使用量子点检测炎症的设备和方法

专利名称：使用量子点检测炎症的设备和方法
使用量子点检测炎症的设备和方法
背景技术：
炎症性肠病(IBD)包括两种慢性的、相关的炎性症状溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(⑶)。此外，非肠道的器官可能涉及IBD的隐伏炎症(underlying inflammation)，因此使得IBD成为多器官疾病。全世界多达四百万人(包括一百万美国人)遭受IBD形式。 仅仅在美国，IBD每年占大约152，000次住院治疗。在美国，用于照顾IBD患者的每年医疗费用估计超过二十亿美元。当评定生产力损失时，总经济负担估计为接近30亿美元。炎症性肠病是复杂的多因素的后遗症，其特征为局部组织结构的结构和功能严重紊乱以及嗜中性粒细胞和淋巴细胞及其它促炎细胞的存在增加。此外，作为炎症过程的结果，上皮、内皮、间充质、脂肪组织和神经细胞都可以显露出宽范围的损害。效应器、调整和免疫类功能与淋巴样细胞异常地相互作用，进一步助长炎性疾病的发病。心脏病、关节炎、 哮喘、过敏症、感染和糖尿病都具有慢性炎症的要素。炎性疾病的实例也包括但不限于中风 (stroke)、心血管疾病、急性冠状综合征、急性心肌梗塞、心包炎、牙周病、癌症、阿尔茨海默病和炎症性肠病。炎性疾病也可以影响多个器官系统，如在自身免疫性疾病中。炎症显著助长IBD急性期和慢性期的发病。IBD的诊断很少是直接的，其涉及宽泛过程的检查和侵入性测试，包括内窥镜检查期间的活组织检查。甚至使用这些专门研究，常常仍难以断定人患有何种类型的IBD，这导致“未确定型结肠炎(indeterminate colitis)，， 的诊断和使疾病处理更加困难。UC具有很大的发展为结肠直肠癌的风险，但仍难以与CD区分开来。由于与一般人群相比，UC特别与高35%的发展为结肠直肠癌的风险相关，所以使得合适的诊断是必须的，以良好地照顾患者。虽然对于IBD没有医学治愈，但其可得到有效的医学治疗，该治疗可以平息炎症并缓解腹泻、腹痛和直肠出血的症状。因为疾病本身往往表现出多次发作和缓解，所以连续监测患者是必须的，以提供必要的医学治疗，减少炎症并防止临床后遗症的发展。当前临床上应用的区分UC与CD的非侵入性测试基于血清中抗体如核周抗嗜中性细胞质抗体(P-ANCA)和抗酿酒酵母抗体(ASCA)的存在，并具有小于70%的特异性。大部分侵入性活组织检查被用于确定特定疾病的存在。因此，对于快速、成本有效且高度灵敏地量化炎性标志的技术存在未满足的需求。 这样的量化可以不仅导致不同的诊断，而且导致评估对炎性疾病中治疗的响应。更具体地， 对于能够区分非IBD症状与IBD症状、精确地区分UC与CD和监控疾病演变、缓解或复发的非侵入性诊断工具存在长期的需求。尤其是，对于这样的技术存在需求其测定低水平的炎性标志并利用该能力检测作为炎性疾病、炎性疾病的治疗响应和向癌症演变的预示物的这些标志。另外，需要提高量子点储存或诊断成像期间从量子点发出的荧光强度随时间的稳定性，以避免有价值信息的损失。

发明内容
本发明包括用于检测指示炎性病症的生物标志的设备。该设备具有毛细管、光源和检测系统，所述毛细管适合于一个或多个生物标志附着至其内表面，所述光源用于给与所述毛细管内生物标志缀合(conjugate)的量子点充能，所述检测系统用于检测和量化由量子点发出的在一个或多个预先确定的波长范围内的荧光能量，每个波长范围都与一个且有一个生物标志相关联。在所述设备的一个实施方式中，所述毛细管包括至少一种选自以下的材料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙酸乙烯酯和聚苯乙烯管。皮下针可以连接至毛细管的末端，以将样本供应给毛细管。所述毛细管可由玻璃毛细管外部支撑。在另一实施方式中，所述设备也包括流体操纵单元和机械定位系统，所述流体操纵单元适于支承多个毛细管，所述机械定位系统连续定位每个毛细管以使包含在其中的样本暴露于光源并且对所述检测系统可见。在另一实施方式中，所述毛细管的体积在大约100纳升至大约1微升的范围内。在所述设备的另一实施方式中，所述光源包括LED、激光二极管或者具有多个LED 或激光二极管的阵列。LED的一个或多个可以是紫外LED。所述光源可以进一步包括用于将所述一个或多个LED聚焦到毛细管上的透镜。在所述设备的另一实施方式中，所述检测系统包括宽带滤波器(宽带滤光器， broadband filter)。在仍另一实施方式中，所述检测系统包括光电探测器。光电探测器可以是分光计，其连接至光电倍增管、雪崩光电二极管检测器或CXD照相机的至少一个。所述检测系统可以包括镜子，其放置在毛细管的至少一部分的周围，用于增加由量子点发出的、 能够被光电探测器检测到的荧光能量的量。该镜子可以选自球面镜、柱面镜和抛物柱面镜。在所述设备的另一实施方式中，所述毛细管是体积小于大约1. 5微升的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)毛细管，其中所述光源包括紫外LED，并且其中所述检测系统包括CCD照相机。在仍另一实施方式中，所述检测系统包括用于将量子点发出的能量聚焦到CCD照相机上的球面镜。在一个变型中，所述光源的第一 LED被引导至毛细管的末端，并且CXD照相机检测通过毛细管壁发出的能量。另外，所述光源的第二 LED可以被引导至毛细管的另一末端。在另一变型中，所述光源的至少一个LED被放置在毛细管壁附近，并且CCD照相机检测通过毛细管末端发出的能量。在所述设备的另一实施方式中，所述生物标志选自髓过氧化物酶(MPO)、IL-I α、 TNFa、核周抗嗜中性细胞质抗体(p-ANCA)、抗-酿酒酵母抗体(ASCA)、血管紧张肽转变酶、 乳铁蛋白、C反应蛋白(CRP)和钙防卫蛋白。在另一实施方式中，所述设备进一步包括用于检测毛细管中包含的生物样本中的生物标志的组合物，其中所述组合物包括至少一种含有量子点和与生物标志特异性结合的抗体的缀合物。所述抗体可以结合至基底表面。本发明还包括通过检测样本中的生物标志诊断对象中的炎性病症的方法。所述方法包括将样本提供至包被有抗体的毛细管，所述样本潜在地包括指示炎性病症的生物标志；使样本接触包括量子点和与生物标志特异性结合的抗体的缀合物；用光源给所述量子点充能，检测来自所述量子点的荧光发射；以及使所述荧光发射与所述样本中的生物标志浓度相关联。在所述诊断方法的一个实施方式中，所述生物标志选自酶、黏附分子、细胞因子、 蛋白质、脂质介体、免疫反应介体和生长因子。
在所述方法的另一实施方式中，所述生物标志选自髓过氧化物酶(MPO)、IL-I α、 TNFa、核周抗嗜中性细胞质抗体(p-ANCA)、抗-酿酒酵母抗体(ASCA)、血管紧张肽转变酶、 乳铁蛋白、C反应蛋白(CRP)和钙防卫蛋白。在一个实施方式中，使用NaOH官能化所述毛细管。可选地，使用等离子体或紫外光官能化所述毛细管。在所述诊断方法的另一实施方式中，所述炎性病症包括选自以下的至少一种炎性疾病炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、中风(stroke)、心肌炎、心血管疾病、急性冠状综合征、急性心肌梗塞、心包炎、牙周病、癌症、阿耳茨海默病和自身免疫性疾病。本发明进一步包括随时间稳定量子点的荧光的方法，包括将量子点暴露于荧光稳定介质。在稳定化方法的一个实施方式中，荧光稳定介质是具有低离子强度的溶液。在稳定化方法的其它实施方式中，荧光稳定介质是PH值大于或等于大约7. 0或者 PH值大于或等于大约8. 0的溶液。在稳定化方法的另一实施方式中，荧光稳定介质包括水溶性自由基猝灭剂。在仍另一实施方式中，荧光稳定介质包括TrisPro和一定量的水溶性维生素E。在一个变型中， 维生素E的量为所述介质的至少大约0. 001%。在另一实施方式中，量子点每个包括Cdk核和ZnS保护层。附图简述为了阐述本发明，描述了本发明的一些实施方式的附图。但是，本发明并不限于附图中所描述的实施方式的精确安排和手段。

图1是如此示意图，其描述以波导管模式检测来自样本的量子点(QD)荧光的设备。图2是检测和诊断炎症性肠病的方法的总的流程图。图3是描述将QD缀合物与抗原结合的过程的示意图。图4是描述夹心量子联免疫吸附测定(sandwich Quantum-Linked Immunosorbent Assay (QLISA))过程的示意图。图5是描述竞争性QLISA过程的示意图。图6A和6B是如此示意图，其描述以波导管模式检测来自QD连接样本的荧光的设备。图7是使用中的图6B的设备的照片。图8是如此示意图，其描述通过以侧照明模式使样本暴露于LED光源而使样本发荧光的设备。图9是如此示意图，其描述通过以侧照明模式使样本暴露于聚焦的LED光源而使样本发荧光的设备。图10是如此示意图，其描述将图8或图9中设备的原始图像数据转化为处理过的图像，从该处理过的图像可获得强度信息。图IlA至IlD是描述检测来自QD连接样本的荧光的可选设备的示意图。图12是曲线图，其关联样本中生物标志(MPO)的浓度与荧光发射的强度。图13是曲线图，其关联MPO的浓度与荧光发射的强度以确定检测阈值。
图14是曲线图，其关联动物样本中MPO的浓度与荧光发射的强度，与对照样本对比。图15是本发明的实施方式中诊断方案的工艺流程图。图16A和16B是用于收集来自PMMA毛细管中QD的荧光信号的设备配置的示意图。图17A至17F是说明封闭(blocking)效果的毛细管的光学显微照片。图18A和18B是用DB-Ab处理以说明冲洗缓冲液中表面活性剂效果的PMMA毛细管的光学显微照片。图19A和19B显示本发明的QLISA方法的实施方式对MPO的灵敏度以及PMMA毛细管的代表性图像，其比较0. 3nM MPO样本与对照。图20是用本发明设备的侧照明配置和波导管配置获得的QD溶液的荧光强度的比较。图2IA至2IC比较通过侧照明获得的各种MPO浓度下的荧光强度。图22显示MPO-掺杂(spiked)的动物粪便样本的荧光强度。图23是显示来自与MMP-13非特异性结合的干扰的图。图M是比较病史(disease time line)和结合至量子点的MPO的荧光强度的图。图25是描述用于多个PMMA管的流体操纵单元的示意图。图沈是显示用于多个PMMA管的示例性流体操纵单元的照片。图27是如此示意图，其显示用于图25或图沈中流体操纵单元的容器的标号。图28A至28D是描述使用模具制造多个样本支承器(支架，holder)的图。图29A和29B是显示存储缓冲液随着时间期间对QD荧光强度和QD稳定性的作用的比较。图30显示掺杂乳铁蛋白的人粪便样本的荧光强度。图31是取样歧管的实施方式的示意图。图32是可拆卸的多个毛细管支承器的实施方式的示意图。图33A和3 显示用于稳定QD荧光强度的缓冲介质和水溶性维生素E的分子结构。图34A和34B是比较QD的荧光强度随时间的衰减作为分别不含维生素E和含有维生素E的溶液中的pH的函数的图。图35A和35B是比较QD的荧光强度随时间的衰减作为分别不含维生素E和含有维生素E的溶液中的pH的函数的图。图36A和36B是比较QD的荧光强度随时间的衰减分别作为对于Ocean Nanotech QD和hvitrogen QD，6. 5pH下维生素E浓度的函数的图。图37A和37B是比较QD的荧光强度随时间的衰减分别作为对于Ocean Nanotech QD和hvitrogen QD，7. 5pH下的维生素E浓度的函数的图。图38A和38B是比较QD的荧光强度随时间的衰减分别作为对于Ocean Nanotech QD和hvitrogen QD，8. 5pH下的维生素E浓度的函数的图。详细描述本发明公开了被报道的简单且廉价的基于量子点的免疫测定的研发，所述免疫测定用于检测生物样本中的髓过氧化物酶(MPO)。引入首字母缩略词QLISA来表示量子联免疫吸附测定。在优选的实施方式中，检测方法利用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微毛细管作为进行夹心测定的基底。，测试高功率(80mW)和低功率(IOmW)的UV-LED以波导管照明或侧照明模式最大化检测灵敏度的效率。本文讨论的结果指出波导管和侧照明模式均能够用于检测低至15ng/ml的MPO ；但是，使用侧照明模式的高功率LED出乎意料地增加灵敏度并使数据获得简单化。用掺杂有MPO的动物粪便样本评估传感器实施方式的测试方案和可靠性(robust)，结果显示，当在粪便样本中使用时，捕获和报道抗体的灵敏度并没有减弱。此外，评估环境的离子强度对量子点荧光稳定性的影响，并发现其影响测定，特别是如果需要长的成像时间的话。显著地，在成像期间用丙三醇或另一非极性或弱极性物质替换缓冲液使量子点的荧光强度增加，同时明显地使强度损失最小化，甚至在相对较短的两小时时间之后。一般而言，本发明涉及检测和量化指示炎性疾病特别是炎症性肠病的生物标志的设备和方法，其对区别非IBD症状和IBD症状以及区分UC与CD具有足够的灵敏度。根据本发明的设备容纳(支承)其中一个或多个生物标志已与量子点缀合的样本，并且提供用于给量子点充能的光源和用于检测和量化量子点的检测系统。使用根据本发明的设备的方法包括收集样本、使量子点与样本中的生物标志缀合、用光源给量子点充能、检测来自量子点的发射以及基于检测的发射和生物标志浓度之间的相关性确定样本中生物标志的浓度。在一个实施方式中，提供用于检测指示炎性病症的生物标志的设备。所述设备包括毛细管，其适合于一种或多种生物标志附着至其内表面。所述设备进一步包括光源和检测系统，所述光源用于给与毛细管内生物标志缀合的量子点充能，所述检测系统用于检测和量化由量子点发出的在一个或多个预先确定的波长范围内的荧光能量，每个波长范围都与一个且仅一个生物标志关联。在另一实施方式中，提供通过检测样本中的生物标志诊断炎性病症的方法。所述方法包括将样本提供至包被有抗体的毛细管，所述样本潜在地包括指示炎性病症的生物标志。所述方法进一步包括使样本接触包括量子点和与生物标志特异性结合的抗体的缀合物，用光源给所述量子点充能，检测来自所述量子点的荧光发射，以及使所述荧光发射与所述样本中的生物标志浓度相关联。作为快速鉴定和测量炎性疾病的生物化学和免疫标志的方法的一部分，图1显示了检测来自样本的QD荧光的设备。如图1所示的设备或者可选地如图6A-9、11A-11D和 16A-16B中所示的设备可被用在如图2中所一般性描述的诊断方法中，更具体地，可用在图 15中以检测包括但不限于炎症性肠病(IBD)的炎性疾病的存在以及例如用于诊断IBD是否特征为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)。用生物感测的纳米粒子定量评估炎症的方法被详细描述在共同转让的、于2007 年7月11日提交的PCT申请号PCT/US2007/015748中，该申请以其整体通过引用并入本文。 纳米粒子包括与靶向部分缀合的量子点，所述靶向部分与生物标志蛋白或编码生物标志的核酸特异性地结合，其中生物标志的失调(dysregulation)与炎性疾病相关。特别地，本文公开的方法使用与量子点缀合的单克隆抗体作为检测生物标志的纳米水平的工具。如本文所用，所述方法已被统称为“量子联免疫吸附测定(Quantum-Linked Immunosorbent Assay) ” (QLISA)，以区别于本领域已知技术酶联免疫吸附测定 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA))。如本文将说明的，QLISA方法优于ELISA。
本文描述的任何设备均可被提供为测试试剂盒，其包括单个测定——其具有定制的抗体包被的微柱和备用的试剂——用于快速且简单的检测。测定可以包括MP0、IL-la、 TNFa、钙防卫蛋白、乳铁蛋白、纤连蛋白、ASCAm p_ANCA和/或其它标志，特别是作为各种形式IBD的指示剂的、可见于粪便样本中的那些。设备和方法可以适于在皮摩尔或纳摩尔浓度下顺次检测单个标志或同时检测多个标志。测试试剂盒适于使用QLISA即量子点固定和荧光来测量生物学样本(例如流体和粪便样本)中的炎性生物标志。测试试剂盒可被用在医生的办公室里作为护理筛查设备(care screening device)的一个点(point)，或作为在诊断实验室中进行的一组测试的一部分。本方法基于使用可得到的生物标志(髓过氧化物酶-MP0、p-ANCA、ASCA)的组合， 以导致炎症性肠病(IBD)和炎症性肠综合征(IBS)的区别诊断以及区分溃疡性结肠炎(UC) 和克罗恩病(⑶)。定义如本文所用，以下术语的每一个都具有与该章节中的术语相关的意义。冠词“一个(a) ”和“一个(an) ”指一个或多于一个(即至少为一个)所述冠词的语法对象。例如，“一个要素(an element)”指一个要素或多于一个要素。本领域普通技术人员理解术语“大约(about)，，和“大约(approximately)，，并且其可以根据其使用的语境在一定程度上变化。术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其能够特异性地与抗原上的特异性表位结合。抗体可以是从自然源或从重组源获得的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(胞内抗体(intrab0dies))、FV、Fab和 F(ab)2以及单链抗体(scFv)、骆驼科动物抗体(camelid antibodies)和人源化抗体。“抗原”或“Ag”指刺激免疫反应的分子。这种免疫反应可以包括抗体生成或特异性的免疫活性细胞的活化，或二者兼有。技术人员理解任何高分子——基本上包括所有蛋白质或肽，可用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员理解，任何DNA， 包括编码引起免疫反应的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因而编码“抗原”，如该术语在本文所用的。进而，技术人员理解，抗原不需要仅被基因的全部长度的核苷酸序列编码。很明显，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，这些核苷酸序列被安排为各种组合以引发期望的免疫反应。而且，技术人员理解，抗原完全不需要被“基因”编码。很明显，抗原可合成生成或可以从生物样本中获得。这样的生物样本可以包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物流体。“生物样本”指包含从生物标志表达可被检测到的生物中获得的细胞、组织或体液的任何样本。这样的生物样本的实例包括从人类患者获得的“体样本(body sample)”。“体样本”包括但不限于血液、淋巴、尿液、妇科流体、活组织检查、羊水、大便样本 (stool sample)、粪便样本(fecal sample)和涂片。天然是液体的样本在本文中指“体液”。 可以从患者通过各种技术取得体样本，所述技术包括例如通过刮擦或棉拭一个区域或通过使用针吸出体液。收集各种体样本的方法在本领域是熟知的。术语“失调(dysregulation) ”指生物标志的过表达或低表达，该生物标志在从推定处于风险中的个体获得的生物样本中存在并被检测，然后与从一个或多个正常的、不处于风险中个体获得的样本中的生物标志进行比较。在一些情况中，生物标志表达的水平与从超过一个不处于风险中的个体获得的平均值进行比较。在其它情况中，生物标志表达的水平与从一个正常的、不处于风险中的样本获得的样本中估算的生物标志水平进行比较。 在仍另一情况中，在推定处于风险中的个体中的生物标志表达水平与从同一个体上不同时间获得的样本中的生物标志水平比较。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并指由通过肽键共价相连的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含至少两个氨基酸，对可以构成蛋白质序列或肽序列的氨基酸的最大数量并没有限制。多肽包括任何包含通过肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语同时指，短链——本领域一般称为例如肽、寡肽和寡聚体，以及较长链——本领域一般称为蛋白质，其具有许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本同源多肽、寡肽、同型二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物，融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。术语“量子点”(QD)指半导体纳米结构，其限制了导带电子、价带空穴或激发子 (导带电子和价带空穴的结合对(bound pairs))在所有的三维空间方向上的移动。限制可能是由于静电电位(由外部电极、掺杂、应变、杂质产生)、不同半导体材料间的界面(如在核-壳型纳米晶体系统)的存在、半导体表面(如半导体纳米晶体)的存在、或这些的组合。量子点具有离散的量子化的能量谱。相应的波函数在空间上位于量子点内部，但延伸超出晶格的许多周期。量子点包含少量的(数量级为1-100)导带电子、价带空穴或激发子， 即少量的元电荷(elementary electric charges)。小的激子量子点的可被肉眼立即查知的一个光学特征是着色。虽然构成量子点的材料限定了它的内部能量特征(signature)，但就着色而言更重要的是尺寸。点越大，荧光越红(越朝向光谱的红端)。点越小，荧光越蓝 (越朝向光谱的蓝端)。着色直接与量子点的能量水平相关。定量地讲，决定荧光能量(且因此颜色)的带隙能量与量子点尺寸的平方成反比。术语“缀合”指将一个分子物理或化学附连到第二个分子。术语“特异性结合”指一种分子如抗体的活动，其识别并结合到细胞表面分子或特征上，但基本上不会识别或结合到样本中其它分子或特征上。术语“变体”指核酸序列或肽序列，其与参比核酸序列或肽序列在序列上分别不同，但保留了参比分子的基本性质。核酸变体序列的变化可以不改变由参比核酸编码的肽的氨基酸序列，或可以导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。肽变体序列的改变一般是受限制的或保守的，所以参比肽和变体的序列接近全部相似，并且在许多区域是相同的。通过一种或多种任何组合的取代、添加、缺失，变体和参比肽可以在氨基酸序列上不同。核酸或肽的变体可以是天然发生的如等位变体，或可以是不知道天然发生的变体。非天然发生的核酸和肽的变体可以通过诱变技术或直接合成得以产生。术语“炎性病症”一般指哺乳动物中最初的有益的免疫反应后继续存在的炎症。炎性病症包括但不限于慢性创伤、关节炎、动脉粥样硬化和炎性疾病如自身免疫性疾病、中风、心血管疾病、急性冠状综合征、急性心肌梗塞、心包炎、牙周病、就其与炎性疾病结合而言的癌症、阿耳茨海默病和炎症性肠病。“生物标志”指任何基因、蛋白质、或代谢物，其在组织、细胞或体液中的表达水平与正常或健康的细胞、组织或生物流体中的表达水平相比是失调的。在一个实施方式中，待依据本发明方法测量的生物标志选择性地响应个体中炎性疾病的存在和发展。“选择性地响应炎性疾病的存在和发展”，意指所关注的生物标志响应个体中炎性疾病的发作和随后的发展而特异性地过表达或低表达。该生物标志在其它疾病过程或者不被认为是临床疾病的其它病症过程期间并不失调。因此，在本发明方法中，测量生物标志的水平允许区分从具有炎性疾病的个体和不具有炎性疾病的个体收集的样本。与疾病相关联的牛物标志可以设计特异性生物标志以与特异性疾病相关。疾病特异性生物标志是这样的生物标志，其响应特定疾病而失调，但在其它疾病过程或不被认为是临床疾病的其它病症过程期间不失调。为了利用生物标志和疾病之间的疾病特异性关联，可以使用依据本发明的设备和方法检测特定的生物标志，并且该特定的生物标志可以与其各自相关疾病相关联， 以指示疾病的存在。特别地，通过使用与疾病如IBD、UC、或CD相关的疾病特异性生物标志， 可检测这些特异性炎性疾病的一种。在一个实施方式中，待被测量的生物标志选择性地响应个体中炎性疾病的存在和发展，意味着所关注的生物标志响应个体中炎性疾病的发作和随后的发展而特异性地过表达或低表达。本文公开的方法中测量疾病特异性生物标志的水平允许区分从具有炎性疾病的个体和不具有炎性疾病的个体收集的样本，以及区分患有UC的个体和患有CD的个体。在本发明的一个方面，炎症性肠病是溃疡性结肠炎。在本发明的另一方面，炎症性肠病是克罗恩病。此外，通过在本发明方法中测量生物标志水平，从业者能够辨别不同形式的IBD，尤其是UC与CD。根据本发明可被测量的生物标志包括蛋白质和变体以及其片段，其在炎性疾病期间表现为失调。应当考虑，在本发明中有用的生物标志核酸包括含有编码所述生物标志的任何核酸序列的整个序列或部分序列、或者这样序列的互补序列的DNA和RNA。类似地，生物标志蛋白应当被考虑为包括任何生物标志蛋白或多肽的整个或部分氨基酸序列。作为非限制性实例，从患有IBD的患者获得的血清学样本——其对于核周抗嗜中性细胞质抗体(PANCA)是阳性的，但对于抗-酿酒酵母抗体(ASCA)是阴性的——指示溃疡性结肠炎，而对ASCA是阳性但对pANCA是阴性的血清学样本指示克罗恩病。在本发明中有用的生物标志包括髓过氧化物酶(MPO)、IL-Ia和TNF a。在本发明中有用的其它生物标志包括但不限于核周抗嗜中性细胞质抗体(p-ANCA)、抗-酿酒酵母抗体(ASCA)、血管紧张肽转变酶、乳铁蛋白、C反应蛋白、纤连蛋白、乳铁蛋白和钙防卫蛋白。另外的生物标志可以包括酶、黏附分子、细胞因子、蛋白质、脂质介体和生长因子。在一个实施方式中，本发明的生物标志的生物学活性是生物标志以可预期方式对 IBD的发作和发展响应的能力。一方面，生物标志响应UC的发作和发展。另一方面，生物标志响应CD的发作和发展。尽管本发明的方法要求检测体样本中的至少一种生物标志，但是两种或更多种生物标志也可用于实施本发明的方法。因此，在一个实施方式中，使用两种或更多种生物标志。在本发明的一个方面，使用两种或更多种补充的生物标志。通过使不同尺寸的量子点与不同的相应生物标志缀合以便通过与量子点的每个尺寸相关的不同波长发射能够检测每种生物标志，可以完成多种生物标志的同时检测。当用于指本文的生物标志时，术语“补充的(complementary) ”意欲指，体样本中生物标志组合的检测使得成功鉴定患有炎性疾病的患者比仅使用一种生物标志进行鉴定有更高百分比。在本发明的一个实施方式中，可以使用两种生物标志以比当仅使用一种生物标志时更精确地鉴定患有IBD的患者。在本发明的一个方面，可以使用两种或更多种生物标志以诊断溃疡性结肠炎。在本发明的另一方面，使用两种或更多种生物标志以鉴定患有克罗恩病的患者。因此，在使用至少两种生物标志时，将使用涉及区分生物标志蛋白的至少两种抗体实施本文公开的免疫细胞化学法。抗体可以与体样本同时接触或顺序接触。可以在任何诊断患有炎症性肠病或处于发展为炎症性肠病的风险的对象中实施本发明。优选地，所述对象是哺乳动物，更优选地，所述对象是人。QD缀合物与牛物标志的结合测量样本中生物标志浓度的一个方法是将QD与生物标志缀合，然后通过荧光检测和量化QD的存在。将QD与生物标志缀合可以通过将QD与中间物如靶向部分缀合来完成，基于中间物与所关注的生物标志特异性结合的能力选择中间物。QD缀合物包括通过其荧光性能可检测到的至少一种量子点(即半导体纳米晶体)。量子点是体外和体内生物分子的超敏感非同位素报道分子。由于其大的量子产额和耐光性，QD是对生物分子有吸引力的荧光标记(fluorescent tags)。因此，QD克服了用作传统荧光团的有机染料的许多固有限制。直径范围在2nm至IOnm的QD包含大约500-1000 个原子的材料如镉和硒，并且荧光具有宽吸收光谱和窄发射光谱。包括核、盖(cap)和亲水性连接基团的水溶性发光QD在本领域中是熟知的且是商业上可得的(例如，Quantum Dot Corp. Hayward, CA ；Invitrogen, Carlsbad, CA ；美国专利号7，192，785 ；美国专利号6，815，064)。核包括纳米粒子尺寸的半导体。虽然可以使用IIB VIB, IIIB VB或IVB-IVB半导体的任何核，但是核必须是如此的在与盖结合后发光。盖或壳是不同于核的半导体的半导体，并与核结合，从而在核上形成表面层。盖必须是如此的在与给定的半导体核结合后发光。两种最广泛使用的商业QD是Cdk或CdTe 核与ZnS壳，并在405nm至805nm范围内发射。连接基团指能够例如通过任何稳定的物理或化学联系被连接至QD的盖的表面的任何有机基团。在一个实施方式中，连接基团可以使QD成为水溶性的而不会使QD不再发光。因此，连接基团包括亲水部分。一方面，可以通过共价键合将连接基团连接至盖，并且以暴露亲水部分的方式将连接基团连接至盖。合适的亲水连接基团包括例如羧酸或其盐、 磺酸或其盐、氨基磺酸或其盐、氨基取代基、季铵盐和羟基。另一方面，通过用聚合物层包覆壳，可以使QD成为水溶性的，所述聚合物层在面向壳的内侧含有疏水链段而面向外侧含有亲水链段。亲水层可以被改性以包括官能团如-COOH和-NH2基团，以进一步缀合至蛋白质和抗体或寡核苷酸，如以其整体通过引用并入本文的Chan和Nie，1998，(Science 281 2016-8)，Igor 等，2005，(Nature Materials 4 :435-46)，Alivisatos 等，2005，(Annu. Rev. Biomed. Eng. 7 :55-76)以及 Jaiswal 等，2003，(Nature Biotech. 21 :47-51)中所述。QD可以缀合至靶向部分。靶向部分与所关注的生物标志特异性结合，并且可以包括抗体、模拟肽(P印tidomimetic)、多肽或适配体、核酸或任何其他分子，条件是其与所关注的生物标志特异性结合。当靶向部分包括抗体时，抗体优选地与在炎性疾病发作和发展期间失调的生物标志特异性结合。在一个实施方式中，抗体与由于炎症性肠病发作和发展而失调的生物标志特异性结合。在另一实施方式中，抗体与由于溃疡性结肠炎发作和发展而失调的生物标志特异性结合。在仍另一实施方式中，抗体与在克罗恩病发作和发展期间失调的生物标志特异性结合。本发明中所关注的生物标志包括但不限于MPO或涉及炎症的细胞因子如IL-Ia或TNFa。在另一实施方式中，QD可以缀合至包括核酸结合部分的靶向部分。核酸结合部分可以包括与核酸结合的任何核酸、蛋白质或肽，如DNA结合蛋白。优选的核酸是单链寡核苷酸，其包括主干(stem)和环状结构，并且亲水连接基团连接至单链寡核苷酸的一个末端。抗体或核酸可以例如通过任何稳定的物理或化学联系、通过任何合适的方式直接或间接连接至QD。可以通过多种策略完成量子点缀合，所述策略包括但不限于被动吸附、 多价螯合或典型的共价键形成，其描述在通过引入并入本文的Jaiswal等，2003 (Nature Biotechnol. 21 :47-51)中。共价键形成在实施中是最简单的，因此广泛用于缀合。抗体或核酸直接或间接通过一个或多个共价键连接至连接基团。如果抗体为间接连接，那么优选通过“连接体 (linker)，，的方式进行连接，即，能够用于将抗体或核酸连接至水溶性QD的连接基团的任何合适的方式。连接体不应使水溶性QD变成水不溶性QD，并且不应不利地影响QD的发光。同样，连接体不应不利地影响所连接的抗体或核酸的功能。如果缀合物在体内应用， 那么期望连接体是生物上相容的。可以使用交联剂如中间体交联剂将抗体连接至QD的连接基团。乙基-3-( 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)是中间体交联剂的一个例子。 用于本发明的中间体交联剂的其它实例在本领域中是已知的。参见例如Bioconjugate Techniques(Academic Press, New York, (1996))。在一个实施方式中，用含有马来酰亚胺基(malemide group)的交联剂分子处理 QD上的胺基。这些“活化的” QD然后可以与整个抗体分子直接缀合。但是，直接缀合可导致位阻，限制抗体接近所关注的抗原。在短连接体可以引起位阻问题或以其他方式影响靶向部分官能化的那些情况中，可以例如通过使用本领域熟知的过程，添加大约10至大约20 个原子的间隔物，增加连接体的长度。一种可能的连接体是活化聚乙二醇，其是亲水的并且广泛用于制备带标记的寡核苷酸。链霉抗生物素生物素反应提供另一缀合方法，其中生物素化蛋白质/生物分子连接至链霉抗生物素包被的QD。本领域技术人员将理解，检测生物样本中多于一种所关注的抗原或蛋白质是可期望的。因此，在特定实施方式中，使用针对两种不同抗原或蛋白质的至少两种抗体。当使用多于一种抗体时，可将这些抗体作为单个抗体试剂顺序添加至单个样本或作为抗体混合物同时添加至单个样本。可选地，每个个体抗体可以被添加至来自相同源的分离样本，并将得到的数据汇合。使用异双官能(heterobiofunctional)交联剂4_(马来酰亚胺基甲基)_1_环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)将量子点缀合至抗体片段。商业量子点anvitrogen Corporation, Carlsbad, CA)在其表面上带有-NH2基团。这些氨基与交联剂SMCC反应在 QD表面上产生马来酰亚胺基(malemide groups)。所关注的抗体被DTT (二硫苏糖醇)还原，二硫键被破坏以产生巯基(-SH)。最终的缀合物依赖于活化QD上的马来酰亚胺基和抗体上的巯基之间形成的共价键。抗体缀合至QD的比例是1 4，在缀合过程结束时反应的典型产量是500 μ 1到800 μ 1之间的任何量。表I提供使用以上列出的过程缀合至抗体的QD的列表表1 缀合至各种抗体的不同颜色QD
权利要求
1.用于检测指示炎性病症的生物标志的设备，所述设备包括毛细管，其适合于一个或多个生物标志附着至其内表面；光源，其用于给与所述毛细管内的生物标志缀合的量子点充能；和检测系统，其用于检测和量化由所述量子点发出的在一个或多个预先确定的波长范围内的荧光能量，每个波长范围都与一个且仅一个所述生物标志相关联。
2.根据权利要求1所述的设备，其中所述毛细管包括透明的聚合物材料。
3.根据权利要求1所述的设备，其中所述毛细管包括至少一种选自以下的材料聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙酸乙烯酯、聚碳酸酯和聚苯乙烯。
4.根据权利要求3所述的设备，进一步包括用于供应样本至所述毛细管的、与所述毛细管的末端连接的皮下针。
5.根据权利要求3所述的设备，其中所述毛细管由玻璃毛细管进行外部支撑。
6.根据权利要求3所述的设备，其中所述毛细管由不锈钢毛细管进行外部支撑。
7.根据权利要求1所述的设备，进一步包括流体操纵单元和机械定位系统，所述流体操纵单元适于支承多个毛细管，所述机械定位系统连续定位每个毛细管以确保包含在其中的样本暴露于所述光源并且对所述检测系统可见。
8.根据权利要求1所述的设备，其中所述毛细管具有约100纳升到约1微升范围内的体积。
9.根据权利要求1所述的设备，其中所述光源包括LED。
10.根据权利要求9所述的设备，其中所述LED是紫外LED。
11.根据权利要求9所述的设备，其中所述光源包括具有多个LED的阵列。
12.根据权利要求9所述的设备，其中所述光源进一步包括用于将所述LED聚焦到所述毛细管上的透镜。
13.根据权利要求1所述的设备，其中所述光源包括一个或多个激光二极管。
14.根据权利要求1所述的设备，其中所述检测系统包括宽带滤波器。
15.根据权利要求1所述的设备，其中所述检测系统包括光电探测器。
16.根据权利要求15所述的设备，其中所述光电探测器是与至少一个光电倍增管连接的分光计。
17.根据权利要求15所述的设备，其中所述光电探测器是CCD照相机。
18.根据权利要求15所述的设备，其中所述光电探测器是雪崩光电二极管检测器。
19.根据权利要求15所述的设备，其中所述检测系统进一步包括用于将光从所述毛细管传输到所述光电探测器的光纤。
20.根据权利要求15所述的设备，其中所述检测系统包括镜子，其放置在所述毛细管的至少一部分的周围，用于增加由所述量子点发出的、能够被所述光电探测器检测到的荧光能量的量。
21.根据权利要求20所述的设备，其中所述镜子选自球面镜、柱面镜和抛物柱面镜。
22.根据权利要求1所述的设备，其中所述毛细管是具有体积小于大约1.5微升的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)毛细管；其中所述光源包括紫外LED ；并且其中所述检测系统包括 C⑶照相机。
23.根据权利要求22所述的设备，其中所述检测系统进一步包括用于将所述量子点发出的能量聚焦到所述CCD照相机的球面镜。
24.根据权利要求22所述的设备，其中所述光源的第一LED导向所述毛细管的末端，并且其中所述CCD照相机检测通过所述毛细管的壁发出的能量。
25.根据权利要求M所述的设备，进一步包含导向所述毛细管的另一端的所述光源的第二 LED。
26.根据权利要求22所述的设备，其中所述光源的至少一个LED被放置在所述毛细管的壁附近，并且其中所述CCD照相机检测通过毛细管的末端发出的能量。
27.根据权利要求1所述的设备，其中所述生物标志选自髓过氧化物酶(MPO)、 IL-I α ,TNFa、核周抗嗜中性细胞质抗体(p_ANCA)、抗-酿酒酵母抗体(ASCA)、血管紧张肽转变酶、乳铁蛋白、C反应蛋白(CRP)和钙防卫蛋白。
28.根据权利要求1所述的设备，其进一步包括用于检测所述毛细管中包含的生物样本中的生物标志的组合物，其中所述组合物包括至少一种含有量子点和与生物标志特异性结合的抗体的缀合物。
29.根据权利要求观所述的设备，其中所述抗体结合至基底表面。
30.根据权利要求1所述的设备，其中使用NaOH官能化所述毛细管。
31.根据权利要求1所述的设备，其中使用等离子体官能化所述毛细管。
32.根据权利要求1所述的设备，其中使用紫外光官能化所述毛细管。
33.通过检测样本中的生物标志诊断对象中的炎性病症的方法，所述方法包括将样本提供至包被有抗体的毛细管，所述样本潜在地包括指示所述炎性病症的生物标志；使所述样本接触包括量子点和与所述生物标志特异性结合的抗体的缀合物；用光源给所述量子点充能；检测来自所述量子点的荧光发射；和使所述荧光发射与所述样本中的生物标志浓度相关联。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述生物标志选自酶、黏附分子、细胞因子、蛋白质、脂质介体、免疫反应介体和生长因子。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述生物标志选自髓过氧化物酶(MPO)、 IL-I a ,TNFa、核周抗嗜中性细胞质抗体(p_ANCA)、抗-酿酒酵母抗体(ASCA)、血管紧张肽转变酶、乳铁蛋白、C反应蛋白(CRP)和钙防卫蛋白。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述炎性病症包括选自以下的至少一种炎性疾病炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、中风、心肌炎、心血管疾病、急性冠状综合征、急性心肌梗塞、心包炎、牙周病、癌症、阿耳茨海默病和自身免疫性疾病。
37.随时间稳定量子点的荧光的方法，包括将所述量子点暴露于荧光稳定介质。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述荧光稳定介质是具有低离子强度的溶液。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述荧光稳定介质是pH值大于或等于大约7.0 的溶液。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述溶液的pH值大于或等于大约8.0。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述荧光稳定介质包括水溶性自由基猝灭剂。
42.根据权利要求37所述的方法，其中所述荧光稳定介质包括TrisPro和一定量的水溶性维生素E。
43.根据权利要求41所述的方法，其中维生素E的量是所述介质的至少约0.001%。
44.根据权利要求37所述的方法，其中所述量子点每个均包括Cdk核和ZnS保护层<
全文摘要
用于检测指示炎性病症的生物标志的设备和方法，包括毛细管、光源和检测系统，所述毛细管适合于一个或多个生物标志附着至其内表面，所述光源用于给与所述毛细管内生物标志缀合的量子点充能，所述检测系统用于检测和量化由量子点发出的在一个或多个预先确定的波长范围内的荧光能量，每个波长范围都与一个且仅一个生物标志相关联。也公开了用于稳定化量子点的荧光强度的方法。
文档编号B32B5/16GK102361748SQ201080013650
公开日2012年2月22日 申请日期2010年1月22日 优先权日2009年1月23日
发明者E·S·帕帕祖格洛, N·S·巴布, S·S·莫哈帕特拉, S·谬塞 申请人:德雷克塞尔大学, 费城健康及教育公司