用于制造组织的装置、系统和方法

专利名称：用于制造组织的装置、系统和方法
用于制造组织的装置、系统和方法
交叉引用本申请要求提交于2010年10月21日的第61/405，582号美国临时申请的权益，其通过引用全文并入。
背景技术：
医疗保健行业面临着许多紧迫的问题。截至2009年12月，有105，305名患者由器官共享联合网络(UNOS)登记为需要器官移植。2009年一月到九月，仅进行了 21，423例移植。每年添加到UNOS名单上的患者比进行移植的更多，导致等待移植的患者数目净增加。例如，在2008年初，有75，834人登记为需要肾；在那一年年底，该数字已增长到80，972人。那一年进行了 16，546例肾移植，但名单上增加了 33，005名新患者。2008年，由UNOS登记为需要肾的患者的移植率为20%。等待名单上的患者的死亡率为7%。此外，新药物化合物的研究和开发成本大约为18亿美元。参见Paul等人(2010).How to improve R&D productivity:the pharmaceutical industry' s grandchallenge.Nature Reviews Drug Discovery 9(3):203_214。药物研发是发现和 / 或设计药物的过程。药物研发的过程通常至少包括以下步骤:候选药物的识别、合成、表征、筛选和治疗效果的分析。尽管技术和对生物系统的理解在进步，但药物研发仍然是一个漫长而昂贵的低效率过程，且新治疗发现出现的几率较低。

发明内容
为了缓解对组织和器官的迫切需求，对于促进再生医学和组织工程技术的应用的工具和技术存在需求。对于大幅增加创新的、有成本效益的新医学产品的数量和质量且不会招致无法承受的研发成本的工具和技术，也存在需求。因此，发明人在本文中描述了用于制造组织和器官的装置、系 统和方法。本文描述了生物打印机，其包含:一个或多个打印机头，其中打印机头包含接收和夹持至少一个墨盒的手段(means)，并且其中所述墨盒包含选自以下一种或多种的内容物:生物墨水和支撑材料；用于校准至少一个墨盒的位置的手段；和用于分配至少一个墨盒的内容物的手段。在一个实施方案中，本文描述的打印机头包含用于接收和夹持一个墨盒的手段。在另一实施方案中，本文描述的打印机头包含用于接收和夹持超过一个墨盒的手段。在另一实施方案中，生物打印机进一步包含打印机台。在另一实施方案中，用于接收和夹持至少一个墨盒的手段选自:磁力吸引、筒夹夹头夹具(collet chuck grip)、套圈、螺母、筒接合器或其组合。在又一实施方案中，用于接收和夹持至少一个墨盒的手段是筒夹夹头夹具。在又一实施方案中，用于校准至少一个墨盒的位置的手段选自:激光准直、光学准直、机械准直、压电准直、磁力准直、电场或电容准直、超声准直或其组合。在又一实施方案中，用于校准至少一个墨盒的位置的手段是激光准直。在另一实施方案中，用于分配至少一个墨盒的内容物的手段是应用活塞、应用压力、应用压缩气体、液压技术或其组合。在又一实施方案中，用于分配至少一个墨盒的内容物的手段是应用活塞。在又一实施方案中，活塞的直径小于墨盒的直径。在另一实施方案中，生物打印机进一步包含用于调节温度的手段。在又一实施方案中，生物打印机进一步包含用于调节环境温度、墨盒温度、墨盒内容物温度、接收表面温度或其组合的手段。在又一实施方案中，用于调节温度的手段是加热元件。在又一实施方案中，用于调节温度的手段是加热器。在又一实施方案中，用于调节温度的手段是辐射加热器、对流加热器、传导加热器、风扇加热器、热交换器或其组合。在又一实施方案中，用于调节温度的手段是冷却元件。在又一实施方案中，用于调节温度的手段是冷却剂容器、冷冻液、冰、辐射冷却器、对流冷却器、传导冷却器、风扇冷却器或其组合。在又一实施方案中，将温度调节为约40°C至约90°C。在又一实施方案中，将温度调节为约0°C至约10°C。在另一实施方案中，本文公开的生物打印机进一步包含用于向以下一种或多种应用润湿剂的手段:打印机台；接收表面、沉积孔口、生物墨水、支撑材料或打印的构建体。本文还公开了校准包含沉积孔口的墨盒的位置的方法,其中墨盒接附在生物打印机上，该方法包括:沿至少一个轴校准墨盒位置；其中所述轴选自X轴、y轴和Z轴；并且其中利用激光进行各校准。在一个实施方案中，该方法包括激发激光并生成至少一道基本稳定和/或基本静止的激光束，并且其中所述激光束与地面平行。在另一实施方案中，该方法包括激发激光并生成至少一道基本稳定和/或基本静止的激光束，并且其中所述激光束与地面垂直。在又一实施方案中，利用第一和第二激光进行各校准。在又一实施方案中，第一激光与地面垂直，而第二激光与地面平行。在另一实施方案中，利用水平激光沿y轴校准墨盒位置包括:定位墨盒，使得墨盒(i)位于第一 y卦限且(ii)分配孔口低于激光束的上阈限；(a)向激光束移动墨盒，并且在激光束被墨盒中断时立即停止所述移动，其中激光束被墨盒中断的位置是第一 I位置；(b)重新定位墨盒，使得墨盒位于第二 y卦限，并且分配孔口低于激光束的上阈限；(C)向激光束移动墨盒，并且在激光束被墨盒中断时立即停止所述移动，其中激光束被中断的位置是第二 y位置；(d)并计算第一 y位置和第二 y位置之间的中点。在另一实施方案中，利用水平激光沿X轴校准墨盒位置包括:(a)将墨盒定位(i)在第一 y位置和第二 y位置之间的中点，且(ii)在激光的传感器阀限(threshold)以外；(b)向传感器阀限移动墨盒，并且在墨盒接触传感器阀限时立即停止所述移动；(c)其中墨盒接触传感器的位置加上半个墨盒宽度为X位置。在另一实施方案中，利用水平激光沿z轴校准墨盒位置包括:(a)定位墨盒，使得分配孔口位于激光束上方；(b)向激光束移动墨盒，并且在激光束被墨盒中断时立即停止所述移动，其中激光束被中断的位置是z位置。在另一实施方案中，利用垂直激光沿y轴校准墨盒的位置包括:(a)定位墨盒，使得墨盒(i)位于第一y卦限且(ii)分配孔口在激光束的传感器阀限以外；(b)向激光束移动墨盒，并且在激光束被墨盒中断时立即停止所述移动，其中激光束被墨盒中断的位置是第一 y位置；(c)重新定位墨盒，使得墨盒位于第二 y卦限且分配孔口在激光束的传感器阀限以外；(d)向激光束移动墨盒，并且在激光束被墨盒中断时立即停止所述移动，其中激光束被中断的位置是第二 I位置；(e)计算第一 y位置和第二 y位置之间的中点；和(f)任选地，重复(a)-(e)并对计算的中点取平均值。在另一实施方案中，利用垂直激光沿X轴校准墨盒位置包括:(a)定位墨盒，使得墨盒(i)位于第一 X卦限且(ii)分配孔口在激光束的传感器阀限以外；(b)向激光束移动墨盒，并且在激光束被墨盒中断时立即停止所述移动，其中激光束被墨盒中断的位置是第一 X位置；(c)重新定位墨盒，使得墨盒位于第二 X卦限且分配孔口在激光束的传感器阀 限以外；(d)向激光束移动墨盒，并且在激光束被墨盒中断时立即停止所述移动，其中激光束被中断的位置是第二 X位置；(e)计算第一 X位置和第二 X位置之间的中点；和(f)任选地，重复(a)-(e)并对计算的中点取平均值。在另一实施方案中，利用垂直激光沿z轴校准墨盒位置包括:(a)定位打印机头，使得分配孔口位于激光束上方并在激光传感器范围阀限以外；(b)沿z轴移动打印机头，达到传感器阀限；其中，z位置是达到激光传感器阀限的位置；和任选地，重复步骤(a)和(b)并计算平均z位置。在另一实施方案中，沿z轴校准墨盒位置包括:目测确定分配孔口的位置。本文进一步描述了用于校准包含分配孔口的墨盒的位置的系统，其中该墨盒接附在生物打印机上，所述系统包含:用于沿至少一个轴校准墨盒位置的手段，并且其中所述轴选自y轴、X轴和z轴。在一个实施方案中，用于校准墨盒的手段是激光准直、光学准直、机械准直、压电准直、磁力准直、电场或电容准直、超声准直或其组合。在另一实施方案中，用于校准墨盒的手段是激光准直。在又一实施方案中，激光准直手段包括选自水平激光和垂直激光的至少一道激光。在又一实施方案中，激光准直手段包括水平激光和垂直激光。在又一实施方案中，将激光准直手段精确到垂直轴上±40 μ m和水平轴上±20 μ m。本文进一步描述了用于制造组织构建体的方法，其包括:计算机模块接收期望的组织构建体的视觉表示(visual representation)的输入；计算机模块生成一系列命令，其中该命令基于该视觉表示且可被生物打印机读取；计算机模块将该系列命令提供给生物打印机；和生物打印机按照该命令沉积生物墨水和支撑材料，以形成具有限定几何形状的构建体。在一些实施方案中，计算机模块包含显示屏。在进一步的实施方案中，计算机模块包含图形用户界面(GUI)。在更进一步的实施方案中，用户使用由计算机模块提供的GUI来限定一个或多个对象的内容，以形成期望的组织构建体的视觉表示。在一个实施方案中，显示屏基本上由包含多个形状基本相同且大小基本相等的对象的网格组成。在又一实施方案中，各个对象的形状是圆形的。在又一实施方案中，用户限定一个或多个对象的内容，以形成期望的组织构建体的视觉表示。在又一实施方案中，用户限定的对象的内容选自生物墨水或支撑材料。在进一步的实施方案中，显示屏由用户电子或手工输入的三维渲染(rendering)组成，从而可以在生物打印机上执行生物打印程序之前在任何合适的平面中或矢量上调整三维渲染的各种组分。本文进一步描述·了将墨盒接附到生物打印机上的方法，包括:(a)将墨盒插入筒夹夹头中，其中该筒夹夹头接附在生物打印机的打印机头上；和(b)调节该筒夹夹头的外套环；其中所述插入和调节基本上不改变打印机头的位置。本文进一步描述了与本文描述的生物打印机一起使用的墨盒，其包含至少一个孔口，其中孔口的边缘是光滑或基本光滑的。在一个实施方案中，墨盒是毛细管或微量移液器。在另一实施方案中，墨盒包含生物墨水。在又一实施方案中，墨盒包含支撑材料。在又一实施方案中，孔口是圆形或正方形的。在又一实施方案中，墨盒具有约I μ m至约1000 μ m的内直径。在又一实施方案中，墨盒具有约500 μ m的内直径。在又一实施方案中，墨盒具有约I μ I至约50 μ I的容积。在又一实施方案中，墨盒具有约5 μ I的容积。在又一实施方案中，标记墨盒以指示生物墨水的组成。在又一实施方案中，标记墨盒以指示支撑材料的组成。在一些实施方案中，生物墨水和/或支撑材料是准备好的(primed)。在进一步的实施方案中，通过在启动生物打印机程序之前将生物墨水挤出到分配孔口的水平来准备生物墨水。在进一步的实施方案中，通过在启动生物打印机程序之前将支撑材料挤出到分配孔口的水平来准备支撑材料。本文进一步描述了用于将墨盒接附到生物打印机上的系统，其包含:用于接收墨盒并将其固定到生物打印机的打印机头上的手段；其中用于接收和固定墨盒的手段的使用基本上不改变打印机头的位置。在一些实施方案中，用于接收墨盒并将其固定到打印机头上的手段选自:磁力吸引、筒夹夹头夹具、套圈、螺母、筒接合器或其组合。在一个实施方案中，用于接收墨盒并将其固定到打印机头上的手段中有筒夹。本文进一步描述了用于接收一个或多个从生物打印机分配的结构的接收表面。在一个实施方案中，接收表面是平坦或基本平坦的。在另一实施方案中，接收表面是光滑或基本光滑的。在又一实施方案中，接收表面是(a)平坦或基本平坦的且(b)光滑或基本光滑的或(C)限定或基本限定的。在另一实施方案中，接收表面的形貌被设计为适应或影响一个或多个分配的结构的大小、形状或纹理(texture)，或者几何形状。在又一实施方案中，接收表面包含固体材料、半固体材料或其组合。在又一实施方案中，接收表面包含玻璃、塑料、金属、金属合金或其组合。在又一实施方案中，接收表面包含凝胶。在又一实施方案中，接收表面抵抗所述一个或多个结构的粘附。在又一实施方案中，接收表面包含聚合的NovoGel 。


图1说明了使用水平激光校准墨盒的一个非限制性实例。图2说明了使用垂直激光校准墨盒的一个非限制性实例。图3说明了毛细管准备过程(priming process)的一个非限制性实例。图4说明了生物打印的组织构建体的二维表示形式的一个非限制性实例。图5说明了通过使用与带有510μπι针头的注射器相连的NovoGen ΜΜΧ 生物打印机来连续沉积PF-127而生成的三维构建体的一个非限制性实例；在该情况下为金字塔形构建体。
`
图6说明了通过使用与带有510μπι针头的注射器相连的NovoGen ΜΜΧ 生物打印机来连续沉积PF-127而生成的三维构建体的一个非限制性实例；在该情况下为立方体形状(左图)和空心立方体形状(右图)的构建体。
具体实施例方式本发明涉及再生医学、组织/器官工程、生物和医学研究以及药物研发领域。更具体地，本发明涉及用于制造组织和器官的装置，用于校准和使用此类装置的系统和方法，以及由本文公开的装置、系统和方法制造的组织和器官。在某些实施方案中，本文公开了生物打印机，其包含:一个或多个打印机头，其中打印机头包含用于接收和夹持至少一个墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含选自以下一种或多种的内容物:生物墨水和支撑材料；用于校准至少一个墨盒的位置的手段；和分配至少一个墨盒的内容物的手段。在某些实施方案中，本文还公开了校准包含沉积孔口的墨盒的位置的方法，其中墨盒接附在生物打印机上，该方法包括:沿至少一个轴校准墨盒位置；其中该轴选自X轴、y轴和z轴；并且其中利用激光进行各校准。在某些实施方案中，本文还公开了用于校准包含沉积孔口的墨盒的位置的系统，其中墨盒接附在生物打印机上，所述系统包含:用于沿至少一个轴校准墨盒位置的手段，其中该轴选自y轴、X轴和z轴。在某些实施方案中，本文还公开了用于制造组织构建体的方法，包括:计算机模块接收期望的组织构建体的视觉表示的输入；计算机模块生成一系列命令，其中该命令基于该视觉表示且可被生物打印机读取；计算机模块将该系列命令提供给生物打印机；以及生物打印机按照该命令沉积生物墨水和支撑材料，以形成具有限定的几何形状的构建体。在某些实施方案中，本文还公开了将墨盒接附到生物打印机上的方法，包括:(a)将墨盒插入筒夹夹头中，其中该筒夹夹头接附在生物打印机的打印机头上；和(b)调节筒夹夹头的外套环；其中所述插入和调节基本上不改变打印机头的位置。在某些实施方案中，本文还公开了用于将墨盒接附到生物打印机上的系统，其包含:用于接收墨盒并将其固定到生物打印机的打印机头上的手段；其中使用用于接收和固定墨盒的手段基本上不改变打印机头的位置。
某些定义除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员所一般理解的具有相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用全文并入。除非上下文另有明确指示，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括其复数形式。因此，例如，提及“一种核酸”包括一种或多种核酸，和/或对本领域技术人员而言在阅读本公开内容后将会变得显而易见的本文所述类型的组合物，诸如此类。除非另有说明，本文中对“或”的任何提及旨在包括“和/或”。本文使用的“同种异体移植物”是指源自与受体物种相同而在遗传上不同的该物种成员的器官或组织。本文使用的“生物墨水”是指含有多个细胞的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包含细胞溶液、细胞聚集体、含细胞的凝胶、多细胞体或组织。在一些实施方案中，生物墨水另外包含支撑材料。在一些实施方案中，生物墨水另外包含提供使生物打印可行的特定生物力学性能的非细胞材料。本文使用的“生物打印”是指通过与自动化的、计算机辅助的、三维成型(prototyping)装置(例如生物打印机)相兼容的方法，利用细胞(例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体、多细胞体等)的三维精确沉积。本文使用的“墨盒”是指能够接收(和容纳)生物墨水或支撑材料的任何物体。本文使用的“计算机模块”是指与更大的计算机系统交互的软件组件(包括一段代码)。在一些实施方案中，软件模块(或程序模块)以文件形式出现，并且一般在更大的软件系统内处理特定任务。在一些实施方案中，模块可包括在一个或多个软件系统内。在其它实施方案中，模块可与一个或多个其它模块无缝集成到一个或多个软件系统内。计算机模块任选地是独立的一段代码，或任选地是不能单独识别的代码。计算机模块的一个关键特征是其允许最终用户使用计算机来执行所识别的功能。本文使用的“可植入的”是指可生物相容并且能够临时或基本永久地嵌入或植入活生物体内或者附加到活生物体上。本文使用的“器官”是指连接成为结构单元以行使常见功能的组织集合。器官的实例包括但不限于皮肤、汗腺、皮脂腺、乳腺、骨、脑、下丘脑、垂体、松果体、心脏、血管、喉、气管、支气管、肺、淋巴管、唾液腺、粘液腺、食道、胃、胆囊、肝脏、胰腺、小肠、大肠、结肠、尿道、肾、肾上腺、管道(conduit)、输尿管、膀胱、输卵管、子宫、卵巢、睾丸、前列腺、甲状腺、甲状旁腺、睑板腺、腮腺、扁桃体、增殖腺(adenoid)、胸腺和脾脏。本文使用的“患者”是指任何个体。该术语与“受试者”、“受体”和“供体”可以互换。这些术语均不应解释为需要医学专业人士(例如医师、护士、执业护士、医师助手、护理员、临终关怀工作者、社工、临床研究员等)或科研人员的(持续的或其它方式的)监督。本文使用的“干细胞”是指展示出潜能和自我更新的细胞。干细胞包括但不限于全能细胞、多潜能细胞(pluripotent cells)、多能细胞(multipotent cells)、寡能细胞、单能细胞和祖细胞。干细胞可以是胚胎干细胞、围产期干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干细胞。本文使用的“组织”是指细胞的聚集体。组织的实例包括但不限于结缔组织(例如网形结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如单层上皮和复层上皮)、内胚层源组织、中胚层源组织和外胚层源组织。本文使用的“异种移植物”是指源自与受体不同的物种的器官或组织。
现有的器官移植方法目前，尚没有可靠的器官从头合成方法。器官仅来自于活供体(例如对于肾和肝捐献)、已故供体(例如对于肺和心脏捐献)，且在少数情况下来自于动物(例如猪心脏瓣膜)。因此，需要器官移植的患者必须等待供体器官可以获得。这导致可用的器官的短缺。此外，对从活生物体获得器官的依赖增加了移植排斥的可能性。
移植排斥 在某些情况下，接受器官移植的患者经历超急性排斥反应。本文使用的“超急性排斥反应”是指因为受体具有预先存在的针对供体器官的抗体而导致的补体介导的免疫应答。超急性排斥反应在数分钟内发生，并且其特征为血液凝集。如果不立即移除移植的器官，患者可能患脓毒症。异种移植物会引起超急性排斥反应，除非首先对受体施用免疫抑制齐U。在一些实施方案中，从头制造的组织或器官将不包含任何抗原，因此不能被受体的任何抗体识别。在某些情况下，接受器官移植的患者经历急性排斥反应。本文使用的“急性排斥反应”是指在移植后约一周到移植后约一年开始的免疫应答。急性排斥反应是由供体器官上存在外源HLA分子而导致的。在某些情况下，APC识别外源HLA并激活辅助T细胞。在某些情况下，辅助T细胞激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。在某些情况下，细胞毒性T细胞和巨噬细胞的存在导致具有外源HLA的细胞死亡，并因此导致移植的器官的损害(或死亡)。急性排斥反应在约60-75%的肾移植和50-60%的肝移植中发生。在一些实施方案中，从头制造的组织或器官将不包含任何HLA，因此将不会导致辅助T细胞的激活。在某些情况下，接受器官移植的患者经历慢性排斥反应。本文使用的“慢性排斥反应”是指由针对移植的组织的慢性炎症性和免疫应答所导致的移植排斥。在一些实施方案中，从头制造的组织或器官将不包含任何抗原或外源HLA，因此将不会引发炎症性或免疫应答。
在某些情况下，接受器官移植的患者经历慢性同种异体移植血管病变(CAV)。本文使用的“慢性同种异体移植血管病变”是指由移植器官的内部血管纤维化所导致的移植器官的功能丧失。在某些情况下，CAV是对移植器官的长期免疫应答的结果。在一些实施方案中，从头制造的组织或器官将不包含任何抗原或外源HLA，因此将不会导致免疫应答。为了避免移植排斥，对器官受体施用免疫抑制药物。免疫抑制剂包括但不限于皮质类固醇(例如泼尼松和氢化可的松)、钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素和他克莫司)、抗增殖剂(例如硫唑嘌呤和霉酚酸)、针对免疫系统的特异性组分的抗体(例如巴利昔单抗、达利珠单抗(dacluzimab)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和抗淋巴细胞球蛋白(ALG)和mTOR抑制剂(例如西罗莫司和依维莫司))。然而，免疫抑制剂具有数种负面副作用，包括但不限于易感染性(例如，肺炎卡氏肺囊虫(pneumocystis carinii pneumonia) (PCP)Jfji炎巨细胞病毒(cytomegalovirus pneumonia) (CMV)、单纯疱疫(herpes simplex)病毒和带状疱疹(herpes zoster)病毒感染)和恶性细胞的扩散、高血压、血脂异常、高血糖、消化性溃疡、肝和肾的损伤以及与其它药物的相互作用。在一些实施方案中，从头制造的组织或器官将不会导致免疫应答，因此将不需要施用免疫抑制剂。
感染在某些情况下，供体器官可能感染了传染原。在移植已感染的器官后，该传染原能够扩散到供体全身(部分是因为免疫抑制药物的使用)。作为非限制性实例，受体已从移植的器官感染了 HIV、西尼罗河病毒、狂犬病、丙型肝炎、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、结核、查加斯病和克-雅氏病。虽然这样的感染是罕见的，但它们仍会发生-已故供体的社会史经常是不准确的，因为其必然来源于近亲，如果未发生血清转化，血清学试验可能产生假阴性结果，或者血清学试验也可能由于输血后的血液稀释而产生假阴性。而且，因为获得的器官存活时间有限，未对许多不常见的传染原进行筛查。在一些实施方案中，从头制造的组织或器官将不包含任何传染原。
供体并发症活供体也可能由于捐献器官而经历并发症。这些并发症包括医院交叉感染、对麻醉的过敏反应和手术差错。而且，器官供体可能某一天发现他们自身需要他们所捐献的器官。例如，肾供体剩下的肾脏或肝供体剩下的肝叶可能受损。在一些实施方案中，从头制造的组织或器官消除了对供体器官的需求，因此将避免对供体的负面副作用。鉴于可用器官的缺乏和供体器官移植之后可能引发的所有并发症，对于从头制造组织和器官的方法存在需求。
鉬织工稈组织工程是一个跨学科领域，它应用和结合了工程和生命科学的原理，旨在发展通过增加、修复或替换器官或组织来恢复、维持或改善组织功能的生物替代品。经典组织工程的基本方法是将活细胞接种到生物相容的且最后可生物降解的环境(例如支架)中，然后在生物反应器中培养该构建体，使得初始细胞群可以在植入后进一步扩充并成熟以生成靶组织。使用模拟生物细胞外基质(ECM)的适当支架，发育中的组织可以在体外和体内成熟后同时继承所需器官的形式和功能。但是，用类似于天然组织的结构达到足够高的细胞密度具有挑战性， 因为控制细胞在支架各处的分布和空间排列的能力受到限制。这些限制可能导致组织或器官的机械性能差和/或功能不足。关于支架的生物降解、残留聚合物的捕获和制造过程的工业规模放大，存在另外的挑战。已尝试了无支架的方法。目前无支架的方法具有数个限制:
复杂的几何形状，例如其中每层包含一种不同的细胞类型的多层结构，可能需要将细胞类型确定地、高分辨率地放置在特定结构内，从而可再现地达到类似于天然组织的成
果O
规模和几何形状受扩散和/或对用于养分供应的功能性血管网络的需求所限。
组织的存活能力可能被限制扩散和限制细胞获取养分的限制材料削弱。在某些实施方案中，本文公开了生成三维组织构建体的装置、系统和方法。本文公开的装置、系统和方法使用了分三个阶段的过程:(i)预处理或生物墨水制备，(ii)处理，即生物打印机将生物墨水颗粒实际自动化递送/打印到生物纸张上，和(iii)后处理，即打印的构建体在生物反应器中成熟/培养。最终的结构形成在后处理期间通过生物墨水颗粒的融合而发生。本文公开的装置、系统和方法具有以下优点:
■其能够产生含细胞的组织和/或器官。
■其通过利用发育生物学的原理来模拟天然组织形成过程的环境条件。
■其可以获得众多的复杂拓扑结构(例如多层结构、重复的几何图案、段、片、管、囊
坐')
寸/ ο
■其与自动化制造手段·兼容并且规模是可调整的。生物打印使得生成可用于组织修复、组织增强、组织替换和器官替换的可植入含细胞组织的改良方法成为可能。此外，生物打印使得生成微尺度的组织类似物(包括对体外试验有用的组织类似物)的改良方法成为可能。
牛物打印 在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的装置、系统和方法。在一些实施方案中，该装置是生物打印机。在一些实施方案中，该方法包括使用生物打印技术。在进一步的实施方案中，利用本文描述的装置、系统和方法而制造的组织和器官是生物打印的。在一些实施方案中，使用利用快速成型技术的方法来生成生物打印的细胞构建体、组织和器官，该快速成型技术基于通过三维递送装置(例如生物打印机)向生物相容的表面(例如由水凝胶和/或多孔膜组成)上三维、自动化、计算机辅助地沉积细胞和支撑材料，该细胞包括细胞溶液、细胞悬浮液、含细胞的凝胶或糊状物、细胞浓缩物、多细胞体(例如圆柱体、球状体、带状物等)。在一些实施方案中，本文使用的术语“工程化”在用来指组织和/或器官时，是指按照计算机代码由计算机辅助的装置(例如生物打印机)定位细胞、细胞溶液、细胞悬浮液、含细胞的凝胶或糊状物、细胞浓缩物、多细胞聚集体和它们的层，以形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本是例如一个或多个计算机程序、计算机应用或计算机模块。在更进一步的实施方案中，三维组织结构通过细胞或多细胞体的打印后融合而形成，类似于早期形态发生中的自组装现象。尽管可使用包括人工布置在内的许多方法在生物相容的表面上排列细胞、多细胞聚集体和/或它们的层以产生三维结构，但是由自动化的、计算机辅助的机器例如生物打印机来定位是有利的。用这一技术递送细胞或多细胞体的优点包括快速、准确且可再现地布置细胞或多细胞体，以用多种组合物产生展示出细胞、多细胞聚集体和/或它们的层的计划的或预定的取向或图案的构建体。优点还包括保证了高的细胞密度，同时使细胞损伤最小化。在一些实施方案中，生物打印的方法是连续和/或基本连续的。连续生物打印方法的一个非限制性实例是通过与生物墨水储器连接的分配尖端(例如注射器、毛细管等)从生物打印机分配生物墨水。在进一步的非限制性实施方案中，连续生物打印方法是以功能单元的重复图案分配生物墨水。在各种实施方案中，重复的功能单元具有任何合适的几何形状，包括例如圆形、正方形、长方形、三角形、多边形和不规则几何形状。在进一步的实施方案中，生物打印的功能单元的重复图案包含层，并且相邻地生物打印(例如堆叠)多个层以形成工程化的组织或器官。在各种实施方案中，相邻地生物打印(例如堆叠)2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个层，以形成工程化的组织或器官。在一些实施方案中，生物打印的功能单元以镶嵌图案重复。“镶嵌图案”是无重叠且无空隙地填充平面的图形平面。连续和/或镶嵌生物打印的优点可包括增加生物打印的组织的产量。产量增加可包括实现规模增加、复杂性增加或者生产时间或成本减少。另一个非限制性的潜在优点可以是减少完成三维构建体的生物打印所需的校准事件数目。连续生物打印还可有利于任选地使用注射器机构由生物墨水的大储器打印较大的组织。连续生物打印中的方法可能涉及独立地或彼此相关地优化和/或平衡参数，例如打印高度、泵速、机扑(robot)速度或其组合。在一个实例中，生物打印机头的沉积速度是3mm/s,第一层的分配高度是0.5mm,而对于随后各层分配高度增加0.4mm 在一些实施方案中，分配高度大致与生物打印机分配尖端的直径相等。非限制性地，合适的和/或最佳的分配距离不会导致材料压扁或附着于分配针头。在各种实施方案中，生物打印机分配尖端具有约 20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 μ m或更大的内径,包括其间的值(increments therein)。在各种实施方案中，生物打印机的生物 墨水储器具有约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100立方厘米或更大的容积，包括其间的值。当系统中的剩余压力积累较低时，泵速可能是合适的和/或最佳的。有利的泵速可取决于储器和分配针头的横截面积之间的比例，比例越大，所需的泵速越低。在一些实施方案中，合适的和/或最佳的打印速度使均匀线的沉积成为可能，而不会影响材料的机械完整性。本文公开的发明包括商业方法。在一些实施方案中，利用本文公开的装置和方法的速度和规模可调性来设计、建立和运行用于生产工程化组织和/或器官的工业和/或商业设施。在进一步的实施方案中，将工程化组织和/或器官作为例如用于医学处理/治疗组织损伤、组织疾病和/或器官衰竭的材料、工具和试剂盒，或者作为用于进行生物试验和/或药物筛选服务的材料、工具和试剂盒进行生产、储存、分送、上市、广告宣传和出售。
生物打印机在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的生物打印机。在一些实施方案中，生物打印机是使生物打印过程自动化的任何仪器。在某些实施方案中，本文公开的生物打印机包含:一个或多个打印机头，其中打印机头包含用于接收和夹持至少一个墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含选自以下一种或多种的内容物:生物墨水和支撑材料；用于校准至少一个墨盒的位置的手段；和用于分配至少一个墨盒的内容物的手段。在各种实施方案中，生物打印机以二维或三维的预定的几何学性质(例如位置、图案等)分配生物墨水和/或支撑材料。在一些实施方案中，生物打印机通过相对于打印机台或适合接收生物打印的材料的接收表面移动打印机头来实现特定的几何学性质。在其它实施方案中，生物打印机通过相对于打印机头移动打印机台或接收表面来实现特定的几何学性质。在某些实施方案中，生物打印机保持在无菌环境中。在一些实施方案中，本文公开的生物打印机包含一个或多个打印机头。在进一步的实施方案中，打印机头包含用于接收和夹持至少一个墨盒的手段。在一些实施方案中，打印机头包含用于接收和夹持超过一个墨盒的手段。在一些实施方案中，用于接收和夹持至少一个墨盒的手段选自:磁力吸引、筒夹夹头夹具、套圈、螺母、筒接合器或其组合。在一些实施方案中，用于接收和夹持至少一个墨盒的手段是筒夹夹头夹具。在一些实施方案中，本文公开的生物打印机包含用于校准至少一个墨盒的位置的手段。在一些实施方案中，用于校准至少一个墨盒的位置的手段选自:激光准直、光学准直、机械准直、压电准直、磁力准直、电场或电容准直、超声准直或其组合。在一些实施方案中，用于校准至少一个墨盒的位置的手段是激光准直。在一些实施方案中，本文公开的生物打印机包含用于分配至少一个墨盒的内容物的手段。在一些实施方案中，用于分配至少一个墨盒的内容物的手段是应用活塞、应用压力、应用压缩气体、应用液压技术或应用其组合。在一些实施方案中，用于分配至少一个墨盒的内容物的手段是应用活塞。在一些实施方案中，活塞的直径小于墨盒的直径。在一些实施方案中，本文公开的生物打印机进一步包含接收表面。在进一步的实施方案中，接收表面是生物打印机向其上分配生物墨水和/或支撑材料的无细胞毒性表面。在一些实施方案中，本文公开的生物打印机进一步包含打印机台。在进一步的实施方案中，接收表面是打印机台的表面。在其它实施方案中，接收表面是与打印机台分离的组件，但是它附着在台上或由台支撑。在一些实施方案中，接收表面是平坦或基本平坦的。在一些实施方案中，表面是光滑或基本光滑的。在其它实施方案中，表面是基本平坦且基本光滑的。在更进一步的实施方案中，接收表面经特别设计以适应生物打印的结构的形状、大小、纹理或几何形状。在更进一步的实施方案中，接收表面控制或影响生物打印的构建体的大小、形状、纹理或几何形状。
`
在一些实施方案中，本文公开的生物打印机进一步包含用于调节温度的手段。在一些实施方案中，用于调节温度的手段调节和/或保持环境温度。在其它各种实施方案中，作为非限制性实例，用于调节温度的手段调节和/或保持打印头、墨盒、墨盒内容物(例如生物墨水、支撑材料等)、打印机台和接收表面的温度。在一些实施方案中，用于调节温度的手段是加热元件。在一些实施方案中，用于调节温度的手段是加热器。在一些实施方案中，用于调节温度的手段是辐射加热器、对流加热器、传导加热器、风扇加热器、热交换器或其组合。在一些实施方案中，用于调节温度的手段是冷却元件。在一些实施方案中，用于调节温度的手段是冷却剂容器、冷冻液、冰或其组合。在一些实施方案中，用于调节温度的手段是辐射冷却器、对流冷却器、传导冷却器、风扇冷却器或其组合。在各种实施方案中，用于调节温度的手段调节温度到约0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90°C，包括其间的值。在一些实施方案中，将温度调节到约40°C至约90°C。在其它实施方案中，将温度调节到约0°C至约10°C。
在一些实施方案中，本文公开的生物打印机进一步包含用于向以下一种或多种应用润湿剂的手段:打印机台；接收表面、沉积孔口、生物墨水、支撑材料或打印的构建体。在一些实施方案中，用于应用润湿剂的手段是应用流体的任何合适方法(例如喷雾器、移液管、喷墨等)。在一些实施方案中，润湿剂是水、组织培养基、缓冲盐溶液、血清或其组合。在进一步的实施方案中，在生物打印机分配生物墨水或支撑材料之后应用润湿剂。在一些实施方案中，与生物打印机分配生物墨水或支撑材料同时或基本同时地应用润湿剂。在一些实施方案中，在生物打印机分配生物墨水或支撑材料之前应用润湿剂。
打印机头在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的生物打印机。在一些实施方案中，本文公开的生物打印机包含一个或多个打印机头。在进一步的实施方案中，打印机头包含用于接收和夹持至少一个墨盒的手段。在更进一步的实施方案中，打印机头将至少一个墨盒接附到生物打印机上。用于接收和夹持至少一个墨盒的许多手段都是合适的。用于接收和夹持至少一个墨盒的合适的手段包括那些可靠地、精确地和牢固地将至少一个墨盒接附到生物打印机上的手段。在各种实施方案中，作为非限制性实例，用于接收和夹持至少一个墨盒的手段是磁力吸引、筒夹夹头夹具、套圈 、螺母、筒接合器或其组合。在一些实施方案中，本文公开的打印机头接收和夹持一个墨盒。在各种其它实施方案中，本文公开的打印机头同时接收和夹持2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个墨盒。在进一步的实施方案中，本文公开的打印机头进一步包含用于从所接收和夹持的多个墨盒中选择在生物打印中欲使用的墨盒的手段。在一些实施方案中，本文公开的打印机头进一步包含储器(或与之流体连通)，以便含有超过一个或多个墨盒的容纳量的生物墨水和/或支撑材料。在进一步的实施方案中，储器向一个或多个墨盒供应生物墨水和/或支撑材料，以便通过分配孔口进行分配。包括储器的打印机头配置在连续或基本连续的生物打印应用中特别有用。许多容积适合本文公开的储器。在各种实施方案中，储器具有例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500ml 或更大的内部容积，包括其间的值。在一些实施方案中，生物打印涉及使用计算机来独立或彼此相关地配置参数，例如打印高度、泵速、机扑速度或其组合。在进一步的实施方案中，计算机代码指定打印机头的定位，以将打印机头的高度配置在接收表面以上。在进一步的实施方案中，计算机代码指定打印机头的移动方向和速度，以配置生物墨水和/或支撑材料的分配特征。
墨盒在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的生物打印机。在一些实施方案中，接附在生物打印机上的墨盒包含生物墨水或支撑材料。在一些实施方案中，生物打印机以特定图案在特定位置分配生物墨水或支撑材料，以形成特定的细胞构建体、组织或器官。为了制造复杂的组织构建体，生物打印机以精确的速度和均匀的量沉积生物墨水或支撑材料。因此，对于具有(a)光滑或基本光滑的分配孔口和(b)光滑或基本光滑的内表面的墨盒存在需求。本文使用的“墨盒”是指能够接收(和容纳)生物墨水和/或支撑材料的任何物体。
在一些实施方案中，本文公开的墨盒包含生物墨水。在一些实施方案中，本文公开的墨盒包含支撑材料。在一些实施方案中，本文公开的墨盒包含生物墨水和支撑材料的组
口 ο在某些实施方案中，本文公开了与本文公开的生物打印机一起使用的墨盒，其包含至少一个分配孔口。在一些实施方案中，墨盒包含一个分配孔口。在各种其它实施方案中，墨盒包含 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 个或更多个分配孔口。在进一步的实施方案中，分配孔口的边缘是光滑或基本光滑的。许多形状适合本文公开的分配孔口。在各种实施方案中，作为非限制性实例，适合分配孔口的形状包括圆形、卵形、三角形、正方形、长方形、多边形和不规则形状。在一些实施方案中，孔口是圆形的。在其它实施方案中，孔口是正方形的。在另外的其它实施方案中，孔口是卵形、椭圆形或长方形的，并且以带样形式分配固体或半固体生物墨水和/或支撑材料。在一些实施方案中，墨盒的内表面是光滑或基本光滑的。在一些实施方案中，墨盒由刚性结构组成以利于校准。在一些实施方案中，墨盒壁由抵抗细胞附着的材料组成。在一些实施方案中，墨盒由生物相容的材料组成。许多类型的墨盒适合与本文公开的生物打印机及其使用方法一起使用。在一些实施方案中，墨盒与涉及通过一个或多个分配孔口挤出半固体或固体生物墨水或支撑材料的生物打印兼容。在一些实施方案中，墨盒与涉及通过一个或多个分配孔口分配液体或半固体的细胞溶液、细胞悬浮液或细胞浓缩物的生物打印兼容。在一些实施方案中，墨盒与不连续生物打印兼容。在一些实施方案中，墨盒与连续和/或基本连续的生物打印兼容。在一些实施方案中，墨盒是毛细管或微量移液器。在一些实施方案中，墨盒是注射器或针头。许多内直径适合基本圆形或圆柱形的墨盒。在各种实施方案中，作为非限制性实例，合适的内直径包括 1、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μπι 或更大，包括其间的值。在其它各种实施方案中，作为非限制性实例，合适的内直径包括1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mm 或更大，包括其间的值。在一些实施方案中，墨盒具有约Iym至约IOOOym的内直径。在一个特定的实施方案中，墨盒具有约500 μ m的内直径。在另一特定的实施方案中，墨盒具有约250 μ m的内直径。许多内部容积适合本文公开的墨盒。在各种实施方案中，作为非限制性实例，合适的内部容积包括1、10、
20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μ I 或更大，包括其间的值。在其它各种实施方案中，作为非限制性实例，合适的内部容积包括1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500ml或更大，包括其间的值。在一些实施方案中，墨盒具有约I μ I至约50 μ I的容积。在一个特定的实施方案中，墨盒具有约5 μ I的容积。在一些实施方案中，墨盒与生物墨水和/或支撑材料向接收表面上的喷墨打印(例如在美国专利7，051，654中所描述的)兼容。在进一步的实施方案中，墨盒包括在本文描述的计算机代码控制下的、电压门控喷嘴或针头形式的分配孔口。在一些实施方案中，墨盒是准备好的。在一些实施方案中，准备墨盒增加了分配、沉积或挤出过程的精度。本文使用的“准备好”是指通过致密化(compacting)和前推墨盒的内容物直到待分配 的材料(生物墨水或支撑材料)位于与分配孔口接触的位置，而将墨盒的内容物准备好以供分配、沉积或挤出。在一些实施方案中，当内容物是致密的或基本致密的且内容物与墨盒的孔口物理接触时，墨盒是准备好的。在一些实施方案中，标记墨盒以指示其内容物的组成。在进一步的实施方案中，标记墨盒以指不其中所含的生物墨水和/或支撑材料的组成。在一些实施方案中，对墨盒的表面着色。在一些实施方案中，对墨盒的外表面染色、上漆、用钢笔标记、用粘贴物(sticker)标记或其组合。在一些实施方案中，标记墨盒的外表面以增加墨盒表面的不透明度(例如，用以增加被墨盒表面反射掉的激光束的量)。在一些实施方案中，对墨盒的表面着色。在一些实施方案中，对墨盒的外表面刻痕。本文使用的“刻痕”是指在墨盒表面上刻划，以降低表面的光滑度。使用任何合适的方法给墨盒表面刻痕(例如应用酸性物质、应用腐蚀性物质、应用磨蚀性物质等)。在一些实施方案中，对墨盒的外表面上漆、抛光(例如火焰抛光)、蚀刻(例如激光蚀刻)、用钢笔标记、用粘贴物标记或其组合。
魁在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的生物打印机。在一些实施方案中，接附在生物打印机上的墨盒包含生物墨水和/或支撑材料。在一些实施方案中，生物打印机以特定图案在特定位置分配生物墨水和/或支撑材料，以形成特定的细胞构建体、组织或器官。在一些实施方案中，包含生物墨水的墨盒是一次性的。在一些实施方案中，在挤出内各物后，将墨盒从生物打印机上退出。在一些实施方案中，新的墨盒随后接附到生物打印机上。为了制造复杂的结构，本文公开的生物打印机以合适的可重复精度从墨盒分配生物墨水和/或支撑材料。在各种实施方案中，合适的可重复精度包括任意轴上约±5、10、20、30、40或50 μ m的可重复精度。在一些实施方案中，本文公开的生物打印机以约±20 μ m的可重复精度从墨盒分配生物墨水和/或支撑材料。但是，墨盒的不受控的移除和插入可导致打印机头的位置(因此导致墨盒的位置)相对于组织构建体发生变化，以至于由新墨盒沉积的第一个生物墨水 颗粒的布置精度可相对于由前一墨盒沉积的最后一个生物墨水颗粒发生变化。因此，需要这样一种将墨盒接附并固定到打印机头上的方法，其中所述接附和固定产生最小的打印机头位置变化。在某些实施方案中，本文公开了将墨盒接附到生物打印机上的方法，包括:(a)将墨盒插入筒夹夹头中，其中该筒夹夹头接附在生物打印机的打印机头上；和(b)调节筒夹夹头的外套环；其中所述插入和调节基本上不改变打印机头的位置。在某些实施方案中，本文公开了用于将墨盒接附到生物打印机上的系统，其包含:用于接收墨盒并将其固定到生物打印机的打印机头上的手段；其中使用用于接收和固定墨盒的手段基本上不改变打印机头的位置。在一些实施方案中，用于接收墨盒并将其固定到打印机头上的手段是夹头或套圈。本文使用的“夹头”是指由可调节的爪组成的夹持装置。在一些实施方案中，用于接收墨盒并将其固定到打印机头上的手段是筒夹。本文使用的“筒夹”是指夹头的一个子类型-其在欲夹持的对象周围形成套环，并施加强劲的夹紧。本文使用的“套圈”是指用来将一个对象固定到另一个上的带(例如金属带)。在一些实施方案中，用于接收墨盒并将其固定到打印机头上的手段是筒接合器。本文使用的“筒接合器”是指用来将一个对象固定到另一个上的螺纹管。
接收表面
在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的生物打印机。在一些实施方案中，生物打印机将生物墨水和/或支撑材料的多个元素、部分和/或区域分配到接收表面上。在进一步的实施方案中，分配以特定图案在特定位置发生。在更进一步的实施方案中，生物打印机将生物墨水和/或支撑材料沉积到接收表面上的位置由用户输入限定，并被翻译成计算机代码。在一些实施方案中，生物墨水和/或支撑材料的元素、部分和/或区域各自具有小于300mmx300mmxl60mm的尺寸。仅举例来说，生物墨水或支撑材料的部分的尺寸可以是75mmx5.0mmx5.0mm ；0.3mmx2.5mmx2.5mm ； lmmxlmmx50mm ;或 1 50mmx 1 5Ommx8Omnin 由于各部
分的尺寸通常较小以及在一些情况下需要高精度，接收表面中的微小瑕疵可导致细胞构建体、组织或器官的瑕疵(并可能导致失败)。因此，对于能够接收生物墨水和/或支撑材料的部分的基本光滑且基本平坦的接收表面或者限定或基本限定的接收表面存在需求。在某些实施方案中，本文公开了用于接收一个或多个由本文公开的生物打印机生成的结构的接收表面。在一些实施方案中，接收表面是平坦或基本平坦的。在一些实施方案中，接收表面是光滑或基本光滑的。在一些实施方案中，接收表面是平坦或基本平坦的。在一些实施方案中，接收表面是限定或基本限定的。在其它实施方案中，接收表面经特别设计以适应特定的生物打印的结构的形状、大小、纹理或几何形状。在进一步的实施方案中，接收表面控制或影响生物打印的构建体的大小、形状、纹理或几何形状。在一些实施方案中，接收表面包含固体材料、半固体材料或其组合。在一些实施方案中，接收表面包含玻璃、涂层玻璃、塑料、涂层塑料、金属、金属合金或其组合。在一些实施方案中，接收表面包含凝胶。在一些实施方案中，接收表面和其上的任何涂层是生物相容的。在各种实施方案中，接收表面包含本文公开的任何支撑材料和/或限制材料。在特定的实施方案中，接收表面包含聚合的NovoGel 或聚合的琼脂糖、聚合的明胶、细胞外基质(或其组分)、胶原蛋白或其组合。
软件
`
在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的生物打印机。在一些实施方案中，接附在生物打印机上的一个或多个墨盒包含生物墨水和/或支撑材料。在一些实施方案中，生物打印机以特定图案在特定位置分配生物墨水或支撑材料，以形成特定的细胞构建体、组织或器官。为了制造复杂的组织构建体，生物打印机在接收表面上的精确位置(二维或三维)沉积生物墨水或支撑材料。在一些实施方案中，生物打印机沉积生物墨水和/或支撑材料的位置由用户输入限定，并被翻译成计算机代码。在进一步的实施方案中，计算机代码包括为执行特定任务而写成的、在数字处理装置的中央处理器(CPU)中可执行的一系列指令。在一些实施方案中，另外的生物打印参数，作为非限制性实例，包括打印高度、泵速、机扑速度和/或可变分配孔口的控制，由用户输入限定，并被翻译成计算机代码。在其它实施方案中，此类生物打印参数不是由用户输入直接限定的，而是源自依据本文描述的计算机代码的其它参数和条件。在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织构建体、组织和器官的方法，包括:计算机模块接收期望的组织构建体的视觉表示的输入；计算机模块生成一系列命令，其中该命令基于该视觉表示且可被生物打印机读取；计算机模块将该系列命令提供给生物打印机；以及生物打印机按照该命令沉积生物墨水和/或支撑材料，以形成具有限定的几何形状的构建体。
计算机可读介质在一些实施方案中，生物打印机沉积生物墨水和/或支撑材料的位置由用户输入限定，并被翻译成计算机代码。在一些实施方案中，本文公开的装置、系统和方法进一步包含计算机可读介质或用计算机可读程序代码编码的介质。在进一步的实施方案中，计算机可读介质是数字处理装置例如生物打印机(或其组件)或者与生物打印机(或其组件)相连的计算机的有形组件。在更进一步的实施方案中，计算机可读介质任选地可从数字处理装置移除。在一些实施方案中，作为非限制性实例，计算机可读介质包括CD-R0M、DVD、闪存装置、固态存储器、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、云计算系统和服务等。
计算机模块在一些实施方案中，本文描述的装置、系统和方法包含软件、服务器和数据库模块。在一些实施方案中，“计算机模块”是与更大的计算机系统交互的软件组件(包括一段代码)。在进一步的实施方案中，软件模块(或程序模块)以一个或多个文件的形式出现，并且通常在更大的软件系统内处理特定任务。在一些实施方案中,模块包含在一个或多个软件系统中。在其它实施方案中，模块与一个或多个其它模块集成到一个或多个软件系统中。计算机模块任选地是独立的一段代码，或任选地是不能单独识别的代码。在一些实施方案中，模块处于单一应用程序中。在其它实施方案中，模块处于多个应用程序中。在一些实施方案中，将模块托管(host)在一台机器上。在其它实施方案中，将模块托管在多台机器上。在一些实施方案中，将模块托管在同一地点的多台机器上。在其它实施方案中，将模块托管在超过一个地点的多台机器上。本文进一步描述了地点和定位 数据的格式化。在一些实施方案中，本文描述的数据文件以任何合适的数据序列化格式进行格式化，作为非限制性实例，所述数据序列化格式包括制表符分隔的值、逗号分隔的值、字符分隔的值、定界符分隔的值、XML、JSON、BSON和YAML。计算机模块的一个关键特征是其允许最终用户使用计算机来执行所识别的功能。
图形用户界面在一些实施方案中，计算机模块包含图形用户界面(⑶I)。本文使用的“图形用户界面”是指这样一种用户环境，其使用应用程序的输入和输出的图像和文本表示形式以及储存信息的分层或其它数据结构。在一些实施方案中，计算机模块包含显示屏。在进一步的实施方案中，计算机模块通过显示屏呈现二维GUI。在其它实施方案中，计算机模块通过显示屏呈现三维GUI，例如虚拟现实环境。在一些实施方案中，显示屏是触摸屏或多点触摸屏，并且呈现交互式⑶I。在一些实施方案中，显示屏呈现基本上由网格组成的⑶I，该网格包含形状基本相同且大小基本相等的有规律间隔排列的对象。呈现的对象具有任何合适的形状。在一些实施方案中，作为非限制性实例，对象的合适形状包括圆形、卵形、正方形、长方形、三角形、菱形、多边形或其组合。在一些实施方案中，用户定义一个或多个对象的内容，以形成期望的组织构建体的二维或三维视觉表示。参见例如图4。在一些实施方案中，作为非限制性实例，用户定义的对象的内容是具有各种组成的生物墨水或具有各种组成的支撑材料。在一些实施方案中，用户通过修改单元(cell)的颜色或对象的形状来定义对象的内容。
牛物墨水在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的装置、系统和方法。在一些实施方案中，该装置包含一个或多个用于接收和夹持至少一个任选地包含生物墨水的墨盒的打印机头。在一些实施方案中，该方法包括使用生物墨水。在进一步的实施方案中，利用本文描述的装置、系统和方法制造的组织和器官在制造时或制造后包含生物墨水。在一些实施方案中，“生物墨水”包括含有多个细胞的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包含液体或半固体的细胞溶液、细胞悬浮液或细胞浓缩物。在进一步的实施方案中，细胞溶液、悬浮液或浓缩物包含液体或半固体(例如粘性)载体和多个细胞。在更进一步的实施方案中，载体是合适的细胞营养培养基，例如本文描述的那些细胞营养培养基。在一些实施方案中，生物墨水包含半固体或固体多细胞聚集体或多细胞体。在进一步的实施方案中，生物墨水如下生产:1)以预定比例混合多个细胞或细胞聚集体和生物相容的液体或凝胶，以得到生物墨水，和2)致密化生物墨水以生产具有期望的细胞密度和粘度的生物墨水。在一些实施方案中，生物墨水的致密化通过离心、切向流过滤(“TFF”)或其组合来实现。在一些实施方案中，生物墨水的致密化生成可挤出的组合物，从而允许多细胞聚集体或多细胞体的形成。在一些实施方案中，“可挤出的”是指能够强制(例如在压力下)通过喷嘴或孔口(例如一个或多个孔或管)而成形。在一些实施方案中，生物墨水的致密化由细胞生长到合适的密度而造成。生物墨水所必需的细胞密度将随使用的细胞和生产的组织或器官而变化。在一些实施方案中，生物墨水的细胞凝聚和/或粘附。在一些实施方案中，“凝聚”是指粘合细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层的细胞间粘附性能。在进一步的实施方案中，该术语与“融合”可交换使用。在一些实施方案中，生物墨水另外还包含支撑材料、细胞培养基、细胞外基质(或其组分)、细胞粘附剂、细胞死亡抑制剂、抗凋亡剂、抗氧化剂、挤出化合物及其组合。
细胞在各种实施方案·中，本文公开了包括含有多个细胞的液体、半固体或固体组合物的生物墨水。在一些实施方案中，生物墨水包含液体或半固体的细胞溶液、细胞悬浮液或细胞浓缩物。在一些实施方案中，任何哺乳动物细胞都适合在生物墨水中使用和在使用本文描述的装置、系统和方法的组织和器官制造中使用。在各种实施方案中，细胞是任何合适的细胞。在进一步的各种实施方案中，细胞是脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞或其组合。在一些实施方案中，在本文公开的方法中使用的细胞类型取决于所生产的细胞构建体、组织或器官的类型。在一些实施方案中，生物墨水包含一个细胞类型(也称为“同源墨水”)。在一些实施方案中，生物墨水包含超过一个细胞类型(也称为“异源墨水”)。在进一步的实施方案中，作为非限制性实例，细胞是收缩性细胞或肌肉细胞(例如骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞，以及分化成骨形成细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠道细胞、肝细胞、胰腺细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、间质细胞、未分化细胞(例如胚胎细胞、干细胞和祖细胞)、内胚层源细胞、中胚层源细胞、外胚层源细胞及其组合。
在一些实施方案中，细胞是成体分化细胞。在进一步的实施方案中，“分化细胞”是在分离时具有与例如平滑肌细胞、成纤维细胞或内皮细胞一致的组织特异性表型的细胞，其中该组织特异性表型(或展现该表型的潜能)从分离时保持到使用时。在其它实施方案中，细胞是成体未分化细胞。在进一步的实施方案中，“未分化细胞”是不具有或已失去例如平滑肌细胞、成纤维细胞或内皮细胞的明确的组织特异性性状的细胞。在一些实施方案中，未分化细胞包括干细胞。在进一步的实施方案中，“干细胞”是展示出潜能和自我更新的细胞。干细胞包括但不限于全能细胞、多潜能细胞、多能细胞、寡能细胞、单能细胞和祖细胞。干细胞可以是胚胎干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干细胞。在另外的其它实施方案中，细胞是成体分化细胞和成体未分化细胞的混合物。
细胞培养基在一些实施方案中，生物墨水包含细胞培养基。该细胞培养基是任何合适的培养基。在各种实施方案中，作为非限制性实例，合适的细胞培养基包括Dulbecco磷酸盐缓冲盐水、Earle平衡盐、Hanks平衡盐、Tyrode盐、Alsever溶液、Gey平衡盐溶液、改良的Kreb-Henseleit缓冲液、Kreb-Ringer碳酸氢盐缓冲液、Puck盐水、Dulbecco改良的Eagle培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基/养分F_12Ham、养分混合物F_10Ham(Ham’ sF-10)、培养基199、最 低基本培养基Eagle、RPM1-1640培养基、Ames培养基、BGJb培养基(Fitton-Jackson 改良)、Click 培养基、CMRL-1066 培养基、Fischer 培养基、Glascow 最低基本培养基(GMEM)、Iscove 改良的 Dulbecco 培养基(IMDM)、L-15 培养基(Leibovitz)、McCoy 5A改良培养基、NCTC培养基、Swim S-77培养基、Waymouth培养基、WiIIiam培养基E或其组合。在一些实施方案中，细胞培养基是改良的或补充的。在一些实施方案中，细胞培养基进一步包含白蛋白、硒、转铁蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、维生素、生长因子、细胞因子、激素、抗生素、脂质、脂质载体、环糊精或其组合。
细胞外基质在一些实施方案中，生物墨水进一步包含细胞外基质的一种或多种组分或其衍生物。在一些实施方案中，“细胞外基质”包括由细胞产生并转运出细胞进入细胞外隙的蛋白质，它们在细胞外隙中可作为支撑用来将组织保持在一起、提供抗张强度和/或促进细胞信号传导。细胞外基质组分的实例包括但不限于胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸盐、弹性蛋白和蛋白聚糖。例如，多细胞聚集体可包含多种ECM蛋白(例如明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或蛋白聚糖)。ECM组分或ECM组分的衍生物可添加到用来形成多细胞聚集体的细胞糊中。添加到细胞糊中的ECM组分或ECM组分的衍生物可从人或动物来源纯化而来，或者通过本领域已知的重组方法生产。或者，ECM组分或ECM组分的衍生物可以由伸长细胞体中的细胞自然分泌，或者可以通过本领域已知的任何合适方法对用于产生伸长细胞体的细胞进行遗传操作，以改变一种或多种ECM组分或ECM组分的衍生物和/或一种或多种细胞粘附分子或细胞-基底粘附分子(例如选择蛋白、整联蛋白、免疫球蛋白和黏附素(adherins))的表达水平。ECM组分或ECM组分的衍生物可促进多细胞聚集体中的细胞凝聚。例如，可适当地向用来形成多细胞聚集体的细胞糊中添加明胶和/或纤维蛋白原。然后可以通过添加凝血酶使纤维蛋白原转化成纤维蛋白。在一些实施方案中，生物墨水进一步包含促进细胞粘附的试剂。
在一些实施方案中，生物墨水进一步包含抑制细胞死亡(例如坏死、凋亡或自吞噬作用)的试剂。在一些实施方案中，生物墨水进一步包含抗凋亡剂。抑制细胞死亡的试剂包括但不限于小分子、抗体、肽、肽体(peptibodies)或其组合。在一些实施方案中，抑制细胞死亡的试剂选自:抗-TNF剂、抑制白细胞介素活性的试剂、抑制干扰素活性的试剂、抑制GCSF(粒细胞集落刺激因子)活性的试剂、抑制巨噬细胞炎性蛋白活性的试剂、抑制TGF-B(转化生长因子B)活性的试剂、抑制MMP(基质金属蛋白酶)活性的试剂、抑制胱天蛋白酶活性的试剂、抑制MAPK/JNK信号传导级联活性的试剂、抑制Src激酶活性的试剂、抑制JAK(Janus激酶)活性的试剂或其组合。在一些实施方案中，生物墨水包含抗氧化剂。
挤出化合物在一些实施方案中，生物墨水进一步包含挤出化合物(即，改变生物墨水的挤出性能的化合物)。挤出化合物的实例包括但不限于凝胶、水凝胶、表面活性剂多元醇(例如Pluronic F-127或PF-127)、温度敏感性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、细胞外基质组分(及其衍生物)、胶原蛋白、其它生物相容的天然或合成聚合物、纳米纤维和自组装纳米纤维。已用多种方式定义了凝胶(有时也称为冻胶)。例如，美国药典将凝胶定义为由以无机小颗粒构成的悬浮液或经液体渗透的有机大分子组成的半固体体系。凝胶包括单相或两相体系。单相凝胶由以在分散的大分子和液体之间不存在明显界限的方式均匀分布在整个液体中的有机大分子组成。一些单相凝胶由合成大分子(例如卡波姆)或由天然树胶(例如黄蓍胶)制备而成。在一些实施方案中，单相凝胶通常是水性的，但也会使用醇和油来制备。两相凝胶由离散小颗粒的网络组成。凝胶还可分类为疏水性或亲水性的。在某些实施方案中，疏水性凝胶的基质由用胶体二氧化硅或者铝皂或锌皂胶凝的液体石蜡与聚乙烯或脂肪油组成。相反，疏水性凝胶的基质一般由用合适的胶凝剂(例如黄蓍胶、淀粉、纤维素衍生物、羧乙烯聚合物和硅酸镁铝)胶凝的水、甘油或丙二醇组成。在某些实施方案中，本文公开的组合物或装置的流变学是假塑性、塑性、触变性或胀流性的。合适的水凝胶包括源自胶原蛋白、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及其组合的水凝胶。在其它实施方案中，合适的水凝胶是合成的聚合物。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括源自聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的水凝胶。在各种具体的实施方案中，支撑材料选自:水凝胶、NovoGel 、琼脂糖、藻酸盐、明胶、Matrigel 、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基η-聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝或其组合。在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是热可逆的凝胶(也称作温度敏感性凝胶或热凝胶(thermogels))。在一些实施方案中,合适的热可逆的水凝胶在室温下不是液体。在特定实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(Tgel)为约10°C、约15°C、约20°C、约25°C、约30°C、约35°C和约40°C，包括其间的值。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约10°C到约25°C。在一些实施方案中，本文描述的生物墨水(例如，包含水凝胶、一个或多个细胞类型和其它添加剂等)在室温下不是液体。在特定实施方案中，本文描述的生物墨水的胶凝温度(Tge l)为约10°C、约15°C、约20°C、约25°C、约30°C、约35°C和约40°C，包括其间的值。在某些实施方案中，本文描述的生物墨水的Tgel为约10°C到约25°C。
由聚氧丙烯和聚氧乙烯组成的聚合物在并入水溶液中时形成热可逆的凝胶。这些聚合物具有在可在生物打印机设备中保持的温度下由液态变为凝胶态的能力。液态至凝胶态的相变取决于溶液中的聚合物浓度和成分。泊洛沙姆407 (Pluronic F-127或PF-127)是由聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物组成的非离子型表面活性剂。其它的泊洛沙姆包括188(F-68级)、237(F-87级)、338(F_108级)。泊洛沙姆的水溶液在酸、碱和金属离子的存在下是稳定的。PF-127是市售的通式为E106P70E106且平均摩尔质量为13，000的聚氧乙烯-聚氧丙烯三嵌段共聚物。该聚合物可通过会增强聚合物的胶凝性能的合适的方法进一步纯化。它包含大约70%的环氧乙烷，这解释了它的亲水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列之一。PF-127具有良好的增溶能力、低毒性，因此被认为是一种合适的挤出化合物。在一些实施方案中，通过描述的任何手段来测量本文提出的水凝胶和生物墨水的粘度。例如，在一些实施方案中，使用LVDV-1I+CP锥板粘度计(Cone Plate Viscometer)和锥转子(Cone Spindle) CPE-40来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在其它实施方案中，使用Brookfield(转子和杯)粘度计来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在一些实施方案中，在室温下测量本文提及的粘度范围。在其它实施方案中，在体温下(例如在健康人的平均体温下)测量本文提及的粘度范围。在进一步的实施方案中，水凝胶和/或生物墨水的特征在于具有约500至
I,000，000 厘泊、约 750 至 I, 000，000 厘泊、约 1000 至 I, 000，000 厘泊、约 1000 至 400，000厘泊、约2000至100，000厘泊、约3000至50，000厘泊、约4000至25，000厘泊、约5000至20，000厘泊或约6000至15，000厘泊的粘度。在一些实施方案中，生物墨水包含适用于连续生物打印的细胞和挤出化合物。在特定的实施方案中，生物墨水具有约1500mPa.s的粘度。Pluronic F-127和细胞材料的混合物可能适用于连续生物打印。这样的生物墨水可如此制备:在48小时内，通过在冷的(4°C)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续混合，溶解Pluronic F-127粉末到30% (w/v)。Pluronic F-127也 可在水中溶解。可使用标准无菌细胞培养技术培养和扩增细胞。细胞可以例如以200g沉淀成块，在30% Pluronic F-127中重悬，并吸入附于生物打印机的储器中，其在储器中可在约10到约25°C的胶凝温度下凝固。生物墨水在生物打印前的胶凝是任选的。生物墨水，包括含Pluronic F-127的生物墨水，可以作为液体进行分配。在各种实施方案中，Pluronic F-127的浓度可以是具有合适的粘度和/或细胞毒性性质的任何值。生物打印后，合适浓度的Pluronic F-127还可能能够在保持其形状的同时支撑重量。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%或约50%。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约30%至约40%，或约30%至约35%。图5描绘了通过使用与带有510 μ m针头的注射器相连的NovoGen MMX 生物打印机连续沉积PF-127而生成的三维金字塔形构建体。图6描述了通过使用与带有510 μ m针头的注射器相连的NovoGen MMX 生物打印机连续沉积PF-127而生成的三维立方体形(左图)和空心立方体形(右图)构建体。在一些实施方案中，在使用前除去生物墨水的非细胞组分(例如，挤出化合物等)。在进一步的实施方案中，非细胞组分是例如水凝胶、表面活性剂多元醇、温度敏感性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、胶原蛋白或其它生物相容的天然或合成聚合物。在更进一步的实施方案中，通过物理、化学或酶手段除去非细胞组分。在一些实施方案中，在使用时一定比例的非细胞组分保持与细胞组分关联。在一些实施方案中，预处理细胞以增加细胞的相互作用。例如，细胞可以在离心后在离心管内培养，以在生物墨水成形前增强细胞间的相互作用。
支撑材料在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的装置、系统和方法。在一些实施方案中，该装置包含一个或多个用于接收和夹持至少一个任选地包含支撑材料的墨盒的打印机头。在一些实施方案中，该方法包括使用支撑材料。在进一步的实施方案中，利用本文描述的装置、系统和方法制造的组织和器官在制造时或制造后包含支撑材料。在一些实施方案中，支撑材料能够拒绝细胞生长或迁移到其中或附着于其上。在一些实施方案中，支撑材料对营养培养基而言是可渗透的。在一些实施方案中，支撑材料的粘度是可改变的。在一些实施方案中，通过改变支撑材料的温度来改变支撑材料的粘度。在一些实施方案中，通过改变支撑材料的压力来改变支撑材料的粘度。在一些实施方案中，通过改变支撑材料的浓度来改变支撑材料的粘度。在一些实施方案中，通过交联(例如通过使用化学交联剂)或光致交联(例如使用紫外线暴露)来改变支撑材料的粘度。在一些实施方案中，支撑材料的渗透性是可改变的。在一些实施方案中，通过改变支撑材料的温度或支撑材料周围的温度来改变支撑材料的渗透性。在一些实施方案中，通过让支撑材料与改变渗透性的试剂接触来改变支撑材料的渗透性。在一些实施方案中，改变支撑材料的顺应性(compliance)(即，弹性或硬度)。在一些实施方案中，通过改变支撑材料的温度或支撑材料周围的温度来改变支撑材料的顺应性。在一些实施方案 中，通过使支撑材料与改变顺应性的试剂接触来改变支撑材料的顺应性。许多支撑材料适用于本文描述的方法。在一些实施方案中，水凝胶是具有一种或多种有利性质的示例性支撑材料，所述性质包括:不可粘附、生物相容、可挤出、可生物打印、非细胞和具有合适的强度。在一些实施方案中，合适的水凝胶是天然聚合物。在一个实施方案中，限制材料由NovoGel 组成。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括源自表面活性剂多元醇(例如Pluronic F-127)、胶原蛋白、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、其衍生物或组合的水凝胶。在其它实施方案中，合适的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括源自聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的水凝胶。在各种具体的实施方案中，限制材料选自:水凝胶、NovoGel 、琼脂糖、藻酸盐、明胶、Matrigel 、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基η-聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝或其组合。在一些实施方案中，支撑材料在存在于生物打印机中之前包含细胞。在一些实施方案中，支撑材料是包含细胞悬浮液的水凝胶。在一些实施方案中，支撑材料是包含超过一种细胞类型的混合物的水凝胶。
支撑材料的示例性用途
在一些实施方案中，支撑材料用作构造生物构建体(例如细胞构建体、组织、器官等)的构建单元。在进一步的实施方案中，支撑材料单元用来限定和保持期望的构建体的缺乏细胞材料的域(即，中间细胞单元)。在一些实施方案中，支撑材料能够采用任何形状或大小。例如，根据一个实施方案，可加热NovoGel 溶液(最初为与缓冲液和水混合的粉末相)以降低其粘度，并将其吸入到具有所需尺寸的微量移液器中(或通过活塞的负位移进入所需形状的室中)。可冷却移液器(或室)中的NovoGel 溶液至室温，例如通过对移液器(或室)外部进行强制风冷或将微量移液器插入含有冷液体的容器中，以便其可以凝固成具有所需形状的凝胶，即支撑材料。得到的支撑材料可在特定细胞构建体、组织或器官的构建期间从移液器或室分配。参见例如图4。在一些实施方案中，使用支撑材料来提高工程化组织或器官在生物打印后的存活能力。在进一步的实施方案中，支撑材料提供了组织或器官与营养培养基之间穿过临时或半永久的限制材料(例如支撑材料)栅格的直接接触。在一些实施方案中，组织被限制在多孔或有间隙的材料中。该组织或器官的至少一些细胞直接获取养分提高了该组织或器官的存活能力。在进一步的实施方案中，本文公开的方法包括另外的和任选的用于提高工程化组织或器官存活能力的步骤，包括:1)任选地在放置凝聚的多细胞聚集体之前分配限制材料(例如支撑材料)的基底层；2)任选地分配限制材料的周界；3)在限定的几何形状内生物打印组织的细胞；和4)以在限制材料中引入间隙的图案(例如栅格、筛网或网格)，分配限制材料的伸长体(例如圆柱体、带状物等)，覆盖初生的组织。在一些实施方案中，覆盖图案的间隙均匀或基本均匀地分布在组织或器官的表面周围。在其它实施方案中，间隙不均匀地分布，因而组织或器官的细胞不均匀地暴露于养分。在不均匀的实施方案中，可利用存在差异的养分获取性来影响组织或器官的一种或多种性能。例如，可能期望使生物打印的细胞构建体、组织或器官的一个表面上的细胞比另一表面上的细胞增殖得更快。在一些实施方案中，组织或器官的各个部分对养分的暴露可在不同的时间变化，以影响组织或器官朝期望的终`点的发育。在一些实施方案中，在任何合适的时间移除限制材料，包括但不限于在生物打印后立即(例如在10分钟内)、在生物打印后(例如在10分钟后)、在细胞彼此基本凝聚前、在细胞彼此基本凝聚后、在细胞产生细胞外基质前、在细胞产生细胞外基质后、恰在使用前，等等。在各种实施方案中，通过任何合适的方法移除限制材料。例如，在一些实施方案中，限制材料被切除、脱离细胞、消化或溶解。
用于校准生物打印机墨盒位置的方法和系统在某些实施方案中，本文公开了用于制造组织和器官的生物打印机。在一些实施方案中，接附到生物打印机上的墨盒包含生物墨水和/或支撑材料。在一些实施方案中，生物打印机以特定图案在特定位置沉积生物墨水或支撑材料，以形成特定的细胞构建体。在一些实施方案中，包含生物墨水的墨盒是一次性的。在一些实施方案中，墨盒在挤出、分配或沉积内容物之后从生物打印机上退出。在一些实施方案中，新的墨盒接附到生物打印机上。为了制造复杂的结构，本文公开的生物打印机以合适的可重复精度从墨盒分配生物墨水和/或支撑材料。在各种实施方案中，合适的可重复精度包括任意轴上约±5、10、
20、30、40或50μπι的精度。在一些实施方案中，本文公开的生物打印机以约±20 μ m的可重复精度从墨盒分配生物墨水和/或支撑材料。但是，在一些实施方案中，由于墨盒的移除和插入，打印机头(因此墨盒)相对于组织构建体的位置发生变化。因此，对于精确地校准打印机头、墨盒和分配孔口相对于打印机台、接收表面、组织或器官的位置的方法，存在需求。在一些实施方案中，校准打印机头位置的方法包括使用至少一道激光。在进一步的实施方案中，校准打印机头位置的方法包括使用第一和第二激光。在一些实施方案中，校准打印机头位置的方法包括手动(例如目视)校准。在一些实施方案中，校准打印机头位置的方法包括手动校准和激光校准。在一些实施方案中，沿一个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，沿两个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和Z轴。在一些实施方案中，沿三个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，利用至少一道激光进行校准。在进一步的实施方案中，利用第一和第二激光进行校准。
使用水平激光进行校准的方法在某些实施方案中，本文公开了校准包含分配孔口的打印机头的位置的方法。在一些实施方案中，本文公开的方法进 一步包括激发激光并生成至少一道基本稳定和/或基本静止的激光束，并且其中所述激光束与地面平行。参见图1。在一些实施方案中，该方法包括沿至少一个轴校准打印机头位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，该方法包括沿至少两个轴校准打印机头位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，该方法包括沿至少三个轴校准打印机头位置，其中该轴选自X轴、y轴和Z轴。在一些实施方案中，该方法包括(a)沿y轴校准打印机头位置；(b)沿X轴校准打印机头位置；和/或(C)沿Z轴校准打印机头位置；其中各轴对应于笛卡尔坐标系中同名的轴。在一些实施方案中，利用至少一道激光进行校准。在一些实施方案中，利用第一和第二激光进行校准。在一些实施方案中，沿y轴校准打印机头位置包括:(a)定位打印机头，使得打印机头(i)位于第一 y卦限且(ii)分配孔口低于激光束的上阈限；(b)向激光束移动打印机头，并且在激光束被打印机头中断时立即停止所述移动，其中激光束被打印机头中断的位置是第一 y位置；(c)重新定位打印机头，使得打印机头位于第二 y卦限且分配孔口低于激光束的上阈限；(d)向激光束移动打印机头，并且在激光束被打印机头中断时立即停止所述移动，其中激光束被中断的位置是第二 I位置；(e)并计算第一 y位置和第二 y位置之间的中点。在一些实施方案中，沿X轴校准打印机头位置包括:(a)将打印机头定位(i)在第一y位置和第二y位置之间的中点且(ii)在激光的传感器阀限以外；和(b)向传感器阀限移动打印机头，并且在打印机头接触传感器阀限时立即停止所述移动；其中打印机头接触传感器的位置加上半个打印机头宽度为X位置。在一些实施方案中，沿y轴校准打印机头位置包括:(a)定位打印机头，使得激光束可测量打印机头的一侧的精确位置；(b)定位打印机头，使得激光束可测量打印机头的对侧的精确位置；(C)并相对于每次测量过程中的激光位置和测量的距离，计算打印机头的中点位置。在一些实施方案中，沿X轴校准打印机头位置包括:(a)定位打印机头，使得激光束可测量打印机头的一侧的精确位置；(b)定位打印机头，使得激光束可测量打印机头的对侧的精确位置；(C)并相对于每次测量过程中的激光位置和测量的距离，计算打印机头的中点位置。在一些实施方案中，沿z轴校准打印机头位置包括:(a)定位打印机头，使得分配孔口位于激光束上方；和(b)向激光束移动打印机头，并且在激光束被打印机头中断时立即停止所述移动，其中激光束被中断的位置是z位置。
使用垂直激光进行校准的方法在某些实施方案中，本文公开了校准包含分配孔口的打印机头的位置的方法。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括激发激光并生成至少一道基本稳定和/或基本静止的激光束，并且其中所述激光束与地面垂直。参见图2。在一些实施方案中，该方法包括沿至少一个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，该方法包括沿至少两个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，该方法包括沿至少三个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，该方法包括(a)沿y轴校准打印机头的位置；(b)沿x轴校准打印机头的位置；和(C)沿z轴校准打印机头的位置；其中各轴对应于笛卡尔坐标系中的同名轴。在一些实施方案中，沿y轴校准打印机头位置包括:(a)定位打印机头，使得打印机头⑴位于第一 y卦限且(·ii)分配孔口在激光的传感器阀限以外；(b)向激光束移动打印机头，并且在激光束被打印机头中断时立即停止所述移动，其中激光束被打印机头中断的位置是第一 y位置；(c)重新定位打印机头，使得打印机头位于第二 y卦限且分配孔口在激光的传感器阀限以外；(d)向激光束移动打印机头，并且在激光束被打印机头中断时立即停止所述移动，其中激光束被中断的位置是第二 y位置；(e)并计算第一 y位置和第二 y位置之间的中点。在一些实施方案中，沿X轴校准打印机头位置包括:(a)将打印机头定位(i)在第一 y位置和第二 y位置之间的中点，且(ii)在激光的传感器阀限以外；和(b)向传感器阀限移动打印机头，并且在打印机头接触传感器阀限时立即停止所述移动；其中打印机头接触传感器的位置加上半个打印机头宽度为X位置。在一些实施方案中，沿z轴校准打印机头位置包括:(a)定位打印机头，使得分配孔口位于激光束上方，使得其恰在激光传感器范围阀限以外；和(b)降低打印机头，直至达到传感器阀限，其中达到激光传感器阀限的位置是z位置。在一些实施方案中，在打印机头的多个点重复步骤(a)和(b)，并对测量的高度取平均值，以确定z位置。在一些实施方案中，沿z轴校准打印机头位置包括:(a)定位打印机头，使得激光束可以测量打印机头底部上的一个或多个点的精确位置；(b)基于该激光位置和已知的测量的距离，计算打印机头的绝对或平均位置。
使用垂直和水平激光进行校准的方法
在某些实施方案中，本文公开了校准包含分配孔口的打印机头的位置的方法，其中打印机头接附在生物打印机上，该方法包括沿至少一个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，该方法包括沿至少两个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和Z轴。在一些实施方案中，该方法包括沿至少三个轴校准打印机头的位置，其中该轴选自X轴、y轴和z轴。在一些实施方案中，该方法包括(a)沿y轴校准打印机头的位置；(b)沿x轴校准打印机头的位置；和(C)沿z轴校准打印机头的位置；其中各轴对应于笛卡尔坐标系中的同名轴。在一些实施方案中，校准包括使用第一激光和第二激光。在一些实施方案中，第一激光是垂直的激光，而第二激光是水平的激光。
使用激光进行校准的系统在某些实施方案中，本文公开了用于校准包含沉积孔口的墨盒的位置的系统，其中墨盒接附在生物打印机上，所述系统包含:用于沿至少一个轴校准墨盒位置的手段，其中该轴选自y轴、X轴和z轴。在某些实施方案中，本文还公开了用于校准包含分配孔口的打印机头的位置的系统，其中打印机头接附在生物打印机上，所述系统包含:用于沿X轴校准打印机头位置的手段；用于沿I轴校准打印机头位置的手段；和用于沿Z轴校准打印机头位置的手段。在一些实施方案中，用于校准打印机头位置的系统包含用于沿X轴、y轴和z轴校准打印机头的手段。在一些实施方案中，用于沿X轴、y轴和Z轴校准打印机头的手段是激光准直、光学准直、机械准直、压电准直、磁力准直、电场或电容准直、超声准直或其组合。在一些实施方案中，用于校准打印机头位置的系统包含用于沿X轴、y轴和z轴校准打印机头的手段。在一 些实施方案中，用于沿X轴、y轴和Z轴校准打印机头的手段是激光准直。在一些实施方案中，激光准直手段包含至少一道激光。在一些实施方案中，激光准直手段包含多道激光。在一些实施方案中，激光准直意味着其具有任何合适的精度。在各种实施方案中，合适的精度包括任意轴上约±5、10、20、30、40或50μπι的精度。在一些实施方案中，激光准直手段精确到垂直轴上±40 μ m和水平轴上±20 μ m。在一些实施方案中,在激光源和测量点之间的激光路径未中断。在一些实施方案中，通过使用反射表面或光学透镜，激光路径改变了最多179°。在一些实施方案中，激光路径改变了 90°。在一些实施方案中，使用水平激光束，通过利用反射表面偏转，在垂直路径上进行测量。在一些实施方案中，使用垂直激光束，通过利用反射表面偏转，在水平路径上进行测量。
实施例以下具体实施例仅应解释为说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余部分。无需进一步详述，相信本领域技术人员可以基于本文的描述最大程度地利用本发明。本文引用的所有出版物特此通过引用全文并入。其引用证明了此类信息的可用性和公开传播。
实施例1:HASMC-HAEC混合细朐圆梓体 细胞培养
平滑肌细胞:使原代人主动脉平滑肌细胞(HASMC)在补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml 青霉素、0.lmg/ml 链霉素、0.25 μ g/ml 两性霉素 B,0.0lM HEPES (全部来自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)、50mg/L 脑氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L 丙氛酸、50mg/L抗坏血酸和3 μ g/L CuSO4 (全部来自Sigma, St.Louis,MO)的低葡萄糖Dulbecco改良eagle培养基(DMEM ；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)中于 37°C和 5% CO2 下保持和扩充。在所有研究中使用第4代至第8代的HASMC的铺满培养物。内皮细胞:使原代人主动脉内皮细胞(HAEC)在补充有2% FBS, I μ g/ml氢化可的松、10ng/ml人表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10 μ g/ml肝素、100U/ml青霉素,0.lmg/ml 链霉素和 0.25 μ g/ml 两性霉素 B (全部来自 Invitrogen Corp.，Carlsbad,CA)的培养基200中保持和扩充。细胞在37°C和5% CO2下在经明胶(来自猪血清；Sigma，St.Louis,MO)包被的组织培养基处理的培养瓶中生长。在所有研究中使用第4传至第8代的HAEC的铺满培养物。
NovoGel 模具2% w/v NovoGel 溶液的制备:将Ig低熔点NovoGel 在50mlDulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中溶解。简言之，在加热板上将DPBS和NovoGel 加热到85°C，持续搅拌直到NovoGel 完全溶解。通过在125°C下蒸汽灭菌25分钟对NovoGel 溶液进行灭菌。只要温度保持在66.50C以上，NovoGel 溶液就停留在液相。低于这一温度则发生相变，NovoGel 溶液的粘度增加，且NovoGel 形成固体凝胶。NovoGel 模具的制备:使用适合IOcm培养皿的丁eflon_'R模具，制造用于温育细胞圆柱体的NovoGel 模具。简言之，使用70%乙醇溶液对Tefl01^模具进行预先灭菌，并使模具经受紫外线照射45分钟。将灭菌的模具放置在IOcm培养皿(VWR International LLC,ffestChester, PA)顶上并牢固接附。使这一组装件(Teflon 模具+培养皿)保持垂直，并将45ml预温热的无菌2% NovoGel 溶液倒入Teflon 模具和培养皿之间的空间中。然后将组装件在室温下水平放置I小时，以使NovoGel 完全胶凝。胶凝后，移除TeflonR印模，并用DPBS洗涤No voGel 模具两次。然后向NovoGel 模具添加17.5mlHASMC培养基。
HASMC-HAEC 圆柱体HASMC-HAEC混合细胞圆柱体的制造:为了制备混合细胞圆柱体，单独收集HASMC和HAEC，然后以预定比例混合。简言之，从铺满培养瓶中除去培养基，并用DPBS(lml/5cm2生长区域)洗涤细胞。通过在胰蛋白酶(lml/15cm2生长区域)的存在下温育10分钟，使细胞从培养瓶表面脱离。使用0.15%胰蛋白酶使HASMC脱离，而使用0.1 %胰蛋白酶使HAEC脱离。温育后向瓶中添加适当的培养基(相对于胰蛋白酶体积的2X体积)。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，接着完全移除上清液。将细胞沉淀在各自的培养基中重悬，并使用血细胞计数器进行计数。合并适当体积的HASMC和HAEC，产生含有5、7.5、10、12.5和15%HAEC(作为总细胞群的％)的混合细胞悬浮液。将该混合细胞悬浮液在200g下离心5分钟，接着完全移除上清液。将混合细胞沉淀在6ml HASMC培养基中重悬，并将其转移到20ml玻璃小瓶中，接着在37°C和5% CO2下在定轨摇床上于150rpm培养60分钟。这使得细胞彼此聚集并开始细胞间粘附。培养后，将细胞悬浮液转移到15ml离心管中并在200g下离心5分钟。移除上清液培养基后，将细胞沉淀在400 μ I HASMC培养基中重悬，并用移液器上下抽吸数次，以确保所有的细胞簇被打碎。将细胞悬浮液转移到放置在15ml离心管内的
0.5ml微量离心管(microfuge tube)中，接着在2000g下离心4分钟，以形成高度密集且致密的细胞沉淀。吸去上清液培养基，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(OD 1.0mm, ID 0.5mm,
T,75mm ；Drummond Scientific C0.,BroomalI,PA)中，以便产生长度为 50mm 的细胞圆柱体。将毛细管内部的细胞糊在37°C和5% CO2下于HASMC培养基中培养20分钟。然后使用与毛细管一起提供的柱塞，将细胞圆柱体从毛细管沉积到NovoGel 模具(用HASMC培养基覆盖)的凹槽中。将细胞圆柱体在37°C和5% CO2下培养24和48小时。
实施例2:多层血管 细胞培养平滑肌细胞:将原代人主动脉平滑肌细胞(HASMC ；GIBC0)在补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml 青霉素、0.lmg/ml 链霉素、0.25 μ g/ml 两性霉素 B,0.0lM HEPES (全部来自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)、50mg/L 脑氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L 丙氛酸、50mg/L抗坏血酸和3 μ g/L CuSO4(全部来自Sigma, St.Louis, MO)的低葡萄糖dulbecco改良的eagle培养基(DMEM)中于37°C和5% CO2保持和扩充。在所有研究中使用第4代至第8代的HASMC的铺满培养物。内皮细胞:将原代人主动脉内皮细胞(HAEC)在补充有2% FBS、1 μ g/ml氢化可的松、10ng/ml人表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10 μ g/ml肝素、100U/ml青霉素、0.lmg/ml 链霉素和 0.25 μ g/ml 两性霉素 B (全部来自 Invitrogen Corp.，Carlsbad,CA)的培养基200中保持和扩充。使细胞在37°C和5% CO2下在经明胶(来自猪血清)包被的组织培养基处理的培养瓶中生长。在所有研究中使用第4代至第8代的HAEC的铺满培养物。成纤维细胞:将原代人皮肤成纤维细胞(HDF)在补充有2 % FBS、I μ g/ml氢化可的松、10ng/ml人表皮生长因子、3ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10 μ g/ml肝素、100U/ml青霉素和0.lmg/ml链霉素(全部来自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)的培养基106中于37°C和5% CO2保持和扩充。在所有研究中使用第4代至第8代HDF的铺满培养物。
NovoGel 溶液和模具2%和4% (w/v)NovoGel 溶液的制备:将Ig或2g(分别对于2%或4% )低熔点NovoGel (超纯LMP)在50ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中溶解。简言之，在持续搅拌下，将DPBS和NovoGel 在加热板上加热到85°C，直到NovoGel 完全溶解。通过在125°C下蒸汽灭菌25分钟对NovoGel 溶液进行灭菌。只要温度保持在66.5°C以上，NovoGel 溶液就停留在液相。低于这一温度则发生相变，NovoGel 溶液的粘度增加，且NovoGel 形成固体凝胶。NovoGel 模具的制备:使用适合IOcm培养皿的Teflon^.模具，制造用于培养细胞圆柱体的NovoGel 模具。简言之，使用70%乙醇溶液对Teflcn^模具进行预先灭菌，并使模具经受紫外线照射45分钟。将灭菌的模具放置在IOcm培养皿顶上并牢固接附。使这一组装件(Teflon &模具+培养皿)保持垂直，并将45ml预温热的无菌2% NovoGel 溶液倒入Teflonp'和培 养皿之间的空间中。然后将组装件在室温下水平放置I小时，以使NovoGel 完全胶凝。胶凝后，移除Teflon 印模，并用DPBS洗涤NovoGel 模具两次。然后，向NovoGel 模具添加17.5ml HASMC培养基以便培养HASMC-HAEC混合细胞圆柱体，或者向NovoGel 模具添加17.5ml HDF培养基以便培养HDF细胞圆柱体。
细胞圆柱体HASMC-HAEC混合细胞圆柱体的制造:为了制备混合细胞圆柱体，单独收集HASMC和HAEC，然后以预定比例混合。简言之，从铺满培养瓶中移除培养基，用DPBS(lml/5cm2生长区域)洗涤细胞。通过在胰蛋白酶(lml/15cm2生长区域)的存在下温育10分钟，使细胞从培养瓶表面脱离。使用0.15%胰蛋白酶使HASMC脱离，而使用0.1 %胰蛋白酶使HAEC脱离。温育后，向瓶中添加适当的培养基(相对于胰蛋白酶体积的2X体积)。使细胞悬浮液在200g下离心6分钟，接着完全移除上清液。使细胞沉淀在各自的培养基中重悬，并使用血细胞计数器进行计数。合并适当体积的HASMC和HAEC，以产生含有15% HAEC和剩余85%的HASMC(作为总细胞群的百分比)的混合细胞悬浮液。将该混合细胞悬浮液在200g下离心5分钟，接着完全移除上清液。使混合细胞沉淀在6ml HASMC培养基中重悬，并将其转移到20ml玻璃小瓶中，接着在37°C和5% CO2下在定轨摇床上于150rpm培养60分钟。这使细胞彼此聚集并开始细胞间粘附。培养后，将细胞悬浮液转移到15ml离心管中，在200g下离心5分钟。移除上清液培养基后，使细胞沉淀在400 μ I HASMC培养基中重悬，用移液器上下抽吸数次，以确保所有的细胞簇被打碎。将细胞悬浮液转移到放置在15ml离心管内的
0.5ml微量离心管中，接着在2000g下离心4分钟，以形成高度密集且致密的细胞沉淀。吸去上清液培养基，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(0D 1.0mm, ID 0.5mm, L 75mm)中，以便产生长度为50mm的细胞圆柱体。将毛细管内部的细胞糊在37 °C和5 % CO2下于HASMC培养基中培养20分钟。然后使用与毛细管一起提供的柱塞，将细胞圆柱体从毛细管沉积到NovoGel 模具(用HASMC培养基覆盖)的凹槽中。将细胞圆柱体在37°C和5% CO2下培养24小时。HDF细胞圆柱体的制造:使用与制备HASMC-HAEC混合细胞圆柱体类似的方法制备HDF圆柱体。简言之，从铺满的HDF培养瓶中移除培养基，并用DPBS(lml/5cm2生长区域)洗涤细胞。通过在胰蛋白酶(0.l%;lml/15cm2生长区域)的存在下温育10分钟，使细胞从培养瓶表面脱离。温育后，向瓶中添加HDF培养基(相对于胰蛋白酶体积的2X体积)。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，接着完全移除上清液。使细胞沉淀在6ml HDF培养基中重悬，并将其转移到20ml玻璃小瓶中，接着在37°C和5% CO2下在定轨摇床上于150rpm培养75分钟。培养后,将细胞悬浮液转移到15ml离心管中，并在200g下离心5分钟。移除上清液培养基后，使细胞沉淀在400 μ I HDF培养基中重悬，并用移液器上下抽吸数次，以确保所有的细胞簇被打碎。将细胞悬浮液转移到放置在15ml离心管内的0.5ml微量离心管中，接着在2000g下离心4分钟，以形成高度密集且致密的细胞沉淀。吸去上清液培养基，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(0D 1.0mm, ID 0.5mm，L 75mm)中，以便产生长度为50mm的细胞圆柱体。将毛细管内部的细胞糊在37°C和5% CO2下在HDF培养基中培养20分钟。然后将细胞圆柱体从毛细管沉积到NovoGel 模具(用HDF培养基覆盖)的凹槽中。将细胞圆柱体在37°C和5% CO2下培养24小时。
多层血管的制造NovoGel 基板的制备:通过将IOml预温热的(> 40°C )NovoGel (2% w/v)分配到IOcm培养皿中来制造NovoGel 基板。分配后NovoGel 立即均勻扩散,从而覆盖整个皿底并形成均匀层。将培养皿在室温下温育20分钟，以使NovoGel 完全胶凝。多层血管:使用HDF圆柱体和HASMC-HAEC混合细胞圆柱体制造由HDF外层和HASMC-HAEC内层组成的血管。采用如图4中所示的几何排列。简言之，在24小时培养期结束时，将成熟的HDF和HASMC-HAEC圆柱体吸回毛细管中并置于适当的培养基中直至进一步使用。由NovoGel 棒组成的支撑结构如下制备:将预温热的2% NovoGel 吸入到毛细管(L=50mm)中，并在冷PBS溶液(4°C )中快速冷却。5cm长的胶凝的NovoGel 圆柱体从毛细管放下(使用柱塞)，并且直接放倒在NovoGel 基板上。第二个NovoGel 圆柱体与第一个毗连，重复该过程直至放置10个NovoGel 圆柱体，从而形成第一层。此时将20 μ I PBS分配到NovoGel 圆柱体上方以保持其湿润。进一步将六个NovoGel 圆柱体在如图4中所示的位置处放到第I层之上(第2层)。然后在位置4、5和6放置三个HDF圆柱体，以完成第2层。分配各个HDF圆柱体后，在放置的圆柱体的上方分配40 μ IHDF培养基，以帮助随后的圆柱体的放置并防止细胞圆柱体脱水。接下来放置第3层的NovoGel 圆柱体，紧接着在位置3和6放置HDF圆柱体。用HDF培养基再润湿该结构后，在位置4和5放倒HASMC-HAEC混合圆柱体。随后，在细胞圆柱体的上方分配40 μ IHASMC培养基和40 μ I HDF培养基。通过在位置I和7放置NovoGel 圆柱体，在位置2和6放置HDF圆柱体，在位置3和5放置HASMC-HAEC混合圆柱体，最后在位置4放置4% NovoGel 圆柱体，完成第4层。类似地，通过在图4中所示的位置放倒NovoGel 圆柱体接着是HDF圆柱体最后是HASMC-HAEC圆柱体，完成第5、6和7层。一旦整个构建体完成，将0.5ml温热的NovoGel 分配到该构建体的各端上，并使其在室温下胶凝5分钟。在该NovoGel 胶凝后，向培养皿添加30ml HASMC培养基(以确保整个构建体完全浸没)。将构建体在37°C和5% CO2下培养24小时，以允许细胞圆柱体之间的融合。在24小时结束时，从融合的多层血管移除周围的NovoGel 支撑结构。
实施例3:生物打印机组装生物打印机。生物打印机包含打印机头，打印机头具有用于夹持墨盒的筒夹夹头夹具和用于分配墨盒的内容物的活塞。使用的墨盒是长度为75-85_的玻璃微毛细管。每次需要生物墨水或支撑材料时，装载新的毛细管。为了打印结构，在打印过程的持续期间，也就是在新的毛细管装载到打印机头中时，需要±20 μ m的分配位置可重复性。为了保持所有装载的毛细管在x、y和z方向上相对于同一点的可重复性，生物打印机包含用于校准微毛细管位置的激光校准系统。激光校准系统将所有毛细管尖端的位置校准到共同参照位置。所有打印移动都是相对于这一参照位置作出的。通过使用单激光测距传感器，校准所有三个轴(x、y和z轴)。该系统由激光传感器和激光束组成。传感器阀限是激光传感器的最大感应距离。传感器设置为忽略比预定义的阀限更远的所有信号。传感器使用三角测量来确定与对象(毛细管尖端)的距离。激光传感器定向为使光束垂直向上对准(+z轴)。
垂直激光校准对于X轴上的校准:将毛细管尖端移动到激光传感器的范围中，尖端在激光束的左侧(-X)。将毛细管向+X方向移动，直到传感器检测到毛细管边缘，并记录这一位置。从对侧重复以上步骤(即，尖端放置在激光束右侧(+X)并向-X方向移动，直到传感器检测到毛细管边缘)。对来自两个步骤的位置取平均值，以计算毛细管的中点。任选地，对不同y位置重复以上过程，并对计算的中点取平均值。对于y轴上的校准:对y轴重复以上(对于X轴的)程序。对于z轴上的校准:毛细管尖端移动到传感器束上方，使得该束击中毛细管的底部表面，且尖端恰在传感器范围阀限以外。降低毛细管，直至达到传感器阀限，该位置记录为z位置。任选地，在毛细管尖端表面上的多个点重复以上步骤，并对测量的高度取平均值。
水平激光校准对于y轴上的校准:移动毛细管，使得尖端恰低于激光束的高度，并且毛细管向一侧离开(以y方向)。毛细管以y方向朝向激光移动。当激光传感器检测到毛细管反射的束时，停止毛细管并记录这一位置。重复以上步骤，让毛细管向激光的另一侧离开，以_y方向移动。将来自以上步骤的中点记录为y位置。对于X轴上的校准:使用y轴上的校准结果，移动y轴，使得激光集中于毛细管上。移动毛细管越过传感器阀限，并向传感器移动。在毛细管越过传感器阀限且传感器输出发生变化时，立即停止毛细管。将这一位置加上1/2毛细管宽度(来自y校准)记录为X位置。对于z轴上的校准:将毛细管从X位置上移，直至其摆脱激光束。毛细管尖端朝向激光束下移，并且在激光束中断时立即停止(使用与对于y轴相同的过程)。将这一位置记录为Z位置。
毛细管准备在从毛细管打印·之前，准备好毛细管内部的生物墨水或支撑材料，使得生物墨水或支撑材料将恰好在毛细管的尖端处开始打印。使用校准激光来准备毛细管。毛细管尖端移动到恰在激光束上方，其中该束集中在y轴上。尖端在激光束上方20-100 μ m处。向下驱动打印机头中的分配活塞，直至生物墨水或支撑材料开始从毛细管尖端向外分配并中断激光束。通过反向驱动活塞(20-100μπι)将分配的生物墨水或支撑材料吸回毛细管中。于是毛细管被准备好以备分配。
NovoGel 毛细管清洁NovoGel 用作支撑材料。为了除去粘在毛细管外表面上的过量NovoGel 并避免过量的NovoGel 影响打印质量,除去过量的NovoGel 。将擦拭部件(wiping feature)集成到散装(bulk)NovoGel 容器中。散装NovoGel 容器配备有标准医疗小瓶，该小瓶具有用于接附隔膜的开盖。隔膜配置为在1-2_厚的硅胶的中心具有十字切口。通过将毛细管穿过隔膜浸入散装NovoGel 容器中并抽吸NovoGel ，在其离开容器时，将过量的NovoGel 从毛细管上擦去，并留在散装容器中。
血管结构的打印如上所述组装生物打印机和墨盒。生物打印机具有台，该台含有用于接收由生物打印机生成的结构的培养皿。培养皿用NovoGel 包被。血管结构的二维表示形式(参见例如图4)由用户输入到软件程序中，进入与生物打印机连接的计算机中。血管结构的二维表示形式由HASMC-HAEC混合细胞圆柱体、HDF圆柱体的棒和限定了血管结构的空隙并围绕血管结构的NovoGel 棒组成。HASMC-HAEC混合细胞圆柱体和HDF细胞圆柱体如实施例1所述制备，并吸入毛细管中以供插入到打印机头的筒夹夹头中。或者，将毛细管装载到打印机头中并浸入散装NovoGel 容器中，并将NovoGel 吸到毛细管中。使用垂直激光校准系统来校准毛细管。当将来自软件程序的命令提供给生物打印机时，生物打印机将在预定位置打印三维结构(在HASMC-HAEC棒、HDF棒和NovoGel 棒之间交替)到培养皿上。参见实施例2。将各个棒放置到培养皿上之后，用少量培养基将棒润湿。一旦整个构建体完成，将温热的NovoGel 分配到构建体的各端上，使其在室温下胶凝，并向培养皿添加细胞培养基以浸没整个构建体。然后将该构建体在37°C和5% CO2下温育，以促使细胞圆柱体之间的融合。在温育时间结束时，从融合的多层血管移除周围的NovoGel 支撑结构。虽然本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但应当理解，能够对本发明的方法作进一步修改。本专利申请旨在涵盖本发明的任何变化、用途或改动，其一般遵循本发明的原理并且包括与本公开内容相比的偏差，这些偏差在本发明所属领域的已知或惯用实践范围内，在阐述前可应用于本文中的基本特`征，并且落在所附权利要求的范围内。
权利要求
1.一种生物打印机，其包含: a.一个或多个打印机头，其中该打印机头包含用于接收和夹持至少一个墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含选自以下一种或多种的内容物: 1.生物墨水，和 .支撑材料； b.用于校准至少一个墨盒的位置的手段；和 c.用于分配至少一个墨盒的内容物的手段。
2.如权利要求1所述的生物打印机，其中所述用于分配至少一个墨盒的内容物的手段是应用活塞、应用压力、应用压缩气体、液压技术或其组合。
3.如权利要求1所述的生物打印机，进一步包含用于调节温度的手段。
4.如权利要求3所述的生物打印机，进一步包含用于调节环境温度、墨盒温度、墨盒内容物温度、接收表面温度或其组合的手段。
5.如权利要求4所述的生物打印机，其中所述用于调节温度的手段是加热元件。
6.如权利要求5 所述的生物打印机，其中所述用于调节温度的手段是辐射加热器、对流加热器、传导加热器、风扇加热器、热交换器或其组合。
7.如权利要求4所述的生物打印机，其中所述用于调节温度的手段是冷却元件。
8.如权利要求7所述的生物打印机，其中所述用于调节温度的手段是冷却剂容器、冷冻液、冰、辐射冷却器、对流冷却器、传导冷却器、风扇冷却器或其组合。
9.如权利要求1所述的生物打印机，进一步包含用于向以下一种或多种应用润湿剂的手段: a.打印机台； b.接收表面； c.沉积孔口； d.生物墨水； e.支撑材料；和 f.打印的构建体； 其中在一个或多个时间点应用润湿剂，该时间点选自:通过生物打印机分配生物墨水或支撑材料之前、与分配基本同时和通过生物打印机分配生物墨水或支撑材料之后。
10.一种校准包含沉积孔口的墨盒的位置的方法，其中所述墨盒接附在生物打印机上，该方法包括:沿至少一个轴校准墨盒位置；其中所述轴选自X轴、y轴和z轴；并且其中利用激光进行各校准。
11.如权利要求10所述的方法，其中利用激光沿至少一个轴校准墨盒位置包括: a.沿轴定位激光束； b.沿与激光束轴垂直的轴移动所述墨盒，并且在激光束被墨盒中断时立即停止所述移动，其中记录激光束被中断的位置； c.在激光束的路径内沿激光束的相同轴移动墨盒，并且在达到传感器阀限时立即停止所述移动，其中记录达到传感器阀限的位置； d.定位墨盒，使得激光束能够测量墨盒上一个或多个点的精确位置；和 e.在一个或多个轴上重复步骤(a)、(b)、(c)和(d)中的一个或多个，并对记录的位置进行计算，以确定墨盒在空间中的位置。
12.一种用于校准包含沉积孔口的墨盒的位置的系统，其中所述墨盒接附在生物打印机上，所述系统包含:用于沿至少一个轴校准墨盒位置的手段，其中所述轴选自y轴、X轴和Z轴。
13.如权利要求12所述的系统，其中所述用于校准墨盒位置的手段是激光准直、光学准直、机械准直、压电准直、磁力准直、电场或电容准直、超声准直或其组合。
14.一种用于制造组织构建体的方法，包括: a.计算机模块接收期望的组织构建体的视觉表示的输入； b.计算机模块生成一系列命令，其中该命令基于该视觉表示且可被生物打印机读取； c.计算机模块将该系列命令提供给生物打印机；和 d.生物打印机按照该命令沉积生物墨水和支撑材料，以形成具有限定的几何形状的构建体。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述视觉表示包含将期望的组织构建体的一个或多个元素识别为以下一种或多种: a.生物墨水； b.生物墨水的具体组成； c.支撑材料；和 d.支撑材料的具体组成。
16.一种接收表面，其用于接收由如权利要求1所述的生物打印机沉积的一个或多个结构，其中该接收表面是基本平坦或基本光滑的。
17.一种接收表面，其用于接收由如权利要求1所述的生物打印机沉积的一个或多个结构，其中该接收表面的形貌被设计为适应或影响一个或多个沉积的结构的大小、形状或纹理，或者几何形状。
全文摘要
本文描述了生物打印机，其包含一个或多个打印机头，其中打印机头包含用于接收和夹持至少一个墨盒的手段，并且其中所述墨盒包含选自以下一种或多种的内容物生物墨水和支撑材料；用于校准至少一个墨盒的位置的手段；和用于分配至少一个墨盒的内容物的手段。本文进一步描述了用于制造组织构建体的方法，包括计算机模块接收期望的组织构建体的视觉表示的输入；计算机模块生成一系列命令，其中该命令基于该视觉表示且可被生物打印机读取；计算机模块将该系列命令提供给生物打印机；和生物打印机按照该命令沉积生物墨水和支撑材料，以形成具有限定的几何形状的构建体。
文档编号B41J2/01GK103249567SQ201180050831
公开日2013年8月14日 申请日期2011年9月27日 优先权日2010年10月21日
发明者基思·墨菲, 斯科特·多尔夫曼, 内森·史密斯, 拉里·鲍文斯, 伊恩·索恩, 堤姆·麦克唐纳, 克里斯·利-兰开斯特, 理查德·金·洛 申请人:奥加诺沃公司