专利名称：：一种可加速有机氯降解的铁还原菌-矿物复合菌剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及有机氯降解
技术领域：
，具体的说，涉及一种可加速有机氯降解的铁还原菌-矿物复合菌剂及其制备方法。
背景技术：
：有机氯是指含有一个或多个氯原子的氯代烃类或芳香化合物，是一类重要的持久性有机污染物(POPs)，其包括DDT(dichloro-diphenyl-trichloroethane，二氯二苯三氯乙烷)、HCH(hexachlorocyolohexane，六氯环已烷)、PCP(pentachlorophenol，五氯苯酚)、PCBs(Polychlorinatedbiphenyls，多氯联苯)等。大多数有机氯具有强疏水性、生物积累性和难降解性，有些还具有内分泌干扰作用，对环境及生物存在很大的危害。因此，有机氯污染及其修复已经成为环境科学的研究热点。土壤有机氯污染是一个全球性的环境问题，我国尤为突出。根据广东省生态环境与土壤研究所的调查，珠江三角洲地区土壤有机氯污染范围广、种类多，600个土壤样品DDT等六种有机氯含量为0.0031.568mg/kg，蔬菜中的含量为0.0311.102mg/kg，DDT检出率达到90%以上，已经引起突出的农产品安全问题与环境健康问题。厌氧条件下的还原脱氯反应是土壤有机氯降解的重要途径。有机氯还原脱氯的本质是氯原子获得电子并从有机物结构上脱除形成氯离子的过程。水稻土、红壤等环境的厌氧过程能够明显促进还原脱氯反应。其中，水溶态、吸附态、络合态的Fe(II)含量较高，在厌氧环境下这些离子可以通过电子传递，作用于有机氯，使其还原脱氯，降低其毒性。大量研究表明，水稻土中有机氯含量明显低于其它土壤。例如，早年蔡道基院士发现，长江三角洲大量施用DDT的棉田改为水田后，明显促进了DDT的降解。珠江三角洲地区的调査也发现水稻土、潮土的六六六、DDT、七氯、艾氏剂、狄氏剂、硫丹、异狄氏剂等有机氯含量均低于旱地土壤。铁在自然环境中通常以难溶性Fe(III)氧化物的形式存在，Fe(III)的还原是由特定微生物介导的酶促反应，具有Fe(III)还原能力的细菌是铁氧化物还原的动力。厌氧环境下，铁还原菌的存在能够有效促进具有还原脱氯活性的Fe(II)的生成，从而加速有机氯的还原降解。经文献与专利检索，在现有技术中还未发现利用铁还原菌与含铁矿物制备复合菌剂，并应用于有机氯污染修复的报道。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种可加速有机氯降解的铁还原菌-矿物复合菌剂。本发明的另一个目的在于提供上述铁还原菌-矿物复合菌剂的制备方法。为了实现上述目的，本发明的可加速有机氯降解的铁还原菌-矿物复合菌剂的制备方法采用液体深层发酵方法，包括如下步骤(1)培养基选用细菌培养基，加入消泡剂，调pH为7.07.2，灭菌备用；(2)摇瓶培养将产气肠杆菌(五繞ra^z"er脏oge廳)或铁还原丛毛单胞菌(aw2flmwzay/ern>edwce/w)接种到装有细菌液体培养基中，进行摇瓶培养，条件为温度3037°C、转速150250转/分钟、三角瓶装液量2040%、培养时间810小时；所述产气肠杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC1969;所述铁还原丛毛单胞菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC1968;(3)种子罐发酵按13%的接种量将产气肠杆菌或丛毛单胞菌的摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养，条件为罐温3037X:、罐压0.020.06MPa、通气量1:1.01.5v/v/min、搅拌速度300400转/分钟、发酵时间912小时；(4)发酵罐发酵按36%的接种量将产气肠杆菌或铁还原丛毛单胞菌的种子液移种到发酵罐，培养条件为罐温3037°C、罐压0.020.06MPa、通气量1:1.0L5v/v/min、搅拌速度300400转/分钟、发酵时间1218小时；(5)含铁矿物-发酵液混合处理发酵结束后，收集所得菌液，按含铁矿物与发酵液的重量比为25:1，将两者混合处理，充分搅拌，混合均匀后分装。所述含铁矿物优选水铁矿、针铁矿、赤铁矿、褐铁矿或红壤胶体。在上述制备方法中，步骤(1)所述细菌培养基优选牛肉膏蛋白胨培养基，其配方为5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/LNaCl。在上述制备方法中，步骤(1)所述消泡剂为泡敌、聚醚消沫剂GPE或豆油，加入消泡剂的重量比为0.05%。(6)产品质量检验合格产品中铁还原菌活菌数25亿个/克，含铁量24%。铁还原菌活菌数检测方法为稀释平板计数法。具体操作过程如下①称取铁还原菌-矿物混合菌剂l.Og，加入盛有99ml并装有玻璃珠的无菌生理盐水锥形瓶中，震荡1020分钟，使复合菌剂中菌体均匀分散，制成10-2稀释度的稀释液；②按10倍稀释法进行稀释取盛有9ml无菌生理盐水试管6支，并依次编号为10—310—8，用无菌移液管吸取1.0ml10—z稀释液到一支盛有9ml无菌生理盐水试管中，用漩涡混合器震荡l分钟，使菌体均匀分散，制成10—3稀释液，用同样的方法制备10—A10-8稀释液;③用无菌移液管分别吸取0.1ml10-6、10—7、10—8三个稀释液于相应编号已制备好的牛肉膏蛋白胨培养基平板上(每个稀释度做三个平行)，用无菌玻璃涂布棒将平板表面的菌液均匀向四周涂布扩散，将平板倒置于3(TC恒温箱中培养；1016小时后每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，根据平板上菌落的数目，计算每克混合菌剂中所含的活菌总数，计算公式如下每克混合菌剂中活菌数=(同一稀释度的3个平板上菌落平均数x稀释倍数)/混合菌剂克数含铁量的检测方法为邻菲罗啉显色法。具体操作过程如下取lg铁还原菌-矿物混合菌剂于20ml6.0MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩尔数)中180转/分钟震荡1.5小时；把菌体等沉淀滤掉，用1%的盐酸羟胺将滤液中的Fe(III)还原成Fe(II)，然后采用邻菲罗林法显色，采用紫外-可见分光光度计在510nm处测定混合菌剂中的铁其中，g/L是指每lL液体培养基中加入目标物的克数；%是指每100份质量的液体发酵培养基中接入接种物的质量分数；v/v/min是指每分钟向1份体积的培养基中通入空气的体积分数。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明以普通细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)为主要营养物，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，使具有铁还原活性的菌株得以生长与增殖，所得发酵液按一定比例与含铁矿物混合制成铁还原菌-矿物复合菌剂。(1)此铁还原菌-矿物复合菌剂具有加速有机氯降解的功效，可为有机氯污染修复提供一条新的处理途径。(2)铁还原菌是从自然环境中分离纯化所得，含铁矿物也是自然环境原有物质，因此本发明来源于自然环境，又应用于自然环境，对环境友好无害，不会对原有环境的生态结构造成破坏。(3)生产方法简单，易于实现大规模生产。图1为本发明的制备流程图。具体实施例方式实施例l产气肠杆菌-水铁矿复合菌剂(1)培养基选用牛肉膏蛋白胨培养基，5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，按0.05%重量比例加入消泡剂泡敌，调pH为7.05，充分溶解，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与12rc下灭菌30分钟，冷却至35。C备用。(2)摇瓶培养从保藏正常的产气肠杆菌(五.CGMCC1969)斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度35。C、转速200转/分钟，三角瓶装液量40%，培养时间9小时。(3)种子罐发酵按2%的接种量将产气肠杆菌摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养。培养条件为罐温35。C、罐压0.04MPa、通气量1:1.0v/v/min、搅拌速度400转/分钟、发酵时间10小时。(4)发酵罐发酵按5%的接种量将产气肠杆菌种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温35。C、罐压0.04MPa、通气量1:1.0v/v/min、搅拌速度400转/分钟、发酵时间12小时。(5)矿物-发酵液混合处理发酵结束后，收集所得菌液。按水铁矿与产气肠杆菌发酵液的重量比为5:1，将两者混合处理，充分搅拌，混合均匀后分装。(6)产品质量检验采用稀释平板计数法检验产品中产气肠杆菌活菌数。具体操作过程如下①称取产气肠杆菌-水铁矿混合菌剂1.0g，加入盛有99ml并装有玻璃珠的无菌生理盐水锥形瓶中，震荡1020分钟，使复合菌剂中菌体均匀分散，制成10—2稀释度的稀释液；②按10倍稀释法进行稀释:取盛有9ml无菌生理盐水试管6支，并依次编号为10—310—8，用无菌移液管吸取l.Oml10—2稀释液到一支盛有9ml无菌生理盐水试管中，用漩涡混合器震荡1分钟，使菌体均匀分散，制成10—3稀释液，用同样的方法制备10—410—s稀释液；③用无菌移液管分别吸取O.lml10—6、10—7、10-8三个稀释液于相应编号已制备好的牛肉膏蛋白胨培养基平板上(每个稀释度做三个平行)，用无菌玻璃涂布棒将平板表面的菌液均匀向四周涂布扩散，将平板倒置于3(TC恒温箱中培养；④16小时后根据平板上菌落的数目，按照如下公式计算每克混合菌剂中所含的活菌总数每克混合菌剂中活菌数=(同一稀释度的三个平板上菌落平均数x稀释倍数)/混合菌剂克数结果显示，产气肠杆菌-水铁矿复合菌剂中活菌数为8.2亿个/克。采用邻菲罗林显色法检验产品的含铁量。具体操作过程如下取lg产气肠杆菌-水铁矿混合菌剂于20ml6.0MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩尔数)中180转/分钟震荡1.5小时；把菌体等沉淀滤掉，用l免的盐酸羟胺将滤液中的Fe(in)还原成Fe(n)，然后采用邻菲罗林法给滤液中的Fe(II)显色，采用紫外-可见分光光度计在510nm处测定混合菌剂中的铁含量。结果显示，产气肠杆菌-水铁矿复合菌剂中铁含量为52.3%。实施例2产气肠杆菌-红壤胶体复合菌剂(1)培养基选用牛肉膏蛋白胨培养基，5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，按0.05免重量比加入消泡剂聚醚消沫剂GPE，调pH为7.17，充分溶解，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121°C下灭菌40分钟，冷却至3(TC备用。(2)摇瓶培养从保藏正常的产气肠杆菌(￡.^ragw"CGMCC1969)斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度37。C、转速220转/分钟，三角瓶装液量40%，培养时间IO小时。(3)种子罐发酵.按3%的接种量将产气肠杆菌的摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养。培养条件为罐温37。C、罐压0.03MPa、通气量1:1.5v/v/min、搅拌速度300转/分钟、发酵时间12小时。(4)发酵罐发酵按5%的接种量将产气肠杆菌的种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温37。C、罐压0.03MPa、通气量1:1.5v/v/min、搅拌速度300转/分钟、发酵时间15小时。(5)矿物-发酵液混合处理发酵结束后，收集所得菌液。按红壤胶体与产气肠杆菌发酵液的重量比为4:1，将两者混合处理，充分搅拌，混合均匀后分装。(6)产品质量检验产品中产气肠杆菌活菌数检验方法同实施例l。结果显示，产气肠杆菌-红壤胶体复合菌剂中活菌数为7.8亿个/克。产品的含铁量检验方法同实施例1。结果显示，产气肠杆菌-红壤胶体复合菌剂中铁含量为5.6%。实施例3铁还原丛毛单胞菌-针铁矿复合菌剂(1)培养基选用牛肉膏蛋白胨培养基，5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，按0.05%重量比加入消泡剂豆油，调pH为7.12，充分溶解，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121'C下灭菌30分钟，冷却至37。C备用。(2)摇瓶培养从保藏正常的铁还原丛毛单胞菌(C./m7'm^"似CGMCC1968)斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度3(TC、转速180转/分钟，三角瓶装液量40%，培养时间8小时。(3)种子罐发酵按3%的接种量将铁还原丛毛单胞菌的摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养。培养条件为罐温3(TC、罐压0.02MPa、通气量l:1.0v/v/min、搅拌速度300转/分钟、发酵时间9小时。(4)发酵罐发酵按5%的接种量将铁还原丛毛单胞菌种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温3(TC、罐压0.02MPa、通气量1:1.0v/v/min、搅拌速度300转/分钟、发酵时间12小时。(5)矿物-发酵液混合处理发酵结束后，收集所得菌液。按针铁矿与产气肠杆菌发酵液的重量比为2:1，将两者混合处理，充分搅拌，混合均匀后分装。(6)产品质量检验产品中铁还原丛毛单胞菌活菌数检验方法同实施例1。结果显示，铁还原丛毛单胞菌-针铁矿复合菌剂中活菌数为97亿个/克。产品的含铁量检验方法同实施例l。结果显示，铁还原丛毛单胞菌-针铁矿复合菌剂中铁含量为31.9%。实施例4铁还原丛毛单胞菌-赤铁矿复合菌剂(1)培养基选用牛肉膏蛋白胨培养基，5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，按0.05%重量比加入消泡剂泡敌，调pH为7.10，充分溶解，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与12rC下灭菌30分钟，冷却至35。C备用。(2)摇瓶培养从保藏正常的铁还原丛毛单胞菌(C./wnV"e^"似CGMCC1968)斜面培养基上挑取一环接种到装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度32。C、转速200转/分钟，三角瓶装液量40%，培养时间9小时。(3)种子罐发酵按3%的接种量将铁还原丛毛单胞菌摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养。培养条件为罐温32°C、罐压0.02MPa、通气量1:1.0v/v/min、搅拌速度400转/分钟、发酵时间10小时。(4)发酵罐发酵按5%的接种量将铁还原丛毛单胞菌种子液移种到发酵罐。培养条件为罐温32。C、罐压0.02MPa、通气量1:1.0v/v/min、搅拌速度400转/分钟、发酵时间15小时。(5)矿物-发酵液混合处理发酵结束后，收集所得菌液。按赤铁矿与铁还原丛毛单胞发酵液的重量比为3:1，将两者混合处理，充分搅拌，混合均匀后分装。(6)产品质量检验产品中铁还原丛毛单胞菌活菌数检验方法同实施例1。结果显示，铁还原丛毛单胞菌-赤铁矿复合菌剂中活菌数为109亿个/克。产品的含铁量检验方法同实施例l。结果显示，铁还原丛毛单胞菌-赤铁矿复合菌剂中铁含量为50.8%。实施例5产气肠杆菌-水铁矿复合菌剂加速有机氯降解的效果称取5g按实施例1制备所得的产气肠杆菌-水铁矿复合菌剂，投放到含有10mg/kgDDT(二氯二苯三氯乙垸)的土壤中，充分混合均匀，并置于N2/CO2=80/20的厌氧环境下3(TC恒温培养，030天内测定并记录其DDT含量(单位为mg/kg)，结果见表l:表1.产气肠杆菌-水铁矿复合菌剂对DDT降解的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>说明产气肠杆菌-水铁矿复合菌剂可显著加速有机氯的降解。实施例6铁还原丛毛单胞菌-针铁矿复合菌剂加速有机氯降解效果称取5g按实施例3制备所得的铁还原丛毛单胞菌-针铁矿复合菌剂，投放到含有10mg/kgDDT的土壤中，充分混合均匀，并置于N2/CO2=80/20的厌氧环境下30'C恒温培养，030天内测定并记录其DDT含量(单位为mg/kg)，结果见表2:表2.铁还原丛毛单胞菌-针铁矿复合菌剂对DDT降解效果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>说明铁还原丛毛单胞菌-针铁矿复合菌剂同样具有加速有机氯降解的功效。实施例7产气肠杆菌-红壤胶体复合菌剂加速有机氯降解的效果称取5g按实施例2制备所得的产气肠杆菌-红壤胶体复合菌剂，投放到含有10mg/kgPCP(五氯苯酚)的土壤中，充分混合均匀，并置于N2/CO2=80/20的厌氧环境下3CTC恒温培养，030天内测定并记录PCP的含量(单位为mg/kg)，结果见表3:表3.产气肠杆菌-红壤胶体复合菌剂对PCP降解的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>说明产气肠杆菌-红壤胶体复合菌剂可显著加速有机氯的降解。实施例8铁还原丛毛单胞菌-赤铁矿复合菌剂加速有机氯降解的效果称取5g按实施例4制备所得的铁还原丛毛单胞菌-赤铁矿复合菌剂，投放到含有10mg/kgHCH(六氯环已垸)的土壤中，充分混合均匀，并置于N2/CO2=80/20的厌氧环境下3(TC恒温培养，030天内测定并记录HCH含量(单位为mg/kg)，结果见表4:表4.铁还原丛毛单胞菌-赤铁矿复合菌剂对HCH降解的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>说明铁还原丛毛单胞菌-赤铁矿复合菌剂可显著加速有机氯的降解。权利要求1.一种可加速有机氯降解的铁还原菌-矿物复合菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)培养基选用细菌培养基，加入消泡剂，调pH为7.0～7.2，灭菌备用；(2)摇瓶培养将产气肠杆菌或铁还原丛毛单胞菌接种到装有细菌液体培养基中，进行摇瓶培养；条件为温度30～37℃、转速150～250转/分钟、三角瓶装液量20～40％、培养时间8～10小时；所述产气肠杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC1969；所述铁还原丛毛单胞菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC1968；(3)种子罐发酵按1～3％的接种量将产气肠杆菌或丛毛单胞菌的摇瓶菌液移入种子罐，进行发酵培养，条件为罐温30～37℃、罐压0.02～0.06MPa、通气量1∶1.0～1.5v/v/min、搅拌速度300～400转/分钟、发酵时间9～12小时；(4)发酵罐发酵按3～6％的接种量将产气肠杆菌或铁还原丛毛单胞菌的种子液移种到发酵罐，培养条件为罐温30～37℃、罐压0.02～0.06MPa、通气量1∶1.0～1.5v/v/min、搅拌速度300～400转/分钟、发酵时间12～18小时；(5)发酵液-矿物混合处理发酵结束后，收集发酵所得菌液，按含铁矿物与发酵液的重量比为2～5∶1，将含铁矿物与发酵液混合处理，充分搅拌，混合均匀，分装。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述细菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，配方为5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/LNaCl。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述消泡剂为泡敌、聚醚消沫剂GPE或豆油，加入消泡剂的重量比为0.05%。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(5)所述含铁矿物为水铁矿、针铁矿、赤铁矿、褐铁矿或红壤胶体。5.—种可加速有机氯降解的铁还原菌-矿物复合菌剂，其特征是利用权利要求1所述制备方法制备得到。全文摘要本发明公开了一种可加速有机氯降解的铁还原菌-矿物复合菌剂及其制备方法。本发明以普通细菌培养基为主要营养物，在维持适宜pH、温度与通气量的条件下，使具有铁还原活性的菌株得以生长与增殖，所得发酵液按一定比例与含铁矿物混合制成铁还原菌-矿物复合菌剂。(1)此铁还原菌-矿物复合菌剂具有加速有机氯降解的功效，可为有机氯污染修复提供一条新的处理途径。(2)铁还原菌是从自然环境中分离纯化所得，含铁矿物也是自然环境原有物质，因此本发明来源于自然环境，又应用于自然环境，对环境友好无害，不会对原有环境的生态结构造成破坏。(3)生产方法简单，易于实现大规模生产。文档编号C22B3/18GK101096646SQ20071002839公开日2008年1月2日申请日期2007年6月1日优先权日2007年6月1日发明者周顺桂,李晓敏,李芳柏,王跃强申请人:广东省生态环境与土壤研究所