专利名称：用于对样本成像的方法和系统的制作方法
用于对样本成像的方法和系统 本发明涉及用于对样本成像的方法以及样本成像系统。
背景技术：
各种样本成像方法可以从现有技术获悉，例如光学显微术(光学反射和透射显微术)、荧光显微术以及其他方法。例如，成像可以包括扫描成像或者宽场成像。此 夕卜，例如样本的成像可以用来诊断癌症。已知的非侵入式方法是通过应用DNA细胞计量 术(cytometry)对只有一些细胞的样本进行诊断。G. Haroske，F. Giroud, A. Reith和 A. Bocking 在“1997ESACP consensus report on diagnostic DNA image cytometry", AnalyticalCellular Pathology 17 (1998)，189-200 中提供了综述。该方法基于数值和 / 或结构染色体异常(异倍性)的存在性，所述异常仅在肿瘤(瘤的)组织中可检测。DNA 异倍性的检测允许实现癌症的非常早期的诊断，通常比活组织检查的组织学诊断提前若干 年。一种已知的DNA样本成像方法使用了单个波长的光。为此目的，使用公知的福尔 根(Feulgen)染色法对细胞核(DNA含量)着色。然而，该方法中的着色步骤是费时的，因 为它基于4. 5小时福尔根染色过程。结果，通过这种方式现场执行刷检(brush biopsy)和 进行实时测量是不可能的。可替换地，已知使用荧光DNA染色，例如对于结合到DNA具有高特异性的标记物大 埤(DAPI)。荧光DNA染色的使用相对于福尔根染色具有某些优点。例如，荧光允许具有比白 色光吸收更高的测量灵敏度。而且，大多数荧光染料具有比福尔根染色过程快得多的染色 时间；例如，大埤染色可以在数分钟内完成。然而，使用荧光DNA染料的一个问题是由于不可逆的光致漂白引起的荧光的褪 色。已知使用抗褪色剂来在一定程度上减缓光致漂白，然而，那仅仅是减轻了该问题，但没 有解决该问题。此外，在荧光DNA细胞计量术中，使用与测量本身期间相同的光源和检测技术(荧 光)来完成对适当照射束的聚焦。这将造成荧光团的不受控的光致漂白，并且因而导致DNA 细胞计量术测量中的变异系数(Coefficient of Variance, CV)增大。
发明内容
本发明旨在解决上面提到的问题。特别地，本发明的目的是提供用于对样本成像 的改进的方法以及改进的样本成像系统。依照一个实施例，提供了一种用于对样本成像的方法，该方法至少包括-利用第一标记物材料以及利用第二标记物材料对样本染色；-在用于相对于样本聚焦成像设备的聚焦步骤中采用第一标记物材料；以及-在成像步骤中采用第二标记物材料以及已经在聚焦步骤中聚焦的成像设备，以 便获取样本的图像。
通过这种方式，可以使用第一标记物材料相对于样本聚焦成像设备，其中随后可 以使用第二标记物材料由成像设备实现对样本的精确测量(成像)。例如，成像设备的聚焦可能涉及设置该成像设备，使得该设备可以拍摄样本的清 晰图像，特别是可以拍摄预定样本部分的清晰图像，所述样本部分例如一个或多个样本成 分或者样本结构，例如以下项中的一个或多个分子、核酸、DNA、RNA、抗体、细胞、细胞部分、 膜、蛋白质、组织以及生物材料。换言之，聚焦可能涉及使成像设备的一个或多个成像单元 和样本达到相对于彼此的某种焦点对准(in-focus)布置，使得成像设备可以获取样本(或 者样本部分)的希望的焦点对准图像。所述方法可以包括作为聚焦步骤的一部分，确定例如与不同样本部分有关的多个 (例如序列的)焦点对准位置，得到包含那些焦点对准位置的焦点对准信息。然后，该得到 的焦点对准信息可以用在成像序列中，该成像序列涉及相对于样本(或者样本部分)将成 像设备聚焦到每个焦点对准位置并且在对应焦点对准位置处获得样本(或者样本部分)的 图像。本领域技术人员应当理解的是，可替换地，随后在对于下一个样本部分应用聚焦步骤 和对应的成像步骤之前，可以通过对于待成像的一个样本部分使用对应的聚焦步骤和对应 的成像步骤，来对不同的样本部分成像。优选地，成像步骤涉及对于待拍摄的每幅图像，在相对较短的预定(优选地固定) 时间段(例如大约10秒或更少，特别地1秒或更少的时段)期间(例如在一秒的小部分期 间)照射样本。这在成像(即测量)步骤期间样本的照射涉及由于第二标记物材料接收该 辐射而引起第二标记物材料的退化(例如光致漂白)的情况下是特别有利的。优选地，第二标记物材料的光学特性不同于第一标记物材料的光学特性。例如，可以在聚焦步骤中使用不使第二标记物材料退化的第一种类型的(照射) 辐射照射样本以便检测第一标记物材料，其中在成像步骤中使用使第二标记物材料退化的 第二种类型的(照射)辐射照射样本以便检测第二标记物材料。依照一个优选的实施例，至少所述第二标记物材料为荧光标记物材料(例如荧光 染料)。在一个非限制性实施例中，所述第一材料和第二标记物材料为具有不同荧光特性的 荧光标记物。此外，依照另一个实施例，所述第一标记物材料和第二标记物材料可以被设计成 对相同的样本成分或样本结构加标签(tag)，所述样本成分或样本结构例如以下项中的一 个或多个分子、核酸、DNA、RNA、抗体、细胞、细胞部分、蛋白质、膜、组织以及生物材料。本 领域技术人员应当理解的是，样本成分的加标签可以包括结合到该样本成分，与该样本成 分相互作用和/或另一种类型的加标签。通过这种方式，精确地聚焦到该样本成分或结构 可以由聚焦步骤来实现，之后可以由成像步骤精确地对该样本成分或结构成像。所述聚焦步骤和成像步骤可以涉及利用适当类型的辐射照射样本，以及使用成像 设备的辐射检测器检测从该样本发出的所得到的样本辐射。本领域技术人员应当理解的 是，提到的所得到的样本辐射可以包括各种类型的辐射，这取决于用来照射该样本的辐射 以及标记物材料。例如，从样本发出的辐射可以包括以下项中的一个或多个进入的(照 射)辐射的反射部分，进入的辐射的透射部分以及荧光辐射，这取决于样本、样本标记物以 及照射辐射的类型。例如，聚焦步骤中使用的辐射可以特别适合与第一标记物材料相互作用，使得成像设备可以检测该第一标记物材料，并且成像步骤中使用的辐射可以被选择成与第二标记 物材料相互作用以便检测该第二标记物材料。有利的是，相同的辐射检测器用来检测由样 本发射或透射的所得到的辐射(即“样本辐射”)，从而导致紧凑而精确的成像系统。本发明的一个实施例提供了一种样本成像系统，该系统包括被配置成对样本成像 的成像设备以及被配置成将成像设备聚焦到待成像的样本上的聚焦单元，该系统包括被配 置成控制该系统实现依照本发明的方法的聚焦和成像步骤的控制器。因此，可以实现上面 提到的优点。从属权利要求中描述了本发明的另外的有利实施例。本发明的这些和其他方面根 据示于附图中的下面描述的非限制性实施例将是清楚明白的，并且将参照这些非限制性实 施例进行阐述。
图1示意性地绘出了在聚焦步骤期间的成像系统的实施例；图2绘出了在成像步骤期间的实施例；图3示出了利用图1的系统获得的图像的实例；以及图4示出了两种不同标记物材料的吸收和发射谱的曲线图，其指示吸收和荧光与 波长的函数关系。
具体实施例方式在本申请中，相似或相应的特征由相似或相应的附图标记表示。图1-2示意性地示出了样本成像系统的非限制性实例。该系统包括被配置成对样 本成像的成像设备1以及被配置成将成像设备聚焦到待成像的样本上的聚焦单元3、6、7。 在该实施例中，聚焦单元3、6、7为成像系统1的组成部分。辐射束路径由该图中的虚线(L， E)示意性地绘出。特别地，成像设备1为荧光成像显微镜1，例如荧光扫描显微镜、荧光扫描共聚焦 显微镜或者不同类型的荧光显微镜，然而，设备1也可以是不同类型的成像设备。所述系统可以包括被配置成控制该系统的操作的控制器6。特别地，如下面将要解 释的，控制器6被配置成控制系统执行特定的聚焦和成像步骤。控制器6可以以各种不同 的方式来配置，例如包括适当的硬件和/或软件、数据处理器、微控制器、计算机和/或其他 电子器件。控制器6可以至少被配置或被编程为提供控制器功能以执行所提到的聚焦和成 像步骤。此外，该控制器可以被配置成控制系统初始化，提供用户交互(例如通过适当的用 户接口)，用于存储成像数据(即样本图像)和或用于其他目的。本领域技术人员应当理解 的是，所述系统可以包括一个或多个用于存储图像的适当存储设备(例如为控制器6的一 部分或者与其分离)、用于显示检测的图像的显示器(未示出)。当前的成像设备1设有被配置成支持样本保持器H的支撑结构2。样本保持器H可 以被配置成支持各种类型的样本S，例如生物样本S，以及特别是包含特定样本成分或样本 结构的样本，所述样本成分或样本结构例如以下项中的一个或多个分子、核酸、DNA、RNA、 抗体、细胞或细胞部分、(细胞)膜、蛋白质、组织以及生物材料。所述样本成分或结构在图 中通过箭头M示意性地表示。本领域技术人员应当理解的是，样本保持器H可以以不同的方式来配置，例如由对于下面所描述方法中使用/存在的照射辐射和样本辐射E的类型透 明的材料(玻璃、透明塑料)制成。当前的成像设备1设有光学系统3和辐射检测器4，光学系统3被配置成向检测器 4透射从(支撑结构2处的)样本保持器支持的样本S发射的辐射。检测器4可以以各种方式来配置，并且可以包括目镜、光电传感器设备11、照相 机、成像装置、滤波装置、数据处理装置和/或其他适当的检测器装置。例如，可选地，可以 在相对于检测器4的上游提供一个或多个滤波器10以便从所述辐射中滤除特定的辐射谱 部分，这取决于使用的检测器类型以及操作期间从样本S向检测器发射的辐射。成像设备1可以相对于样本S聚焦，使得设备1可以获取样本S的清晰图像。如上 所述，该聚焦可能涉及使成像设备1的一个或多个成像单元和样本S达到相对于彼此的某 种焦点对准布置，使得成像设备(特别地，检测器单元4或者传感器11)可以获取样本(或 者样本部分)的希望的焦点对准图像。在当前实施例中，所述光学系统包括被定位成与样本支撑结构2相对的物镜部分 或单元3。在一个实施例中，当物镜部分3的焦平面分别与样本S或者样本成分M相交时， 成像设备1相对于样本S或样本成分M(由支撑2处/上的保持器H支持)是焦点对准的。 物镜部分3和样本S可以在双箭头Z指示的方向上相对于彼此移动以便聚焦设备1。在当 前实施例中，为此目的，提供了例如包括适当致动器或电机的驱动机构7，该驱动机构7被 配置成在所述方向Z(即设备1的聚焦方向)上移动样本支撑结构2。可替换地，物镜部分 3可以设有用于相对于样本S重新定位该透镜部分3的适当致动机构。优选地，所提到的驱 动机构7可由控制器6控制。在另一个实施例中，也可以包括一个或多个致动器以便在一个或多个其他方向 (尤其是与Z方向正交的方向)上相对于彼此扫描样本S (即样本保持器H或者支撑2)和 透镜单元3。辐射源组件8被提供来照射样本S。例如，辐射源组件8可以是照明设备1的一部 分。在一个实施例中，辐射源组件8可以被设置成直接照射样本支撑结构2上支持的样本。 在当前实施例中，从源组件8发出的辐射通过物镜部分3导向样本。为此目的，提供双色镜 或分束器5，其设置在相对于辐射源组件8的下游并且在检测器部分4与物镜单元3之间。 双色镜或分束器5可以朝物镜部分3反射从源部分8发出的辐射，并且可以朝检测器4透 射从物镜部分3发出的样本辐射(像图中一样)。本领域技术人员应当理解的是，所述成像 系统可以以许多其他方式来配置；例如，检测器部分4和源组件8、9的位置可以互换。优选地，在使用期间，待成像的样本S已经由至少第一标记物材料和第二标记物 材料染色。每种标记物材料可以例如通过吸收、反射和/或光致发光(即荧光)与适当的 进入的辐射L (在该实施例中即由物镜单元3透射到样本S上的照射辐射)相互作用，以便 提供或产生或影响得到的样本辐射E(即从样本S发出的辐射)。例如，该相互作用可以包 括单光子激发或者多光子激发。依照一个有利的实施例，所述第一和第二标记物材料都是荧光标记物材料(即荧光团)。可替换地，一种或所有两种标记物材料可以为非荧光标记物材料，例如提供对样本 的吸收染色的辐射吸收标记物材料。在第一标记物材料和第二标记物材料被设计成对相同的样本成分或者样本结构加标签的情况下，可以获得良好的结果，所述样本成分或样本结构例如以下项中的一个或 多个分子、核酸、DNA、RNA、抗体、细胞或细胞部分、(细胞)膜、蛋白质、组织以及生物材料。例如，第二标记物材料的光学特性可以不同于第一标记物材料的光学特性。第一 标记物材料和第二标记物材料可以为具有不同荧光特性的荧光标记物。例如，这些标记物 材料的荧光辐射发射峰值可以位于不同的波长处(像图4中一样，参见下文)。优选地，第一标记物材料的主辐射吸收峰值不与第二标记物材料的主辐射吸收峰 值重合(即具有不同的波长)。依照一个实施例，第一标记物材料的主辐射吸收峰值的波长可以位于第二标记物 材料的主辐射吸收峰值的波长的至少50nm以上或以下，特别地在IOOnm以上或以下，更特 别地在150nm以上或以下(像图4中一样，参见下文)。优选地，特别是在第一标记物材料为荧光材料的情况下，第一标记物材料的主辐 射吸收峰值的波长高于第二标记物材料的主辐射吸收峰值的波长。在这种情况下，可以以 简单的方式防止第二标记物材料对于从第一标记物材料发出的荧光辐射(所述荧光辐射 通常具有比对应荧光标记物材料的主辐射吸收峰值更低的波长)的过早辐射吸收。在一个非限制性实例中，可以通过使用曙红(Eosin)Y作为第一标记物材料并且 利用大埤(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4' , 6-diamidino-2-phenylindole))作为第二标 记物材料(或者相反的情况)来对样本S染色。图4示出了这些标记物材料的发射和吸收 谱。其中，A(大埤)和E(大埤)分别表示大埤的吸收谱和发射谱，而A(曙红)和E(曙红) 分别表示曙红Y的吸收谱和发射谱。大埤的发射谱在360nm附近具有激发最大值，并且在 460nm处具有发射峰值；曙红Y在525nm附近吸收，并且在 550nm处发射。在大埤的激发 最大值处，曙红Y表现出近似为零的吸收。考虑到如上所述的不同标记物材料的应用，当前系统的源组件8优选地设有第一 辐射源8a和第二辐射源8b，所述第一辐射源被配置成提供第一种类型的照射辐射Ll (参见 图1)以便使得设备1能够检测第一标记物材料，所述第二辐射源被配置成提供第二种类型 的照射辐射L2(参见图2)以便使得设备1能够检测第二标记物材料。例如，第一和第二源 8a、8b中的每一个都可以是激光器、白炽灯或者不同类型的辐射源。特别地，第二种类型的 照射辐射在以下项中的一个或多个方面不同于第一种类型的照射辐射波长、波长谱以及 频谱带宽。优选地，可以由控制器9独立地控制辐射源8a、8b，例如在希望的时间激活这些 辐射源和使其失活。依照一个实施例，在操作期间，第一和第二种类型的辐射L1、L2中一次 只有一个被引导到样本S上。第一和第二源8a、8b可以是如图所示的单独的实体，或者它们可以彼此集成在一 起。在单独的辐射源8a、8b的情况下，可以提供辐射定向单元9(例如包括可控可移动的反 射镜或者适当的束组合器)以便将来自源8a、8b中的每一个的辐射引导到通往样本S的光 路上(所述路径在当前系统中经由分束器5和物镜单元3)。可替换地，可以提供被配置成发射宽带频谱辐射的单个辐射源8以发射所述频谱 的预定部分的辐射，该单个辐射源设有可控的辐射滤波器以便调节由此发射的辐射谱。例 如，该辐射源滤波器可以被配置成经过控制以提供第一滤波模式以及提供第二滤波模式， 所述第一滤波模式阻挡来自所述源发射的辐射的一个或多个预定辐射谱段以便提供第一 种类型的照射辐射，所述第二滤波模式透射该一个或多个预定辐射谱段以便提供第二种类型的照射辐射。如上面所提到的，聚焦步骤中使用的辐射Ll可以特别适合与第一标记物材料相 互作用以便检测该第一标记物材料。成像步骤中使用的辐射L2可以被选择成与第二标记 物材料相互作用以便检测该第二标记物材料。优选地，第一源8a发射的辐射Ll具有与第二源8b发射的辐射L2不同的频谱。此 夕卜，第一种类型的辐射的频谱可以部分地与第二种类型的辐射L2的频谱重叠，这取决于标 记物材料。在另一个实施例中，第一种类型的照射辐射(由第一辐射源8a发射)不使上面提 到的第二标记物材料退化。然而，在一个实施例中，第二种类型的照射辐射可以导致第二标 记物材料的退化。当第二标记物材料为荧光材料时，情况可能如此(因为这种材料可以通 过特定波长的照射而光致漂白)。例如，所述退化可以是以下项中的一个或多个改变对应 材料的光学特性，减少该材料的量，该材料的光致漂白，和/或不同类型的退化。优选地，上面提到的辐射检测器4被设置成检测与第一标记物材料有关的第一种 类型的样本辐射El (即从样本发出的辐射)并且被设置成检测与第二标记物材料有关的第 二种类型的样本辐射E2。此外，控制器6可以被配置成处理在聚焦步骤中由成像设备1获得的成像数据 (由于检测器4检测第一种类型的样本辐射El)以便确定成像设备1相对于样本S的至少 一个焦点对准位置。控制器6可以适于控制成像设备1获得所述焦点对准位置以便执行至 少一个后续的成像步骤。在操作期间，上述系统可以用在用于对样本成像的方法中，该方法至少包括前述 利用第一标记物材料以及利用第二标记物材料对样本染色。然后，如图1中所示，在聚焦步 骤中使用第一标记物材料(存在于样本中，例如以便标记特定的样本部分M)以便相对于样 本S(或者样本部分)将成像设备1聚焦到焦点对准位置。为此目的，使用适当的第一种类 型的辐射Ll照射样本S，得到从样本S发出的第一种类型的样本辐射El，所述样本辐射El 由检测器4检测。所述照射可以是连续的样本照射、半连续照射、脉冲式照射，或者有所区 别地，使用导致足够的样本辐射El以便对其检测的适当辐射剂量。此外，设备1可以被配 置成例如在检测器4检测到不充分的或者过量的样本辐射El的情况下在聚焦步骤期间调 节辐射剂量。所述聚焦步骤可以涉及获得以及存储要在一个或多个(后续的)成像步骤中使用 的所得到的设备聚焦信息。此外，所述聚焦步骤可以涉及调节样本S相对于透镜单元3的位置(在Z方向上) 以便确定哪个/哪些位置是相对于一个/多个样本部分M的焦点对准位置。在另一个实施例中，也可以在一个或多个与Z方向正交的方向上相对于透镜单元 3扫描样本S，例如以便将聚焦束引导到不同的(隔开的)样本部分M。可以执行一个或多 个聚焦步骤，例如以便获得有关样本S的若干部分M的设备焦点对准信息。在聚焦步骤期间，可以使用不使第二标记物材料退化的第一种类型的辐射Ll (在 当前实施例中由第一源8a提供)照射样本S以便检测第一标记物材料。例如，在第一标记 物材料为曙红Y且第二标记物材料为大埤的情况下，第一种类型的辐射Ll优选地在大埤的 吸收峰值(大约360nm)附近没有频谱部分。在这种情况下，第一种类型的辐射Ll被配置成例如通过在525nm处包含频谱部分(导致曙红Y标记物的逐渐退化)来激发曙红Y (例如使用单光子激发)。 接着(在已经获得了希望的焦点对准信息之后)，可以相对于样本S聚焦成像设备 1，至少使其达到至少一个提到的焦点对准位置，参见图2。然后，在一个或多个成像步骤中 使用第二标记物材料(存在于样本中)，其中成像设备1获取样本(或者样本部分M)的至 少一幅图像。为此目的，使用第二种类型的辐射L2照射样本S以便检测第二标记物材料。 图3示出了在荧光成像的情况下在成像步骤期间得到的图像的实例。特别地，图3示出了 具有多个由适当荧光团(明亮)标记的细胞的样本切片(section)的荧光图像。此外，在成像步骤期间，所述照射可以是连续的样本照射，但是优选地为半连续或 者脉冲式照射，其使用提供足够的样本辐射E2以便对其检测的适当辐射剂量。在成像步骤期间，可以利用第二辐射L2 (在当前实施例中由第二源8b提供)照射 样本S，得到从样本发出的由检测器4检测的第二种类型的样本辐射E2。优选地，在成像步骤期间，控制且固定每次曝光时间。优选地，成像步骤期间使用 的每次照射辐射剂量(例如以拉德(Rad)(辐射吸收剂量)测量)对于要获取的每幅图像 是恒定的(相等的)(即相同剂量的第二辐射L2用来获取大量图像中的每幅图像)。此外， 通过用支持待成像的后续样本的新保持器代替成像的样本S的样本保持器H，设备1可以用 来例如以序列的方式对若干(不同的)样本S成像。在这种情况下，优选地，在样本的对应 成像步骤期间将相同辐射剂量的第二种类型的辐射L2施加到每一个样本。例如，在第一标记物材料为曙红Y并且第二标记物材料为大埤的情况下，第二种 类型的辐射L2被配置成例如通过在360nm处包含频谱部分(隐含地导致大埤标记物的逐 渐退化)来激发大埤。优选地，成像步骤涉及对于待拍摄的每幅图像，在相对较短的预定(优选地固定) 时间段(例如大约10秒或更少，特别地1秒或更少的时段)期间(例如在一秒的小部分期 间)利用第二辐射类型L2照射样本S。优选地，在操作期间，成像设备1采用第一和第二标记物材料自动地实现自聚焦 到样本S上以及对样本的成像。本领域技术人员应当理解的是，可以由控制器6控制设备 自聚焦过程，包括图像数据处理以获得希望的焦点对准位置(介于样本S或样本部分与成 像设备之间)、调节样本S相对于透镜单元3的位置(通过致动器7)、辐射源操作的激活/ 失活以及其他设备功能。在另一个实施例中，所述方法可以包括作为聚焦步骤的一部分，确定例如与不同 样本部分M有关的多个(例如序列的)焦点对准位置，得到包含那些焦点对准位置的焦点 对准信息。然后，该得到的焦点对准信息可以用在成像序列中，该成像序列涉及相对于样本 S (或者样本部分M)将成像设备1聚焦到每个焦点对准位置并且在对应焦点对准位置处获 得样本S(或者样本部分M)的图像。可替换地，随后在对于下一个样本部分应用聚焦步骤 和对应的成像步骤之前，可以通过对于待成像的一个样本部分使用对应的聚焦步骤和对应 的成像步骤，来对不同的样本部分M成像。例如，本领域技术人员应当理解的是，在一个实施例中，由当前方法获得的样本图 像可以用来提供最终的DNA细胞计量直方图。由上可知，在本发明的各个实施例中，不同的技术用于聚焦样本S，优选地使用不漂白荧光团(即标记物)的光源8a，并且连续地使样本S暴露于激发光固定且受控的时隙， 所述时隙优选地足够收集荧光图片。实施例可以应用两种成像模式在聚焦模式下，使用不影响待测量的荧光团而是 用来使组织样本S达到正确的聚焦位置的光，以及在成像模式二中，在短暂的时刻，对于 DNA细胞计量测量打开影响荧光团的光并且之后立即关闭该光。优选地，控制和固定曝光时 间，使得在可以利用成像结果获得的最终的DNA细胞计量直方图中，残余光致漂白对于所 有曝光的样本部分(例如细胞)都是相同的，并且它因而不会影响测量变异系数(CV)。此 夕卜，用于DNA细胞计量测量的荧光团的曝光时间可以最小化为拍摄图片所需的时间(即大 约为数秒或者更少)，光致漂白强烈地降低。
在另一个实施例中，不同ζ位置(即沿着Z方向的不同位置)处的多幅样本图像 可以由成像设备1拍摄。然后，得到的图像可以用于聚焦步骤或模式中以便找出在哪幅图 像中哪个细胞在焦点上，并且然后在成像步骤或模式中将该ζ位置的图像用于DNA细胞计 量测量。通过这种方式，可以获得良好的DNA细胞计量测量，其中每个细胞可以在焦点上， 接收相同的曝光量(辐射剂量)，以便正确地定量测量来自细胞核的荧光量。这与多光子激 发(参见下文)相结合是特别有利的。由上可知，一种选项是通过利用两种不同的染料对样本S染色而在两种模式下使 用荧光成像一种染料用于聚焦模式，并且另一种染料用于实际的DNA细胞计量方法(例如 大埤)，从而用于该成像模式的染料在与聚焦模式下的染料截然不同的波长处受激发。因 此，通过在聚焦模式下而不是在成像模式下首先应用激发荧光团的波长，可以使样本S在 焦点上。第一标记物(荧光团)在聚焦模式下漂白不成问题，因为它不用于定量测量。一 旦焦点对准，具有另一波长的辐射L2可以用来激发第二标记物荧光团，以便进行DNA细胞 计量测量。另一个实施例包括应用扫描共聚焦显微术。除了上面的实施例之外，所述聚焦步 骤可以包括扫描并且使一个或多个感兴趣细胞在焦点上。然后，在成像步骤期间，对于DNA 细胞计量方法可以再次扫描感兴趣细胞M，在这种情况下，共聚焦照射仅在扫描希望的细胞 期间激活，并且在所述设备在感兴趣细胞M之外扫描时不是激活的。通过这种方式，在扫描 期间，仍然必须测量的其他细胞在成像步骤中不被照射并且因而还没有遭受漂白。本发明的实施例可以允许实现快速的基于DNA细胞计量术的癌症检测(数分钟而 不是常规福尔根染色DNA细胞计量方法中的数小时)。应用领域现在例如为癌组织切除期 间用于癌症边界检测的手术支撑工具。尽管已经参照附图更详细地描述了本发明的说明性实施例，但是应当理解的是， 本发明并不限于这些实施例。本领域技术人员在不脱离如权利要求书中所限定的本发明的 范围或精神的情况下可以实现各种变化或修改。应当理解的是，在本申请中，措词“包括/包含”并没有排除其他的元件或步骤。此 夕卜，措词“一”和“一个”中的每一个并没有排除复数。权利要求书中的任何附图标记都不 应当被视为对权利要求书的范围的限制。例如，在本申请中，聚焦步骤和成像步骤之一或二者可以包括荧光标记物材料的 单光子激发(参见上文)。在这种情况下，照射辐射的单光子吸收提供了激发对应荧光材料 的能量。
可替换地，聚焦步骤和成像步骤之一或二者可以包括同样地从现有技术(参见例如US7170675)获悉的荧光标记物材料的多光子激发，例如2光子激发。在这种情况下，多 (例如2)光子的吸收提供激发荧光材料的等效于单光子激发的能量。标记物材料的这种 类型的激发的应用在不同Z位置(沿着Z方向)处拍摄多幅样本图像的情况下是特别有利 的。特别地，标记物材料的多光子(2光子)激发通常需要相对较高的光子密度，所述高密 度可以在成像设备1的瞬时焦点对准位置(例如使用高功率激发激光源)获得。瞬时离焦 位置(即不同于焦点对准Z位置的瞬时Z位置)将接收较低的光子密度，所述较低的密度 不会导致(对应瞬时离焦位置处)对应标记物材料的激发(或者相当程度地降低该激发的 机会)。因此，在不同Z位置处拍摄多幅样本图像的情况下，聚焦步骤和成像步骤优选地包 括(对应第一和第二荧光标记物材料的)多光子激发。此外，在本申请中，辐射可以涉及光子辐射、粒子束辐射或者不同类型的辐射。此 夕卜，例如，荧光标记物可以被配置成附接到特定的分子。这些标记物可以表征为，它们非常 特别地将自身附接到例如特定类型的抗体，而不将自身附接到其他类型的抗体和其他分 子。此外，这些标记物可以表征为，响应于例如光子的激发，它们发射荧光辐射E1、E2。例 如，标记物可以是有机或无机标记物。有机标记物通常包括芳环。实例是FITC(异硫氰酸 荧光素)、TRITC(异硫氰酸四甲基若丹明)和大埤。许多类型的有机标记物可商业上获得， 每种类型具有其自身的附接特性。这样的有机标记物目前由例如美国俄勒R州尤金市的分 子探针公司出售。
权利要求
一种用于对样本成像的方法，至少包括-利用第一标记物材料以及利用第二标记物材料对样本染色；-在用于相对于样本聚焦成像设备的聚焦步骤中采用第一标记物材料；以及-在成像步骤中采用第二标记物材料以及已经在聚焦步骤中聚焦的成像设备，以便获取样本的图像。
2.依照权利要求1的方法，其中第二标记物材料的光学特性不同于第一标记物材料的 光学特性。
3.依照权利要求1或2的方法，其中在聚焦步骤中使用不使第二标记物材料退化的第 一种类型的辐射照射样本以便检测第一标记物材料，其中在成像步骤中使用使第二标记物 材料退化的第二种类型的辐射照射样本以便检测第二标记物材料。
4.依照前面的权利要求中任何一项的方法，其中至少所述第二标记物材料为荧光标记 物材料。
5.依照权利要求4的方法，其中所述第一标记物材料和第二标记物材料为具有不同荧 光特性的荧光标记物。
6.依照前面的权利要求中任何一项的方法，其中第一标记物材料的主辐射吸收峰值 的波长位于第二标记物材料的主辐射吸收峰值的波长的至少50nm以上或以下，特别地在 IOOnm以上或以下，更特别地在150nm以上或以下。
7.依照前面的权利要求中任何一项的方法，其中所述第一标记物材料和第二标记物材 料被设计成对相同的样本成分或样本结构加标签，所述样本成分或样本结构例如以下项中 的一个或多个分子、核酸、DNA、RNA、抗体、细胞、膜、细胞部分、蛋白质、组织以及生物材料。
8.依照前面的权利要求中任何一项的方法，其中所述聚焦步骤和成像步骤涉及利用适 当的辐射照射样本，以及使用成像设备的辐射检测器检测从该样本发出的所得到的样本辐 射。
9.依照前面的权利要求中任何一项的方法，其中成像设备采用所述第一和第二标记物 材料自动地实现自聚焦到样本上以及对样本的成像。
10.依照前面的权利要求中任何一项的方法，其中第一标记物材料的主辐射吸收峰值 的波长高于第二标记物材料的主辐射吸收峰值的波长。
11.一种样本成像系统，该系统包括被配置成对样本成像的成像设备以及被配置成将 成像设备聚焦到待成像的样本上的聚焦单元，该系统包括被配置成控制该系统实现依照前 面的权利要求中任何一项的方法的聚焦和成像步骤的控制器。
12.依照权利要求11的系统，其中聚焦单元与成像设备集成在一起。
13.依照权利要求11或12的系统，包括第一辐射源和第二辐射源，所述第一辐射源被 配置成提供不使第二标记物材料退化的第一种类型的照射辐射，所述第二辐射源被配置成 提供使第二标记物材料退化的第二种类型的照射辐射。
14.依照权利要求11-13中任何一项的系统，所述成像设备包括辐射检测器，该辐射检 测器被设置成检测与第一标记物材料有关的从样本发出的第一种类型的样本辐射并且被 设置成检测与第二标记物材料有关的第二种类型的样本辐射。
15.依照权利要求11-14中任何一项的系统，其中所述控制器被配置成处理在聚焦步 骤中由成像设备获得的成像数据以便确定成像设备相对于样本的至少一个焦点对准位置，其中该控 制器适于控制成像设备获得所述焦点对准位置以便执行成像步骤。
全文摘要
本发明提供了一种用于对样本成像的方法，该方法至少包括利用第一标记物材料以及利用第二标记物材料对样本染色；在相对于样本聚焦成像设备的聚焦步骤中采用第一标记物材料；以及在成像步骤中采用第二标记物材料以及已经在聚焦步骤中聚焦的成像设备，以便获取样本的图像。本发明也涉及用于对样本成像的系统。
文档编号G02B21/00GK101821608SQ200880100713
公开日2010年9月1日 申请日期2008年7月23日 优先权日2007年7月27日
发明者B·H·W·亨德里克斯, R·W·I·德博尔 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司