用于带电粒子显微术的冷冻样本的制备方法

用于带电粒子显微术的冷冻样本的制备方法
【专利摘要】一种制备用于在带电粒子显微镜中进行研究的样本的方法，包括如下步骤：提供基本上平板状的样本保持架，该保持架具有相对的、基本上彼此平行的第一和第二主表面，包括至少一个孔隙，所述孔隙连接所述主表面，并且隔膜越过该孔隙跨越在所述第一主表面上，隔膜包括至少一个穿孔；使含水液体膜跨越所述穿孔，该液体包括悬浮在其中的至少一个研究样品；把样本保持架投入到冷冻剂溶液上，由此样本保持架被保持为所述第一主表面指向冷冻剂并且布置为基本上平行于冷冻剂的暴露表面，还包括下列步骤：紧接在膜与所述冷冻剂接触之前，把发射的冷冻流体从指向所述第二主表面的喷嘴施加到所述膜。
【专利说明】用于带电粒子显微术的冷冻样本的制备

【技术领域】
[0001]本发明涉及制备用于在带电粒子显微镜中进行研究的样本的方法，该方法包括如下步骤:
-提供基本上平板状的样本保持架，该保持架具有相对的、基本上彼此平行的第一和第二主表面，包括至少一个孔隙，该孔隙连接所述主表面，并且隔膜越过该孔隙跨越在所述第一主表面上，该隔膜包括至少一个穿孔；
-使含水液体膜跨越所述穿孔，该液体包括悬浮在其中的至少一个研究样品；
-把样本保持架投入到冷冻剂溶液上，由此样本保持架被保持为所述第一主表面指向冷冻剂并且布置为基本上平行于冷冻剂的暴露表面。
[0002]本发明附加地涉及用于投入-冷却在带电粒子显微镜中进行研究的样本的设备，该样本被提供在基本上平面的样本保持架上，该设备包括:
-臂状物，能被用于抓牢所述样本保持架的边缘并且将其保持在基本上水平的定向上；
-容器，能被至少部分地填充有冷冻剂溶液(bath)，以使得所述冷冻剂在给定的水平水准处具有暴露的上表面；
-下落机构，能够用于把所述臂状物移动到所述容器中，允许处于所述臂状物中的样本保持架被投入到所述水平水准下方，其中样本保持架的前侧面指向下方。
[0003]本发明还涉及在带电粒子显微镜中检查样本的方法，该显微镜包括:
-带电粒子源，用于产生带电粒子射束；
-支撑装置，用于支撑样本保持架，所述样本安放在样本保持架上；
-冷却装置，用于至少当样本保持架处于所述支撑装置上时保持所述样本保持架处于冷冻温度；
-粒子光学镜筒，用于把所述射束引导到所述样本上并且通过所述样本，以便在检测器上形成样本的部分的图像。

【背景技术】
[0004]如贯穿这个文本所使用的，接下来的术语应当被理解为与下面的解释一致:
-词语“带电粒子”包含电子或离子(通常为正离子，诸如例如镓离子或氦离子，但也可以是负离子；所讨论的离子可以是带电原子或分子)。该术语还可以指代例如质子。
-术语“显微镜”指代用于创建物体、特征或部件的放大图像的设备，这些物体、特征或部件通常太小而不能用人类裸眼看到满意的细节。在带电粒子显微镜(CMP)中，带电粒子的成像射束通过使用所谓的“粒子光学镜筒”而被引导到样本上，粒子光学镜筒包括静电和/或磁透镜的集合，该集合能被用于操控所述射束，用于向其提供例如特定的聚焦或偏转和/或减轻其中的一个或多个像差。在某些类型的CPM中，不同的粒子光学镜筒还可以被用于把从样本发出的带电粒子聚焦到检测器上。除了成像，CPM还可以具有其他功能，诸如执行分光镜检查、检查衍射图、执行(定位)表面修改(例如铣削、刻蚀、沉积)等。 -基本上平板状的样本保持架可以包括多于一个的所描述的孔隙；具体来说，其可以是包含这种孔隙的矩阵布置的网格状结构。类似地，跨越给定孔隙的隔膜可以包含多于一个的所描述的穿孔；具体来说，其可以包括这种穿孔的(随机的或规则的)分布。穿孔自身可以是被故意创建的(例如使用钻、刺、冲压或刻蚀技术)，或者他们可以天然地存在于隔膜中。这里所描述的预先制造的、可置换的、网格状样本保持架对CPM的用户来说是商业上可获得的。
-词语“含水液体”意图包含纯液体水，但还可以包含基于水的溶液或悬浮液。因此，除了生物液体(诸如例如细胞浆、血浆、淋巴液或羊水)之外，该术语还包括电解液。
-在表面张力效应的帮助下，含水液体膜基本上“跨越”所述(一个或多个)穿孔。存在已知的现有技术方法用于执行这个过程，例如，使用一片吸墨纸，该吸墨纸压靠样本保持架，被所讨论的含水液体弄湿，并且然后被移除-使含水液体薄膜留在(一个或多个)穿孔中，在某种程度上类似于吹泡器的环中的肥皂膜。
-术语“冷冻剂”应当被理解为指代处于冷冻温度的液体，即处于或低于_150°C。
-在当前情况中的“样本”可以被认为是具有(凝固的)含水液体的所述跨越膜，包括(一个或多个)其悬浮的研究样品。实际上，对这种样本执行的CPM研究通常将倾向于集中在所述(一个或多个)样品上而不是集中在(凝固的)液体上，样品被封装在(凝固的)液体中。
[0005]在接下来的内容中，将通过示例的方式经常在电子显微镜的特定背景中阐述本发明。然而，这种简化仅意图出于清楚/说明性目的，并且不应当被理解为限制。
[0006]带电粒子显微镜是用于对微观物体进行成像(尤其以电子显微镜检查法的形式)的公知的并且越来越重要的技术。历史上，电子显微镜的基本种类已经历发展而成为许多公知的设备类别，诸如透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、和扫描透射电子显微镜(STEM)，并且还成为各种子类别，诸如所谓的“双射束”工具(例如FIB-SEM)，其附加地采用“加工”聚焦离子射束(FIB)，允许支持性活动，诸如例如离子射束铣削或离子射束诱导沉积(IBID)。在TEM中，用于辐射样本的电子射束通常将具有比SEM的情况中显著高的能量(例如300keV对1keV),以便允许其组成电子穿透样本的总深度；出于相关的原因，在TEM中被调查的样本还将通常需要比在SHM中被调查的样本更薄。在传统电子显微镜中，成像射束在给定成像时段期间被“打开”达一延长的时间段；然而，在相对较短的电子“闪现”或“突发”的基础上发生成像的电子显微镜也是可获得的，当试图对例如移动样本或辐射敏感样品进行成像时，这样的方法具有潜在的益处。
[0007]因为TEM中的成像电子射束刺穿待调查的样本，所以这样的样本需要相对较薄(如上面已经陈述的那样)并且还需要安放在样本保持架上，该样本保持架不明显地干扰所述电子射束。这些要求在某些类型的样本的情况下可能呈现显著的挑战。具体来说，关于他们在CPM中的检查，需要在含水液体(诸如水、电解液、细胞液、血浆等)的主体中进行存储和研究的生物样品(诸如细胞、细胞部件、单细胞有机体等)可能呈现显著的挑战，因为:
-引入到CPM的(准)真空环境中的含水液体将开始放气/沸腾，因此倾向于使样本降级；
-为了防止这种情况，在被引入到所述真空中之前，样本可以首先被冰冻；
-然而，为了防止由(尖锐)冰晶的形成所引起的对样本的损坏，这种冰冻通常必须非常快速地执行，目的是实现样本玻璃化(凝固成无定形的、玻璃状的相)而没有显著冰结晶化； -由这个玻璃化过程产生的样本应当足够薄以被CPM中的冲击射束高效刺穿，但是该样本应当能够由其边缘支撑它(或至少支撑在非常薄的样本保持架(的部分)上)，以便支撑装置对射束穿透没有影响，或有至少相对有限的影响。
[0008]这些要求趋向于使这种样本的制备面临显著的技术挑战。
[0009]在上面的开始段落中阐述的方法在如下文章中得到阐明Nitrificat1n ofcryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imagingby S.Kasas et al.，J.Microscopy 211(1)，July 2003，pp.48-53。该文章基本上关注研究网格状样本保持架(3mm直径铜网格，碳隔膜，通常700-200 μ m的孔隙尺寸，大约2 μ m的穿孔尺寸，穿孔之间大约1-5 μ m的典型节距)和其被投入的冷冻剂溶液之间的以频闪方式分析的、时间分辨的热接触分布图。在这点上，其讨论了样本保持架“竖直投入”到冷冻剂中(由此样本保持架的平面垂直于冷冻剂的暴露表面)和“水平投入”(由此样本保持架的平面平行于冷冻剂的暴露表面)之间的差别，并且其提出后者作为实现比前者更一致的玻璃化结果的方式(在从样本到冷冻剂的更均一的热传递方面)。然而，该文章自身(基本上)没有涉及样本制备的其它重要方面，并且具体来说，没有解决样本污染的主题。
[0010]在本发明之前的研究中，发明人注意到上面暗示的“水平投入”方法一贯地倾向于产生遭受显著污染的样本。例如，参见下面的图3A，其示出了使用现有技术获得的玻璃化样本的Ιμπι χ? μ m正方形部分。在所采用的放大倍数(大约30k)下,这个正方形应当基本上是准一致的灰色(因为样本中的前面提到的研究样品太小而不能在这个图像中被分辨);然而，如从该图中可以清楚看见的，样本反而被深色、点状特征的分布所覆盖。这些污染物特征的存在可以大大地阻碍在CPM中对样本随后的分析，因为他们充当CPM的带电粒子成像射束的散射点。如果特定研究样品恰好被定位成沿着具有这样的污染物特征的共享瞄准线，或者接近于其，那么他通常不能通过使用CPM来被满意地查看。


【发明内容】

[0011]本发明的目的是解决上面阐述的问题。具体来说，本发明的目的是提供样本玻璃化过程，在该过程中，上面提到的污染问题的发生被减轻。
[0012]这些和其它目的在上面的开始段落中阐述的方法中被实现，该方法的特征在于:紧接在膜与所述冷冻剂接触之前，其把发射的冷冻流体从指向所述第二主表面的喷嘴施加到所述膜。
[0013]在导致本发明的实验中，发明人精密地调查了上面讨论的污染物特征。使用TEMX射线断层摄影术，他们能够探知所述特征发生在样本的“背侧面”(即在水平投入期间背向冷冻剂溶液的侧面)上。组合分析显示污染物特征是水冰的表面岛，该表面岛在样本的其它部分正在玻璃化时以某种方式成功形成。在许多进一步调查之后，发明人得出如下结论:当样本的前侧面接触冷冻剂溶液时，在样本自身中存在的液体水从样本背侧面浸出，并且该浸出的水冰冻成表面冰(在他能够被冷冻剂溶液无定形地凝固在样本中之前)。具有了这一认识，发明人寻求防止这样的浸出发生的方法。他们最终得出见解:通过恰巧在冷冻剂溶液和样本的前侧面之间接触时刻之前把突然发射的冷冻流体施加到样本的背侧面，样本的背侧面可以被玻璃化，因此形成对否则可能从样本浸出的液体水的阻挡。这个发明性过程的结果是至今广泛分布的污染物特征的发生显著减少，例如如图3B中图示的那样，图3B示出了使用本发明获得的玻璃化样本的Iym Xlym正方形部分，其基本上没有在图3A中普遍的污染物特征。
[0014]在本发明的背景下，下面的内容应当要注意:
-关于被发射到含水膜的背侧面上的冷冻流体，术语“流体”应当被广泛地理解为包含气体或液体，或混合形式，诸如例如飞沫或蒸汽，并且术语“冷冻”应当(再次)被理解为指代处于或低于_150°C的温度。
-在所述发射中的冷冻流体和投入溶液中的冷冻剂不一定(但如果需要，仍然可以)具有相同的组成/温度。例如，冷冻剂可以是处于_178°C温度的液体乙烷，而冷冻流体可以是处于-160°C温度的基本上干燥的氮气(并且〈10 ppm的水，ppm=百万分率)。
-术语“喷嘴”应当被广泛地理解为指代任何定量给料设备，其能够递送临时定义剂量的冷冻流体。这种临时定义可以例如在可控阀门或闸门的帮助下完成，和/或使用能够把喷嘴快速移动到样本背侧面上方的位置内/位置外的机构来完成。所述发射的定时/持续时间可以例如由自动机构(生成的定位点)来命令，该自动机构用于把样本保持架投入到冷冻剂中。为了方便，可以采用软管/导管来把要求的冷冻流体(或其前体)供应给喷嘴。
-规定“紧接”在膜与所述冷冻剂接触之前应当被理解为指示在所述接触之前的200毫秒内开始所述发射，优选地在100毫秒内，并且更优选地在10-50毫秒内。
[0015]这些点将在下面被更详细地阐明。
[0016]在本发明的特定实施例中，冷冻流体是基本上干燥的冷冻气体。在各种测试中，发明人已观测到:通常，气体相对较容易供应给喷嘴以及从喷嘴流出，并且还相对容易地防止气体干扰(混合)冷冻剂溶液和/或紧贴到样本/样本保持架。这不是说另一形式的冷冻流体不能被使用:例如，不是气体而是液体形式的流体通常将具有显著更高的热容量，这在某些情形下是有优势的。然而，上面阐述的实际方面(易于使用)通常将比这样的优势更重要。为了防止把不需要的晶体冰引入到样本附近，所采用的冷冻气体应当基本上是干燥的。例如，人们可以使用处于_160°C并且具有〈10 ppm (并且优选地甚至更少)的水蒸汽的氮气。其它气体(诸如氦、氙、氩、氖等)在原则上也可以被使用，但这样的气体比氮倾向于更昂贵并且更难以处理。
[0017]在前面的段落中阐述的本发明的实施例的特定方面中，使所述发射中的冷冻气体经受沿着所述第二主表面的至少部分的基本上分层流。这种流的优势是气体以可预测和可控的方式形成与第二主表面(和第二主表面内的(一个或多个)孔隙的内部)的基本上一致的热接触，由此(例如)如果需要，该流的速度可以被调整以便影响从样本到冷冻流体的热传递速率。相反的，非分层/混乱的发射将倾向于较差的均一性，从而产生如下风险:该发射可能包含相对较低压强的气穴，在该气穴中从样本到该发射的热传递比最优的低，伴随的风险是在这样的气穴内形成不想要的冰。这不是说非分层流体发射在本发明中不能使用，而是其随机的/不佳的可控性质倾向于使得他成为稍微较少吸引力的选项。
[0018]如果气体被用作冷冻流体，它将需要以冷冻温度从喷嘴发出。处于冷冻水平以上温度的气体(例如室温气体)能够例如通过使其穿过热交换器(该术语应当被广泛地理解为包含任何适当的冷却装置)而被适当冷却。这样的热交换器可以例如包括中空管道，该中空管道被卷绕成桶中的盘管；该桶可以被填充(或被注满)有冷冻液体(诸如液氮)，并且要冷却的气体(诸如处于室温的氮)可以传递到管道中并且穿过该管道，从该管道开始，气体将以降低的温度出现。如果盘管管道足够长并且壁足够薄，桶中的液体足够冷并且以足够的量存在/充满，并且管道内的气体流速不太高，那么从管道出现的气体将处于冷冻温度。如果气体以非冷冻温度出现，那么能够采用这种热交换器的一系列布置来执行例如多阶段/级联冷却。在不同的方案中，热交换器可以例如采用绝热冷却器，在该绝热冷却器中，通过允许输入气体突然膨胀(例如使用基于活塞的机构)来冷却输入气体。这些和其它的替代方案将适宜处于低温学领域的技术人员的范围内。理想地，从热交换器出现的冷却产品将完全由冷冻气体构成。然而，如果由热交换器获得的温度接近所讨论的气体的沸点/冷凝点，则一些输入气体可以以(准)液体形式(例如，作为液滴的蒸汽或雾状物)出现；例如，在处于I大气压的氮气的情况下，在大约-196°C的温度将开始发生这种到液体的(部分)冷凝。在这个背景下，在本发明的特定实施例中，使用包括下列步骤的方法，供应给喷嘴的气体被冷却到冷冻温度:
-给热交换器的输入提供处于非冷冻温度的气体；
-从热交换器的输出取得处于冷冻温度的气体/蒸汽混合物，该蒸汽包括所述气体的冷凝液滴；
-从所述气体/蒸汽混合物提取冷冻气体，并且使用提取的气体来产生所述发射。
[0019]在这种实施例的特定方面中，从所述气体/蒸汽混合物的流提取冷冻气体的步骤包括下列过程的至少一个:
-在所述流的基本上横向的方向上从所述流吸取所述气体；
-在所述流的基本上横向的方向上从所述流吹走所述气体。
[0020]这些方法利用如下事实:气体/蒸汽混合物中的气体的密度将小于蒸汽中冷凝液滴的密度，使得可以使用压强梯度来从所述流横向吸取/吹走气体，同时引起液滴的最小横向位移。使用这些见解，可以设想各种可能的喷嘴设计。例如:
(i)具有环形截面的第一管道能被用于引导降落环形“幕帘”中的混合气体/蒸汽流，该降落环形“幕帘”垂直于圆形样本保持架的背侧面并且以其为中心。所述环形截面的内径稍微大于样本保持架的直径，以使得这个幕帘倾向于在样本保持架的周界外侧降落。第二管道沿第一管道的圆柱轴集中布置，其中一端恰好位于样本保持架的上方，并且另一端连接到抽吸器(吸取装置)。这创建从样本保持架的边缘朝向其中心的圆形对称压强梯度，并且这个压强梯度从环形幕帘抽取冷冻气体并且使其在样本保持架的背侧面表面上方朝向第二管道流动并且流动到第二管道中。这个流可以通过(例如)突然打开/关闭第二管道和抽吸器之间的阀门而以发射的形式被施加。例如参见图4A。
[0021](ii)在这种设计的变型中，第一管道不再需要具有环形截面，并且被定位到样本保持架的一侧(其周界外侧)；这创建降落气体/蒸汽混合的切向“幕帘”。第二管道其被类似地定形/定尺寸/和定位，除了他被定位成与第一管道截然相反地穿越(相对于样本保持架的中心)。在这种情况下，连接到第二管道的抽吸器从切向幕帘抽取冷冻气体，并且使其在样本保持架的介入背侧面表面上方朝向第二管道流动并且流动到第二管道中。再次，这个流可以通过(例如)突然打开/关闭第二管道和抽吸器之间的阀门而以发射的形式被施力口。例如参见图4B。
[0022]各种其它这种实施例的设计和实施方式将适宜处于技术人员的能力内。为了好的秩序，图4C示出与图4B中的情形类似的情形，除了来自所采用的热交换器的产品现在仅包括气体，而不是气体和液滴的混合。这个情形可以例如使用对热交换过程的更准确的温度调节来实现。
[0023]为了实现含水液体膜的背侧面的满意玻璃化，其对来自本发明的喷嘴的冷冻流体的暴露应当是突然的-此后为术语“发射”。如果对来自喷嘴的冷冻流体的暴露是比较渐增/延长的，则存在如下风险:所述膜的背侧面将(至少部分地)冰冻成晶体形式而不是无定形凝固-这在本发明的背景下是不期望的。发明性发射的定时和持续时间可以依赖于各种因素被调谐/优化，具体来说依赖于样本(竖直)投入到冷冻剂溶液中的速度(其通常可以是大约每秒2-3米的数量级)而且还依赖于如下参数，诸如发射中的冷冻流体的温度、由喷嘴产生的压强/流样式等。作为概测法，这里仅出于一般指导的目的给出下面的参数可以被用于本发明中:
-所述发射在所述膜与冷冻剂溶液接触之前的时间T开始，其中T被选择为在1-100毫秒的范围中。
-所述发射持续Δ T的持续时间，其中Δ T被选择为在1-100毫秒的范围中。
[0024]技术人员将能够选择其自己的T和ΔΤ值，调节为关于本发明的给定实施例的布置和参数。
[0025]参考上面的讨论，并且尤其参考在先前的段落中的讨论，本发明还提供一种用于投入-冷却样本的设备，所述样本被提供在基本上平面的样本保持架上，所述设备包括:
-臂状物，能被用于抓牢所述样本保持架的边缘并且将其保持在基本上水平的定向上；
-容器，能被至少部分地填充有冷冻剂溶液，以使得所述冷冻剂在给定的水平水准处具有暴露的上表面；
-下落机构，能够用于把所述臂状物移动到所述容器中，从而允许处于所述臂状物中的样本保持架被投入到所述水平水准下方，其中样本保持架的前侧面指向下方，
其特征在于所述设备还包括:
-定量给料机构，用于把可控发射的冷冻流体施加到所述样本保持架的背侧面；
-控制器，连接到所述下落机构和所述定量给料机构，用于把所述发射定时为紧接在所述样本保持架与所述水平水准相交之前发生。
[0026]关于这样的设备，可以注意下面各项:
-臂状物可以是能够用于水平地保持所述样本保持架并且良好安装在容器周界内的任何结构/附件。臂状物用来抓牢样本保持架的机构是开放选择的:其可以例如需要某一种类的镊子或磁夹具或例如与样本保持架上对应的孔隙协作的销。
-容器可以是任何不漏液体的器皿，该器皿使自己适用于保持所选冷冻剂的主体，足够深以允许样本保持架被投入到期望深度(例如几毫米)并且足够宽以在投入期间容纳臂状物/样本保持架的进入。它可以是例如(相对较小的)杜瓦瓶或烧瓶，或者仅是绝缘(金属或陶瓷)杯。
-下落机构可以采用各种形式。其可以例如采用自由降落机构，利用机械或电磁释放。替代地，其可以采用某一种类的弹力/弹性机构，该弹力/弹性机构可以被选择性地触发以便把臂状物“弹射”到容器中。或者其可以采用促动器(诸如压力或线性电机)，促动器可以展现为把臂状物主动地驱动到容器中，等。 -定量给料机构将基本上包括某种形式的可控喷嘴，该喷嘴可以用于按命令发出冷冻流体的发射(喷出、喷射)。人们能够例如设想阀门操作喷嘴，该阀门操作喷嘴与臂状物一起移动并且在样本保持架下降到容器中期间被引导到样本保持架的背侧面。替代地，人们例如能够设想不是默认位于样本背侧面上方的喷嘴，而是改为在可选的时刻摆动到样本保持架的上方位置中/越过样本保持架；在这种情况下，要求的喷射借助于喷嘴迅速/突然运动越过所述样本保持架来递送。喷嘴可以例如经由柔性软管/导管连接到冷冻流体的储液器，或者它可以具有其自身的“板上”(on-board)(微型)储液器。
-控制器通常可以是某种形式的计算机处理器。它可以以不同方式决定发射的定时，例如简单地基于先前的校准运行(被动方法)或基于对下落臂状物/样本保持架的(瞬时)位置/速度的实时测量使用测量装置(诸如光学编码器、干涉仪、电容式传感器、光电二极管等)的输出来确定发射的发生/持续时间(主动方法)。
[0027]技术人员将理解这些点，并且将能够根据给定情形的细节选择并且展现各种实施方式。
[0028]关于样本被投入其中的冷冻剂溶液，存在关于所使用的冷冻剂的各种可能的选择。例如，各种专业人员使用液体乙烷/丙烷混合来报告。在本发明的特定实施例中，冷冻剂溶液包括处于_160°C到_183°C范围中温度的液体乙烷(不具有大量的其它组成物)。当通过投入-冷却样本来玻璃化样本时，人们可能趋向于遵守“越冷越好”规则。然而，在低于大约-183°C的温度，发明人已观测到液体乙烷倾向于变得如此粘稠以至于开始妨碍投入过程，例如通过紧贴到样本保持架。因此在这个水平(例如_178°C)以上的温度通常是优选的。

【专利附图】

【附图说明】
[0029]现在将在示例性实施例和所附的示意图的基础上更详细地阐明本发明，其中:
图1A呈现用于投入-冷却样本到冷冻温度的现有技术设备的各方面的正视图；
图1B示出在根据本发明修改之后的图1A的设备；
图2呈现样本保持架的特定实施例的各方面的平面视图(顶部)、横截面视图(中间)和扩大的细节视图(底部)，该样本保持架可以用于承载包括含水液体膜的样本；
图3A和3B是含水液体样本的相对较低放大倍数的--Μ图像，该含水液体样本在网格上制备并且使用根据现有技术(图3A)和本发明(图3B)的投入方法玻璃化；
图4A、4B和4C描绘了不同喷嘴/流构造的纵截面视图，该喷嘴/流构造使他们自身适合于应用在本发明的实施例中；
图5呈现带电粒子显微镜的正视图，带电粒子显微镜使其自身适合于与本发明一起使用。
[0030]在图中，相关的、对应的部分使用对应的参考符号指定。应当注意的是，通常这些图不是按比例的。

【具体实施方式】
[0031]图1A呈现用于投入-冷却样本到冷冻温度的现有技术设备I的各方面的示意正视图，样本被保持在样本保持架S上(在图2中更详细地示出)。注意笛卡尔坐标系XYZ，该坐标系将在后面的描述中被使用。描绘的设备I包括:
-臂状物3，能被用于在样本保持架S的边缘处/附近抓牢样本保持架S，并且将样本保持架S保持在基本上水平的定向上(平行于XY平面)。该臂状物3包括抓牢部分3a，抓牢部分3a使用例如镊子动作来抓牢样本保持架S。如果需要，样本保持架S可以具有小的突耳(未描绘)，该突耳允许样本保持架S更容易地被抓牢部分3a所抓牢。
-容器5 (诸如杜瓦瓶)，能被至少部分地填充有冷冻剂7的溶液，以使得所述冷冻剂7在给定的水平水准H处具有暴露的上表面9。这个上表面9将基本是水平的，除了相对较小的新月效应。
-下落机构lla、llb，能够用于(至少部分地)把臂状物3移动到所述容器5中，允许处于臂状物3 (的抓牢部分3a)之中/之上的样本保持架S被投入到所述水平水准H下方，其中样本保持架S的前侧面Sf指向下方(平行于Z方向)。如这里描绘的，下落机构11a、Ilb包括滑块11a，滑块Ila能够沿杆Ilb向上和向下平行于Z方向移动(如由箭头Ilc指示的)。在投入期间滑块Ila的向下运动例如可以是自由降落、弹射的或机动化的，如上面已经阐述的那样。在当前的布置中，线性电机(未描绘)被提供在滑块Ila中，并且这使其自身沿杆/定子Ilb动作。
[0032]图2 (不按比例)呈现能够与图1A的设备I 一起使用的样本保持架S的特定实施例的各方面的更详细的(示意)视图。该特定类型的样本保持架S经常被称为“网格”或“自动网格”。其包括Cu线的圆形环21a，该环的直径大约是3_并且线的直径(通常)是大约50-100 μ m数量级。直线部分21b附接在环21a内，直线部分21b被布置为形成正交网格样式，因此限定(基本上为正方形的)孔隙(开口 /孔/窗口)23的矩阵状阵列。图2的中间部分示出沿直径A-A’取得的该图的上部的横截面视图。其示出了样本保持架S具有基本上平面(平板状)形式，具有基本上彼此平行的相对的第一(SI)和第二(S2)主表面。任何给定的孔隙23 “连接”这些主表面S1、S2，其中孔隙23充当主表面之间的连接通道。如这里描绘的，隔膜25跨越在第一主表面SI上(并且可选地，固定到线21b，例如使用粘合剂或通过熔化结合)。该隔膜25可以例如包括碳质材料，诸如尼龙或石墨烯，并且通常将具有从大约0.3nm到数百nm范围的厚度(在Z方向)。隔膜25包含分布的穿孔27，穿孔27在该图的底部的详细视图中清晰可见。这些穿孔27通常具有大约2 μ m数量级的直径(平行于XY平面)。实质上，网格结构21a、21b充当隔膜25的支架，并且隔膜25继而充当穿孔27的支撑结构(使得其有时被称为“有孔碳支撑”)。在穿孔27内提供和支撑最终的“样本以含水液体的薄膜29的形式(包括悬浮于其中的一个或多个研究样品)，该薄膜29跨越每个给定的穿孔27，(尤其)借助于表面张力效应而保留在原位。
[0033]应当注意的是，图2中描绘的(网格21a、21b+穿孔隔膜25、27)和上面描述的样本保持架S在商业上可获得，例如从诸如美国加利福尼亚州莱丁的Ted Pella公司之类的企业。还可以例如从诸如德国耶拿的Quantifoil Micro Tools有限责任公司之类的企业购买(各种)预先制造的有孔碳膜(对应于穿孔隔膜25、27)。应当注意的是，原则上，在本发明中使用的样本保持架S基本上要求仅一个孔隙23和仅一个穿孔27 ;然而，多个这种结构23,27当然被本发明所允许，并且通常是有优势的，因为其通常允许更多的样本材料出现在样本保持架S的给定区域上。
[0034]使用在技术著作中充分描述并且技术人员已知的方法，含水液体的膜29可以被提供在样本保持架S的各个穿孔27中。在一个这种已知的方法中，一片吸墨纸(未描绘)压靠样本保持架S的表面SI，然后被所讨论的含水液体弄湿，并且随后从样本保持架S被移除(例如剥离)_使(大部分)孔隙27被赋予含水液体的(微型)膜29，该膜29通过表面张力效应跨越在孔隙27内。这个类型的方法例如在如下文章中描述并且这里将不接受进一步的注意力:Cryo-negative Staining by Marc Adrian et al.1n Micron 29 (2-3), ElsevierScience Limited, 1998， pp.145-160。
[0035]现在回到图1，一旦样本保持架S已被提供有上面阐述的它的(一个或多个)含水液体的膜29，它就可以被安放在臂状物3的抓牢部分3a上，按照表面SI上的隔膜25面向下朝向容器5的这种方式，因此形成保持架S的前侧面Sf (其中表面S2形成背侧面Sb)。冷冻剂7的合适溶液(例如液态乙烯)被提供在容器5中，并且然后下落机构IlaUlb用于把样本保持架S突然投入到冷冻剂7中，例如以大约2 ms—1的速度。这样的过程例如在上面提到的Kasas等的文章中描述。在样本保持架S已按这个方式被投入-冷却后，样本保持架S从冷冻剂7被移除并且放置在冷冻保持架(未描绘)之上/之中，该冷冻保持架能够维持其处于冷冻温度直到其在CPM中经受研究。
[0036]如上面已经阐述的，发明人已经发现这个现有技术方法在样本质量方面产生不满意的结果。更具体来说，以这种方式冷却的样本倾向于展示出严重的污染。这个效应在图3A中示出，其描绘了含水液体膜29的I μπι xl ym正方形部分(平铺)，该正方形部分已使用在图1A中图示并且在上面阐述的现有技术的设备/技术被投入-冷却，并且在这里使用冷冻-TEM以相对较低的放大倍数(太低而不能分辨悬浮于所讨论的含水液体中的微小生物研究样品)被成像。应当是基本上均一 /无特征的图像的内容改为点缀有深色、点状特征31。如上面解释的，发明人已证实这些特性31事实上是表面冰岛，其在投入期间在膜29的面向上/背向冷冻剂7的侧面上形成。这些特征31的存在使共享共同瞄准线的研究样品模糊，并且在用于研究膜29的带电粒子射束中引起不想要的散射效应。
[0037]实施例1
为了解决在前面的比较性示例(关于膜29的污染)中阐述的负面问题，本发明人修改了上面描述的现有技术设备/技术。根据本发明的投入-冷却设备I’的示例在图1B中示出。其与图1A的设备共享许多特征(其使用相同的参考符号标记)，但是它也包含许多附加的特征/方面。
[0038]具体来说，设备I’包括喷嘴13，喷嘴13安放在臂状物3的附件3b上以使得喷嘴13指向样本保持架S的背侧面Sb，并且能够紧接在样本保持架的前侧面Sf到达水平水准H之前递送到达其的冷冻流体的受控发射15。喷嘴13经由柔性软管/导管13b连接到生产单元(热交换器/储液器)13a，并且该生产单元13b可以用于产生/存储喷嘴13要求的冷冻流体的供应；在这种情况下，协作组合13、13a、13b可以被认为包括定量给料结构以用于供应发射15。发射15的定时/持续时间由控制器17 (例如计算机处理器)支配，控制器17通过控制线17’连接到设备I’的关键元件。如这里图示的，控制器17连接到:
-定量给料机构13、13a、13b,例如连接到定量给料阀门或闸门，该阀门或闸门支配到达/来自喷嘴13的输出的冷冻流体流；
-下落机构I la、I lb，例如连接到促动器/释放机构，该促动器/释放机构设置滑块I Ia向下运动； -装置19，该装置19用于确定样本保持架S即将与水平水准H相交的时间。这样的装置19可以包括例如光学编码器、或与光束协作的光电二极管、或者照相机等，所述光束将由于样本保持架S的降落而被中断，所述照相机使用图像识别软件来识别样本保持架S(或臂状物3的给定部分)的位置。如果需要，设备19还可以用于确定在样本保持架S的投入期间样本保持架S的降落速度。
[0039]如上面已经陈述的，装置19实际上是可选的；作为替代，人们可以例如基于在前校准运行来预测水平水准H将与样本保持架S相交的时刻。如果需要，人们可以努力维持水平水准H基本上恒定，例如通过使容器5具体化为“溢流杯”，冷冻剂7的流持续流入/流出该“溢流杯”。
[0040]在特定(非限制)示例中:
-样本保持架S以2 HiiT1的速度与水准H相交。
-喷嘴13施加冷冻气体发射，该发射在水准H被相交之前的1-10毫秒(T)开始，并且持续1-10毫秒(Δ T)的持续时间。
-在发射15中采用的冷冻流体是干燥氮气，处于_160°C并且处于10-1OOOmbar的压强/每分钟0.1-3升的流速。
-喷嘴13 (的出口)位于样本保持架S的背侧面Sb的上方0.2-2mm。
[0041]如上面已经陈述的，根据本发明的喷射15的效果是恰好在膜29的面向下侧面接触容器5中的冷冻剂7之前使膜29的面向上侧面玻璃化，因此形成防止水从所述面向上侧面浸出的密封层。这个密封层的最终效果是防止在膜29上形成上面提到的表面冰岛。这个效果由图3B生动地图示，其描绘了含水液体膜29的I μ m xl μ m正方形部分(平铺)，该正方形部分已使用图1B中图示的并且在本实施例中阐述的设备/技术被投入-冷却并且使用冷冻TEM以与图3A中相同的放大倍数(30k)被成像。注意不存在图3A中如此普遍的深色特征31。
[0042]注意，在样本保持架S已被投入到冷冻剂7的溶液中并且从冷冻剂7的溶液取出之后，并且在把他放置在冷冻保持架中以用于随后的存储/传输之前，一个好构想可能是，将其短暂倾斜以便允许可能在其上存在的任何过量的冷冻剂流走。
[0043]实施例2
图4A呈现适于与本发明一起使用的喷嘴13的特定实施例的纵截面视图。描绘的喷嘴13是上面阐述的类型(i )，并且包括:
-具有环形截面的第一管道(孔洞/沟道/通道)41，中心为圆形样本保持架S的背侧面，并且具有稍微大于样本保持架S的直径的内径。这个管道41具有输入流41i (例如来自图1B中示出的软管13b)和(主)输出流41ο。在这个特定实施例中，输入流41 i包括混合气体/液滴的流41m，流41m在平行于Z方向的环形“幕帘”中降落，并且(主要)在样本保持架S的周界外侧穿过。
-第二管道(孔洞/沟道/通道)43，其沿第一管道41的圆柱轴集中布置，其中一端恰好位于样本保持架S的上方，并且另一端连接到抽吸器/吸取装置(未描绘)。这个布置创建从样本保持架S的边缘朝向其中心的圆形对称压强梯度，并且这个压强梯度从环形流41m抽取冷冻气体(但不抽取冷凝液滴)并且使其在样本保持架S的背侧面表面上方朝向第二管道43流动并且流动到第二管道43中，因此，形成到管道43的冷冻气体43g的输入流43i以及到抽吸器的对应输出流430。
[0044]冷冻气体43g的流43i可以通过(例如)突然打开/关闭以下各项而以发射的形式被施加:
-第二管道43和抽吸器之间的输出阀门；或 -第一管道41上游的输入阀门。
[0045]替代地，人们可以采用“推进和撤回”策略，由此喷嘴13被短暂摆动/推动到样本保持架S的背侧面Sb上方的位置中，暂时地使其就位以递送短暂剂量的冷冻气体43i/43g。图4A还图示了可选的网孔45，该网孔(如果需要)能被用于帮助从混合流41m带离气体流43g的过程。
[0046]实施例3
图4B呈现适于与本发明一起使用的喷嘴13的替代实施例的纵截面视图。描绘的喷嘴13是上面阐述的类型(ii )，并且包括:
-第一管道41 (不需要具有环形截面)，定位到样本保持架S的一侧(其周界外侧)。管道41具有输入流41i (例如来自图1B中示出的软管13b)和输出流41ο。再次，输入流41i包括混合气体/液滴的流41m，并且流41m在平行于Z方向的切向“幕帘”中降落，在样本保持架S的周界外侧穿过。
-第二管道43，其被类似地定形/定尺寸/和定位，除了他被定位成与第一管道41截然相反地穿越(相对于样本保持架S的中心)。抽吸器(未描绘)连接到第二管道43，并且其从切向幕帘41m抽取冷冻气体43g (不具有冷凝液滴)，在样本保持架S的介入背侧面表面上方引起流43i并且使流43i到第二管道43中(从第二管道43开始，其最终作为到抽吸器的输出流43ο出现)。
[0047]再次，冷冻气体43g的流43i可以通过(例如)突然打开/关闭以下各项而以发射的形式被施加:
-第二管道43和抽吸器之间的输出阀门；或 -第一管道41上游的输入阀门。
[0048]如上面解释的，人们可以替代地采用所述“推进和撤回”策略，由此喷嘴13被短暂摆动/推动到样本保持架S的背侧面Sb上方的位置中，暂时地使其就位以递送短暂剂量的冷冻气体43i/43g。
[0049]实施例4
图4C示出与图4B的情形类似的情形，除了输入流41i现在包括冷冻气体41g而不是气体/液滴混合物。这个不同可以例如是在图1B的生产单元13a中更高效的温度控制的结果，由此气体41g被冷却到冷冻温度，但不冷却到太接近其沸点/冷凝点(在氮气的情况下为-196°C)的温度。
[0050]实施例5
图5是带电粒子显微镜M的实施例的高度示意性描绘，带电粒子显微镜M使其自身适用于与本发明一起使用。在图中，真空外壳2封装CPM，该CPM在这个情况中为TEM。在描绘的TEM中，电子源4 (诸如例如肖特基枪)产生电子射束，该电子射束穿越电子光学镜筒6，电子光学镜筒6用于把电子射束引导/聚焦到样本保持架S (例如图2中描绘的类型)的所选择区域上。这个电子光学镜筒6具有电子光学轴8，并且一般将包括各种静电/磁透镜、偏转器、改正器(诸如消象散器)等。在TEM的情况下，电子光学镜筒6可以被称为(包括)聚光器系统。
[0051]样本保持架S被保持在支撑装置10上，支撑装置10可以由放置装置(平台)12以多自由度放置；例如，支撑装置10可以包括指状物，该指状物可以在(尤其)XY平面中移动(参见描绘的笛卡尔坐标系)。这样的移动允许样本保持架S的不同区域被沿轴8行进的电子射束辐射/成像/检查，并且还允许扫描运动以STEM模式执行。冷却装置14与支撑装置10紧密热接触，并且能够维持后者处于冷冻温度。因此，根据本发明被投入-冷却到冷冻温度的样本保持架S可以使用(商业上可获得的)冷冻保持架(其维持样本保持架处于冷冻温度)转移到CPM M，并且能够被放置以供在支撑装置10上检查，支撑装置10已由冷却装置14预先冷却。冷却装置14可以例如使用循环冷冻冷却剂来实现并且维持期望的低温。
[0052]沿轴8行进的聚焦电子射束将与样本保持架S上的样本((一个或多个)含水液体膜29)以如下方式交互:即，使各种类型的“受激励”辐射从样本发出，包括(例如)次级电子、反向散射电子、X射线和光学辐射(阴极致发光);如果需要，在检测器22的帮助下可以检测这些辐射类型中的一个或多个，检测器22可以是例如组合的闪烁器/光电倍增器或EDX(能量色散X射线光谱仪)检测器。然而，在TEM中主要关注的是穿过样本、从样本出现并且继续沿轴8传播的电子。这种透射电子进入电子光学投影系统24，电子光学投影系统24通常将包括各种静电/磁透镜、偏转器、改正器(诸如消象散器)等。这个透镜系统24把透射电子聚焦到荧光屏26上，如果需要，荧光屏26可以缩进/抽出(如由箭头28示意性指示的)以便使其离开轴8的路径。样本(的部分)的图像将由透镜系统24在屏幕26上形成，并且其可以通过查看端口 30查看，查看端口 30位于壁2的合适部分中。针对屏幕26的缩回机构可以例如是机械和/或电气性质的，并且在这里没有描绘。
[0053]作为查看屏幕26上图像的替代，人们可以改为利用像素化电子检测器32，诸如例如CMOS或CCD检测器。为了这个目的，屏幕26被缩回(参见前面段落)，并且电子光学系统34被展现以便使从透镜系统24出现的电子的焦点移位并且把他们重新引导/聚焦到检测器32上(代替屏幕26)。这里，这些电子可以形成可以由控制器50处理并且显示在显示装置(未描绘)(诸如例如平板显示器)上的图像。替代地，电子光学系统34可以起EELS偏转器的作用，例如用于把来自透镜系统24的电子射束分开成多个(能量选择)子射束，该多个子射束冲击检测器32的不同区域。如又另一替代方案，检测器32可以例如用于记录由样本S产生的衍射图案。技术人员将非常熟悉这些各种可能性，其在这里不需要进一步的阐明。他还将意识到，如果需要，检测器22可以是与检测器32类似/相同的类型的像素化检测器。
[0054]要注意，控制器(计算机处理器)50经由控制线(总线)50’连接到各种图示部件。该控制器50可以提供各种功能，诸如同步动作、提供定位点、处理信号、执行计算、和在显示装置(未示出)上显示消息/信息。技术人员将理解，外壳2的内部不一定被维持为严格真空；例如，在所谓的“环境TEM”中，给定气体的背景氛围被故意引入(维持)在外壳2内。
[0055]对于关于这个主题的一些通用信息，参考下面的链接: http://en.wikipedia.0rg/wiki/Electron_optics http://en.wikipedia.0rg/wiki/Electron_microscope。
【权利要求】
1.一种制备用于在带电粒子显微镜中进行研究的样本的方法，包括如下步骤: -提供基本上平板状的样本保持架，所述保持架具有相对的、基本上彼此平行的第一和第二主表面，包括至少一个孔隙，所述孔隙连接所述主表面，并且隔膜越过所述孔隙跨越在所述第一主表面上，所述隔膜包括至少一个穿孔； -使含水液体膜跨越所述穿孔，所述液体包括悬浮在其中的至少一个研究样品； -把样本保持架投入到冷冻剂溶液上，由此样本保持架被保持为所述第一主表面指向冷冻剂并且布置为基本上平行于冷冻剂的暴露表面， 其特征在于: -紧接在所述膜与所述冷冻剂接触之前，把发射的冷冻流体从指向所述第二主表面的喷嘴施加到所述膜。
2.根据权利要求1的方法，其中所述冷冻流体是基本上干燥的冷冻气体。
3.根据权利要求2的方法，其中使所述发射中的所述冷冻气体经受沿着所述第二主表面的至少部分的基本上分层流。
4.根据权利要求2或3的方法，其中使用包括下列步骤的方法来提供处于冷冻温度的所述气体: -给热交换器的输入提供处于非冷冻温度的气体； -从热交换器的输出取得处于冷冻温度的气体/蒸汽混合物的流，所述蒸汽包括所述气体的冷凝液滴； -从所述流提取冷冻气体，并且使用提取的气体来产生所述发射。
5.根据权利要求4的方法，其中从所述流提取冷冻气体的所述步骤包括下列过程的至少一个: -在所述流的基本上横向的方向上从所述流吸取所述气体； -在所述流的基本上横向的方向上从所述流吹走所述气体。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述发射在所述膜与所述冷冻剂接触之前的时间T开始，其中T被选择为在1-100毫秒的范围中。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述发射持续ΔΤ的持续时间，其中ΔΤ被选择为在1-100毫秒的范围中。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述冷冻剂包括处于_160°C到_183°C范围中温度的液体乙烷。
9.一种用于投入-冷却在带电粒子显微镜中进行研究的样本的设备，所述样本被提供在基本上平面的样本保持架上，所述设备包括: -臂状物，能被用于抓牢所述样本保持架的边缘并且将其保持在基本上水平的定向上； -容器，能被至少部分地填充有冷冻剂溶液，以使得所述冷冻剂在给定的水平水准处具有暴露的上表面； -下落机构，能够用于把所述臂状物移动到所述容器中，从而允许处于所述臂状物中的样本保持架被投入到所述水平水准下方，其中样本保持架的前侧面指向下方， 其特征在于所述设备还包括: -定量给料机构，用于把可控发射的冷冻流体施加到所述样本保持架的背侧面； 控制器，连接到所述下落机构和所述定量给料机构，用于把所述发射定时为紧接在所述样本保持架与所述水平水准相交之前发生。
10.一种在带电粒子显微镜中检查样本的方法,所述显微镜包括: -带电粒子源，用于产生带电粒子射束； -支撑装置，用于支撑样本保持架，所述样本安放在样本保持架上； -冷却装置，用于至少当样本保持架处于所述支撑装置上时维持所述样本保持架处于冷冻温度； -粒子光学镜筒，用于把所述射束引导到所述样本上并且通过所述样本，以便在检测器上形成所述样本的部分的图像， 其特征在于:在被放置在所述支撑装置上之前，使用权利要求1-8中任一项所述的方法制备所述样本。
【文档编号】H01J37/20GK104517791SQ201410519575
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】H-W.米格, K.斯穆德斯-维梅斯, M.M.奧维斯延科, K.S.萨德, F.尼佩斯 申请人:Fei 公司