的核酸片段插入pBBRlMCS_5的HindIII和Sac I位点之间所得。
[0019]含有本发明所述的pbaAaAbAc基因或pbaAaAbAcAd基因的基因工程菌株，优选将上述的重组表达载体导入宿主菌所得，进一步优选含有所述的重组表达载体PBBRAaAbAc的基因工程菌株RW-1 (pBBRAaAbAc)或者含有所述的重组表达载体pETAaAbAc和pBBRAd的基因工程菌株 E.Co I i BL21(DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd )。
[0020]所述的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd在降解和转化3_苯氧基苯甲酸和/或4_苯氧基苯甲酸中的应用。
[0021]所述的含有双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组表达载体在降解和转化3_苯氧基苯甲酸中的应用。
[0022]所述双加氧酶基因pbaAaAbAcAd在构建抗3_苯氧基苯甲酸和/或4_苯氧基苯甲酸的转基因作物中的应用。
[0023]所述双加氧酶基因pbaAaAbAc在构建抗3_苯氧基苯甲酸的转基因作物中的应用。
[0024]所述双加氧酶PbaAaAbAcAd在降解3_苯氧基苯甲酸和/或4_苯氧基苯甲酸中的应用。
[0025]所述双加氧酶PbaAaAbAc在降解3_苯氧基苯甲酸中的应用。
[0026]所述双加氧酶PbaAaAbAcAd在去除土壤、水体中3_苯氧基苯甲酸和/或4_苯氧基苯甲酸残留中的应用。
[0027]所述双加氧酶PbaAaAbAc在去除土壤、水体中3_苯氧基苯甲酸残留中的应用。
[0028]本发明的有益效果如下:
[0029]本发明从出发菌株鞘酯菌(Sphingobium.sp.)JZ_1 (CGMCC N0.1.7748)中克隆到降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd。在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)分别为1308、531、321和1227bp，编码435、176、106和408个氨基酸。该基因能够降解3-苯氧基苯甲酸和/或
4-苯氧基苯甲酸，可在构 建抗3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸的转基因作物中应用。该基因的编码蛋白可在降解3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸或除土壤、水体中3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸残留中应用。【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶pbaAaAbAcAd基因克隆技术路线图。
[0031]图2双加氧酶基因pbaAaAbAcAd功能验证技术路线图。
[0032]图3还原酶基因pbaAd的查找和功能验证技术路线
[0033]图4为pbaAaAbAcAd所在的转座子序列及下游的邻苯二酚基因簇
[0034]图5基因工程菌株降解3-苯氧基苯甲酸的液质检测图谱
[0035]a~c图依次为3-苯氧基苯甲酸、3_羟基苯甲酸和邻苯二酚标准品液相检测图谱；
[0036]d图为JZ-1降解3-苯氧基苯甲酸的液相检测图谱；
[0037]e图为d图中产物3-羟基苯甲酸的质谱图。
[0038]f图为重组菌株Sphingomonas sp.RWl (pBBRAaAbAc)降解3_苯氧基苯甲酸的液相检测图谱；
[0039]g图为f图中产物的质谱图。
[0040]h图为重组菌株 E.Co I i BL21(DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd )降解3-苯氧基苯甲酸的液相检测图谱；
[0041]i~j图为h图中产物的质谱图。
[0042]图6基因工程菌降解4-苯氧基苯甲酸的液质检测图谱
[0043]a~c图依次为4-苯氧基苯甲酸、4_羟基苯甲酸和邻苯二酚标准品液相检测图
-1'Tfe1曰；
[0044]d图为重组菌株E.Co I i BL21(DE3) (pETAaAbAc/pBBRAd )降解4-苯氧基苯甲酸的液相检测图谱；
[0045]e~f图为d图中产物的质谱图。
[0046]生物材料保藏信息
[0047]3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸降解菌JZ-1,分类命名为Sphingobiumwenxiniae JZ_1，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.1.7748，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年8月2日。
【具体实施方式】
[0048]实施例1.3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆(策略图见图1)
[0049]1.2细菌基因组总DNA的提取
[0050]菌株JZ-1 (Sphingobium sp.) (CGMCC N0.1.7748)大量培养后，采用高盐结合CTAB法提取高纯度、大片段的JZ-1的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8.0)中，置于_20°C保藏，具体方法参考F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。
[0051]1.3DNA样品寄送与检测
[0052]细菌基因组测序要求样品OD值在1.8-2.0之间，浓度越高越好，浓度不低于30ng/μ L，达到精细图至少需要样品量30微克。将准备好的足量的DNA样品在干冰保温下寄送至美吉生物科技。[0053]样品检测采用:1.浓度检测，琼脂糖凝胶电泳定量；2.0D260:280和0D260/230检测方法:NanoDrop。
[0054]1.4菌株基因组测序
[0055]DNA样品检测合格后建库，测序，并对数据进行基本分析(包括碱基识别、过滤接头序列、去污染)。然后进行后续生物信息分析，主要包括基因组序列组装、基因组成分分析、基因功能注释以及比较基因组分析等。
[0056]1.5测序片段组装与分析
[0057]运用SOAPdenovo组装软件对reads数据进行组装,得到scaffold序列并作相关基本数据统计。
[0058]1.6基因预测与功能注释
[0059]采用Glimmerf.0基因预测软件对组装结果进行基因de novo预测，并对预测的基因与数据库比对并进行功能注释。
[0060]基因注释主要基于蛋白序列比对。将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。由于每一条序列可能会有许多比对结果，这里为了保证其生物意义，我们保留一条比对效果最好的结果，作为此条基因的注释。所有的注释均使用BLAST软件结合各个数据库的特点完成。BLAST的版本为:blastall2.2.21，供注释的蛋白库为:KEGG、GO
坐寸ο
[0061]1.7菌株JZ-1全基因组信息和9个角度双加氧酶大亚基核酸序列的比对的比较
[0062]基因组测序结果，野生株JZ-1基因组大小为4766968bp，99个scaffold，通过denovo预测共4887个ORF ;突变株MJZ-1基因组大小为4641033bp，178个scaffold，通过denovo预测共4620个0RF。
[0063]米用0MIGA3.0将9个角度双加氧酶大亚基核酸序列(DxnAl, Sphingomonas sp.Rffl, 3426122;CarAa, Sphingomonas sp.CB3，AF060489;DfdAl,Terrabacter sp.YK3,22036072;DbfAl,Terrabacter sp.DBF63,AB054975;CarAal, Sphingomonassp.ΚΑΙ, 113473718;CarAa, Pseudomonas stutzeri 0M1, AB001723;CarAa, Janthinobacterium sp.J3,75765412;CarAa, Pseudomonas sp.CA10, 2317678;PobA, P.pseudoalcaligenesP0B310)与JZ-1 (CGMCC N0.1.7748)的全基因组信息比对，结果发现，野生菌株JZ-1基因组中有I个双加氧酶大小亚基和铁氧还蛋白基因，放在NCBI网上BlastP，比对结果发现双加氧酶大小亚基和Sphingomonas sp.RfflDxnAlA2同源性分别为66%和53%,铁氧还蛋白与DxnAlA2相配套的Fdxl无同源性,但与Sphingomonas sp.Rffl中的另一铁氧还蛋白同源性为59%，命名该双加氧酶大小亚基和铁氧还蛋白为PbaAaAbAc，氨基酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7 所示，相应的基因为 pbaAaAbAc。
[0064]实施例2双加氧酶基因pbaAaAbAc功能验证技术路线图(策略图见图2)
[0065]2.1菌株JZ-1基因组DNA提取
[0066]同 1.1
[0067]2.2包含pbaAaAbAc基因的4K核酸片段(见图4) PCR扩增
[0068]以引物 pbaF (SEQ ID N0.9)和 pba2R (SEQ ID N0.10)，用 PCR 从 SphingobiumJZ-1 (CGMCC N0.1.7748)基因组 DNA 中扩增 3.4K_pbaAaAbAc。(见图 4)
[0069]扩增体系:[0070]
【权利要求】
1.一个降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因PbaAaAbAcAd,其特征在于该基因由核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的大亚基基因pbaAa、SEQ ID N0.2所示的小亚基基因PbaAb、SEQ ID N0.3所示的电子传递体铁氧还蛋白基因pbaAc和SEQ ID N0.4所示的电子传递体还原酶基因PbaAd组成。
2.—个降解3-苯氧基苯甲酸和4-苯氧基苯甲酸的双加氧酶基因pbaAaAbAc,其特征在于该基因由核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示的大亚基基因pbaAa、SEQ ID N0.2所示的小亚基基因pbaAb和SEQ ID N0.3所示的电子传递体铁氧还蛋白基因pbaAc组成。
3.权利要求1所述的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd编码的蛋白质PbaAaAbAcAd,其特征在于氨基酸序列为 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8。
4.权利要求2所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc编码的蛋白质pbaAaAbAc,其特征在于氨基酸序列为 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7。
5.含有权利要求1或2所述的基因的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于将包含权利要求2所述的加氧酶基因pbaAaAbAc的核酸片段插入pBBRlMCS_2的HindIII和Sac I位点之间得到含有权利要求2所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组载体pBBRAaAbAc ;或者将包含权利要求2所述的加氧酶基因pbaAaAbAc的核酸片段插入pET29a(+)的NdeI和XhoI位点之间得到含有权利要求2所述的双加氧酶基因pbaAaAbAc的重组载体pETAaAbAc ;或者将包含权利要求1所述的SEQ ID N0.4所示的电子传递体pbaAd的核酸片段插入pBBRlMCS_5的HindIII和Sac I位点之间得到含有权利要求1所述的双加氧酶基因pbaAd的重组载体pBBRAd。
7.含有权利要求1或2所述的双加氧酶基因的基因工程菌，优选将权利要求5所述的重组表达载体导入宿主菌所得；进一步优选将权利要求6所述的重组载体pBBRAaAbAc导入Rffl所得，或者将权利要求6所述的重组载体pETAaAbAc和pBBRAd导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)所得。
8.权利要求1或2所述的双加氧酶基因在降解和/或转化3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸中的应用。
9.权利要求1或2所述的双加氧酶基因pbaAaAbAcAd在构建抗3_苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸转基因作物中的应用。
10.权利要求3所述的双加氧酶PbaAaAbAcAd在降解3_苯氧基苯甲酸和/或4_苯氧基苯甲酸中的应用，优选权利要求3所述的双加氧酶PbaAaAbAcAd在去除土壤、水体环境中3-苯氧基苯甲酸和/或4-苯氧基苯甲酸残留中的应用。
【文档编号】A62D101/28GK103981195SQ201310696034
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】何健, 王成红, 施超, 陈青, 李顺鹏 申请人:南京农业大学