专利名称：全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统，属于荧光显微成像领域。
背景技术：
生命科学从宏观逐渐走向微观，在亚细胞水平实现生理条件下蛋白质、核酸等生物分子成像表征，对揭示生命的奥秘、提高疾病的预防、诊断、治疗水平具有重要意义。荧光成像是最常用的成像表征技术，在细胞成像中，由于荧光标记往往不仅限于焦平面内，在使用普通宽场荧光显微镜成像时，焦平面以外的发光体往往会带来较强的背景荧光干扰，限制了它在亚细胞荧光追踪研究中的应用。2000年以来，研究人员开始在活细胞荧光成像领域使用全内反射荧光显微镜(Y.Sako, S.Minoghchi, T.Yanagida (2000)Nature Cell Biology2:168-172.)，全内反射显微镜以其对细胞膜区域成像的优势在单分子荧光成像领域取得了巨大的进展。全内反射突光显微成像也是一种宽场成像技术，它是在传统宽场突光显微镜的基础上，改变激发光的光路，通过调制激发光的入射角度，使激发光在折射率不同的两种介质的交界面发生全内反射现象。光线在界面处发生全内反射时，仍会向较低折射率的介质中投射一段很短的距离，一般在百纳米左右，被称为隐矢波或隐矢场。隐矢波的电磁场沿界面法线方向迅速衰减。这样一来焦平面以外的荧光分子不会被激发，背景荧光大大降低。在细胞成像中，这一深度刚好能照亮细胞膜区域，因此，全内反射荧光显微成像在细胞膜区成像非常有潜力。但是，全内反射荧光显微成像并不能直接应用到细胞内。由于细胞生命过程往往是连续的，在细胞膜上发生的生命活动往往也会延续到细胞内，例如细胞信号转导过程。如果能够将全内反射荧光显微镜拓展到细胞内，将是另一个突破。半全内反射突光显微成像就是一种介于普通宽场突光显微镜和全内反射突光显微镜之间的成像方法。当激光入射角稍小于临界角时，折射光会以接近平行的角度穿过细胞。折射光能够照亮一部分细胞内的区域，同时也会照亮细胞膜，也能获得背景干扰相对较低的突光图像(B.X.Cui, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of Americal04:13666-13671 (2007).)。由于细胞膜区的荧光也会干扰到细胞内区域的成像，信号背景比的提升不够明显，半全内反射荧光显微镜的应用受到了一定的限制。此前，已有人应用宽场落射式荧光成像与全内反射荧光成像先后成像来对细胞内微管进行成像(J.Schmoranzer, S.M.Simon, Molecular Biology of theCelll4:1558-1569 (2003).)。在全内反射荧光显微镜的光路上做一些调整，增加一条光路，就能够同时实现全内反射荧光显微成像和半 全内反射荧光成像。既可以同时实现细胞内和细胞膜区交替成像，也可以通过细胞膜区漂白的方式来进一步提高细胞内荧光成像信号背景比。这一技术整合，将进一步拓展半全内反射荧光成像在细胞内成像中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统，本发明通过在全内反射荧光显微照明系统中加入了第二路激发光，通过独立调节两路激发光的入射角度同时实现全内反射荧光成像和半全内反射荧光成像。本发明所提供的全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统，在激发光的光路上设置与光路呈135°的分光片I，使激发光成为2束垂直的透射光和反射光；所述透射光经反射镜反射后与所述反射光平行；所述反射光和所述透射光的光路上分别依次设有渐变密度中性滤光片、凸透镜1、凸透镜II和光斑孔径调节器；所述反射光和所述透射光分别经过所述渐变密度中性滤光片、所述凸透镜1、所述凸透镜II和所述光斑孔径调节器后再分别通过反射镜调整传输方向成为2束垂直光路；相互垂直的所述反射光和所述透射光的光路上均设有凸透镜III ；所述反射光和所述透射光经过所述凸透镜III后均入射至与所述反射光的光路呈135°的分光片II，经所述分光片II分成的2束平行光入射至显微镜激发光入口。上述的双光路荧光显微系统，所述渐变密度中性滤光片与所述凸透镜I之前设有光阀门。上述的双光路荧光显微系统，所述光阀门可为机械阀门，具体可由电脑进行控制。
上述的双光路荧光显微系统，所述反射光和所述透射光均通过2个所述反射镜进行调整传输方向成为垂直光路。上述的双光路突光显微系统,所述分光片I和所述分光片II均为50/50镜形分光片。上述的双光路荧光显微系统，所述渐变密度中性滤光片为圆形渐变密度中性密度滤光片。本发明提供的全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统中，两路激光可以是同波长激发光，用于激发位于不同深度的同一荧光分子，也可以选用不同波长的激发光，用于激发位于不同深度的不同荧光分子。本发明提供的全内反射照明光路可以用于漂白细胞膜区荧光分子，从而避免细胞膜区荧光分子给细胞内焦平面成像时带来的背景荧光干扰，进一步提高细胞内半全内反射荧光成像的信号背景比。
图1为本发明的双光路突光显微系统的结构不意图。图2为本发明双光路荧光显微系统对绿色荧光蛋白标记的细胞内囊泡的半全内反射荧光显微图和全内反射荧光显微图，其中标尺为10微米。图3为绿色荧光蛋白标记的细胞内囊泡的半全内反射荧光显微图，其中左图为未采用全内反射照明漂白，右图为采用了全内反射照明漂白细胞膜区域；其中标尺为10微米。图1中各标记如下:1激发光、2，1150/50镜形分光片、3，9反光镜、4圆形渐变密度中性滤光片、5机械阀门、6凸透镜1、7凸透镜I1、8光斑孔径调节器、10凸透镜111、12显微镜激发光入口。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。图1为本发明提供的全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统的结构示意图，一束激发光I经过50/50镜形分光片2分成两束激光:一束反射光和一束透射光。其中透射光经反射镜3反射后与反射光平行。反射光和透射光的强度可以由圆形渐变密度中性滤光片4调节。在反射光和透射光两条光路上分别设有两个由电脑控制的机械阀门5，能够由相机给出的信号控制独立开关。通过机械阀门5后的激发光分别被凸透镜I 6聚焦，再由凸透镜II 7转化为平行光，激发光经过这两组透镜之后实现了激光扩束的效果。然后，使用光斑孔径调节器8可以调节扩束之后激光光斑大小。两路激光分别经由反射镜9调整入射方向，在此处光路放置一个凸透镜III 10，并通过改变凸透镜III 10的水平位置来调节激发光射入物镜的位置并最终实现调节激发光从物镜出来后的射入样品的角度。两路激发光再次经由50/50镜形分光片11合并平行射入显微镜激发光入口 12，实现了两路激光的独立照明。荧光信号经显微物镜收集后由侧口双色双通道分光进入EMC⑶感光芯片。感光芯片分为两半，分别接收单色的荧光信号。反射镜9能够随时调整入射光的入射位置和入射角度，便于激光校准。而光斑孔径调节器8可以根据需要选择合适的照明区域大小，两路光可以分别由机械阀门5控制开闭，操作中可以选择所需的光路。本发明提供的双光路荧光显微系统中，其中分光片还可选择为其它比例的镜形分光片，通常用于漂白细胞膜的全内反射光路光强度要高一些，而细胞内成像用的半全内反射光路光强度可以稍低一些。使用上述双光路荧光显微系统对绿色荧光蛋白标记的细胞内囊泡进行了全内反射荧光成像和半全内反射荧光成像，结果如图2所示，其中图2中左图为半全内反射荧光显微图，图2中右图为全内反射荧光显微图。
在此基础上，又对比了采用全内反射照明的方法漂白细胞膜前后，细胞内半全内反射荧光成像如图3所示，可以通过对比全内反射照明漂白前的图像(左)和全内反射照明漂白后的图像(右)，其中漂白细胞膜后的细胞内荧光成像比直接使用半全内反射荧光显微镜信号背景比提高了 40%。另外，如果将本发明光路图中的50/50镜形分光片2和11同时替换为二向色性片该处二向色性片能反射小于500纳米的激发光，但是能透射高于500纳米的激发光，激发光为488纳米和561纳米混合输出时，反射光将只含有波长为488而透射光只含有波长为561的光。就可以实现两条光路分别使用不同波长的激发光，从而实现细胞膜以内一定范围内不同深度的双色荧光成像。
权利要求
1.全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统，其特征在于:在激发光的光路上设置与光路呈135°的分光片I，使激发光成为2束垂直的透射光和反射光；所述透射光经反射镜反射后与所述反射光平行；所述反射光和所述透射光的光路上分别依次设有渐变密度中性滤光片、凸透镜1、凸透镜II和光斑孔径调节器； 所述反射光和所述透射光分别经过所述渐变密度中性滤光片、所述凸透镜1、所述凸透镜II和所述光斑孔径调节器后再分别通过反射镜调整传输方向成为2束垂直光路； 相互垂直的所述反射光和所述透射光的光路上均设有凸透镜III; 所述反射光和所述透射光经过所述凸透镜III后均入射至与所述反射光的光路呈135°的分光片II，经所述分光片II分成的2束平行光入射至显微镜激发光入口。
2.根据权利要求1所述的双光路荧光显微系统，其特征在于:所述渐变密度中性滤光片与所述凸透镜I之前设有光阀门。
3.根据权利要求2所述的双光路荧光显微系统，其特征在于:所述光阀门为机械阀门。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的双光路突光显微系统,其特征在于:所述反射光和所述透射光均通过2个所述反射镜进行调整传输方向成为垂直光路。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的双光路突光显微系统,其特征在于:所述分光片I和所述分光片II均为50/50镜形分光片。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的双光路突光显微系统,其特征在于:所述渐变密度中性滤光片为圆形 渐变密度中性密度滤光片。
全文摘要
本发明公开了全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统。在激发光的光路上设置与光路呈135°的分光片Ⅰ，使激发光成为2束垂直的透射光和反射光；透射光经反射镜反射后与反射光平行；反射光和透射光的光路上分别依次设有渐变密度中性滤光片、凸透镜Ⅰ、凸透镜Ⅱ和光斑孔径调节器；反射光和透射光再分别通过反射镜调整传输方向成为2束垂直光路；相互垂直的反射光和透射光的光路上均设有凸透镜Ⅲ；反射光和透射光经过凸透镜Ⅲ后均入射至与反射光的光路呈135°的分光片Ⅱ，经分光片Ⅱ分成的2束平行光入射至显微镜激发光入口。本发明可以用于漂白细胞膜区荧光分子，避免细胞膜区荧光分子给细胞内焦平面成像时带来的背景荧光干扰，进一步提高细胞内半全内反射荧光成像的信号背景比。
文档编号G02B21/18GK103235406SQ20131015298
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者方晓红, 罗望熙, 夏铁 申请人:中国科学院化学研究所