专利名称：一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像器件及成像方法
技术领域：
本发明属于显微成像领域，涉及ー种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法。
背景技术：
光学显微成像技术是观 测微观世界的一种有效手段，其高效、无损的优点使其在各领域，尤其是在生物、医学、材料研究領域有着广泛的应用。然而，普通光学显微镜使用的是场光源，在观察样品表面形貌时，样品内部结构也会被照明并产生衍射或散射，这将严重影响显微镜对样品表层结构(如细胞壁、蛋白质分子壁等)的成像质量。为了克服普通光学显微镜对样品表层成像模糊的缺点，共聚焦显微镜利用点光源照明，点探测器收集的方法，成功消除了在探测样品时产生的多种散射光，实现了样品光学横断面的清晰成像。然而，这种成像质量的改进是利用减小显微镜视场来获得的，虽然可通过扫描机制来进行补偿，但这将导致其结构复杂，工作效率低等缺点。如果光源仅对样品的表层进行照明，而不进入样品内部，则可避免样品内部散射光对表层结构成像的影响，提高表层成像质量。根据这一思想，研究人员提出将传统的载玻片替换为ー个棱镜，并使照明光在棱镜底面发生全反射，利用产生的消逝波对样品表层进行照明，即可通过普通光学显微镜观测到较清晰的表层成像。然而，该方法中的消逝波在样品表层的穿透深度由棱镜的折射率和照明光入射角共同決定。由于棱镜材料的限制，消逝波穿透深度最小可达到200nm左右，这对于观测深度200nm以内的表层结构仍然会存在一定程度的散射干扰。因此，为了清晰的观察到深度200nm甚至更薄的表层结构信息，需要构建一种表层穿透深度更小的照明光源。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对普通光学显微镜对样品表层成像模糊的问题，提出ー种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法，利用该方法可提供200nm及以下深度的表层照明，用于提高这一尺度的表层光学显微成像的质量。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是ー种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像器件，该器件从下到上依次包括—透明基底层；—纳米结构层，用于对照明光进行空间频率和偏振方向调制的纳米结构；一 PMMA(聚甲基丙烯酸甲酷，Polymethylmethacrylate简称PMMA)填充层，用于平整化纳米结构表面的PMMA填充层；一金属/介质多层膜层，用于对不同空间频率谐波进行高通滤波的金属/介质多层膜。优选的，所述纳米结构层的尺寸和间距不大于照明光波长；所述纳米结构层的材料为不透光材料，可以为金属，也可以为介质；所述纳米结构层的形状可以为规则的几何体、或不规则的任意面型；所述纳米结构层的分布可以是均匀的、或非均匀的，可以是ー维的、或ニ维的。优选的，所述PMMA填充层的上表面相对纳米结构层上表面的厚度为10 30nm。优选的，金属/介质多层膜层中的金属可以为金、银、铝等良导体材料，介质可以为Si02、Al203等低损耗光学膜层材料 ；所述金属/介质多层膜层为金属/介质交替膜层，各膜层厚度范围为IOnm 30nm，各层膜厚可以相等，也可以不相等。根据照明光强需要，金属/介质多层膜的总层数2层或更多层。另外，本发明提供ー种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法，照明光从上述器件的透明基底层背面入射，经过纳米结构层对其空间频率和偏振方向的调制后进入金属/介质多层膜层进行高频滤波，最終在金属/介质多层膜层的上表面形成局域在5 200nm深度范围内的消逝光场，被消逝光场照明的待测样品表层区域可以被光学显微镜或光谱仪进行分析检测。优选的，所述照明光可以为紫外到可见光范围的宽光谱光源或者激光光源。优选的，改变所述纳米结构层的尺寸和间距，可以调节多层膜表面消逝光场的空间频率和強度分布。优选的，当所述纳米结构层的材料为金属吋，改变纳米结构层的分布可以调节多层膜表面消逝光场的偏振方向和空间分布。优选的，改变所述金属/介质多层膜层中的金属材料和介质材料或者改变金属膜层与介质膜层的厚度之比，可以调整高通滤波时的截止频率。优选的，改变所述金属/介质多层膜层中的金属材料和介质材料，或者改变金属膜层与介质膜层的厚度之比、层数，可以调整高通滤波时的截止频率，从而调节多层膜表面消逝光场在样品表层的作用深度，调节范围5nm 200nm。优选的，所述被消逝光场照明的待测样品可直接利用光学显微镜进行观测，或通过激发样品荧光，经滤色片滤光后再由光学显微镜进行观测，或通过激发样品斯托克斯散射光，经滤色片滤光后再由拉曼光谱仪进行分析检测。本发明的原理在于当一束光从基底背面入射至纳米结构，其振幅将受到纳米结构的调制，并被激发出各种不同空间频率的谐波成分。如果所述纳米结构的材料为金属，且呈一定规律的分布排列，则照明光中沿光栅方向上的电场分量将在金属光栅中驱动电子产生电流，电子又和导线晶格原子碰撞使导线变热，最終使电场能转化成热能而损耗。因此沿光栅方向的电场分量基本不会通过光栅，只有垂直于光栅方向的电场分量才能通过光栅，因而可以实现偏振光的调制。经过调制后的入射光将进入具有特殊色散关系的金属/介质多层膜，在可见光波段下，所述金属具有实部为负的介电系数，它将与具有正的介电系数的介质共同构成ー种各向异性等效介质。根据等效介质理论可知，选择合适的金属、介质材料可使等效介质在切向和法向分别具有负的和正的介电系数，再由色散公式も2/ち+も2ん=も2可得该等效介质材料的色散关系为一双曲线，如图2所示。显然，该等效介质材料对空间频率kx具有高通滤波的效果，也就是说，只有空间频率kx较高的谐波成分才能通过金属/介质多层膜而进入待测样品。值得注意的是，进入待测样品的谐波成分均有& >λ/^&，根据色散关系も2+も2=S、2可知，待测样品中谐波成分的法向波矢匕为一虚数，这表明进入待测样品的谐波成分只能以消逝波的形式局域在金属/介质多层膜的上表面，因此可实现仅对待测样品下表面的照明。此外，消逝波的穿透深度由公式h = l/2^x2 -Sk20決定，通过改变金属/介质多层膜中的材料及膜厚可使消逝波穿透深度在5nm 200nm范围得到调节，以满足对待测样品不同表层深度的照明。被照明样品可根据照明光波长以及分析检测的目的进行不同的观测与測量。如果照明光为可见光，则被照明样品可直接由光学显微镜进行表层显微成 像；如果照明光为紫外光，则待测样品应为荧光祥品或涂有荧光染料的样品，经过对样品的荧光激发、滤板滤波后，携带样品表层结构信息的荧光再由光学显微镜进行观测；如果不仅需要对样品进行表层成像，而且还希望对样品表层中的物质进行鉴定与确认，则还可以利用拉曼光谱仪对样品表层激发的斯托克斯散射光进行分析和监测。本发明与现有技术相比具有以下优点I、本发明中的用于纳米尺度表层光学显微成像的器件可提供对样品5nm 200nm深度范围内的表层照明，更大程度上减小了样品内部结构散射光对表层成像质量的影响，进ー步提高了样品表层成像的质量。该器件提供的照明深度、偏振方向可通过纳米结构的尺寸、分布及排列进行调节，为设计方案提供了更多的自由度，适用范围更广。2、此外，该器件具有结构简单、效率高、成本低等优点，为高分辨率表层光学显微成像技术提供了一条新型、有效的方法。
图I是本发明所述用于纳米尺度表层光学显微成像的器件结构示意图；图中1为透明基底；2为纳米结构；3为PMMA填充层；4为金属膜层；5为介质膜层；6为待测样品；7为盖玻片；8为滤波片；9为光学显微镜；图2为本发明中金属/介质多层膜等效介质的色散关系示意图；图3为实施例I中可以实现对入射光进行线偏振调制的ー维周期性纳米结构示意图，右侧双箭头线段表示所述纳米结构的透振方向；图4为实施例2中可以实现对入射光进行偏振方向交替调制的ニ维周期性纳米结构示意图，右侧双箭头线段表示所述纳米结构的透振方向；图5为实施例3中可以实现对入射光进行切向偏振调制的ニ维周期性纳米结构示意图，右侧带有箭头的圆环表示所述纳米结构的透振方向；图6为实施例I中Ag/Al203多层膜在波长为436nm照明光下光学传递函数的ニ维图；图7为实施例I中AgAl2O3多层膜表面的消逝波归ー化光强随进入待测样品深度的变化曲线图；图8为实施例2中Au/Si02多层膜在波长为589nm照明光下光学传递函数的ニ维图；图9为实施例2中Au/Si02多层膜表面的消逝波归ー化光强随进入待测样品深度的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式
详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，而且通过以下实施例对领域的技术人员即可以实现本发明权利要求的全部内容 。本发明的实施例I，是能够产生线偏光，并用于15nm尺度表层光学显微成像的器件。图I是器件结构示意图，所述器件由下到上依次为透明石英基底；铬钠米光栅，用于对照明光进行空间频率和偏振方向调制；PMMA填充层，用于平整化纳米结构表面；Ag/Al203多层膜，用于对不同空间频率谐波进行高通滤波。铬钠米光栅周期150nm线宽75nm，PMMA填充层的上表面相对纳米结构上表面的厚度为10nm，Ag的介电系数为-5. 4939+0. 2156 ,Al2O3的介电系数为3. LAgAl2O3多层膜的每层膜厚均为10nm，共64层。照明光为部分相干光，波长为436nm。经铬纳米结构调制后，入射光场中只有横向波矢较高的谐波成分才能通过多层膜并只能以消逝波的形式局域在该器件多层膜的表面约15nm范围内，从而实现仅对消逝波光场的穿透深度即距离多层膜表面15nm范围内的样品表层进行照明。这可以减小样品内部结构的散射光对样品表层成像的干扰。图3为本实施例中铬纳米光栅的结构示意图，铬纳米光栅可以用作一个线栅起偏器，实现对照明光偏振方向的调制，图中双向箭头线段表示线栅起偏器的透振方向。为获得较高空间频率的谐波成分，取铬光栅周期为150nm、线宽为75nm、高度为50nm。图6为本实施中Ag/Al203多层膜在照明波长为436nm时光学传递函数的ニ维图。从图中可以看出，经铬纳米结构调制后的入射光场中只有横向波矢kx > 2. Sk0的谐波成分才能通过AgAl2O3多层膜，而满足这ー要求的谐波成分只能以消逝波的形式局域在该器件多层膜的表面。假设生物样品介电系数为2. 2，则可得到消逝波归ー化光强与进入样品深度的变化曲线，如图7所示。通常取消逝波光强衰减为初始光强Ι/e处为其穿透深度，即
Lp = \丨1批-Sk20，当取kx = 2. Sk0吋，消逝波光场的穿透深度约为15nm。将待测样品置于
多层膜的上表面，即可实现对样品下表面15nm深的区域进行线偏光照明。由于采用紫光照明，样品必须为荧光物质或经荧光染料处理，经过荧光激发、滤板滤波后，携带样品15nm深度内的表层结构信息的突光可由光学显微镜进行观测。本发明的实施例2,是能够产生切向偏振光，并用于50nm尺度表层光学显微成像的器件。照明光为部分相干光，波长为589nm，该器件由下到上依次为玻璃基底、沿径向分布的铬钠米结构、PMMA填充层以及Au/Si02多层膜。PMMA填充层的上表面相对纳米结构上表面的厚度为IOnm, Au的介电系数为-O. 9969+0. 2319 , SiO2的介电系数为2. 25，Au/Si02多层膜的每层膜厚均为20nm，共32层。图4和图5为本实施例中铬纳米结构的分布示意图，显然，铬钠米结构沿径向分布，根据线栅起偏器的工作原理，该金属纳米结构的分布将产生沿切向的偏振光，透振方向如图中带有箭头的圆所示。图8为本实施中Au/Si02多层膜在照明波长为589nm时的光学传递函数的ニ维图，从图中可以看出，经铬纳米结构调制后的入射光场中只有横向波矢kx> I. 751 的谐波成分才能通过Au/Si02多层膜。仍假设生物样品介电系数为2. 2，可得到消逝波光强与进入样品深度的变化曲线，如图9所示，此时消逝波光场的穿透深度约为50nm。由于采用黄光照明，因此可以直接利用光学显微镜对携带样品50nm深度内的表层结构信息进行观測。本发明未详细阐述的部分属于本领域公知技木。
权利要求
1.一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像器件，其特征在于该器件从下到上依次包括 一透明基底层； 一纳米结构层，用于对照明光进行空间频率和偏振方向调制的纳米结构； 一 PMMA填充层，用于平整化纳米结构表面； 一金属/介质多层膜层，用于对不同空间频率谐波进行高通滤波。
2.根据权利要求I所述的利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像器件，其特征在于所述纳米结构层的尺寸和间距不大于照明光波长；所述纳米结构层的材料为不透光材料的金属或者介质；所述纳米结构层的形状可以为规则的几何体或不规则的任意面型；所述纳米结构的分布可以是均匀的或非均匀的，也可以是一维的或二维的。
3.根据权利要求I所述的利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像器件，其特征在于所述PMMA填充层的上表面相对纳米结构层上表面的厚度为10 30nm。
4.根据权利要求I所述的利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像器件，其特征在于所述金属/介质多层膜中的金属可以为良导体材料的金、银或铝，介质可以为低损耗光学膜层材料的SiO2或Al2O3 ;所述金属/介质多层膜为金属/介质交替膜层，各膜层厚度范围为IOnm 30nm，各层膜厚可以相等，也可以不相等；根据照明光强需要，金属/介质多层膜的总层数2层或更多层。
5.一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法，其特征在于照明光从权利要求I至4中任一项所述器件的透明基底层背面入射，经过纳米结构层对其空间频率和偏振方向的调制后进入金属/介质多层膜层进行高频滤波，最终在金属/介质多层膜层的上表面形成局域在5nm 200nm深度范围内的消逝光场，被消逝光场照明的待测样品表层区域可以被光学显微镜或光谱仪进行分析检测。
6.根据权利要求5所述的一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法，其特征在于所述照明光可以为紫外到可见光范围的宽光谱光源或者激光光源。
7.根据权利要求5所述的一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法，其特征在于改变所述纳米结构层的尺寸和间距，可以调节多层膜表面消逝光场的空间频率和强度分布。
8.根据权利要求5所述的一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法，其特征在于当所述纳米结构层的材料为金属时，改变纳米结构层的分布可以调节多层膜表面消逝光场的偏振方向和空间分布。
9.根据权利要求5所述的一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法，其特征在于改变所述金属/介质多层膜层中的金属材料和介质材料，或者改变金属膜层与介质膜层的厚度之比、层数，可以调整高通滤波时的截止频率，从而调节多层膜表面消逝光场在样品表层的作用深度，调节范围5nm 200nm。
10.根据权利要求5所述的一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像方法，其特征在于所述被消逝光场照明的待测样品，可直接利用光学显微镜进行纳米尺度表层样品观测，或通过激发样品表层荧光，经滤色片滤光后再由光学显微镜进行观测，或通过激发样品斯托克斯散射光，经滤色片滤光后再由拉曼光谱仪进行分析检测。
全文摘要
本发明公开了一种利用超衍射离轴照明技术的纳米表层光学显微成像器件及成像方法，所述器件从下到上依次包括透明基底层、纳米结构层、PMMA填充层和金属/介质多层膜层。其中纳米结构层可对从透明基底背面入射的照明光进行空间频率和偏振方向的调制，金属/介质多层膜层可对调制后的照明光进行空间频率的高通滤波，最终在金属/介质多层膜层的上表面可以形成一个局域在5nm～200nm范围内的消逝光场。该消逝光场可用于普通光学显微镜对待测样品的照明，实现待测样品5nm～200nm深度范围内的表层成像。所述器件所提供的照明的方式能有效减小样品内部结构的散射光对表层成像的干扰，提高表层成像的分辨率，为物质表层结构观测、成分分析提供了一条有效的途径。
文档编号G02B21/36GK102628985SQ20121010795
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者冯沁, 刘凯鹏, 刘玲, 方亮, 杨磊磊, 王彦钦, 王长涛, 罗先刚, 赵泽宇, 陶兴 申请人:中国科学院光电技术研究所