专利名称：人源化重组噬菌体抗体库方法
技术领域：
本发明属于一种用来合成完全人源化噬菌体抗体的新型实验方法。
背景技术：
抗体技术的发展经历了三个重要阶段第一代为多克隆抗体，其特点是用抗原免疫动物而获得的针对混合抗原的多克隆抗体；第二代是利用杂交瘤技术生产的针对一种抗原决定簇的单克隆抗体。第一、二代抗体技术为免疫学的发展作出了重要贡献，但由于它们是动物源性抗体，对人有较强的免疫原性，易产生人抗鼠抗体反应；此外，杂交瘤技术产生的单克隆抗体产量低，生产成本高，稳定性和亲和力差，抑制了临床应用。于是第三代抗体-基因工程抗体应运而生。基因工程抗体包括嵌合抗体、改型抗体、全套抗体库抗体。嵌合抗体是将鼠免疫球蛋白可变区基因和人免疫球蛋白恒定区基因重组利用杂交瘤技术生产的人鼠杂合抗体，改型抗体是将鼠可变区中的互补决定区基因替代人可变区互补决定区基因而制备的抗体，这两种经改造的抗体与第二代单克隆抗体相比，既保持了原单抗的亲和力，又大大减少了免疫原性，但它们仍含有鼠源性基因，仍有免疫原性，只属于部分人源化抗体。目前还没有可表达完全人源化抗体的实验技术，限制了科研的发展。
发明内容
本发明属于一种合成完全人源化噬菌体抗体的新型实验方法，可用于新型抗体的研究。
本发明所采用的技术原理，就是用PCR技术从人类免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达在其外壳蛋白表面。然后利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆性扩增，使抗体基因通过宿主以分泌的方式表达，获得可溶性抗体片段。
与以往的抗体制备技术相比，本发明所采用的技术省去了传统单克隆抗体抗制备中的细胞融合，可不经免疫直接利用抗原从抗体库中筛选特异性抗体，该技术筛选容量大，筛选能力强，并可直接克隆到抗体基因，使人源化单抗的制备简单易行，稳定有效；此外，噬菌体抗体是片段抗体，完全人源化，并能在原核系统中表达易于生产，必将替代传统的杂交瘤技术，是制备单抗的重要手段。
本发明所采用的技术路线包括以下过程 (1)从人外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； (2)根据免疫球蛋白基因序列，设计一组数对带有简并序列的抗体重链和轻链引物，根据抗体库的需要PCR技术扩增全套或特定的Ig基因片段； (3)构建噬菌体载体，并将克隆的免疫球蛋白基因表达于载体中，构成全套抗体库，丝状噬菌体、噬菌粒是常用的载体； (4)经过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆，然后转化宿主使目标抗体表达； (5)利用免疫实验技术(如酶联免疫反应技术)，对纯化后的抗体进行体内活性鉴定。
具体实施例方式 本发明的检测方法步骤如下 1、外周血单个核细胞的分离和纯化 (1)无菌采集目标人群静脉血20ml注入盛有2ml肝素的无菌小瓶中，加盖晃匀，抗凝。
(2)无菌吸管加入等体积的PBS缓冲液，稀释血液，提高分离效果。
(3)吸取淋巴细胞分层液10ml置于50ml锥底离心管中，然后将离心管倾斜45°角，将稀释后的血液在距分层液界面上1CM处沿试管壁缓慢加至分层液上面，使两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。
(4)将离心管置于水平离心机内，在18～20℃下，以2000r/min离心20min。
(5)用毛细吸管轻轻插入灰白色单个核细胞层(位于血浆与分层液交界处)，沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞，盛入另一离心管。
(6)将得到的单个核细胞悬液用5倍体积的RPMI-1640培养液洗涤2次，分别用2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，可去除大部分血小板。
(7)用完全RPMI-1640培养液定容细胞，计数细胞后调整至所需浓度。
(8)用2％台盼蓝染液检查所分离的细胞活性2滴细胞加1滴台盼蓝染液，3～5min后取样做湿片高倍镜检。活性应在95％上。
(9)氯化铵去除红细胞在沉淀的单个核细胞中加入1ml0.83％氯化铵溶液，轻轻摇晃2min即可裂解红细胞，洗涤后可去除红细胞。
(10)单核细胞的去除将单个核细胞悬液在室温下1300r/min离心10min，弃上清，用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml。将50ml细胞悬液移至150ml斜颈培养瓶中。在5％CO2温箱中，37℃及95％湿度下培养1h。将非粘附细胞吸至离心管中，再用37℃预温的RPMI-1640培养液轻轻荡洗培养瓶，并将洗涤液收集到离心管中，室温下1300r/min离心10min。弃上清，用10ml完全RPMI-1640培养液悬浮细胞，计数细胞，用2％台盼蓝染液检查细胞活性。
2、提取总RNA (1)将纯化的单个核细胞1000r/min离心10min，弃上清，在5×106～1×107细胞中加入TRIzol试剂1ml，用吸头混匀细胞悬液，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，盖好EP管(1.5ml)，用手快速摇动15秒，室温静置2～3min (2)2～8℃16000r/min离心15min，取上层无水相层(RNA溶于此层中)，约占整个细胞匀浆的60％，将其转移至一新的EP管中 (3)加入0.5ml异丙醇，轻摇均匀，室温静置10min后，2～8℃16000r/min离心10min，在管壁下底处可见-乳白色小沉淀，即RNA。
(4)弃上清，用75％乙醇1ml洗RNA沉淀一次，再在2～8℃7500r/min离心5min。除去上层乙醇后，于无菌层流台中风干RNA沉淀。但不能使沉淀过于干燥，以免影响RNA的溶解。
(5)用20μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA沉淀，置-80℃的冰箱备用。
3、ScFv基因的合成及抗体库构建 3、cDNA的合成 (1)取纯化后的RNA约10μg，放入DEPC处理的EP管，加入4μl(0.5μg/μl)oligodT16，分为2管，至于70℃10min，然后置于冰浴1分钟。
(2)制备下列混合液体10×PCR缓冲液8μl、25mM MgCl28μl、10mM Dntp41、100mM DTT8μl (3)取14μl上述混合液分别加入上述EP管，离心混匀，室温放置5min (4)每管加入2μl(200单位)逆转录酶Super script II RT，42℃60min，然后70℃10min终止反应，置冰浴中。加2μlRNAase H于每管中，37℃20min。
(5)反应产物置于冰浴或-20℃保存。
4、VH和VL基因的扩增和纯化 (1)将下列混合物加入到0.5ml EP管中 上游引物(20pmol/μl) 2μl 下游引物(20pmol/μl) 2μl 10×PCR缓冲液5μl 25mM MgCl2 5μl Taq DNA聚合酶0.5μl 20mM dNTP 2.5μl cDNA2μl 加去离子水至50μl (2)每管加入50μl石蜡油，PCR反应程序94℃1min；94℃30s，55℃1min，72℃1min 30循环；72℃5min。
(3)PCR结束后，从每管中取5μl反应产物1.5％的琼脂糖电泳观察结果，VH基因约为400bp，VL基因约为380bp。
(4)PCR反应产物纯化用低熔点琼脂糖电泳纯化或用MicroSpinTM离心纯化柱735g离心纯化。
5、纯化VH和VL基因的定量 (1)取3个1.5ml EP，分别加入5纯化VH、5μl纯化VL和2.5μlVH Marker，加TE缓冲液每管调至6μl。
(2)将6μl混合液用1.5％的琼脂糖电泳观察结果，用凝胶扫描系统对电泳出现的3条380bp左右条带进行分析。
(3)已知2.5μlVH Marker约为12.5ng，根据扫描结果3条带亮度的比值计算出VH和VL的浓度。
6、linker的扩增和纯化 (1)将下列混合物加入到0.5ml EP管中 pHEN2质粒模板 1μl(约1ng) 上游引物(50pmol/μl)1μl 下游引物(50pmol/μl)1μl 10×PCR缓冲液 5μl 25mM MgCl2 5μl Taq DNA聚合酶酶 0.5μl 20mM dNTP 2.5μl 加去离子水至50μl (2)每管加入50μl石蜡油，PCR反应程序94℃3min；94℃30s，40℃1min，72℃1min 30循环；72℃5min。
(3)PCR结束后，从每管中取5μl反应产物1.5％的琼脂糖电泳观察结果，linker基因片断约为100bp。
(4)PCR反应产物纯化用低熔点琼脂糖电泳纯化。定量方法同VH和VL基因的定量(同步骤5)。
7、ScFv的连接连接成功的关键在于VH、VL、linker的量要保持适当的比例，三者的摩尔数之比应为1∶1∶1，质量比应为4∶4∶1。
(1)将下列混合物加入到0.5ml EP管中 纯化的VH1μg 纯化的VL1μg 纯化的linker0.25ng 10×PCR缓冲液 5μl 25mM MgCl2 5μl Taq DNA聚合酶 0.5μl 20mM dNTP 2.5μl 加去离子水至50μl 上述反应体系不加引物，linker与VH的3’端、VL5’端分别存在互补序列，通过PCR三者可自动连接成ScFv。
(2)每管加入50μl石蜡油，PCR反应程序94℃5min；94℃1min，60℃4min，72℃2min 25循环；72℃10min。
(3)PCR反应结束后，每管再加入下列混合反应液 上游Sfi I酶切位点引物(50pmol/μl)1μl 下游Not I酶切位点引物(50pmol/μl)1μl 10×PCR缓冲液5μl 25mM MgCl2 5μl Taq DNA聚合酶1μl(5U) 20mM dNTP2.5μl 加去离子水至50μl (4)混合后再次PCR，反应程序94℃1min，55℃2mi，72℃2min 30循环；72℃10min。
(5)PCR结束后，从每管中取5μl反应产物1.5％的琼脂糖电泳观察结果，连接成功的ScFv约为780bp。
(6)用低熔点琼脂糖电泳纯化或装有S-400HR树脂的MicroSpinTM纯化柱纯化反应产物。
(7)ScFv定量方法同VH和VL基因的定量。
8、ScFv的酶切 (1)Sfi I酶切 纯化的ScFv产物40μl(400ng) 10×酶切缓冲液8.5μl Sfi I酶(10U/μl) 5μl 加去离子水至85μl 加入石蜡油85μl，于50℃反应完毕后，置于室温，瞬时离心，将管壁上的液体甩下，然后进行Not I酶切。
(2)Not I酶切在上述酶切反应体系中加入 3M NaCl 3.6μl 10×酶切缓冲液1.5μl Not I酶(10U/μl) 6μl 加去离子水至15μl 37℃进行4小时酶切反应。
(3)将酶切产物转移至另一EP管中，用低熔点琼脂糖电泳纯化或加入100μl酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，剧烈振荡1分钟，14000g离心2～3分钟，将上清液用装有S-400HR树脂的MicroSpinTM纯化柱纯化。
(4)纯化后酶切产物定量方法同VH和VL基因的定量(见2.3)。
9、TG1细胞感受态的制备 (1)从微量培养基平皿中挑选单个菌落，接种于5ml 2×YT培养基(17g蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl，加水至1000ml)中。37℃振荡过夜。
(2)取上述过夜菌1∶100稀释接种于500ml新鲜的培养基中，37℃振荡培养至OD值＝0.5。
(3)将上述带有菌液的三角瓶置冰浴20分钟。
(4)4000r/m 4℃离心20分钟，弃上清，用500ml预冷无菌的1mol/l Hepes(PH7.0)溶液重悬细胞。
(5)重复2.7.4步骤。
(6)4℃离心20分钟，用10ml含10％甘油的1mol/l Hepes(PH7.0)溶液重悬细胞。
(7)4000r/m 4℃离心20分钟，最后用1ml 10％甘油重悬细胞沉淀。100μl每管分装细菌，置于冰浴待用，或立即冻于干冰中，存放于-70℃。
10、ScFv-pCANTAB-5E载体的构建和鉴定 (1)将上述纯化ScFv和pCANTAB-5E载体进行连接反应，反应体系 纯化ScFv 20μl(150ng) 10×连接缓冲液5μl pCANTAB-5E载体5μl(250ng) T4连接酶 1μl(5U) 加去离子水至50μl 同时设一对照管，仅有载体ScFv，无ScFv。在16℃连接1小时，置于70℃灭活连接酶，乙醇沉淀，用20μl离子水溶解沉淀。
(2)将2.7.7步骤中制备好的感受态TG1200μl分别加入上述连接反应产物中，置于冰浴。取0.2CM的电转化杯一支，将上述混合物沿管壁轻轻加入，避免气泡产生，置电转化杯于电转化仪中，设置电转化时的电压为2.5Kv，电击1秒种。加10ml2×YT-G(含2％的葡萄糖)，37℃培养1小时。
(3)分别将100μl ScFv-pCANTAB-5E载体和载体本身(阴性对照)的100μl转化菌涂到含2×YTAG(含2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)培养基的平皿中，30℃培养过夜。通过计算菌落而测量库容量，剩余的细菌可以直接进行下一步辅助噬菌体拯救试验，或加入15％的甘油，分小包装保存于-70℃。
(4)在2.8.3步骤中的2×YTAG培养皿中随机挑选随机15个分隔良好的菌落，加入2ml 2×YTAG，37℃振荡过夜培养。
(5)将菌液倒入1.5ml的EP管，10000r/m离心5分钟，弃去上清液，加250μl重悬液，剧烈振荡，重悬菌体。
(6)加250μl裂解液，上下悬倒4次，放置5分钟后加10μl碱性磷酸酶，室温放置5分钟。加350μl中和液，颠倒混匀4次，室温12000r/m10分钟。
(7)小心吸取上清液加入结合柱中，12000r/ml分钟弃去废液。70％乙醇洗一次，TE溶解，-20℃保存。
(8)提取质粒的Sfi I/Not I酶切鉴定。
Sfi I酶切 提取的质粒 10μl(约400ng) 10×酶切缓冲液 8.5μl Sfi I酶(10U/μl)5μl 加去离子水至85μl 加入石蜡油85μl，于50℃反应完毕后，置于室温，瞬时离心，将管壁上的液体甩下，然后进行Not I酶切。
Not I酶切在上述酶切反应体系中加入 3MNaCl3.6μl 10×酶切缓冲液1.5μl Not I酶(10U/μl) 6μl 加去离子水至15μl 37℃进行4小时酶切反应。反应产物用1.5％的琼脂糖电泳观察结果，应出现两条带，其中一条带为780bp大小。
11、噬菌体抗体库的构建 (1)将100μl 2×YT-G培养液稀释后的电转化菌加入202×YTAG培养液，30℃过夜培养，至OD600值＝0.5。
(2)加入2×1010辅助噬菌体M13K07，37℃1小时。4000r/m离心10分钟，重悬沉淀于200ml 2×YTAK(100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素，不含葡萄糖)，置于500ml三角瓶中，30℃振荡过夜培养。
(3)加入1/5体积噬菌体沉淀液(20％PEG8000，2.5M NaCl)，4℃30分钟，9000r/m离心20分钟，用2mlPBS重悬沉淀，建立噬菌体抗体库，4℃保存。
(4)4取1μl上清液1∶10，1∶100，1∶1000连续稀释后感染A600＝1的感受态TG1，室温放置15min后铺2×YTAG平板，30℃过夜培养，计数菌落数以计算抗体库滴度(菌落数/ml×稀释倍数)。
(5)所得噬菌体抗体可根据抗原的不同使用常用的酶联免疫反应(ELISA)技术进行率先、纯化、检测。
引物核苷酸序列表
权利要求
1、人源化重组噬菌体抗体库方法，其特征在于它采用如下步骤
(1)从人外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；
(2)根据人类免疫球蛋白基因序列，设计一组数对带有简并序列的抗体重链和轻链引物，根据抗体库的需要PCR技术扩增全套或特定的Ig基因片段；
(3)构建噬菌体载体，并将克隆的Ig基因表达于载体中，构成全套抗体库，丝状噬菌体、噬菌粒是常用的载体；
(4)经过多轮的抗原亲合吸附一洗脱一扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆，然后转化宿主使目标抗体表达；
(5)利用免疫实验技术(如酶联免疫反应技术)，对纯化后的抗体进行体内活性鉴定。
2、根据权利要求1所述人源化重组噬菌体抗体库方法，其特征在于该方法采用的引物具有下列碱基序列
VH15’-CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT-3’
VH25’-CAG GTC ACC TTG AAG GAG TCT-3’
VH35’-GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT-3’
VH45’-CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG-3’
VH55’-GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT-3’
VH65’-CAG GTA CAG CTG CAG CAG TC-3’
VH75’-CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT-3’
CH 5’-GAC CGA TGG GCC CTT GGT GG-3’
VL15’-GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CC-3’
VL25’-GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC-3’
VL35’-GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CC-3’
VL45’-GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CC-3’
VL55’-GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC-3’
VL65’-GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC-3’
CL 5’-GAA GAC AGA TGG TGC AGC CAC AGT-3’
Sfi I-VH15’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT-3’
Sfi I-VH25’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCT-3’
Sfi I-VH35’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCT-3’
Sfi I-VH45’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG-3’
Sfi I-VH55’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCT-3’
Sfi I-VH65’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTC-3’
Sfi I-VH75’-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCT-3’
Not I-CL 5’-CAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGT-3’
linker CH5’-TCCACCAAGGGCCCATCGCTCACCTCGAGTGGTGG-3’
linkerVL15’-GGAGACTGGGTCATCTGGATGTCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL25’-GGAGACTGAGTCATCACAACATCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL35’-GGAGACTGCGTCAACACAATTTCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL45’-GGAGACTGGGTCATCACGATGTCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL55’-GGAGACTGCGTGAGTGTCGTTTCCTGTGCACTACCGCC-3’
linkerVL65’-GGAGACTGAGTCAGCACAATTTCCTGTGCACTACCGCC-3’
全文摘要
本发明属于一种合成完全人源化抗体的人源化噬菌体抗体库方法。本发明所采用的技术原理，就是用聚合酶链式反应(PCR)技术从人类免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达在其外壳蛋白表面。然后利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆性扩增，使抗体基因通过宿主以分泌的方式表达，获得可溶性抗体片段。本发明所采用的技术省去了传统单克隆抗体抗制备中的细胞融合，可不经免疫直接利用抗原从抗体库中筛选完全人源化的特异性抗体。
文档编号C40B40/10GK101294308SQ20071011319
公开日2008年10月29日 申请日期2007年10月22日 优先权日2007年10月22日
发明者明 侯, 冀学斌, 军 彭, 张丽萍, 艳 石, 平 秦, 张爱军, 刘新光 申请人:明 侯, 冀学斌, 军 彭