专利名称：一种颈椎间盘退变模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及动物模型的建立方法，具体涉及动静力失衡后颈椎间盘退变模型的建立方法。
本发明公开的颈椎间盘退变模型即动静力失衡性实验动物颈椎间盘退变模型的建立方法是通过下述方法实现的选择清洁级实验动物，在颈背部正中纵向切口，切开皮肤后，充分游离各层肌肉，横向切断深群颈夹肌和头、颈、寰最长肌，切除颈髂肋肌与头半棘肌，然后再依次切除C2-C7棘上和棘间韧带，彻底止血后缝合皮肤，红霉素软膏外涂防止感染，3月后即成，到5月、7月椎间盘退变更严重。
本发明所述实验用动物可以是各种实验用种系的兔，各种实验用种系的大鼠，各种实验用种系的小鼠，各种实验用种系的豚鼠，各种实验用种系的犬，各种实验用种系的猴和各种实验用种系的羊等。
下面通过详细的试验结果来说明本发明颈椎间盘退变模型的建立方法和实验观察结果。
动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型建立的方法(一)对象与方法1.对象与分组8月龄清洁级SD大鼠60只，体重400±20g。随机分为3月、5月、7月对照组和模型组，每组10只。对照组不手术，模型组于术后3、5、7月沿上、下软骨终板与椎体的交界面切下椎间盘。2.造模方法取颈背部正中纵向切口，长约2-2.5cm，切开皮肤后，充分游离各层肌肉，横向切断深群颈夹肌和头、颈、寰最长肌，切除颈髂肋肌与头半棘肌，然后再依次切除C2-C7棘上和棘间韧带，彻底止血后缝合皮肤，红霉素软膏外涂防止感染。(二)实验结果1.组织形态学观察椎间盘HE染色，显微镜下观察。3、5月对照组椎间盘由排列规则的纤维环和髓核组成，软骨终板钙化层和非钙化层清晰(
图1、图2)；3月模型组纤维环出现裂隙，髓核皱缩，软骨终板不规则增生；7月对照组有类似表现(图3、图4)；5月模型组髓核完全纤维化，纤维环板层状结构消失，多数椎间盘突出，部分软骨终板凸向椎体内，血管芽稀少，周边不规则(图5)；7月模型组椎间盘内部结构与5月模型组相似，部分椎体边缘骨赘形成(图6)。按照Miyamoto分级标准将椎间盘退变程度分为1-5级，分别规定为1、2、3、4、5分。
表1 大鼠颈椎间盘退变程度Miyamoto分级评分值(x±s)组别 N形态学分级评分3月对照组101.30±0.483月模型组102.70±0.68△△5月对照组101.40±0.525月模型组103.10±0.87△△7月对照组101.70±0.827月模型组104.40±0.70△△☆☆
注同一时间段组间比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；5月、7月模型组与3月模型组间比较☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。以下表格说明相同。
各个正常组之间比较，椎间盘退变程度逐渐增加，但无组间差异(P＞0.05)；模型组与同组对照组比较，5月、7月模型组与3月模型组比较，分值都明显升高(P＜0.01)。2.血管芽数量、面积、软骨终板厚度测量CMIAS-99B型医学图像分析系统。采用Disector自动计数法和体视学分析技术。
表2 大鼠软骨终板交界面血管芽数量、面积(x±s)组别 数量(个) 平均面积(μm2)3月对照组11.02±1.38 3.76±0.613月模型组10.17±1.93 4.35±0.845月对照组12.19±2.16 3.92±0.345月模型组6.07±1.32△△☆☆2.23±0.53△☆☆7月对照组10.86±1.35 3.51±0.837月模型组8.23±1.67△☆2.06±0.67△☆☆各个模型组血管个数较正常组减少，5月、7月模型组变化明显，与3月模型组及同期正常组比较，P＜0.01。3月模型组血管密度降低，但单位平均面积增加；5月模型组血管密度和单位平均面积都明显降低。
表3 大鼠软骨终板厚度比较(单位μm，x±s)组别钙化层 非钙化层3月对照组 7.25±1.746.03±2.313月模型组 8.23±2.114.05±1.13△5月对照组 6.79±1.325.12±2.565月模型组 14.17±2.61△△☆☆2.95±2.37△△☆☆7月对照组 7.79±2.053.90±1.437月模型组 16.14±3.53△△☆☆2.43±1.33△△☆正常组钙化层波动在一定范围内，非钙化层有逐渐减少的趋势；各个模型组比较，钙化层厚度逐渐增加，非钙化层厚度逐渐减少，5月、7月模型组与各个正常组及3月模型组比较，变化明显(P＜0.01)。3.大鼠颈椎间盘细胞凋亡的观察采用透射电镜法，TUNEL法，流式细胞仪PI标记法。3.1.透射电镜观察正常软骨细胞核卵圆状，核表面光滑，有完整的核膜；细胞质中可见排列整齐的粗面内质网和线粒体、溶酶体，细胞膜完整(图7)；退变软骨细胞外形不规则，核表面不光滑，核膜皱缩，核内以异染色质为主(图8)；凋亡软骨细胞细胞外形不规则，核膜皱缩、内陷，染色质离散且靠近核膜，核内出现透明区；细胞质浓缩，细胞器少，有较多空泡结构(图9)。各个模型组正常细胞少，退变与凋亡细胞较多。3.2.TUNEL法观察对照组椎间盘中凋亡细胞(细胞内有淡棕色颗粒)较少(图10)，模型组凋亡细胞数多(图11)，对照实验样本中没有阳性细胞出现(图12)。3.3.流式细胞仪PI法观察凋亡细胞正常椎间盘亚G1峰低平，退变椎间盘G0-G1期的前方出现凋亡细胞峰，3月、5月模型组凋亡细胞峰高而尖，高于对照组，7月模型组与5月模型组类似。
表4 大鼠颈椎间盘中细胞凋亡百分率比较(x±s)组别TUNEL法(％) 流式细胞仪PI法(％)3月对照组 20.36±2.8710.87±1.073月模型组 27.73±4.12△21.45±2.23△△5月对照组 20.59±3.2613.09±1.555月模型组 36.59±5.93△△☆☆37.56±3.82△△☆☆7月对照组 24.68±4.2014.90±1.357月模型组 36.36±5.13△△☆☆28.02±3.48△△☆各组椎间盘退变后细胞凋亡百分率较对照组明显增高(P＜0.05)。两种方法进行相关性分析，发现PI法和TUNEL法比较呈显著正相关(r＝0.90)。细胞凋亡可能是细胞密度降低的主要原因。Gruber等对腰椎间盘突出症患者手术取出的椎间盘组织进行细胞凋亡检测的研究发现，在退变的椎间盘标本中，椎间盘细胞的凋亡率高达53-73％。我们通过以上方法相互印证，表明椎间盘退变后椎间盘内细胞凋亡明显增加。4.间盘组织PGE2、6-keto-PGF1α测定采用ELISA法。
表5椎间盘中PGE2和6-酮-PGF1α含量(各组n＝10，x±s)组别 PGE2(ng/ml) 6-酮-PGF1α(ng/ml)3月对照组 11.20±1.79 10.35±1.533月模型组 18.03±4.71△16.94±1.58△△5月对照组 12.26±1.75 11.91±1.935月模型组 21.74±3.17△△20.42±1.15△△☆☆7月对照组 11.08±1.41 13.19±2.307月模型组 14.65±2.33△19.30±2.67△△正常组之间比较无统计学差异(P＞0.05)，模型组与对照组比较，三个时间段组间PGE2和6-酮-PGF1α都明显升高(P＜0.05-0.01)；7月模型组6-酮-PGF1α较3月组明显升高(P＜0.05)。5.胶原酶活性的检测采用3H-I型胶原蛋白作为底物法。
表6椎间盘中MMP-1活性(各组n＝10，x±s)组别 MMP-1(IU/g)3月对照组2.68±0.593月模型组3.39±0.735月对照组3.69±0.855月模型组7.77±0.92△△☆☆7月对照组3.51±0.987月模型组6.25±0.99△△☆☆正常组之间比较无统计学差异(P＞0.05)，模型组与对照组比较，7月和5月组间MMP-1明显升高(P＜0.01)。7月和5月模型组MMP-1较3月组明显升高(P＜0.05)。6.大鼠颈椎间盘组织基因表达谱的研究基因芯片技术。采用Biodoor Chip 512基因表达谱芯片，进行生物信息学分析。
以5月对照、模型组大鼠椎间盘组织中抽提出mRNA作为标记探针，模型组以cy5为标记，对照组以cy3为标记。图13是散点图，代表Cy3(对照组)和Cy5(模型组)荧光信号比值的离散程度，愈靠近X轴或Y轴表明该点基因差异表达愈显著。
表7大鼠椎间盘基因表达谱accession Classification Ratio DefinitionZ17227 细胞信号和传递蛋白类 2.69 Homo sapiens mRNA for transmebranereceptor protein.X56134 细胞骨架和运动类 3.46 Human Mrna for vimentin.D84657 代谢类 2.59 Homo sapiens mRNA for photolyasehomologAF028832 外压反应蛋白类 3.73 Homo sapiens Hsp89-alpha-delta-NmRNAAB008226 未知 3.41 Homo sapiens FCMD mRNA for fukutinL26081 未知 2.85 Homo sapiens semaphorin-III(Hsema-I)MrnaM63838 免疫相关类 2.86 Interferon-gamma induced protein geneX98801 细胞信号和传递蛋白类 0.32 H.sapiens mRNA for dynactin.X79444 DNA合成、转录因子类 0.36 H.sapiens endonuclease G (ENDOG)mRNA.U13261 蛋白质翻译合成类 0.28 Homo sapiens eIF-2-associated p67homolog MrnaL19185 细胞信号和传递蛋白类 0.30 Human natural killer cell enhancing factor(NKEFB)MrnaD00726 代谢类/免疫相关类0.17 Human mRNA for ferrochelatase(EC4.99.1.1).L40636 细胞信号和传递蛋白类 0.29 Homo sapiens(clone FBK III 16)proteintyrosine kinase(PTK) mRNA，M33680 细胞周期蛋白类 0.38 cell surface protein TAPA-1mRNAD63475 免疫相关类 0.39 Human mRNA for KIAA0109 geneM95809 蛋白质翻译合成类 0.33 Human basic transcription factor 62kDsubunitM98399 细胞信号和传递蛋白类 0.36 Human antigen CD36(clone 21)mRNA，AF003522 未知 0.35 Homo sapiens Delta mRNA.
正常组与模型组之间表达明显的基因比较(ratio＝模型组/正常组)，11条基因在颈椎间盘退变表达量明显下降(ratio＜0.4)，而7条基因在颈椎间盘退变时表达量明显上升(ratio＞2.5)。其中细胞信号和传递蛋白类表达情况如图14所示。
本发明发现细胞信号和传递蛋白类基因表达变化的有5条，其中下调的有4条。酪氨酸蛋白激酶(L40636)在退变椎间盘组织中下调(ratio＝0.29)。许多生长因子受体和多数癌基因产物具有PTK活性，在调节细胞增殖、粘附和迁移的过程中起重要作用。我们推测退变椎间盘中可能存在多种生长因子受体的持续激活，从细胞分子水平认为其椎间盘退变的实质可能是椎间盘细胞外基质的降解及基质与细胞粘附功能减退，导致输入细胞中的各种“存活信号”转导中断，细胞失去赖以生存的信号环境刺激而凋亡。
本发明通过切除实验动物颈棘上、棘间韧带造成颈椎静力失衡，当造模3个月之后，诱发了颈椎病动物模型；本发明曾通过手术直接破坏了大鼠颈背部浅层、深层及全层肌肉，6个月之后，建立了颈椎动力失衡性颈椎病动物模型。发现椎间盘突向硬膜囊，纤维环肿胀、变性、纤维断裂类似颈椎退行性病变的改变，从而证实颈椎肌肉的损伤可加速颈椎的退变。以上实验结果说明，仅仅是颈部动力性失衡就可以导致颈椎间盘退变，但其退变程度往往没有静力性失衡严重，且颈部动力性失衡必须通过诱导静力性失衡才能诱导颈椎间盘退变。综合上述研究，本发明提出“动力失衡为先，静力失衡为主”的颈椎病病机学说。同时认为椎间盘退变的实质是椎间盘细胞外基质降解和细胞内外信号传导降低导致的椎间盘细胞发生凋亡，指出退变的不同阶段上述表现各有轻重。说明颈椎病可以采用中药改善椎间盘营养供应、抑制椎间盘内化学性炎症和局部免疫反应，减少细胞凋亡，通过推拿、导引、医疗体操、理疗、中药内服、外敷等手段改善肌肉的肌力状态，恢复颈椎的动力平衡，纠正或补偿静力平衡，重建颈椎力学平衡系统，从而防治颈椎病的发生与发展。
本发明公开的实验动物动静力失衡性颈椎间盘退变模型，操作简单，模型显现准确，提出了颈部力学失衡是导致颈椎间盘退变的原因，为颈椎病的实验研究、非手术治疗和术后康复提供了理论依据及可靠的实验模型。
核膜皱缩、固缩，核内异染色质；细胞质中细胞器异常(×10000)图9凋亡软骨细胞图核膜内陷，染色质离散且靠近核膜；细胞质浓缩，细胞器少(×10000)图10对照组椎间盘中凋亡细胞图对照组椎间盘中凋亡细胞较少(×40)图11模型组凋亡细胞图模型组凋亡细胞数多(×40)图12对照实验样本中阳性细胞图对照实验样本中(TUNEL中不加TdT)没有阳性细胞出现(×40)图13散点图Cy3和Cy5荧光信号比值的离散程度图14细胞信号和传递蛋白类表达情况图细胞信号和传递蛋白类基因表达变化的有5条，其中下调的有4条。
2、组织形态学观察椎间盘HE染色，显微镜下观察。3、5月对照组椎间盘由排列规则的纤维环和髓核组成，软骨终板钙化层和非钙化层清晰(图1、2)；3月模型组纤维环出现裂隙，髓核皱缩，软骨终板不规则增生；7月对照组有类似表现(图3、4)；5月模型组髓核完全纤维化，纤维环板层状结构消失，多数椎间盘突出，部分软骨终板凸向椎体内，血管芽稀少，周边不规则(图5)；7月模型组椎间盘内部结构与5月模型组相似，部分椎体边缘骨赘形成(图6)。按照Miyamoto分级标准将椎间盘退变程度分为1-5级，分别规定为1、2、3、4、5分。
权利要求
1.一种颈椎间盘退变模型的建立方法，其特征在于该方法通过诱导颈部动静力失衡诱发颈椎间盘退变，具体步骤包括选择清洁级实验动物在颈背部正中纵向切口，切开皮肤后，充分游离各层肌肉，横向切断深群颈夹肌和头、颈、寰最长肌，切除颈髂肋肌与头半棘肌，然后再依次切除C2-C7棘上和棘间韧带，彻底止血后缝合皮肤，红霉素软膏外涂防止感染，3月后即成，到5月、7月椎间盘退变更严重。
2.一种如权利要求1所述的颈椎间盘退变模型的建立方法，其特征在于其中所述实验动物是各种实验用种系的兔，各种实验用种系的大鼠，各种实验用种系的小鼠，各种实验用种系的豚鼠，各种实验用种系的犬，各种实验用种系的猴和各种实验用种系的羊。
3.一种如权利要求1或2所述的颈椎间盘退变模型的建立方法，其特征在于其中所述实验动物是SD大鼠。
全文摘要
本发明涉及一种颈椎间盘退变模型的建立方法。本发明提出颈部动静力失衡是导致颈椎间盘退变的原因，通过横向切断实验动物深群颈夹肌和头、颈、寰最长肌，切除颈髂肋肌与头半棘肌，切除C
文档编号G09B23/28GK1402199SQ01126560
公开日2003年3月12日 申请日期2001年8月28日 优先权日2001年8月28日
发明者施杞, 王拥军 申请人:上海中医药大学