专利名称：鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白ymdd功能区的抑制肽及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术的分子生物学和生物化学领域，涉及从噬菌体肽库中筛选到的鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽，可抑制DHBV复制，适用于HBV的分子病毒学研究以及抗HBV药物的研制。
背景技术：
慢性乙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病，慢性乙肝的防治是一个全球性公共卫生问题，已引起世界各国的关注。开发切实有效的病毒性肝炎的治疗药物，是当前亟待解决的重大课题。
在HBV复制周期中，肝细胞核中的HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)分子是HBV mRNA和前基因组RNA的合成模板，它是HBV持续感染的主要因素，因此抑制HBV cccDNA的合成是根治乙型肝炎的关键所在。乙型肝炎不能彻底治愈的根本原因在于目前所用的抗病毒药物无法抑制肝细胞核内HBV cccDNA的合成。HBV逆转录酶抑制剂能阻断大部分新的HBV DNA合成，但对核内多达50或更多拷贝的cccDNA池影响甚微。这也是目前临床使用的拉米呋啶(Lamivudine，3TC)等核苷类似物不能根治乙型肝炎的原因。因此，有必要开发能抑制HBVcccDNA的药物。
HBV属于嗜肝DNA病毒科，其它哺乳动物和禽类嗜肝病毒的发现为人类研究HBV的生物学相关机制提供了实验和(或)道德伦理上的方便。在研究人类HBV感染相关机制时，土拨鼠肝炎病毒(WHV)感染的旱獭和鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染的鸭子是最广泛采用的模型。由于鸭子人工感染DHBV与人类感染HBV的结果相似，所以DHBV感染鸭子是一个很好的模型，能获得在人类身上不能获得的信息，现多用于HBV的分子病毒学研究，以及抗HBV药物的研究。
大多数开发成功或正在开发的直接作用于病毒的药物为核苷类似物，其抑制多聚酶功能的机制为竞争性抑制作用。根据竞争性抑制作用的原理，作用的药物必须有较高浓度才起作用。理想的抑酶药物应该是能与酶促反应中间产物结合，产生反竞争性抑制作用或非竞争性抑制作用。抑制肽与靶蛋白(多聚酶)的结合，并非酶与底物的关系，而是类似抗原抗体反应的分子间作用力。亲合力高的抑制肽有可能达到这种效果。
应用噬菌体展示技术筛选抑制肽，是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选与靶分子特异性结合的多肽的一项新技术。它将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选技术。将待选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因之间，每一个噬菌体只含有一个外源基因，即每一个噬菌体只表达一种外源肽或蛋白，且呈现在噬菌体表面，而且不影响噬菌体的完整性。利用展示的多肽与目的蛋白(主要是抗体、抗原及一些细胞生长因子受体等)或其他生物大分子亲和的性质可高效率的筛选出特异多肽。噬菌体展示的有特异性结合力的多肽可以用固定的配体从肽库中筛选出来，筛选出来的多肽的序列可以从被包裹着的DNA序列推论出。
本发明是通过噬菌体表面展示技术，筛选与鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区特异性结合的抑制肽，用于抑制鸭肝原代培养细胞中DHBV复制。适用于HBV的分子病毒学研究，以及抗HBV药物的研究。
发明内容
本发明利用噬菌体表面展示技术，筛选到与一种鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区能特异性结合的抑制肽，用于抑制鸭肝原代培养细胞中DHBV复制。适用于HBV的分子病毒学研究，以及抗HBV药物的研制。
上述抑制肽的氨基酸序列为SEQ NO 1His Phe Ser Leu Ser Pro Arg。
上述抑制肽的筛选方法为用鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的短肽作为靶位，利用噬菌体表面展示技术筛选与所述靶位特异性结合的肽，即为抑制肽。
上述鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区短肽的氨基酸序列为SEQ NO 2Phe AsnVal Trp Thr Phe Thr Tyr Met Asp Asp Phe Leu Leu Cys His Pro Asn Ala Arg。
本发明筛选的抑制肽应用于抗HBV药物的制备。
上述抑制肽的筛选方法包含以下的步骤1、根据绍兴麻鸭的DHBV多聚酶蛋白序列，合成拉米呋定与DHBVP结合位点的YMDD功能区的短肽的氨基酸序列Phe Asn Val Trp Thr Phe Thr Tyr Met Asp Asp Phe Leu Leu Cys His ProAsn Ala Arg。
2、噬菌体肽库筛选、滴度的测定、噬斑的扩增噬菌体多肽库筛选的方法，参见实施例一。
3、模板序列测定方法参见实施例一。根据提供的载体信息，获得DHBV YMDD功能区抑制肽氨基酸序列His Phe Ser Leu Ser Pro Arg。
4、DHBV YMDD功能区抑制肽抑制DHBV复制的生物学功能测定试验方法参见实施例二。DHBVYMDD功能区抑制肽His Phe Ser Leu Ser Pro Arg直接作用组对细胞DHBV DNA抑制率为95.4％；抑制肽直接作用组对胞浆DHBV DNA抑制率为89.1％。
本发明利用噬菌体表面展示技术筛选到的DHBV多聚酶(P蛋白)的YMDD功能区能特异性结合的抑制肽，应用于HBV的分子病毒学研究，以及抗HBV药物的研制。
具体实施例方式
本发明结合实施例作进一步说明。
实施例一 鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区抑制肽的筛选。
(一)鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区短肽的合成根据绍兴麻鸭的DHBV多聚酶蛋白序列设计，在杭州中肽生化有限公司合成短肽，序列为Phe Asn Val Trp Thr Phe Thr Tyr MetAsp Asp Phe Leu Leu Cys His Pro Asn Ala Arg。短肽的纯度＞85％，溶解度＞0.5mg/ml。
(二)噬菌体肽库筛选1.第一天1.1.以0.1M NaHCO3(PH8.6)制备的靶分子溶液乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区短肽配成150μg/ml的溶液，先以DMSO助溶，再加0.1M NaHCO3(PH8.6)溶解。
1.2.包被在每孔内加入150μl靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润。在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。
2.第二天2.1.将ER2537接种至10ml LB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中(比例为l∶100)。37℃剧烈振摇4.5~5hrs(至A600值约0.5)。
2.2.将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1hr。
2.3.去除包被液。用TBST(TBS+0.1％Tween-20)快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。每次更换纸巾，以避免交叉污染。
2.4.用100μl TBST稀释2×1010噬菌体(10μl原库)，加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。
2.5.以步骤2.3的方法去除未结合的噬菌体。
2.6.以步骤2.4的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。
2.7.用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体(0.1-1mM)的TBS，或是含有靶蛋白(100μg/ml)的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10-60min。将洗脱液转入微量离心管中。
2.8.使用通用缓冲液(酸洗脱液)100μl
。轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μl 1M Tris-HCl(PH9.1)中和。
2.9.取小量洗脱液(1μl)测定滴度。可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序(见后续操作)。(未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1∶100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5hrs，进入步骤2.11)。
2.10.将剩余的洗脱物进行扩增将洗脱物加入20ml ER2537培养物中(对数早期)，37℃剧烈振摇孵育4.5hrs。
2.11.将培养物转入50ml离心管中，4℃，10000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。
2.12.将80％的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌体至少60min或过夜。
3.第三天3.1.4℃，10000转离心PEG的沉淀物15min，倾去上清，再次离心，吸去多余的上清。
3.2.用1ml TBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4℃离心5min使残留的细胞沉淀。
3.3.将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15-60min。4℃离心10min，弃上清，再次短暂离心，用微量枪头吸去残留的上清。
3.4.用200μl TBS，0.02％NaN3悬浮沉淀物，离心1min，将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。
3.5.测定洗脱物在扩增后的浓度，贮存于4℃。
3.6.包被平皿进行第二轮筛选，同步骤1-3。
4.第四天和第五天4.1.计数蓝色噬斑，确定噬菌体的滴度，计算对应于1×1011-2×1011pfu的噬菌体体积。如果滴度太低，在筛选时可采用对应于109pfu的噬菌体体积。
4.2.进行第二轮筛选重复步骤2.2-3.4，用含1×1011-2×1011pfu噬菌体的第一轮扩增洗脱液进行筛选，将洗涤液中的Tween 20浓度增至0.5％。
4.3.测定第二轮筛选扩增洗脱液的滴度。
4.4.包被平皿进行第三轮筛选，步骤1.1-2.1。
5.第六天5.1.进行第三轮筛选用第二轮扩增洗脱液中1×1011-2×1011pfu噬菌体进行筛选，洗涤时，Tween 20的浓度仍为0.5％。
5.2.测定未扩增的第三轮洗脱液的滴度。如果不进行第四轮筛选则不必扩增第三轮的筛选洗脱物。滴度测定时的蓝色噬斑可用于测序平板的孵育时间不长于18hrs。将剩余得洗脱物保存于4℃。
5.3.选取单克隆ER2537过夜培养。
(三)噬菌体滴度的测定1.在5-10ml LB培养基中接种单个ER2537克隆，振摇孵育直至对数生长中期(OD600＝0.5)。
2.在细胞生长时，微波融化顶层琼脂糖凝胶，分装至无菌培养管内，每管3ml。维持在45℃备用。
3.37℃预热LB/IPTG/Xgal培养板，备用。
4.以LB培养基10倍比稀释噬菌体。
5.稀释范围对扩增的噬菌体培养上清，108-1011；对未扩增的筛选洗脱液，101-104。每次稀释都换用新的加样枪头。
6.一旦ER2537培养物长至对数生长中期，分装至微量离心管中，每管200μl。
7.将倍比稀释的噬菌体上清加入含细菌培养物的微量离心管中，一支微量离心管中仅加入一种稀释液10μl，快速涡旋，室温孵育1-5min。
8.转移至含有45℃顶层琼脂糖凝胶的管中，快速涡旋混匀，立即倾倒至预热的LB/IPTG/Xgal平板上，轻缓摇动平板使顶层胶均匀分布。
9.冷却平板5min，37℃倒置培养过夜。
10.噬斑计数以噬斑数为100左右的平皿为准，噬斑数乘以稀释度即可获得每10μl噬菌体的滴度-噬斑形成单位(pfu)。
(四)噬斑的扩增1.以LB培养基稀释ER2537过夜培养物。1ml分装至培养管，每管中接种一个克隆。
2.使用消毒牙签或枪头，穿刺噬斑，接种至上述培养管中。
3.37℃振摇孵育4.5-5hrs(不能过长)。
4.测定单个克隆的序列。取10μl未扩增的洗脱物加至1ml宿主菌稀释液中37℃振摇孵育4.5-5hrs。
5.将培养物转至微量离心管，离心30sec，取上清转入新的离心管中再次离心，取上部约80％的上清转至新的离心管。这是扩增的噬菌体贮存液，能4℃保存。
(五)测序模板的快速纯化1.扩增噬斑，在第一次离心后，将500μl含有噬菌体的上清转入新的离心管中。
2.加入200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温静置10min。
3.离心10min，倾去上清。
4.再次短暂离心，仔细吸去残留上清。
5.用100μl碘化物缓冲液完全重悬沉淀物，加入250μl乙醇。室温孵育10min，室温短暂孵育将选择性沉淀单链噬菌体DNA，而大部分噬菌体蛋白保留在溶液中。
6.离心10min，倾去上清，用70％乙醇洗涤沉淀物，真空吸干。
7.用30μl TE缓冲液重悬沉淀物。
8.取5μl作为测序模板，送出测序。
(六)测序结果共挑取20个克隆进行测序。根据提供的载体信息，对测序结果进行分析，得到多肽序列。经过软件分析后，选择其中的多肽His Phe Ser Leu Ser Pro Arg(DHBV YMDD功能区抑制肽)进行进一步进行抑制病毒复制的研究。另外的序列未作进一步研究。
实施例二 抑制肽对鸭乙型肝炎病毒抑制作用的实验(一)分离原代培养细胞1、雏鸭4只(品种绍兴麻鸭)取血各1ml备检，70％酒精浸泡3min。
2、无菌操作取肝脏于平皿中，无菌生理盐水漂洗，放到另一干净平皿中，再用无菌生理盐水漂洗，然后吸去生理盐水。
3、剪碎肝脏，加10ml无血清DMED(100ml加5ml双抗)，加20mg/ml的IV型胶原酶2ml(终浓度为4mg/ml)。加5％胰酶200Ul(终浓度为0.1％)。37C，10min。摇动，补加胰酶200ul。37℃，10min。过筛网(100目)，收集细胞，离心1600g，12min。洗涤3遍。前两遍用无菌生理盐水洗涤去除脂质，到上清透亮，最后一遍用培养基洗，以平衡细胞，1200g，8min。4、2％冰醋酸为计数液计数细胞，细胞铺入60mm每孔的培养板，2×106/平皿。37℃，5％CO2细胞培养箱培养。
(二)DHBV感染原代培养细胞1.无菌取DHBV阳性成年鸭的鸭血，室温过夜，离心3000g 10min，取血清。为保证无菌，再用一次性滤器除菌一次。
2.感染细胞过程原代雏鸭肝细胞培养18h后，细胞先用含1％FBS的DMEM培养基冲洗，然后加入感染液30μl，(30μl鸭血清，5×109virions/ml)，无血清DMEM培养基3.0ml。不感染对照组加10％FBSDMEM 3.0ml。
3.37℃4hrs，移去感染液体，PBS冲洗细胞两遍后，加10％FBS DMEM，并添加Penicillin300mg/L、Streptomycin 100mg/L、Insulin 1mg/L、Glucose 1.5mg/ml、Nystatin 10U/ml10-5M hydrocortisone-hemisuccinate。其中3个平皿设为不感染对照组。每个抑制肽及对照组设三个复孔。
(三)加入DHBV YMDD功能区抑制肽1.DHBV YMDD功能区抑制肽序列为HFSLSPR，由杭州中肽生化有限公司合成。
2.实验组每平皿加30μl抑制肽溶液。拉米夫定对照组每平皿加3μl拉米夫定储存液。所设的不感染对照组和阴性对照组，加入30μl PBS。37℃，5％CO2细胞培养箱培养。
3.每48hrs换液1次。收集细胞上清置-20℃保存待检。培养基换成5％FBS DMEM，并添加Penicillin 300mg/L、Streptomycin 100mg/L、Insulin 1mg/L、Glucose 1.5mg/ml、Nystatin10U/ml、10-5M hydrocortisone-hemisuccinate。换液后实验组每平皿加30μl抑制肽溶液。拉米夫定对照组每平皿加3μl。所设的不感染对照组和阴性对照组，加入30μl PBS。
3.第10天收集细胞上清后，细胞用PBS洗涤2次，用0.25％胰蛋白酶消化，4℃1500g离心5min。PBS洗涤2次。稀释后计数每个平皿的细胞总数。
(四)荧光定量PCR检测DHBV DNA
1.模板处理取细胞培养上清50μl，加50μl病毒提取A液，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀加病毒提取B液25μl，i00℃煮沸5min，4℃12000r/min离心10min，取上清置-20℃备用。
2.PCR反应抽提好的DHBV DNA模板4.0μl，依次加入36.0μl SYBR GREEN I荧光染料、Taq酶、dNTP、Buffer混和物，混匀，在荧光定量PCR仪上扩增。PCR反应程序为95℃预变性5min后按下列程序进行40个循环94℃变性15Sec，56℃退火30Sec，72℃延伸45Sec。采用Single检测，在每一循环后检测DNA量，未次循环后由计算机计算出DNA含量。
(五)抑制率分析组别细胞上清 细胞核细胞浆实验组 2.74E4±3.28E4 6.24E4±1.26E42.38E4±2.60E4阳性对照2.43E4±3.16E4 6.54E4±1.73E47.73E3±1.53E3阴性对照9.39E5±1.23E6 7.73E4±1.41E42.14E5±1.37E5计算公式抑制率＝(阴性对照测定值-样品测定值)/阴性对照测定值抑制肽直接作用组对细胞DHBV DNA抑制率拉米呋定97.4％抑制肽(实验组)95.4％抑制肽直接作用组对胞浆DHBV DNA抑制率拉米呋定96.4％抑制肽(实验组)89.1％上述实验证明了本发明所筛选的对鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD的抑制肽对DHBV的DNA有明显的抑制作用。由于其来源于对YMDD功能区靶位特异性结合的噬菌体展示技术，作用机理为抑制DHBV复制，为抗DHBV药物的制备提供了一种新的有效的药源。相对现有的作用于阻断DHBV DNA合成的核苷酸类药物，本发明的抑制肽从根本上抑制HBV的复制，与现有的拉米呋啶类药物有互补作用。本发明对人HBV药物的研制提供了一种新的途径，具有较好的应用前景。
权利要求
1.鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用，其特征在于所述抑制肽的氨基酸序列为SEQ NO 1His Phe Ser Leu Ser Pro Arg。
2.按权利要求1所述鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用，其特征在于所述抑制肽的筛选方法为用鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的短肽作为靶位，利用噬菌体表面展示技术筛选与所述靶位特异性结合的肽，即为抑制肽。
3.按权利要求2所述鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用，其特征在于所述YMDD功能区短肽的氨基酸序列为SEQ NO 2Phe Asn Val Trp Thr Phe Thr TyrMet Asp Asp Phe Leu Leu Cys His Pro Asn Ala Arg。
4.按权利要求1所述鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用，其特征在于所述抑制肽应用于抗HBV药物的制备。
全文摘要
鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用属于生物技术的分子生物学和生物化学领域。用鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的短肽作为靶位，利用噬菌体表面展示技术筛选与所述靶位特异性结合的抑制肽，本发明筛选的抑制肽其氨基酸序列为His Phe Ser Leu Ser Pro Arg。实验证明了本发明所筛选的鸭乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD的抑制肽对DHBV的DNA有明显的抑制作用。相对现有的作用于阻断DHBV DNA合成的核苷酸类药物，本发明的抑制肽从根本上抑制DHBV的复制，与现有的拉米呋啶类药物有互补作用，适用于抗HBV药物的研制以及HBV的分子病毒学研究。本发明对人HBV药物的研制提供了一种新的药源途径，具有较好的应用前景。
文档编号C40B30/04GK1789279SQ20051006193
公开日2006年6月21日 申请日期2005年12月12日 优先权日2005年12月12日
发明者周林福, 贾红宇, 朱海红, 许晓燕, 陈智 申请人:浙江大学