专利名称：荧光显微镜载玻片的制作方法
荧光显微镜载玻片相关申请的参考本申请要求美国临时专利申请No. 61/336，115(2010年I月15日提交)的优先权。简述本教导涉及用于增加找到焦点区域(field of focus)的效率以及增加在利用荧光显微技术读取载玻片(slide)时视场的准确性的设备和方法。结核病(TB)成为了全球性的健康问题。估计世界人口的三分之一感染了 TB致病媒介，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在大部分情况中，疾病保持潜伏状态，大约5至10%的受感染人群在他们生命中的一定时期将继续发展成为活动性疾病。剩下的是未被发现的和/或未治疗的，患者死亡率为大约50%。另外，统计分析显示未治疗的 受感染个体每年将继续感染10至15个其他个体。至少从1990开始(其中在1990时世界卫生组织开始追踪发生率数据)，世界范围内的活动性TB的发生率呈增加趋势。评估显示了如果当前全球TB状况不改善，则到2020年将会有一亿五千万人发展为活动性结核病以及三千六百万人将死亡。全球TB问题由于增加的HIV流行病而进一步恶化。患有HIV的人感染了结核分枝杆菌，则发展为活动性TB的风险增加。事实上，TB是感染了 HIV个体的第一死亡原因。减小这个疾病的发生率是全球优先的且是2000年发布的联合国千年发展目标的主要部分。为了实现这些目标，世界卫生组织(WHO)已经开发了 STOP TB策略，该策略是用于减小全球TB负担的多方位方法。该策略的关键是通过高质量保证的细菌学来检测病例。特别地，已经制定了大于70%的涂阳(smear positive)病例检测的全球目标。在长达一世纪的时间内，TB检测的重要手段是痰涂片明视野显微镜且其仍是全球范围内最常用的病例检测技术。普遍使用该技术的原因部分是因为该方法所需的资源相对较少。这对于发展中国家是尤其重要的，相对工业化国家，发展中国家TB(和HIV)感染的形势严峻。虽然明视野显微镜在TB健康方面起作用，但是其灵敏度较低，约为60%。在HIV流行程度高的情况中，该方法灵敏度显著降低，这是因为经常发现HIV患者中的杆菌负荷小。此外，在化验体积(assay volume)高的实验室中,检查时间可能减小,导致灵敏度进一步损失。当前最常使用的明视野痰涂片染色技术是齐-尼氏(ZN)方法，该方法使用品红染剂(fuschin stain)、酸-醇脱色剂以及亚甲基蓝复染剂。该染色方法和其他染色方法利用结核分枝杆菌和其他分枝杆菌类(一起被称为抗酸杆菌(acid fast bacilli) (AFB))的“耐酸性”的优势。在这些方法中，AFB吸收染色但是具有酸脱色抗性，而一般的呼吸道菌群和碎片退色。ZN染色导致AFB相对蓝色背景被染为红紫色。通过该技术以及利用其他明视野方法，较难从背景材料中鉴别和区分杆菌，且熟练技术人员需要较长的时间进行适当检查。在很多TB实验室设置中时间和熟练技术人员通常是有限的。基于上述，最广泛使用的检测结核病的测试是利用来自标准光学显微镜的白光进行明视野显微镜分析。用于该检测的标准观察倍数是1000倍。但是，由于细菌的形态是独特的以及具有大量区别特征，以及由于上述的ZN染色困难，需要相当熟练的技术员和/或实验室专家来检测结核病。另外，明视野显微镜的标准的和当前可接受的测试参数需要一百个以1000倍的倍数的分离的观察“场”来进行诊断。该方法是特别耗时的以及限制显微镜技术人员或技术员在给定的时间内可以准确读取的载玻片数目。相应地，对显微镜技术人员的需求比当前可支配的显微镜技术人员显著更大。在世界上的一部分地区确实如所述，在这些地区中，结核病测试是重要的且是需要的，包括非洲和亚洲。还显示荧光显微镜(FM)可用于检测AFB。FM技术利用荧光染料例如金胺_0，以及还使用一些形式的脱色剂和淬灭剂。通过FM，AFB染色(AFBstain)从绿色变为黄色，背景为暗色背景，从而相比较明视野方法而言，使得生物体和背景之间存在显著差别。该差别的增加减小了眼睛压力且允许使用具有更大视场的物镜，从而减小总检查时间。总体来说，相比较标准明视野显微镜而言，证实了基于FM的TB检测提供更高的灵敏度以及更短的检查时间。基于这些优势以及新型发光二极管(LED)荧光显微镜的可获得性，世界卫生组织积极促进利用荧光显微镜来诊断结核病的全球化。虽然具有所认识到的优势，FM(常规的和基于LED的两者)仍然存在着明显的问题，这影响了它的利用和广泛使用。所述问题围绕以下事实FM是暗视野技术，如此则需要 样品提供光信号。在TB涂片的情况中，背景荧光被淬灭(对于增加信噪比是重要的)。杆菌负荷小或不存在杆菌的样品中，检测区域(examination field)提供的在其上聚焦的信号少或不提供信号。因此，较难确保发现了阴性结果的测定的质量。另外，来自荧光染色的AFB的信号较小(相比较明视野方法而言)且仅在少量焦平面(focal plane)内可见。此时，不熟练的使用者较易由于遗漏信号可辨别的焦平面而忽略阳性样品。因此，相比较明视野显微镜而言，荧光显微镜需要显著更多的培训以便显微镜技术人员熟悉找到焦平面。这主要是因为明视野技术也允许显微镜技术人员观察包括背景材料的非-AFB材料，其也更容易在焦平面的“上方”和“下方”看见。不易对荧光显微镜进行调焦不仅对于不熟练的技术员是个问题，对于经验丰富的技术员也是个问题。结果是显微镜技术人员非常难确定他或她是否在焦点对准(in focus)的条件下进行观察，因此，显微镜技术人员通常不能很有信心地报告不存在结核病。最后，对于FM显微镜技术人员仍非常困难的是确定他们是否观察相同的横向(lateral)视场或新视场，特别是当存在较少的背景材料或不存在背景材料以提供内部参考点时，当在视场之间移动时，结果是即使利用荧光显微镜技术，也缺少结果的可预见性，以及读取载玻片时的准确程度小于所需的准确程度。另外,FM对于全球大多数健康机构而言是不适合的(在一些情况中是不适合的)。缺少适合性是因为技术存在的显著问题，所述问题包括昂贵的资金投入；复杂的、短寿命的以及昂贵的光源；技术员对于UV导致的健康风险的担忧；皆知的精密的仪器；对稳定电源的需求；以及对培训的显著需求。发光二极管(LED)技术的进步带来了明亮的、耐用的光源，其由用于取代常规的FM光源的低电压电源供电，从而排除了上述问题。事实上，制造者已引入基于LED的附件，其可以将现有的明视野显微镜改造为荧光显微镜。和常规FM—样，相比较明视野技术而言，新型LED FM技术已显示出具有增加的TB检测灵敏度。如上述，这些进步使得WHO认可使用基于LED的FM。很可能继续认可基于FM的技术，作为在全球范围内的通过涂片显微镜来进行TB检测的方法的选择。但是，由于在全球范围内促进实施FM，确保技术员适当地检查涂片的机制对于有质量保证的细菌学是关键的。因此，在本领域中存在经证实的对于显微镜读取技术的需求，所述显微镜读取技术减小显微镜技术人员的压力、增加读取人员结果的准确度以及增加读取载玻片包括结核病载玻片的速度和效率。还进一步存在对于以下技术的需求，所述技术使得荧光显微镜可以较易地适应和使用，包括全球不发达地区以及存在大量待读取的载玻片的区域。
发明内容
本教导提供有用的设备，其包括根据策略压印(imprint) 了设置的油墨的显微镜载玻片，当利用荧光显微技术读取载玻片时所述油墨发荧光，沉积在载玻片上的图案使得显微镜技术人员可以找到焦点区域以及准确鉴定视场(field of view)。
熟练技术人员要理解的是下述附图仅用于说明的目的。附图不意在以任何方式限制本教导的范围。图I说明了根据本教导的具有椭圆形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。图2示出了根据本教导的具有椭圆形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。图3是根据本教导的具有椭圆形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。图4说明了根据本教导的具有椭圆形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。图5示出了根据本教导的具有矩形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。图6是根据本教导的具有圆形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。
图7说明了根据本教导的具有三角形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。图8示出了根据本教导的具有菱形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。图9是根据本教导的具有梯形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。图10说明了根据本教导的具有正方形设计的荧光显微镜载玻片的一实施方式。
具体实施例方式根据本教导的突光显微镜载玻片70包括显微镜基底(microscopesubstrate) 72，其具有发荧光的标记74。该设备使得显微镜技术人员可以鉴定和保持针对抗酸杆菌突光显微镜的合适焦平面。显微镜载玻片70的突光划界(demarcation)或“标记”74，其通常采用形状、符号等形式，可以用于最初聚焦以及用作检查期间的焦点引导。这些荧光界标(landmark)也可以大于物镜视场以便于显微镜可以较易置于焦点上方的中心而无需通过显微镜目镜找到界标。一旦置于界标上方的中心，显微镜技术人员可以调整焦距(focus)直到荧光标记74进入焦距。如果未找到焦平面，显微镜技术人员可以分离载玻片和物镜至大于物镜的工作距离的距离，重新检查物镜相对荧光开始点的位置，以及向下聚焦直到找到正确的焦平面。显微镜技术人员然后可以检查标本区域。当在检查期间遇到荧光界标74，显微镜技术人员可以确定聚焦的程度以及根据需要进行调整。本文的教导用于显微镜技术人员标定样品区域78的边界，这对于培训技术员如何确保“很好准备”的基底是重要的。在这种情况下，技术员涂片标本(例如来自患者)以完全填充被标定的区域，确保向基底72施用了充足的标本。边界标记和边界内的标记通过标本涂片是可见的以及提供通过估计标记74被覆盖的程度一致地测量涂片厚度的手段。合适的涂片量和厚度对于确保TB测试的灵敏性是关键性的，因为薄的、稀少的标本减小了可用于鉴定的有机体的数目。目前的技术不提供内置的测量(built in gauge)来用于检测准备载玻片时的标准一致性。因此，这影响了通过所述载玻片生成的数据的再现性和一致性。通过荧光显微镜载玻片70的标记74，实现了载玻片准备的可预见性，其提高了测试结果的质量，以及标准化的数据。荧光显微镜载玻片70的另外特征是划界使得显微镜技术人员可以建立简单的横坐标系统从而显微镜技术人员较易从重要发现物中区分制造品(artifact)。该划界系统使得在多种情况中可以重新查看相同的载玻片以及再现观察结果。另外，在通过第二方的例如在质量监查或实际测验期间的后续读取期间更容易发现荧光发现物。这增加了读取结核病载玻片的质量控制且有利于培训。当前利用已有的技术不能实现这样的再现性。荧光显微镜载玻片70的另外方面是它使得显微镜技术人员、技术员以及其他使用者可以检查合适量的标本。在此，发荧光以及因此在观察时通过暗视野显微镜是可见的界标74提供开始点和结束点，在横穿开始点和结束点时确保检查了正确数目(所需数目) 的场。在一些实施方式中，荧光显微镜载玻片70结合使用一致的(或预先确定的)位置用于显微镜技术人员分析的开始。这提供给显微镜技术人员针对开始、进行和停止读取的再现性方法，以及允许以标准化模式横穿载玻片进行观察。由于具有以可预见的方法启动载玻片读取的能力，上述位置使得显微镜技术人员可以更有效以及更迅速地观察更大的观察区域。由于载玻片的读取过程在身体上以及精神上耗尽显微镜技术人员和其他观察员的精力，存在于载玻片70上的荧光划界74也用于减少显微镜技术人员的疲乏以及因此提高结果的准确性。界标74的心理影响减少了显微镜技术人员的压力以及实际提供给显微镜技术人员经设计的激励以在测试中结束对载玻片以及焦点的观察。根据本文教导的突光显微镜载玻片70的另一方面是意在标本定量化。具有突光特征的通过暗视野显微镜可见的界标74可以划界已知量的标本区域78。这些界标74使得显微镜技术人员可以准确地检查分离的视野，而没有重叠(现有技术的教导记载了重叠)。由于不存在重叠，统计变异的风险小得多，从而允许更准确地平均每个视野的细胞样品。当通过显微镜目镜可见的标记74用作边界(边界也算在内(in which to count))时，可以测定荧光物体浓度。根据本教导的突光显微镜载玻片70有利地提供了 (a)突光参考,用于确定系统是否合适地运行以及(b)荧光校准数据。在相同载玻片上的已知的或恒量荧光值的界标或具有变化的已知的荧光值的界标可以用于确定设备和/或试剂是否正确地起作用。这样的界标74也可以用于生成荧光标准曲线(数字图像或光测量设备也可用于所述目的)。根据本教导的荧光显微镜载玻片70改进了载玻片的准确性和可用性。因此，本发明设备减小了在本领域中利用荧光显微镜技术的阻力，增加了显微镜技术人员对其的接受度。实施例本教导的设备使得可以利用荧光显微镜快速地以及准确地检测样品中的受关注成分的存在(例如抗酸杆菌)。荧光显微镜基底70的特征为标本容器(receptacle)(例如显微镜载玻片或盖玻片)72,其包括在容器表面的标记74 :该标记发出突光、划界样品标本区域78、鉴定检查开始区域以及划界检查距离。此外,突光标记74确定了样品用的祀区域(target area) 12。另外,祀区域12附近(即紧邻、相邻或内部)的荧光标记74使得显微镜技术人员或其他使用者可以确定焦点区域。靶区域12附近的荧光标记74也使得使用者可以鉴定视场。荧光显微镜载玻片70的标记74可以采用任何所需的形式，包括但不限于线、蚀刻图案(etchings)、符号、数字、文本、几何形状(例如椭圆10、30、44、50 ;圆80 ;三角形82 ；矩形76;菱形84;正方形88;梯形86)或其他不同的构造。标记74可以具有任何尺寸(例如宽度、高度或厚度)，其容纳被认为是AFB涂片的统计标准的区域。例如，荧光显微镜载玻片70的标记74可以具有的宽度为大约I. O至3. 0cm、高度为大约O. 5至2. Ocm以及厚度为大约O. 01至O. 2cm。在一些实施方式中，标记74是平的以及通常紧靠显微镜载玻片70。 在一些实施方式中，标记74被升高使其位于显微镜载玻片70之上或延伸超过其平面(或界限)。显微镜基底70包括显微镜标本容器72，其例如由使其可以在显微镜下观察的材料制造的载玻片、盖玻片或它们的组合。在一些实施方式中，基底是透明的且包括玻璃、塑料或硅材料。在容器72的表面上、样品/标本区域78的内部或附近包含了一系列具有荧光性质的标记，例如具有荧光颜料或染料的涂料、油墨、自发荧光油墨或蚀刻油墨(etchings),其形成用于具体的突光应用。油墨可来自工业熟知的来源。一个实例是组合了荧光颜料例如 BASF Lumogen F Yellow 083 或 DayGlo Signal Green AX-18 的Markem4166Series Ink。突光标记的载玻片可以利用标准沉积技术和/或玻璃印刷工艺(glass printing procedures)例如丝网印刷或移印工艺来制造。涂料的荧光强度可以通过调节荧光颜料或染料的浓度或者通过利用非-荧光涂料稀释荧光涂料进行调整。所需的荧光强度针对每种应用可以是具体的。例如，在TB显微镜中，对荧光进行最小化以防止眼睛压力和标本区域中的荧光携带污染(carryover)，但是保持一定亮度使其足以利用标准荧光显微镜装置清楚可见。为了制造荧光显微镜载玻片70，将颜料、染料等以合适的比率加入油墨中且混合至所需程度的均匀性。油墨可以根据需要通过针对荧光标准的测试进行质量控制。荧光涂料或油墨然后可以通过本领域中已知的沉积或印刷技术例如移印或丝网印刷施用至显微镜标本容器72。取决于荧光物质或所使用的基体，可以在以下沉积中使用热或UV-光固化。在印刷或另外以聚集体(例如以大量片(large sheets)的方式)制造的荧光显微镜载玻片70实施方式中,载玻片可以被切割成一定尺寸。如此处所用的，涉及“水平的”和“垂直的”方向是指当观察者以附图中所示方向向下观看载玻片时的方向。图I中的标记74包括具有策略尺寸的椭圆形10，其具有的结构为大约3cm x 2cmX O. Icm(分别为宽度、高度和厚度)。该椭圆形10划界了标本78区域，其被认为是与AFB涂片统计相关的。嵌在椭圆形上且位于策略选定位置上的是目标点，从12至22，其直径大于椭圆线的宽度。这些目标区域12提供用于找到初始焦距(initial focus)的界标，以及用于确定检查的开始点。垂直线24在椭圆内部从椭圆形10的顶部中心(top center)和底部中心(bottom center)延伸,提供了中间焦点检查点24。垂直线24也标出了以下点，在该点处扫描了 62. 5视场(从开始点16、12、18或20)，当水平行进和使用100倍物镜时。始于圆14和20的水平线26伸入椭圆10，再次确定中间焦点检查点26以及标记36. I视场，相对地从开始点16和12或18和22，以及使用100倍物镜。当图I中的焦点检查点26是线时，将理解包括检查点的荧光标记可以采用任何可以垂直于观察方向取向的构造。图2示出了具有另外策略尺寸椭圆30的显微镜载玻片70，其具有的结构为大约3cm X 2cm x O. Icm(分别为宽度、高度和厚度)。外椭圆30划界被认为是AFB涂片标准的标本区域。嵌在椭圆上的关键位置的为圆，从32至42，其直径大于椭圆线，其提供界标用于找到初始焦距和用于确定检查开始点。椭圆30内部的中心是更小的同心椭圆44，其具有的结构为大约2cm xlcm x O. 05cm(分别为宽度、高度和厚度)。该构造特别适用于期望在位置34、40或在椭圆30的顶部或底部开始涂片检查的显微镜技术人员。当从点34或40开始并水平移动时，视场中的第一和第二荧光划界74是自开始的41. 7和125视场，以100倍 物镜。当开始于椭圆30的顶部或底部并垂直移入椭圆时，视场中的第一和第二荧光划界74是自开始的27. 8和83. 3视场，以100倍物镜。图3示出了具有另外策略尺寸的椭圆设计50的显微镜载玻片70，其具有的结构为大约3cm X 2cm x O. Icm(分别是宽度、高度和厚度)。外椭圆50划界了被认为是AFB涂片标准的标本区域。嵌在椭圆中的是矩形网格52。在网格52内部定义的每个正方形例如54具有的开口区域是大约O. 18cm x0. 18cm，例如由宽度为大约O. 025cm的荧光线划界。每个尺寸跨越10视场以及提供等同于127视场(以100倍物镜)的区域。为了对杆菌负荷(load)进行定量，显微镜技术人员可以扫描两个正方形的宽度的总共20视场或者一个正方形的整体的总共约100视场。图4示出了具有宽度为约O. 2cm的垂直线60至68的显微镜载玻片。每条线包含变化的但是浓度已知的荧光颜料。在此线A、B、C、D和E分别具有0%、0. 0025%,O. 005%、
O.010%和O. 015%w/w的荧光颜料与油墨之比。配置了光测量设备、例如数字相机的荧光显微镜可有利地捕获来自每条线的突光。像素计算软件(Pixel counting software)例如ImageJ也可以用于加速突光强度的测量。显微镜载玻片70可以通过以下生成荧光校准数据计算样品中的颜料或染料的浓度；比较所计算的样品颜料浓度和标本容器72上的标记的已知的荧光强度值；以及生成荧光强度对荧光颜料或染料浓度曲线方程。相对颜料或染料浓度的荧光浓度也可以利用曲线方程进行计算。根据该校准数据和方法，可以确定受关注的样品成分的突光强度。此外，可以测定未知突光浓度的标本的突光。为了证实荧光的定量化，例如图4中所示的显微镜载玻片70通过以上述比率向油墨中添加染料来进行制备。载玻片标记(线)74利用包括以下组件的显微镜和数字成像系统进行成像QBC ParaLens荧光显微镜转接器；Nikon 0ptiPhot-2显微镜；Jenoptik ProgRes⑧数码相机jPPC。然后利用ImageJ将图像转化至灰度(grayscale)从而对图像进行分析。像素强度通过确定200x 200像素窗(pixel window)以及使用ImageJ的“分析”功能进行测量。测量了以下集成密度(integrated density)
权利要求
1.用于和荧光显微镜系统一起使用的显微镜基底，其包括 显微镜标本容器； 在所述容器表面上确定样品的靶区域的荧光标记； 在所述靶区域附近的所述容器表面上划界焦点区域的荧光标记；以及 在所述靶区域附近的所述容器表面上鉴定视场的荧光标记。
2.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记包括用于焦平面鉴定和保持的界标。
3.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记包括尺寸大于显微镜物镜视场的界标， 所述界标使得显微镜可以不依赖于显微镜目镜而置于焦点上方的中心。
4.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记包括用于结果再现的横坐标系统。
5.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记还包括能够检查所需数目的场的开始点和结束点。
6.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记还包括至少一个中间焦点检查点，其具有垂直于观察方向的取向。
7.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记包括如下构造，其容纳针对抗酸杆菌涂片的标本的统计学相关区域。
8.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记包括平面构造从而通常紧靠所述标本容器。
9.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记包括如下构造，其延伸超过所述标本容器的平面。
10.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述荧光标记包括线、符号、数字、文本或几何形状。
11.根据权利要求10的显微镜基底，其中所述几何形状包括椭圆、圆形、三角形、矩形、正方形、菱形或梯形构造。
12.根据权利要求I的显微镜基底，其中所述标记包括荧光颜料、染料、涂料、油墨、蚀刻油墨或自发突光油墨。
13.用于和荧光显微镜系统一起使用的显微镜基底，其包括 显微镜标本容器； 在所述容器表面上确定样品的标本区域的荧光标记； 在所述样品的标本区域附近的所述容器表面上划界焦点区域的荧光标记； 在所述样品的标本区域附近的所述容器表面上鉴定视场的荧光标记； 在所述样品的标本区域附近的所述容器表面上鉴定检查开始点的荧光标记；以及 在所述样品的标本区域附近的所述容器表面上划界检查距离的荧光标记。
14.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述荧光标记包括用于焦平面鉴定和保持的界标。
15.根据权利要求13的显微镜基底,其中所述突光标记包括尺寸大于显微镜物镜视场的界标，所述界标使得显微镜可以不依赖于显微镜目镜而置于焦点上方的中心。
16.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述荧光标记包括用于结果再现的横坐标系统。
17.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述荧光标记还包括能够检查所需数目的场的开始点和结束点。
18.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述荧光标记还包括至少一个中间焦点检查点，其具有垂直于观察方向的取向。
19.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述荧光标记包括如下构造，其容纳针对抗酸杆菌涂片的标本的统计学相关区域。
20.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述荧光标记包括平面构造从而通常紧靠所述标本容器。
21.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述荧光标记包括如下构造，其延伸超过所述标本容器的平面。
22.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述荧光标记包括线、符号、数字、文本或几何形状。
23.根据权利要求22的显微镜基底，其中所述几何形状包括椭圆、圆形、三角形、矩形、正方形、菱形或梯形构造。
24.根据权利要求13的显微镜基底，其中所述标记包括荧光颜料、染料、涂料、油墨、蚀刻油墨或自发突光油墨。
25.用于利用荧光显微镜检测抗酸杆菌的存在的显微镜基底，其包括 显微镜标本容器； 在所述容器表面上确定样品的靶区域的荧光标记； 在所述靶区域附近的所述容器表面上划界焦点区域的荧光标记；以及 在所述靶区域附近的所述容器表面上鉴定视场的荧光标记。
26.用于利用荧光显微镜基底检查样品的方法，其包括 制备显微镜标本容器，该显微镜标本容器具有 在所述容器表面上确定样品的靶区域的荧光标记， 在所述靶区域附近的所述容器表面上划界焦点区域的荧光标记，以及 在所述靶区域附近的所述容器表面上鉴定视场的荧光标记； 在荧光显微镜下观察所述标本容器的荧光标记； 鉴定焦平面；以及 检查所述样品。
27.权利要求26的方法，其中鉴定所述焦平面还包括 将所述显微镜标本容器和显微镜物镜分开至大于所述物镜的工作距离的距离；以及 观察所述物镜相对荧光开始点的位置直到找到正确的焦平面。
28.权利要求26的方法，其还包括通过如下测定细胞样品浓度 在所述显微镜标本容器上使用荧光标记用于划界已知量的样品区域和分离的场；以及 利用通过显微镜目镜可见的荧光标记作为用于在每个场计数细胞样品的边界。
29.权利要求26的方法，其还包括通过如下生成荧光校准数据计算样品中的颜料浓度； 比较所计算的样品颜料浓度和所述显微镜标本容器上的荧光标记的已知荧光强度值；以及 生成荧光强度对荧光颜料浓度曲线方程。
30.权利要求29的方法，其还包括使用所述荧光校准数据用于计算所关注的样品成分的荧光强度。
31.权利要求29的方法，其还包括使用所生成的荧光校准数据用于测定荧光显微镜系统是否合适运行或设备和试剂是否适当起作用。
全文摘要
用于增加找到焦点区域的效率以及通过利用荧光显微技术增加读取包括结核病载玻片时视场的准确性的装置和方法。
文档编号G02B21/34GK102812392SQ201180014305
公开日2012年12月5日 申请日期2011年1月3日 优先权日2010年1月15日
发明者C.J.格拉哈姆, C.斯图特 申请人:Qbc诊断股份有限公司