专利名称：用于羟基化化合物的标签试剂和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年5月26日提交的共同未决的美国临时申请60/809133的权益和优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。
绪论 快速筛选和/或分析大量生物样品的能力对于许多领域来说具有重大意义。质谱是一种可提供快速样品分析的技术。然而，由于质量干扰和样品浓度低，通过质谱检测许多具有生理学重要性的分子可能存在问题。此外，一些种类的化合物不适用于通常制备用于质谱分析的样品的传统化学和/或条件。
一类具有生理学重要性的化合物是类固醇。用于样品中类固醇定量的传统方法包括免疫测定、带有紫外(UV)荧光的高效液相色谱(HPLC)以及液相色谱/质谱联用(LC/MS)和/或串联质谱(MS/MS)。
通过上述方法进行类固醇的绝对定量可能是有问题的。用于现代临床实验室中的免疫测定缺乏灵敏度并且受到交叉反应物质的干扰。利用LC或HPLC之后通过UV、MS或MS/MS检测的传统方法也缺乏灵敏度。例如，为了通过HPLC分析许多类固醇，在进行分析之前必须进行困难且耗时的衍生化步骤。此外，HPLC具有分析时间长、运行偏差大、缺乏多重能力和非特异性的缺点。
更近些时候，使用LC/MS和MS/MS用于化合物的检测和定量提供了速度提高及特异性提高以及能够快速测量一种样品中的多种化合物的能力；然而，这些技术也缺乏多重能力并且可能缺乏灵敏度。为了进行绝对定量，将昂贵的同位素富集的化合物用作内标物，这与一些串联质谱法不相容。另外，这些同位素富集的内标物并不提高分析物化合物检测的灵敏度。
概论 本教导提供了用于分析含有一种或多种羟基化化合物的样品的试剂和方法。在多个实施方案中，所提供的这些试剂和方法可用于测定一种或多种样品中的一种或多种类固醇的相对浓度、绝对浓度或相对浓度和绝对浓度二者。通过对试剂的同位素取代的适当选择，本教导可用于同量异位的标记试剂和方法、以及质量差异性标记试剂和方法。本文所用的术语“标记物”和“标签”可互换使用。用于合成同位素富集的化合物之方法的实例可见于美国专利申请公开2005/0148774中，其全部内容在此通过引用并入本文。
可应用本教导多个实施方案的羟基化化合物可来自多种来源，例如生理性流体样品、细胞或组织裂解物样品、蛋白质样品、细胞培养物样品、发酵肉汤培养基样品、农产品样品、动物产品样品、动物饲料样品、供人消费的食品或饮料样品、以及以上的组合。在多个实施方案中，本教导可用于天然以及合成的类固醇。多种类固醇(包括但不限于皮质醇、11-去氧皮质醇(化合物S)、皮质酮、DHT、睾酮、表睾酮、去氧甲基睾酮(DMT)、四氢孕三烯酮(THG)、雌二醇、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮基雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、DHEA(去氢表雄酮)、17OH孕烯醇酮、17OH孕酮、17OH孕酮、雄酮、表雄酮、D4A(Δ4雄烯二酮)、豆甾醇和胆固醇)可在本教导的多个实施方案中进行分析。
在多个方面，本教导提供了利用质量差异性标签来分析含有一种或多种羟基化化合物的样品的试剂和方法。在多个实施方案中，提供了质量差异性标记物组，其中所述组的一种或多种标记物含有一种或多种重原子同位素。通过制备具有不同总质量和不同初始报告物离子质量的标记物可提供质量差异性标记物组。应当理解，并非质量差异性标签组中的每一个成员都按照本教导进行了重原子同位素富集。在多个实施方案中，本教导提供了利用质量差异性标记物和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)来分析一种或多种样品中的一种或多种羟基化化合物的试剂和方法。在多个实施方案中，可利用质量差异性标签试剂和质谱法将本教导用于羟基化化合物的定性和定量分析。所述质量差异性标签包括但不限于非同量异位的同位素编码的试剂。在多个实施方案中，本教导提供了不利用同位素富集的标准化合物而对羟基化化合物进行绝对定量的试剂和方法。在多个实施方案中，所述羟基化化合物包括含有羟基化环的化合物。在多个实施方案中，所述含有羟基化环的化合物包括含有羟基化多环的化合物。
在多个方面，本教导提供了利用同位素富集的同量异位的标签来分析含有一种或多种羟基化化合物的样品的试剂和方法。在多个实施方案中，提供了同量异位的标记物的组，其中所述组的每个标记物包含一种或多种重原子同位素。可通过制备其中每一种标记物的质量基本上相同但每一种标记物的初始报告物离子具有不同质量差异性的多种标记物来提供同量异位的标记物组。在多个实施方案中，利用质谱法可将同量异位的标签试剂组用于羟基化化合物的定性和定量分析。例如，在多个实施方案中，提供了使用同位素富集的同量异位的标签和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)来测定样品中一种或多种羟基化化合物的存在和/或浓度的方法。在多个实施方案中，所述羟基化化合物包括含有羟基化环的化合物。在多个实施方案中，所述含有羟基化环的化合物包括含有羟基化多环的化合物。
在多个方面，本教导提供了用于羟基化化合物(包括但不限于含有羟基化环的化合物)的相对定量、绝对定量或相对定量和绝对定量二者的标记试剂和标记试剂组，其中所述标记试剂可以由通式(I)表示 Z—R1 (I)， 并且可以以盐或水合物形式提供和/或使用。在通式(I)中(a)Z表示取代或未取代的直链、支链或环状烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的氨基；或者取代或未取代的硫代基(thio)；(b)R1表示取代或未取代的
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
(c)X表示Cl、Br、I或乙酰基；以及(e)R2表示取代或未取代的烷基；取代或未取代的卤代烷基；或者取代或未取代的芳基。
在多个方面，本教导提供了被标记分析物，其中所述分析物含有至少一个羟基以利用本教导的标记物进行标记。在多个实施方案中，所述被标记化合物可以由通式(II)表示
并且可以以其盐或水合物形式提供和/或使用。在通式(II)中(a)Z可以是式I所给出的那些；(b)A表示在形成所述被标记化合物之前含有一个或多个羟基基团的化合物；(c)RY表示在形成所述被标记化合物之前与含有羟基的A的碳原子形成键的氧原子；(d)n表示1至至多在形成被标记化合物之前A中羟基基团数的整数；以及(e)Rx表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
本教导并不限于对羟基化化合物的分析，还可通过在利用本教导中一个实施方案的标签进行标记之前还原羰基基团、通过利用标记反应原位还原或者二者的组合而用于含有非羟基化羰基的化合物。
在多个实施方案中，所述被标记分析物化合物含有四环。在多个实施方案中，所述四环可以由通式(III)表示
其中四环上不与RY成键的一个或多个位置各自独立地被氢、烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基、氰基、烷基芳基或者芳族或杂芳族基团取代。通式(III)中给出的数字仅仅作为位置参考。在多个实施方案中，衍生得到A的羟基化化合物含有在3位、17位或3位和17位二者上羟基化的式(III)的多环结构。
在多个实施方案中，本教导可提供利用质量差异性标记物、同量异位的标记物或二者，以及母离子-子离子跃迁监测(PDITM)来分析一种或多种样品中的一种或多种类固醇的试剂和方法。在多个方面，本教导可提供用于测定一种或多种样品中的一种或多种类固醇的相对浓度、绝对浓度或二者的方法。在多个实施方案中，本教导可提供可以多重方式测定一种样品中多种类固醇、多种样品中的一种或多种类固醇、或其组合的相对浓度、绝对浓度或二者。在多个实施方案中，本教导可利用质量差异性标签试剂、同量异位的标签试剂或二者以及质谱法用于类固醇的定性和/或定量分析。
参照图1，由通式(I)所表示的标记物组的标记物含有连接物基团部分(102)和至少一个报告物基团部分(104)，其可用于例如标记含有羟基的分析物(106)。
在提供同量异位的标记物组的实施方案中，选择连接物基团部分(LG)和报告物基团部分(RP)的重原子取代，以使得每个报告物基团部分的质量不同而每个同量异位的标签的质量基本上相等。在含有同量异位的标记物组的实施方案中，所述连接物基团部分可称为平衡物基团。例如，参照图2，在多个实施方案中，一组4种同量异位的标记物被加入到一种或多种分析物(202)的组中并合并而形成合并样品(204)，将所述合并样品(204)进行MS/MS分析以断裂被标记分析物化合物而产生4种不同质量的报告物离子(206)。可通过适当组合报告物部分(RP)和平衡物基团部分(BG)的重原子取代而使得标记物是同量异位的；例如在图2中，RP和BG的质量使得所述组中每种标记物的质量是约186个原子质量单位。
在提供质量差异性标记物组的实施方案中，选择报告物基团部分(RP)(104)的重原子取代，以使得每个报告物基团部分具有不同的质量。在多个实施方案中，在质量差异性标记物组的标记物上基本上不含有重原子取代。
在本教导的多个实施方案中，选择连接物基团部分，以使得被标记分析物(108)进行断裂时，通过断开至少报告物基团部分(104)的氮原子和平衡物基团(102)之间的键(110)而发生断裂。
在多个实施方案中，每个标记物中的重原子同位素分布可被设计成当在质谱仪(MS)中分析时导致形成不同的报告物离子信号。因此，在多个实施方案中，利用与各标记物相关的报告物离子信号，可将与混合物(例如不同分析物，来自不同样品、标准物等的分析物)中多种被标记成分相关的离子信号解卷积(deconvolution)。解卷积可包括例如测定混合物中一种或多种被标记成分的相对量和/或绝对量(通常以浓度或量表示)。可使用本教导的标记试剂的多种实验分析的实例包括但不限于时间过程研究、生物标志物分析、多重分析、亲和力捕获(affinitypull-down)和多重控制实验。
在多个方面，本教导提供了利用式(I)的标记物和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)来分析一种或多种样品中的一种或多种含有羟基化环的化合物的方法。
术语“母离子-子离子跃迁监测”或“PDITM”是指例如利用质谱法的测量而选择第一质量分离器(通常称为质谱法的第一维)的被传输质荷比(m/z)范围来将分子离子(通常称为“母离子”或“前体离子”)传输到离子断裂器(例如碰撞室、光解离区域等)以产生片段离子(通常称为“子离子”)，选择第二质量分离器(通常称为质谱的第二维)的被传输m/z范围来将一种或多种子离子传输到测量子离子信号的检测器中。所监测的母离子和子离子质量的组合可称为所监测的“母离子-子离子跃迁”。对于所监测的给定母离子-子离子组合，检测器中的子离子信号可称为“母离子-子离子跃迁信号”。
例如，母离子-子离子跃迁监测的一个实施方案是多重反应监测(MRM)(又称为选择性反应监测)。在MRM的多个实施方案中，对给定母离子-子离子跃迁的监测包括使用第一质量分离器(例如停在目标母离子m/z上的第一四极杆)来传输目标的母离子，利用第二质量分离器(例如停在目标子离子m/z上的第二四极杆)来传输一种或多种目标子离子。在多个实施方案中，可通过第一质量分离器(即停在目标母离子m/z上的四极杆)来传输母离子并在m/z范围内(其中包括所述一种或多种目标子离子的m/z值)扫描所述第二质量分离器而进行PDITM。
例如，串联质谱仪(MS/MS)仪器(或者更一般而言，多维质谱仪(MSn)仪器)可用于进行PDITM，例如MRM。合适的质量分析器系统的实例包括但不限于含有三重四极杆、四极杆线性离子阱、四极杆TOF以及TOF-TOF中的一种或多种的系统。
在多个实施方案中，利用本教导的标记物分析一种或多种样品中的一种或多种羟基化化合物包括以下步骤(a)各利用来自式(I)的标记物组中的不同标记物分别标记一种或多种羟基化化合物中的每一个，以提供式(II)的被标记分析物化合物，所述被标记分析物化合物各自具有报告物离子部分；(b)合并每种被标记分析物化合物的至少一部分以产生合并样品；(c)将所述合并样品的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(d)测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号；以及(e)至少基于比较所测的相应报告物离子的离子信号与所测的标准化合物的一种或多种离子信号，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度。因此，在多个实施方案中，可以多重方式(例如通过合并两种或更多种被标记分析物化合物以产生合并样品、将所述合并样品进行PDITM以及监测两种或更多种被标记分析物化合物的报告物离子)来测定一种或多种样品中的多种羟基化化合物的浓度。
在多个实施方案中，所述测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度的步骤包括测定一种或多种被标记分析物化合物的绝对浓度、测定一种或多种被标记分析物化合物的相对浓度或者测定该二者。
在多个实施方案中，使用色谱柱分离两种或更多种被标记分析物化合物。例如，在多个实施方案中，通过色谱柱将在一种或多种样品中发现的第一被标记分析物化合物与在一种或多种样品中发现的第二被标记分析物化合物分离开来。
在多个实施方案中，一种或多种目标样品包含含有一种或多种标准化合物的标准样品，其中在该方法中所测的对应于标准化合物的报告物离子的离子信号与所测的标准样品中的一种或多种被标记标准化合物的报告物离子信号相对应。
在本教导的多个实施方案中，可通过以下步骤生成标准化合物的浓度曲线(a)提供具有第一浓度的非同位素富集的标准化合物；(b)利用来自式(I)或其盐或水合物形式的标记物组的标记物标记所述标准化合物，所述被标记标准化合物具有报告物离子部分；(c)将被标记标准化合物的至少一部分加样到色谱柱上；(d)对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(e)测量所述被传输的报告物离子的离子信号；(f)对一种或多种不同的标准化合物浓度重复步骤(a)至(e)；以及(g)至少基于在两种或更多种标准化合物浓度下所测量的被传输的报告物离子的离子信号生成标准化合物的浓度曲线。
标准化合物可被包含在标准样品中，标准样品可包含一种以上的标准化合物。在本教导的多个实施方案中，可通过以下步骤生成标准化合物的浓度曲线(a)提供包括一种或多种具有第一浓度的非同位素富集的标准化合物的标准样品；(b)将式(I)或其盐或水合物形式的标记物加入到所述标准样品中以标记样品中的一种或多种标准化合物，被标记标准化合物各自具有报告物离子部分；(c)将被标记样品的至少一部分加样到色谱柱上；(d)对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；(e)测量被传输的报告物离子的离子信号；(f)针对含有不同浓度的一种或多种不同标准化合物的一种或多种不同标准样品重复步骤(a)至(e)；以及(g)至少基于在两种或更多种标准化合物浓度下所测量的相应标准化合物的被传输的报告物离子的离子信号生成一种或多种标准化合物的浓度曲线。在多个实施方案中，向标准样品中添加式(I)或其盐或水合物形式的标记物以标记样品中的一种或多种标准化合物的步骤包括两步式反应，其中添加标记物的第一部分(例如含有式(I)中R1部分的一结构部分)之后进行添加标记物的第二部分(例如含有式(I)中Z部分的一结构部分)的第二步骤，以实现标准化合物的标记。
通过下面结合附图的描述，可以更全面地理解本教导的前述和其它方面、实施方案以及特征。在附图中，相同的附图标记一般而言是指所有各个图中的相同特征和结构单元。附图不必按比例绘制，相反重点是在举例说明本教导的原理。
图1是根据本教导的多个实施方案的标记物、标记反应、被标记分析物化合物以及报告物离子之形成的示意图。
图2是利用本教导的同量异位标记试剂分析一种或多种样品中一种或多种羟基化化合物的方法的多个实施方案的示意图。
图3A-3K示意性地描述了多种含有羟基化环的化合物的结构；图3A-3E示意性地描述了类固醇；3F-3H示意性地描述了维生素D3及其多种代谢物和类似物；图3I-3K示意性地描述了可通过本教导的多个实施方案进行分析的多种羟基化化合物。
图4A和4B是分析一种或多种样品中一种或多种羟基化化合物的方法的多个实施方案的示意图。
图5示意性地描述了利用本教导的标记物的多个实施方案标记胆固醇的实例和所得的被标记分析物化合物的实例。
图6A-6C示意性地以图示方式说明了利用具有异氰酸酯R1部分的本教导标签对通式(I)的化合物进行标记的多个实施方案；图6A以图示方式说明了一般反应，图6B是利用哌嗪异氰酸酯进行的两步式标记反应，图6C是三甲基异氰酸酯标记的分析物的生成反应，其中被标记分析物是碘盐。
图7A-7B示意性地以图示方式说明了被标记分析物的多个实施方案，其中羟基化化合物即胆固醇已经利用二乙基胺(图7A)或三甲基铵(图7B)标签进行了标记。
图8A-8E示意性地以图示方式说明了对于通式(I)化合物用具有哌嗪Z部分的本教导标签标记的分析物的多个实施方案；图8A-8C以图示方式说明了标记分析物上的多个羟基。
图9A-9E示意性以图示方式说明了对于通式(I)化合物用具有苯甲酰基或取代的苯基Z部分的本教导标签标记的分析物的多个实施方案；图9A-9C以图示方式说明了通过苯甲酰基异氰酸酯与分析物的直接反应而进行标记。
图10是铵标记试剂和利用该试剂标记的分析物的多个实施方案的图示。
图11是被标记分析物的多个实施方案和多个断裂点实例的图示。
图12A-12B是利用质量差异性标签来标记羟基化化合物的方法的多个实施方案的图示。
图13是哌嗪标记试剂、被标记分析物和报告物离子的多个实施方案的图示。
图14示意性地以图示方式说明了本教导的同量异位标签及其相关报告物离子的多个实施方案。
图15示意性地以图示方式说明了本教导的同量异位标签、其与胆固醇产生被标记胆固醇的反应和进行MS/MS分析的该被标记胆固醇的相关报告物离子的多个实施方案。
图16A-16B示意性地以图示方式说明了本教导的被标记化合物的多个实施方案。
图17和18示意性地以图示方式说明了形成本教导之标记试剂的方法的多个实施方案。
图19和20示意性地以图示方式说明了用于形成实施例1-4的多种被标记分析物的反应。
图21示意性地以图示方式说明了实施例1的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子的大致基数质量(与虚线相连的数)。
图22A-C示意性地描述了实施例1的各种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图23示意性地以图示方式说明了实施例2的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子的大致基数质量(与虚线相连的数)。
图24A-B示意性地描述了实施例2的各种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图25示意性地以图示方式说明了实施例3中实例(维生素D3)的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子的大致基数质量(与虚线相连的数)。
图26示意性地描述了有关实施例3的作为以电子伏特(eV)给出的碰撞能(x轴)函数的多种MRM(母离子-子离子跃迁)的信号强度(y轴)的实验数据。
图27示意性地描述了在45eV的碰撞能时实施例3的实验LC/MS/MS数据。
图28示意性地以图示方式说明了实施例3的实例(25(OH)维生素D3)的被标记分析物的多种理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子大致基数质量(与虚线相连的数)。
图29A-B和图30A-B示意性地描述了实施例3的各种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图31示意性地以图示方式说明了实施例3的实例(1，25(OH)2维生素D3)的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子大致基数质量(与虚线相连的数)。
图32A-D和图33A-D示意性地描述了实施例3的实验数据；图32A和33A描述了作为碰撞能(CE)函数的总离子电流(TIC)；图32B-D和图33B-D描述了多种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图34-38示意性地描述了相对于未标记分析物而言，利用本教导多个实施方案的标记物进行标记的分析物在提高的信号和/或检测限方面的实施例4实验数据。
图39A-39E示意性地描述了实施例5的实验数据。图39A示意性地描述被标记雌二醇样品的色谱。图39B和39C分别示意性地描述了图39A中在约5.0分钟和5.3分钟时洗脱液的电喷雾(ESI)质谱。图39D和39E分别示意性地描述了图39A中在约5.02分钟和5.3分钟时洗脱液的ESI-MS/MS谱。
图40A-40D示意性地描述了实施例6的实验数据。图40A和40B分别示意性地描述了标记和未标记的睾酮的色谱图。图40C和40D分别示意性地描述了未标记和标记的睾酮的ESI-MS/MS谱。
图41A-41D示意性地描述了实施例6的实验数据。图41A和41B分别示意性地描述了标记和未标记的表睾酮的色谱图。图41C和41D分别示意性地描述了未标记和标记的表睾酮的ESI-MS/MS谱。
图42A-42C示意性地描述了实施例7的实验数据。图42A和42B分别示意性地描述了未标记和标记的豆甾醇的色谱图。图42C示意性地描述了标记豆甾醇的ESI-MS/MS谱。
图43A-43I示意性地描述了实施例8的实验数据。图9A示意性地描述了标记的胆固醇的色谱。图43B示意性地描述了标记的胆固醇的ESI-MS/MS谱。图43C和43D示意性地描述了利用来自质量差异性标签组的质量差异性标签进行标记的胆固醇的ESI-MS谱的比较。图43E和43F示意性地描述了利用来自质量差异性标签组的质量差异性标签进行标记的胆固醇的ESI-MS/MS谱的比较。图43G和43H分别显示了ESI-MS和ESI-MS/MS谱的较细微和较广泛的细节，图43I显示了未标记的胆固醇的ESI-MS/MS谱。
图44A-44D示意性地描述了实施例9的实验数据。图44A和44B分别示意性地描述了标记的胆钙化醇(维生素D3)和标记的25-羟基胆钙化醇(维生素D3的代谢物)的ESI-MS谱。图44C和44D分别示意性地描述了标记的胆钙化醇(维生素D3)和标记的25-羟基胆钙化醇的ESI-MS/MS谱。
图45A-45B示意性地描述了实施例10的实验数据。图45A示意性地描述了标记的前列腺素的ESI-MS谱，图45B示意性地描述了标记的前列腺素的ESI-MS/MS谱。
图46示意性地以图示方式说明了形成实施例11的被标记分析物的反应。
图47示意性地以图示方式说明了实施例11的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子大致基数质量(与虚线相连的数)。在实施例11中，可见各片段具有钠离子。
图48A-F示意性地描述了实施例11的实验数据；图48A描述了作为时间函数的总离子电流(TIC)；图48B-F描述了多种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图49示意性地以图示方式说明了形成实施例12的被标记分析物的反应。
图50示意性地以图示方式说明了实施例12的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子的大致基数质量(与虚线相连的数)。在实施例12中，可见各片段具有钠离子。
图51A-F示意性地描述了实施例12的实验数据；图51A描述了作为时间函数的总离子电流(TIC)；图51B-F描述了多种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图52示意性地以图示方式说明了形成实施例13的被标记分析物的反应。
图53示意性地以图示方式说明了实施例13的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子大致基数质量(与虚线相连的数)。
图54A-F示意性地描述了实施例13的实验数据；图54A描述了作为时间函数的总离子电流(TIC)；图54B-F描述了多种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图55示意性地以图示方式说明了形成实施例14的被标记分析物的反应。
图56示意性地以图示方式说明了实施例14的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子大致基数质量(与虚线相连的数)。
图57A-F示意性地描述了实施例14的实验数据；图57A描述了作为时间函数的总离子电流(TIC)；图57B-F描述了多种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图58示意性地以图示方式说明了形成实施例15的被标记分析物的反应。
图59示意性地以图示方式说明了实施例15的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子大致基数质量(与虚线相连的数)。
图60A-F示意性地描述了实施例15的实验数据；图60A描述了作为时间函数的总离子电流(TIC)；图60B-F描述了多种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图61示意性地以图示方式说明了形成实施例16的被标记分析物的反应。
图62示意性地以图示方式说明了实施例16的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子的大致基数质量(与虚线相连的数)。
图63A-F示意性地描述了实施例16的实验数据；图63A描述了作为时间函数的总离子电流(TIC)；图63B-F描述了多种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
图64示意性地以图示方式说明了实施例17的被标记分析物的多个理论断裂点(虚线)和在该点断裂产生的可能报告物离子的大致基数质量(与虚线相连的数)。
图65A-F示意性地描述了实施例17的实验数据；图65A描述了作为时间函数的总离子电流(TIC)；图65B-F描述了多种碰撞能(CE)的实验LC/MS/MS数据。
各个实施方案的描述 在进一步描述本教导之前，给出本文所用的某些术语的定义可能有助于提供对其的理解。
本文所用的冠词以其不确定的含义使用，意指“一种(个)或多种(个)”或“至少一种(个)”。也就是说，不定冠词对本教导任何要素的修饰并不排除存在一种以上要素的可能性。
术语“标记物”、“标签”和“标记试剂”在本文中可互换使用。
短语“质量差异性标记物”、“质量差异性标签”和“质量差异性标记试剂”在本文可互换使用。短语“质量差异性标记物组”、“质量差异性标签组”可互换使用并且指例如试剂或化学结构部分的组，其中所述组的成员(即单个的“质量差异性标记物”或“质量差异性标签”)具有基本上相似的结构和化学性质，但由于所述组的成员之间重同位素富集的不同使得质量不同。当进行离子断裂时，质量差异性标签组中的每个成员可产生不同的子离子信号。离子断裂可以例如通过与惰性气体碰撞(例如碰撞诱导解离(CID)、碰撞活化解离(CAD)等)、通过与光子相互作用导致解离(例如光诱导解离(PID))、通过与表面的碰撞(例如表面诱导的解离(SID))、通过与电子束相互作用导致解离(例如电子诱导解离(EID)、电子捕获解离(ECD))、热/黑体红外辐射解离(BIRD)、源后衰变或其组合来实现。可用于区分所述组中成员的质量差异性标签或标记物的子离子可称为所述质量差异性标签或标记物的报告物离子。在多个实施方案中，质量差异性标签组包含由于所述组的成员之间重同位素富集不同而仅在质量上不同的式(I)化合物或其盐或水合物形式。
短语“同量异位的标记物”、“同量异位的标签”和“同量异位的标记试剂”可互换使用。短语“同量异位的标记物组”、“同量异位的标签组”和“同量异位的标记试剂组”可互换使用，并且指例如其中所述组的成员(单个的“同量异位的标记物”、“同量异位的标签”或“同量异位的标记试剂”)具有基本上相同的质量但当进行离子断裂(例如通过碰撞诱导解离(CID)、光诱导解离(PID)等)时所述组的每个成员可产生不同的子离子信号的试剂或化学部分。在多个实施方案中，同量异位标签组包含式(I)化合物或其盐或水合物形式。可用于区分所述组中成员的同量异位标签的子离子可称为所述同量异位标签的报告物离子。在多个实施方案中，同量异位的标签组用于标记含有羟基化环的化合物并且在不存在断裂情况下产生基本上色谱不可区分的和基本上质谱不可区分的，而在CID之后产生信号离子的被标记化合物。
应当理解，原子或分子的质量可近似到最接近的整数原子质量单位或最接近的原子质量单位的十分之一或百分之一。本文所用的“质量”指绝对质量以及一定范围内的近似质量，其中使用的不同原子类型的同位素在质量上如此接近，以至于它们在功能上是等价的，例如对于平衡报告物(reporter)质量和平衡同量异位的标记物的反应部分的目的而言是等价的(从而同量异位标记物组或试剂盒中同量异位标记物的总质量基本上相同)，而不论所用的不同同位素类型在质量上的差异是否可被检测到。
例如，地球上两种最常见的氧同位素的大致质量是16(实际质量15.9949)和18(实际质量17.9992)，两种地球上最常见的碳同位素的大致质量是12(实际质量12.00000)和13(实际质量13.00336)，两种地球上最常见的氮同位素的大致质量是14(实际质量14.0031)和15(实际质量15.0001)。虽然这些值是近似的，但本领域技术人员将会理解，使用18O原子代替16O原子与使用两个碳13C原子代替两个12C原子、两个15N原子代替两个14N原子和/或一个13C原子和一个15N原子代替12C和14N在功能质量上是等同的。
本文所用的“同位素富集”意指已经通过合成富集了一种或多种重原子同位素(例如稳定的同位素比如氘、13C、15N、18O、37Cl或81Br)的化合物(例如标记试剂)。由于同位素富集并非100％有效，所以可存在这些化合物的富集程度较低些的杂质，它们的质量较小。同样，由于过量富集(不期望的富集)和天然同位素丰度的变化，可存在质量较高些的杂质。
本文所用的“天然同位素丰度”指基于自然界中一种或多种同位素在地球上天然占据的优势而在化合物中发现的一种或多种同位素的水平(或分布)。例如，从活的植物材料中得到的天然化合物通常含有约0.6％的13C。
术语“取代的”旨在描述分子的一个或多个原子(例如碳、氮、氧等)上具有替代氢的取代基的基团。取代基可包括例如烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷氧基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和酰脲)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳基硫基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香基团或杂芳香基团。因此，短语“本文所述的取代基”等指上述取代基中的一个或多个及其组合。
术语“烷基”包括饱和的脂肪族基团，其包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”二者，“取代的烷基”指具有替代烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基基团。术语“烷基”包括直链烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷基(脂肪族)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)以及环烷基取代的烷基。术语“烷基”还包括天然和非天然氨基酸的侧链。
“烷基芳基”或“芳烷基”是被芳基取代的烷基(例如苯甲基(苄基))。
术语“芳基”包括五元和六元单环芳香基团，以及多环芳基基团，例如三环、二环，例如萘、蒽、菲等)。芳香环可在一个或多个环位置上被如上述这些取代基取代。芳基还可与例如不是芳香族的脂肪族环或杂环稠合或桥接以形成例如多环。
术语“烯基”包括在长度以及可能的取代方面与上述烷基类似的不饱和脂肪族基团，但是其含有至少一个双键。例如，术语“烯基”包括直链烯基(例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、支链烯基、环烯基(脂肪族)基团(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基)、烷基或烯基取代的环烯基、以及环烷基或环烯基取代的烯基。术语烯基包括“未取代的烯基”和“取代的烯基”二者，其中“取代的烯基”指具有替代烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烯基。
术语“炔基”包括在长度类似以及可能的取代方面与上述烷基类似的不饱和脂肪族基团，但是其含有至少一个叁键。例如，术语“炔基”包括直链炔基(例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)、支链炔基、以及环烷基或环烯基取代的炔基。术语炔基包括“未取代的炔基”和“取代的炔基”二者，其中“取代的炔基”指具有替代烃主链上的一个或多个碳原子上的氢的取代基的炔基。
术语“酰基”包括含有酰基(CH3CO-)或羰基的化合物和基团。术语“取代的酰基”包括具有替代一个或多个氢原子的取代基的酰基。
术语“酰基氨基”包括其中酰基键合到氨基上的基团。例如，该术语包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基。
术语“芳酰基”包括其中芳基或杂芳基键合到羰基上的化合物和基团。芳酰基基团的实例包括苯基羧基、萘基羧基等。
术语“烷氧基烷基”、“烷基氨基烷基”和“硫代烷氧基烷基”包括如上所述的烷基基团，但还含有替代烃主链的一个或多个碳的氧、氮或硫原子，例如氧、氮或硫原子。
术语“烷氧基”包括与氧原子共价连接的取代和未取代的烷基、烯基和炔基。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基，并且可包括环状基团如环戊氧基。
术语“胺”或“氨基”包括其中氮原子与至少一个碳原子或杂原子共价键合的化合物。术语“烷基氨基”包括其中氮与至少一个另外的烷基基团键合的基团和化合物。术语“二烷基氨基”包括其中氮原子与至少两个另外的烷基基团键合的基团。术语“芳基氨基”和“二芳基氨基”分别包括其中氮原子与至少一个或两个芳基基团键合的基团。术语“烷基芳基氨基”、“烷基氨基芳基”或“芳基氨基烷基”指与至少一个烷基和至少一个芳基键合的氨基。术语“烷氨基烷基”指与氮原子键合的烷基、烯基或炔基，所述氮原子还与烷基键合。
术语“酰胺”或“氨基羧基”包括含有与羰基或硫代羰基的碳键合的氮原子的化合物或基团。该术语包括“烷氨基羧基”基团，其包括与氨基键合的烷基、烯基或炔基，其中所述氨基与羧基键合。其包括含有与氨基结合的芳基或杂芳基的芳基氨基羧基，其中所述氨基与羰基或硫代羰基的碳键合。术语“烷基氨基羧基”、“烯基烷基羧基”、“炔基氨基羧基”和“芳基氨基羧基”包括其中烷基、烯基、炔基和芳基分别与氮原子键合的基团，其中所述氮原子依次与羰基的碳键合。
术语“羰基”或“羧基”包括含有通过双键与氧原子键合的碳原子的化合物和基团以及其互变异构形式。含有羰基的基团的实例包括醛、酮、羧酸、酰胺、酯、酸酐等。术语“羧基”或“羰基”指诸如以下的基团其中烷基与羰基共价键合的“烷基羰基”基团、其中烯基与羰基共价键合的“烯基羰基”、其中炔基与羰基共价键合的“炔基羰基”、其中芳基与羰基共价键合的“芳基羰基”。此外，该术语还指其中一个或多个杂原子与羰基共价键合的基团。例如，该术语包括例如以下的基团氨基羰基基团(其中氮原子与羰基的碳键合，例如酰胺)、氨基羰基氧基基团(其中氧原子和氮原子都与羰基的碳键合，例如还称为“氨基甲酸酯”)。此外，氨基羰基氨基(例如脲)还包括与杂原子(例如氮、氧、硫等以及碳原子)键合的羰基的其它组合。此外，所述杂原子还可另外被一个或多个烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、酰基等基团取代。
术语“醚”包括含有与两个不同碳原子或杂原子键合的氧的化合物或基团。例如，该术语包括“烷氧基烷基”，其指与氧原子共价键合的烷基、烯基或炔基，其中所述氧原子与另一个烷基共价键合。
术语“酯”包括含有与氧原子键合的碳或杂原子的化合物和基团，其中所述氧原子与羰基的碳键合。术语“酯”包括烷氧基羧基，比如甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、戊氧基羰基等。烷基、烯基或炔基如上所定义。
术语“羟基”包括具有-OH或-O-的基团。
术语“卤素”包括氟、溴、氯、碘等。术语“全卤化”通常指其中所有的氢被卤原子替代的基团。
术语“杂原子”包括除了碳或氢以外的任何元素。优选的杂原子是氮和氧。术语“杂环”或“杂环的”包括含有一个或多个杂原子的饱和、不饱和、芳香(“杂芳基”或“杂芳香的”)和多环的环。所述杂环可以是取代或未取代的。杂环的实例包括例如苯并二噁唑、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并吡喃、氮杂嘌呤(deazapurine)、呋喃、吲哚、中氮茚(indolizine)、咪唑、异噁唑、异吲哚、异喹啉、异噻唑、亚甲基二氧苯基、萘啶(napthridine)、噁唑、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、喹啉、四唑、噻唑、噻吩和三唑。其它杂环包括吗啉、哌嗪、哌啶、硫代吗啉和硫代四氢吡咯(thioazolidine)。
术语“多环”和“多环结构”包括具有两个或更多个环(例如环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环基)的基团，其中两个或更多个碳是两个相邻的环所共用的，例如，所述环是“稠环”。通过非毗邻的原子相连接的环被称为“桥”环。多环的每个环都可被上述这些取代基取代。
术语“含有羟基化环的化合物”指环的至少一个氢被羟基替代的化合物。
术语“羟基化化合物”指至少一个氢原子被羟基替代的化合物。
术语“含有羟基化多环的化合物”指至少一个环的至少一个氢原子被羟基代替的化合物。
本文所用的术语“盐形式”包括化合物的盐或化合物的盐的混合物。此外，化合物的两性形式也被包括在术语“盐形式”中。具有胺或其它碱基的化合物的盐可通过例如与合适的有机酸或无机酸(比如盐酸、氢溴酸、醋酸、高氯酸等)反应得到。含有季铵基团的化合物还可含有反阴离子，比如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、高氯酸根等。具有羧酸或其它酸性官能团的化合物的盐可通过使所述化合物与合适的碱(例如氢氧化物碱)进行反应而制得。因此，酸性官能团的盐可具有反阳离子，例如钠、钾、镁、钙等。
本文所用的“水合物形式”指化合物或混合物的水合状态或者化合物的一种以上的水合状态。例如，本文所述的标记试剂可以是半水合物、一水合物、二水合物等。此外，本文所述的标记试剂的样品可包括单水合物、二水合物和半水合物形式。
标记试剂 在本教导的多个方面提供了标记试剂、标记物组和被标记分析物。在多个实施方案中，提供了通式(I)的质量差异性标记物的组。在多个实施方案中，提供了非盐形式和/或非水合物形式的通式(I)的同量异位的标记物的组。在多个实施方案中，在所述非盐和/或非水合物形式中，所述标记物的质量差异小于约0.05个原子质量单位。所提供的标记物的组含有两种或更多种通式(I)的化合物或其盐或水合物 Z—R1(I)， 其中所述标记物组中的一种或多种化合物含有一种或多种重原子同位素。在多个实施方案中，所述重原子同位素各自独立地是13C、15N、18O、33S或34S。
在式(I)中，Z表示取代或未取代的直链、支链或环状烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的氨基；或者取代或未取代的硫代基；R1表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
X表示Cl、Br、I或乙酰基；R2表示取代或未取代的烷基、取代或未取代的卤代烷基、或者取代或未取代的芳基。
式(I)的化合物可以各种盐和水合物的形式提供，包括但不限于其单TFA盐、单HCl盐、二HCl盐或二TFA盐或水合物。
在多个实施方案中，标记物组的一种或多种化合物在同位素方面富集了两个或更多个重原子、三个或更多个重原子、和/或四个或更多个重原子。在多个实施方案中，向式的标记物组中引入重原子同位素，以使得同位素以至少80％的同位素纯度、至少93％的同位素纯度和/或至少96％的同位素纯度存在。
在多个实施方案中，标记物组含有通式(IV)的三甲基铵化合物或其盐或水合物形式
其中R1可以如式(I)所述。在多个实施方案中，R1表示
应当理解，式(I)或式(IV)的标记物组例如可以是质量差异性标记物组、同量异位的标记物组或者质量差异性标记物和同量异位的标记物的组合。例如，本教导中质量差异性标记物组可包含选自通式(IVa)-(IVb)的化合物中的两种或更多种化合物，本教导中同量异位的标记物组可包含选自通式(IVc)-(IVf)的化合物中的两种或更多种化合物
其中星号表示重原子取代。
本教导的标签组的成员甚至在它们是质量差异性标签的情况下也可具有基本上相似的结构性质，所述质量不同是由于所述组的成员之间的重同位素富集不同。因此，在多个实施方案中，尽管各自利用来自标签组的不同标记物进行标记的两种相同的化合物可具有不同的质量，但是被标记化合物可具有基本上相似的化学反应活性和色谱分离性质，使得例如在色谱分离、离子化等方面的差异不导致传输到质量分析器的标记化合物的相对量产生显著差异。在本教导中，质量差异性以及同量异位的标签组中的每个成员在进行离子断裂(例如通过碰撞诱导解离(CID)、光诱导解离(PID)等)时可产生不同的子离子信号。这些子离子可用于区分所述组的成员并且可称为所述标签或标记物的报告物离子。在多个实施方案中，给定的标签可产生一种以上的报告物离子信号。
在多个实施方案中，标记物组包含两种或更多种通式(V)的5元、6元或7元杂环或其盐或水合物形式
在式(V)中，m＝0、1或2(假若分别是4元、5元、6元或7元环)，R1可以如式(I)所述，R3表示C、N、O或S；R4表示氢、直链或支链的C1-C6烷基基团、直链或支链的C1-C6烷氧基基团；R5各自独立地表示氢、氘、氟、氯、溴、碘、氨基酸侧链、可任选地含有取代或未取代的芳基基团的直链或支链的C1-C6烷基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子各自独立地与氢、氘或氟原子中的一种或更多种键合。
在多个实施方案中，标记物组包含两种或更多种通式(VI)的N-取代哌啶、哌嗪或吗啉化合物或其盐或水合物形式
在式(VI)中，R1、R3、R4和R5可如式(I)和/或式(V)所述。
在多个实施方案中，R1表示
或
或
或
其中X和R2可如式(I)所述。
还应当理解，式(V)和(VI)的标记物组例如可以是质量差异性标记物组、同量异位的标记物组、或质量差异性标记物和同量异位的标记物的组合。
在多个实施方案中，提供了含有通式(VII)的两种或更多种N-取代哌嗪化合物的质量差异性标签组
其中R9表示卤素、-OH或-OC(＝O)R11，其中R11是氢或直链或支链烷基；R4和R5可如前所述。在多个实施方案中，质量差异性标签的组含有通式(VIII)或(IX)的N-取代哌嗪化合物
其中R9和R4如前所述。在多个实施方案中，用于区分标签组中的标签的重原子同位素富集使用这样的标签其中同位素富集是来自哌嗪环的原子、直接与哌嗪环的原子键合的原子、R4的原子或上述组合。
应当理解，根据本教导，并非质量差异性标签组中的每一个成员都是重原子同位素富集的。例如，本教导中的质量差异性标签的组可包含选自通式(IXa)-(IXl)化合物的两种或更多种化合物或其盐或水合物形式
和
其中例如成员(IXa)不是同位素富集的。
在多个实施方案中，提供了含有通式(X)的两种或更多种N-取代哌嗪化合物的同量异位的标签组
其中R4是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基，同量异位的标签组的每个成员都是重原子同位素富集的。在多个实施方案中，同量异位的标签组含有通式(Xa)-(Xd)的两种或更多种标签
和
其中R4是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
同量异位的标记物 在多个实施方案中，本教导提供了同量异位的标记试剂、被标记分析物、标记和分析羟基化化合物的方法。一般而言，本教导的同量异位的标记物包含至少一个报告物基团部分和平衡物基团部分。例如，图13、14和16提供了可在本教导的多个实施方案中用作同量异位标记物的标记物结构的多个非限定性实例。
参照图13，在多个实施方案中，所述报告物基团部分(1302)包含通过报告物基团部分的氮原子(1306)与平衡物基团部分(1304)连接的N-取代哌啶、哌嗪或吗啉。多种平衡物基团部分可用于提供同量异位的标签。在多个实施方案中，所述平衡物基团包含用于与目标分析物上的羟基反应的反应中心。例如，在多个实施方案中，平衡物基团含有通过分析物的氧原子与分析物形成键的羰基(C＝O)反应中心。
在多个实施方案中，当被标记分析物(1308)进行断裂时，至少被标记分析物(1308)的氮(1306)与平衡物基团部分(1310)之间的键断裂产生报告物离子，在多个实施方案中，所述报告物离子是乙酰胺、N-取代哌啶、哌嗪或吗啉(1312)的离子。
参照图14，示意性地以举例方式说明了本教导的同量异位的标签的多个实施方案以及与其相关的报告物离子的多个实施方案。描述了同量异位的标签组的4种同量异位的标签，其中每种标签含有报告物部分(RP)和平衡物基团部分(BG)。在该实施例中，每个标签是具有多个重原子同位素取代(以星号表示)的(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酰基异氰酸酯。在多个实施方案中，利用同量异位的标签标记来自一种或多种样品中的一种或多种分析物，过滤被标记分析物的质量(例如利用TOF MS、RF多极MS、离子迁移MS等)并进行断裂(例如碰撞诱导解离(CID)、光解离等)以产生可通过质谱进行检测的报告物离子(1422、1424、1426、1428)。
报告物基团和离子 本教导的同量异位的标签的报告物基团部分可以是当被标记分析物进行断裂时由被标记分析物产生报告物离子的基团，这种具有基本上一致质量和/或质量-电荷比的该报告物离子可通过质谱进行检测。在本教导中，同量异位的标签组中不同的同量异位的标签的报告物离子具有不同的质量和/或质量-电荷比(m/z)。不同的报告物基团和离子可包含一种或多种重原子同位素，以实现不同标签之间质量或m/z的不同。例如，碳(12C、13C和14C)、氮(14N和15N)、氧(16O和18O)、硫(32S、33S和34S)和/或氢(氢、氘和氚)的重原子同位素可用于制备报告物基团和离子的不同基团。
报告物离子可与目标样品相关联，从而利用具有相应报告物基团的本教导同量异位的标签标记所述样品的一种或多种分析物。这样，例如，与报告物离子有关的信息可与关于所述样品的一种或全部分析物的信息相关联。在多个实施方案中，使被标记分析物的离子断裂从而产生子片段离子和可检测的报告物离子。被检测的报告物离子信号可用于例如确定分析物所来源的样品的身份。被检测的报告物离子信号可用于例如确定样品中分析物的相对量或绝对量(通常以浓度和/或量表示)。例如，通过将报告物离子信号与其它报告物离子、校正标准物等的信号进行比较可测定样品中被标记分析物的量。在多个实施方案中，例如特定样品中一种或多种分析物的量的信息可与报告物离子相关联，所述报告物离子对应于用于标记每种特定样品的同量异位的标签的报告物基团。在多个实施方案中，有关分析物身份的信息可与属于不同报告物离子的信息相关联，从而有助于确定一种或多种样品中每种被标记分析物的身份和量。
报告物可包含固定电荷或者能被电离。在多个实施方案中，可以利用具有固定电荷或能被电离的报告物基团来分离和/或利用同量异位的标签以标记盐、盐混合物、两性离子形式或其组合中的分析物。报告物基团的电离有助于在质谱仪中对其进行测定。当电离时，报告物基团可包含一个或多个净正电荷或负电荷。因此，报告物基团可包含一个或多个酸性基团或碱性基团，因为这样的基团的多个实施方案可容易地在质谱仪中电离。例如，报告物基团可包含一个或多个碱性氮原子(正电荷)或者一个或多个可电离的酸性基团比如羧酸根、磺酸根或磷酸根(负电荷)。含有碱性氮的报告物基团的实例碱包括但不限于取代或未取代的吗啉、哌啶或哌嗪。
可选择报告物基团使得其在通常用于分析物分析的条件下基本上不进行亚断裂(sub-fragment)。在多个实施方案中，可选择报告物离子使得其在施加解离能以引起报告物基团的烷基酰胺的氮和平衡物基团之间的键的断裂条件下基本上不进行亚断裂。“基本上不进行亚断裂”，意指在进行目标分析物的成功分析时，难于或不可能检测到高于背景噪音水平的报告物离子片段。
可选择报告物离子的质量，使之与目标分析物和/或任何所预计的分析物片段的质量不同。例如，当蛋白质或肽是分析物时，可选择报告物离子的质量，使之与任何天然氨基酸或肽或所预计的其片段不同。
在本教导的多个实施方案中，所述母离子是利用同量异位的标签进行标记的类固醇，所述子离子是所述同量异位的标签的报告物离子；因此，在检测器中测量的给定的同量异位标记的类固醇母离子的报告物离子的离子信号可称为“被标记的类固醇-报告物离子跃迁信号”。相似地，在检测器中测量的给定的同量异位标记标准化合物的报告物离子的离子信号可称为“被标记的标准物-报告物离子跃迁信号”。
平衡物基团 在多个实施方案中，本教导的同量异位的标签包含报告物基团和平衡物基团，其中报告物和平衡物基团的结合质量使得同量异位的标签组中的每一种标签都具有基本上相同的质量。在多个实施方案中，所述平衡物基团包含一个或多个羰基(C＝O)。在多个实施方案中，利用氧原子通过平衡物基团的羰基碳将分析物与标签相连接以形成被标记化合物。
在多个实施方案中，当被标记分析物进行断裂时平衡物基团还作为离去基团。例如，在多个实施方案中，所述平衡物基团包含当断裂时以二氧化碳形式离去的羰基部分(通过分析物的氧原子与分析物键合)。
本教导提供了标记试剂的许多实施方案。图5仅举例说明了用于举例说明利用3种不同标记物(502)标记胆固醇的许多可能试剂中的仅仅几个。图6A-9E提供本教导中多种标记方法和被标记分析物化合物的另外的非限定性例子。
应当理解，本文的标记方法、向化合物中添加标记物的方法以及对例如提供和添加标记物的描述包括例如式(I)化合物的一步反应或通过多步反应添加式(I)化合物(参见例如图6B，17，19和52)。例如，在多个实施方案中，所述向化合物中添加式(I)或其盐或水合物形式的标记物以标记所述化合物的步骤包含两步反应，其中添加标记物的第一部分(例如含有式(I)中的R1部分的结构部分)之后是添加标记物的第二部分(例如含有式(I)中Z部分的结构部分)的第二步，以实现标准化合物的标记。
图10示意性地描述了根据通式(I)的多个实施方案的含有报告物基团(1002)和平衡物基团(1004)的标记物以及根据通式(II)的多个实施方案的被标记分析物化合物(1008)，并且举例说明了被标记化合物进行CID时键断裂的多个实施方案。在多个实施方案中，被标记化合物通过胺(1006)和羰基(1010)之间的键的断裂产生报告物离子。在多个实施方案中，被标记化合物可在两个或更多的点处断裂。
被标记分析物 在多个方面，本教导提供了含有被标记羟基的化合物，其可由通式(XI)表示 RP-BX-LG-O-BY-AR (XI)， 其中AR是含有环的化合物，LG表示连接物基团，BX表示RP和LG的原子之间的键，O是氧，BY表示氧O和在标记反应之前被羟基化的AR的碳之间的键。在多个实施方案中，LG用作平衡物基团(BG)。在多个实施方案中，LG和O一起充当平衡物基团(BG)。在多个实施方案中，BX表示当含有被标记多环的化合物进行碰撞诱导解离(CID)时断裂的键。在多个实施方案中，BX和BY二者均表示当含有被标记多环的化合物进行碰撞诱导解离(CID)时断裂的键。
在多个实施方案中，含有被标记分析物的化合物可产生一个以上的报告物离子质量/标签组的成员。例如，在多个实施方案中，进行CID的被标记化合物样品产生两种不同m/z值的报告物离子由BX键的断裂产生的报告物离子以及由BY键的断裂产生的报告物离子。
图11示意性地描述了根据本教导多个实施方案的被标记分析物化合物，并且举例说明了被标记化合物进行CID时键断裂的多个实施方案。在多个实施方案中，被标记化合物通过BX键的断裂产生报告物离子、RP片段1(方案1101)。在多个实施方案中，被标记化合物可在两个或更多个点处断裂。在方案1102中，被标记化合物可通过BX键、BY键或其二者的解离进行断裂；BY键的断裂产生不同的报告物离子RP片段2。因此，在多个实施方案中，优选重原子同位素富集(以区分标签组的成员)的是来自所述化合物的RP片段2部分的原子。
图16A-B示意性地描述了含有被标记环的化合物(被标记胆固醇)的多个实施方案。图16A描述了胆固醇标记的同量异位的标签，其中BG(1604)是羰基-C＝O，BX键(1606)是氮原子与羰基碳之间的键；此外还指出了另一个可能的断裂点BY键。图16B描述了胆固醇标记的同量异位的标签，其中BG(1614)是羰基-C＝O，BX键(1616)是羰基碳之间的键；此外还指出了另一个可能的断裂点BY键。在多个实施方案中，被标记化合物可在两个或更多个点处断裂。
在多个方面，本教导提供了被标记分析物，其中所述分析物含有至少一个羟基基团以利用本教导的标记物进行标记。在多个实施方案中，所述被标记化合物可以由通式(II)表示并可以其盐或水合物形式提供和/或使用
在通式(II)中(a)Z可以如式(I)所给出；(b)A表示在形成被标记化合物之前含有一个或多个羟基基团的化合物；(c)RY表示氧原子，其与在形成被标记化合物之前含有羟基基团的A的碳原子形成键；(d)n表示1至至多为在形成被标记化合物之前A中羟基基团数的整数；以及(e)Rx表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
本教导并不限于羟基化化合物的分析，还可通过在利用本教导实施方案的标签标记之前还原羰基、通过利用标记反应原位还原、或其组合而用于含有非羟基化羰基的化合物。
在多个实施方案中，Z-Rx具有通式(IIa)的结构
以及，在多个实施方案中，其中RX表示
在多个实施方案中，被标记分析物化合物含有四环。在多个实施方案中，所述四环可由通式(III)表示
其中不与RY成键的四环上的一个或多个位置各自独立地被氢、烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基、氰基、烷基芳基或芳族或杂芳族基团取代。通式(III)中给出的数字仅仅用于指明位置的目的。在多个实施方案中，衍生得到A的羟基化化合物含有在3位、17位或3位和17位二者上羟基化的式(III)的多环结构。
在多个实施方案中，含有羟基化环的化合物可以是含有羟基化多环的化合物。在多个实施方案中，所述含有羟基化多环的化合物可以是四环化合物，比如甾醇、类固醇等，包括天然以及合成的类固醇、甾醇等。含有带羟基的环的类固醇的实例包括但不限于皮质醇、11-去氧皮质醇(化合物S)、皮质酮、DHT、睾酮、表睾酮、去氧甲基睾酮(DMT)、四氢孕三烯酮(THG)、雌二醇、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮基雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、DHEA(去氢表雄酮)、17OH孕烯醇酮、17OH孕酮、17OH孕酮、雄酮、表雄酮、D4A(Δ4雄烯二酮)、豆甾醇、以及胆固醇。本教导并不局限于对羟基化化合物的分析，还可通过在利用本教导实施方案的标签标记之前进行羰基的羟基化、通过利用标记反应进行原位羟基化或其组合而用于含有非羟基化羰基的化合物。
在多个实施方案中，所述多环化合物含有与芳基、环烷基或环烯基相连接的多环，实例包括但不限于维生素D2(有时称为麦角钙化醇)、维生素D3(有时称为胆钙化醇)、其代谢物和类似物。
在多个实施方案中，所述含有羟基化环的化合物包括含有环的激素样化合物，包括但不限于前列腺素、其代谢物和类似物。在多个实施方案中，含有羟基化环的化合物包括含有环的维生素，包括但不限于维生素B2、维生素B6、维生素A、维生素A2、维生素E、维生素K以及其代谢物和类似物。
可应用本教导的多个方面和实施方案的羟基化化合物可来自多种来源，例如生理性流体样品、细胞或组织裂解物样品、蛋白质样品、细胞培养物样品、发酵肉汤培养基样品、农产品样品、动物产品样品、动物饲料样品、供人消费的食品或饮料样品以及其组合。所述样品可来自不同的来源、条件，或者既来自不同来源又来自不同条件；例如对照品对比实验、来自不同时间点的样品(例如以形成序列)、疾病对比正常、实验对比疾病、被污染的对比未被污染的等。生理性流体的实例包括但不限于血液、血清、血浆、汗液、泪液、尿、腹腔液、淋巴、阴道分泌物、精液、脊髓液、腹水(ascetic fluid)、唾液、痰液、乳腺流出物及其组合。
标记方法 在多个方面，本教导提供了用于标记羟基化化合物以形成被标记分析物化合物的方法。在多个实施方案中，所述方法包括使通式(I)的标记化合物或其盐或水合物形式与含有羟基化环的化合物在一种或多种偶联剂存在下反应，以形成含有被标记环的通式(II)的化合物。在多个实施方案中，所述向羟基化化合物中添加式(I)或其盐或水合物形式的标记物以标记所述羟基化化合物的步骤包含两步式反应，其中加入标记物的第一部分(例如含有式(I)中R1部分的结构部分)之后进行加入标记物的第二部分(例如含有式(I)中Z部分的结构部分)的第二步骤以实现利用式(I)的标记物标记所述化合物。
在多个实施方案中，可通过使通式(XIIa)的化合物或其盐或水合物形式 L-R1 (XIIa) 与羟基化化合物反应来标记羟基化化合物从而形成通式(XIIIa)的前体被标记化合物 L—RX—RY—A (XIIIa)， 以及 使通式(XIVb)的化合物或其盐或水合物 ZR8 (XIVb) 与所述前体被标记化合物反应而形成通式(II)的被标记化合物或其盐或水合物形式
其中L表示离去基团；R8表示离去基团、反离子或氢。A、Z、n、RX、RY、X、R1和R2可以如之前的式(I)和(II)所述。
在多个实施方案中，可通过使通式(I)的化合物或其盐或水合物形式 Z—R1 (I) 与羟基化化合物反应来标记羟基化化合物从而形成通式(II)的被标记化合物或其盐或水合物形式
A、Z、n、RX、RY、X、R1和R2可以如之前的式(I)和(II)所述。
在多个实施方案中，所述方法可包括首先在目标化合物上形成一个或多个羟基以获得用于随后标记的羟基化化合物。例如，在多个实施方案中，所述方法包含将化合物上的羰基基团转化成羟基基团的步骤。在多个实施方案中，将碱与一种或多种偶联剂联合使用以促进标记反应。
多种偶联剂可用于标记反应的多个实施方案中，所述偶联剂包括但不限于六氟磷酸盐化合物(例如HATU(2-(1H-7-偶氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、HBTU(O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、HCTU(1H-苯并三唑1-[二(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯六氟磷酸盐(1-)，3-氧化物))、四氟硼酸盐化合物(例如TBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐))以及乙基二乙基氨基丙基碳二亚胺化合物(例如EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺))。多种碱可用于进一步促进标记反应，包括但不限于二异丙基乙胺(例如DIPEA(N，N-二异丙基乙基乙胺))。
本教导的被标记分析物化合物可包含多种羟基化化合物，包括但不限于含有多环的化合物。本教导的方法可用于多种羟基化化合物以形成被标记分析物化合物。图3A-3H示意性地举例说明了能适用于本教导方法的多个实施方案的几种含有羟基化多环的化合物，图3I-3K示意性地举例说明了能适用于本教导方法的多个实施方案的几种含有羟基化环的化合物。
在多个实施方案中，本教导可用于天然以及合成的类固醇。类固醇的实例包括但不限于皮质醇、11-去氧皮质醇(化合物S)、皮质酮、DHT、睾酮、表睾酮、去氧甲基睾酮(DMT)、四氢孕三烯酮(THG)、雌二醇、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮基雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、DHEA(脱氢表雄酮)、17OH孕烯醇酮、17OH孕酮、17OH孕酮、雄酮、表雄酮、D4A(Δ4雄烯二酮)、豆甾醇、以及胆固醇。本教导可用于含有桥接多环的化合物以及含有稠环的化合物。例如，在多个实施方案中，本教导可用于维生素D3及其代谢物，参见例如图3F-3H。
参照图12A-12B，显示了利用质量差异性标签组的成员标记睾酮和表睾酮的实例。方案1201-1204是在HATU和DIPEA存在下通过与(4-甲基-哌嗪-1-基)乙酸标签进行反应来标记睾酮。方案1205-1208举例说明了表睾酮的标记。在举例说明的反应中，(4-甲基-哌嗪-1-基)乙酸的乙酸部分与睾酮或表睾酮化合物上的羟基反应，以形成被标记化合物。
方案1201和1205利用非同位素富集的(4-甲基-哌嗪-1-基)乙酸而其它方案利用来自标签组的重原子同位素富集的标签。这些质量差异性标记提供了区分不同样品的方法。例如，分别进行方案1201和1205的反应的睾酮和表睾酮可以来自参比样品，进行其余方案的反应的睾酮和表睾酮可以来自处于例如用于提高潜在性能的类固醇使用的研究中的样品。
参照图15，显示了已经利用通式(X)的同量异位的标签进行标记以形成被标记分析物化合物的被标记胆固醇分析物的多个实施方案以及相关的报告物离子的多个实施方案。图15举例说明了标记4种样品中的胆固醇(方案1500至1503)，其中在样品间使用不同的同量异位的标记物(各自含有同位素取代的(4-甲基-哌嗪-1-基)乙酰基异氰酸酯)。在多个实施方案中，可对这些被标记样品进行MS/MS分析，例如将被标记化合物通过一级质量过滤器到达离子断裂器(例如碰撞室)、使被标记化合物经受解离能、并使所得的片段通过质量过滤器、检测所述报告物离子以及基于所述报告物离子信号测定一种或多种分析物的相对和/或绝对浓度。在其中同量异位的标签含有N-取代哌啶、哌嗪或吗啉、乙酰基异氰酸酯或乙酰基肼基的多个实施方案中，所得的报告物离子是N-取代哌啶、哌嗪或吗啉羧基胺的离子，例如铵离子。虽然在图15的方案中使用了偶联剂，这样的试剂可以省略，但是当反应的离去基团是OH时通常使用这样的试剂。
在图15中，方案1500和1503利用同位素富集的(4-甲基-哌嗪-1-基)乙酰基异氰酸酯，其在同量异位的标签组中的标签之间的报告物部分的质量不同。这些标记提供了区分不同样品的方法。例如，在方案1500和1501的含环的化合物是睾酮(而不是胆固醇)以及方案1502和1503的含环的化合物是表睾酮(而不是胆固醇)的情况下，对多种报告物离子(在例如方案1500和1503的类固醇来自待分析的样品，方案1501和1503的类固醇来自标准物的情况下)的监测可用于例如检测提高潜在性能的类固醇的使用。
可以使用多种合成技术以形成含有所期望的重原子同位素取代的本教导的标记物。参照图17，在多个实施方案中，可通过使同位素富集的取代或未取代哌啶、哌嗪或吗啉(1702)(其中n＝0、1或2(倘若分别为5、6或7元环))反应而制备本教导的同位素富集的标记物；在图17中，R2是取代或未取代的碳、氮或氧。例如，在图17中，R2可被直链或支链的C1-C6烷基或者直链或支链的C1-C6烷氧基取代。所述环的碳原子可在一个或多个位置上独立地被氟、氯、溴、碘、氨基酸侧链、可任选地含有取代或未取代的芳基的直链或支链的C1-C6烷基取代。同位素富集的取代或未取代的哌啶、哌嗪或吗啉(1702)与具有离去基团(LG)的同位素富集的乙酰胺(1704)反应形成含有羧基胺(1706)的化合物。然后所述羧基胺(1706)可与亲电试剂(例如光气(1708))反应形成同量异位的标签(1710)。
参照图18，描述了形成(4-甲基-哌嗪-1-基)乙酰基异氰酸酯同量异位的标签组的多个实施方案(方案1800-1803)，图17和18中的星号表示重原子同位素取代。
分析方法 在多个方面，本教导提供了利用式(I)的标记物和母离子-子离子跃迁监测(PDITM)分析一种或多种样品中的一种或多种羟基化化合物的方法。
在多个实施方案中，本教导提供了通过向每种样品中添加不同的标记物、合并被不同标记的样品以及利用PDITM以测定样品中一种或多种羟基化化合物的浓度而测定两种或更多种样品中的一种或多种羟基化化合物的浓度的方法。在多个实施方案中，样品之一含有标准物样品，例如对照样品、参比样品、含有已知浓度化合物的样品等。因此，所述方法可提供对来自多种样品中的多种化合物的分析。
例如，参照图4A，在多个实施方案中，所述方法包括通过向每种目标样品中添加来自式(I)或其盐或水合物形式的标签组的不同标签来标记两种或更多种样品中的一种或多种羟基化化合物的步骤(步骤410a)，以形成被标记分析物化合物，来自所述标签组的每种标签含有报告物离子部分。根据其所来源的样品，所述被标记分析物化合物被不同地标记。在多个实施方案中，所述添加式(I)或其盐或水合物形式的标记物以标记羟基化化合物的步骤包含两步式反应，其中添加标记物的第一部分(例如含有式(I)中R1部分的结构部分)之后进行添加标记物的第二部分(例如含有式(I)中Z部分的结构部分)的第二步骤，以实现利用式(I)的标记物标记化合物。
然后，所述方法合并每种样品的至少一部分以产生合并样品(步骤420a)，对所述合并样品的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测(其中被传输的母离子m/z范围包括被标记分析物化合物的m/z值，被传输的子离子m/z范围包括与所述被标记分析物化合物的标签对应的报告物离子的m/z值)，以及测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(步骤430a)。然后可至少基于比较所检测的相应报告物离子的离子信号与一种或多种所检测的标准物化合物的离子信号，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度(步骤440a)。所述离子信号可例如基于离子峰的强度(平均值、中间值、最大值等)、离子峰面积或其组合。在多个实施方案中，所述两种或更多种目标样品中的一种或多种可以是含有一种或多种标准物化合物的标准物样品。
在多个实施方案中，通过将所检测的相应的被标记分析物化合物-报告物离子跃迁信号的离子信号与下述一种或多种相比较来测定羟基化化合物的浓度 (i)标准物化合物-报告物离子跃迁的浓度曲线；以及 (ii)含有被标记分析物化合物的合并样品中的标准物化合物的标准物化合物-报告物离子跃迁信号。
在多个实施方案中，可在含有第一质量分离器、离子断裂器和第二质量分离器的质量分析器系统上进行PDITM。选择PDITM扫描的被传输的母离子m/z范围(通过第一质量分离器选择)以包括一种或多种被标记分析物化合物的m/z值，选择PDITM扫描的被传输的子离子m/z范围(通过第二质量分离器选择)以包括与被传输的被标记分析物化合物的标签对应的一种或多种报告物离子的m/z值。
在多个实施方案中，被添加到所述两种或更多种样品中的标签选自式(I)或其盐或水合物形式的标签组，使得例如在一次实验测量内(i)可比较和/或定量来自不同样品(例如对照样品、处理样品、时间顺序的样品)的多种羟基化化合物；(ii)可对来自不同样品的相同羟基化化合物进行多次浓度测量；(iii)可对比基线样品评价血液样品的不同分离物等。
再次参照图4A，在多个实施方案中，所述将合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤包括直接将合并样品引入到质量分析器系统中(工作流程路径421a和步骤430a)，例如利用电喷雾电离(ESI)离子源引入处于合适的溶液中的合并样品。
在多个实施方案中，所述将合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤包括将所述合并样品的所述部分加样到色谱柱(例如LC柱、气相色谱(GC)柱或其组合)上(工作流程路径422a和步骤425a)、对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测、测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(工作流程路径423a和步骤430a)。
在多个实施方案中，在所述合并样品用于测量报告物离子信号之前将其净化(clean up)(例如通过高效液相色谱(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交换分级(extrange fractionation)、阳离子交换、高分离度阳离子交换等以及其组合以除去例如干扰样品、人工加入的缓冲剂等)。
在多个实施方案中，使用色谱柱分离被标记化合物的分析物部分中不同的两种或更多种被标记分析物化合物。例如，在多个实施方案中，通过色谱柱将在一种或多种样品中发现的第一被标记分析物化合物与在一种或多种所述样品中发现的第二被标记分析物化合物分开。在多个实施方案中，分离两种或更多种被不同标记的分析物化合物使得不同的化合物基本上不发生共洗脱。这样的色谱分离可通过例如提供关于化合物色谱保留时间的信息而进一步有助于分析多种样品中的多种化合物。
再次参照图4A，可以多种方式提供一种或多种所检测的标准物化合物的离子信号，该离子信号用于测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度之步骤(步骤440a)中。在多个实施方案中，利用来自式(I)或其盐或水合物形式的标签组中的标签来标记一种或多种非同位素富集的标准物化合物，所述一种或多种被标记分析物化合物中的一种或多种的至少一部分与每种所述被标记分析物化合物的至少一部分合并以产生合并样品(步骤450a)；之后将该合并样品的至少一部分进行PDITM并测量被传输的报告物离子中的一种或多种的离子信号(步骤430a)。
在多个实施方案中，将来自标签组的标签加入到一种或多种标准物样品中以提供一种或多种被标记标准物样品，每种标准物样品含有一种或多种利用所述标签进行标记的非同位素富集的标准物化合物，被加入到所述一种或多种标准物样品中的标签不同于被加入到目标样品中的标签。在多个实施方案中，将所述一种或多种被标记标准物样品中的一种或多种的至少一部分与每种所述目标样品的至少一部分合并以产生合并样品(步骤450a)；之后对该合并样品的至少一部分进行PDITM并测量被传输的报告物离子中的一种或多种的离子信号(步骤430a)。
然后可将所测的相应于合并样品中的所述一种或多种被标记标准物化合物中的一种或多种报告物离子的离子信号用于测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度。因此，在多个实施方案中，至少基于比较所检测的相应报告物离子的离子信号与所检测的相应于一种或多种被标记标准物化合物中的一种或多种的一种或多种报告物离子的离子信号，测定被标记分析物化合物的浓度(步骤440a)。对该合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤可包括例如直接引入到质量分析器系统中(工作流程路径452a和步骤430a)；首先将该合并样品的至少一部分加样到色谱柱上(工作流程路径453a和步骤425a)，之后对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行PDITM并测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(工作流程路径423a和步骤430a)；或者它们的组合。
在多个实施方案中，通过色谱柱分离一种或多种标准物样品中的两种或更多种被标记标准物化合物，使得它们基本上与以其作为标准物的化合物一起洗脱。
在多个实施方案中，至少基于比较所检测的相应报告物离子的离子信号与所检测的与一种或多种标准物化合物中的一种或多种浓度曲线对应的一种或多种报告物离子的离子信号，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度(步骤440a)。在多个实施方案中，提供了具有第一浓度(步骤460a)和利用来自式(I)或其盐或水合物形式的标签组中的标签进行标记(步骤470a)的非同位素富集的标准物化合物。对被标记标准物化合物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测(其中被传输的母离子m/z范围包括被标记标准物化合物的m/z值，被传输的子离子m/z范围包括与所述被标记标准物化合物的标签对应的报告物离子的m/z值)，并测量报告物离子的离子信号(步骤480a)。将标记步骤(步骤470a)以及PDITM和测量被传输的报告物离子的离子信号的步骤(步骤480a)对至少一个不同于第一浓度的标准物化合物浓度进行重复，以生成标准物化合物的浓度曲线(步骤490a)。
对被标记标准物化合物的至少一部分进行PDITM的步骤可包括例如直接引入到质量分析器系统中(工作流程路径471a和步骤480a)(例如利用ESI离子源引入处于合适溶液中的合并样品，或者将合并样品与合适的基质混合以及利用合适的MALDI离子源引入样品)；首先将该合并样品的至少一部分加样到色谱柱上(工作流程路径472a和步骤475)，之后对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行PDITM并测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(工作流程路径473a和步骤480a)；或者它们的组合。
在多个实施方案中，可在包含第一质量分离器、离子断裂器和第二质量分离器的质量分析器系统上进行标准物化合物的PDITM。选择PDITM扫描的被传输的母离子m/z范围(通过第一质量分离器选择)以包括一种或多种被标记标准物化合物的m/z值，选择PDITM扫描的被传输的子离子m/z范围(通过第二质量分离器选择)以包括与被传输的标准物化合物的一种或多种报告物离子对应的m/z值。
在多个实施方案中，浓度曲线的生成可利用被包含在标准物化合物的至少一部分中的一种或多种内标物，以例如有助于浓度测定、解释注射体积的不同等。
在多个实施方案中，浓度曲线可通过以下方式生成利用PDITM检测与相应的标准物化合物相关的报告物离子的离子信号以及通过所检测的浓度的线性外推使得零浓度与零报告物离子信号对应，生成浓度曲线。在多个实施方案中，浓度曲线可通过以下方式生成利用PDITM检测与相应的在两个或更多个已知浓度下的标准物化合物相关的报告物离子的离子信号以及通过拟合所检测的报告物离子信号的函数生成浓度曲线。合适的拟合函数可取决于例如检测器的响应(例如检测器饱和、非线性等)。在多个实施方案中，所述拟合函数是线性函数。
再次参照图4A，在多个实施方案中，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度(步骤440a)至少基于以下两点(i)所检测的相应报告物离子的离子信号与所检测的与一种或多种标准物化合物的一种或多种浓度曲线对应的一种或多种报告物离子的离子信号的对比，以及(ii)所检测的相应报告物离子的离子信号与所检测的与和被标记分析物化合物合并的一种或多种被标记标准物化合物对应的一种或多种报告物离子的离子信号的对比。在多个实施方案中，提供了具有第一浓度(步骤460a)和利用来自式(I)或其盐或水合物形式的标签组中的标签进行标记(步骤470a)的非同位素富集的标准物化合物。被标记标准物化合物的一部分与每种被标记样品的至少一部分合并以产生合并样品(工作流程路径476a和步骤450a)，然后可如本文所述进一步分析该合并样品。在多个实施方案中，用于产生所述合并样品的相同被标记标准物化合物的一部分还用于生成浓度曲线，如本文所述。
在多个实施方案中，本教导提供了用于测定一种或多种样品中的一种或多种羟基化分析物化合物的浓度的方法。例如，参照图4B，在多个实施方案中，所述方法包括利用来自式(I)或其盐或水合物形式的标签组中的不同标签分别标记一种或多种羟基化化合物的步骤，来自标签组的每种标签包含报告物离子部分；合并每种被标记分析物化合物的至少一部分以产生合并样品(步骤420b)，对所述合并样品的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测(其中被传输的母离子m/z范围包括被标记分析物化合物的m/z值，被传输的子离子m/z范围包括与所述被标记分析物化合物的标签对应的报告物离子的m/z值)，并测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(步骤430b)。然后至少基于比较所检测的相应报告物离子的离子信号与一种或多种所检测的标准物化合物的离子信号，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度(步骤440b)。所述离子信号可例如基于离子峰的强度(平均值、中间值、最大值等)、离子峰面积、或其组合。
在多个实施方案中，可在包含第一质量分离器、离子断裂器和第二质量分离器的质量分析器系统上进行PDITM。选择PDITM扫描的被传输的母离子m/z范围(通过第一质量分离器选择)以包括一种或多种被标记分析物化合物的m/z值，选择PDITM扫描的被传输的子离子的m/z范围(通过第二质量分离器选择)以包括与被传输的被标记分析物化合物的标签对应的一种或多种报告物离子的m/z值。
在多个实施方案中，利用选自式(I)或其盐或水合物形式的质量差异性标签组中的一种或多种标签标记一种或多种羟基化化合物，使得例如在一次实验测量内(i)可比较和/或定量来自不同样品(例如对照样品、处理样品)的多种含有羟基的化合物；(ii)可对来自相同样品的相同羟基化化合物进行多次浓度测量；(iii)可对比基线样品评价血液样品的不同分离物等。
再次参照图4B，在多个实施方案中，所述对合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤包括直接将所述合并样品引入到质量分析器系统中(工作流程路径421b和步骤430b)，例如利用电喷雾电离(ESI)离子源引入处于合适的溶液中的合并样品。
在多个实施方案中，所述对合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤包括将合并样品的部分加样到色谱柱(例如LC柱、气相色谱(GC)柱或其组合)上(工作流程路径422b和步骤425b)、对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测、测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(工作流程路径423b和步骤430b)。
在多个实施方案中，在所述合并样品用于测量报告物离子信号之前将其净化(例如通过高效液相色谱(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交换分级、阳离子交换、高分离度阳离子交换等以及其组合以除去例如干扰样品、人工加入的缓冲剂等)。
在多个实施方案中，通过将所检测的相应的被标记分析物化合物-报告物离子跃迁信号的离子信号与下述的一种或多种相比较来测定羟基化化合物的浓度 (i)标准物化合物-报告物离子跃迁的浓度曲线；以及 (ii)含有被标记分析物化合物的合并样品中的标准物化合物的标准物化合物-报告物离子跃迁信号。
再次参照图4，可以多种方式提供一种或多种所检测的标准物化合物的离子信号，所述离子信号用于测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度之步骤(步骤440b)中。在多个实施方案中，利用来自式(I)或其盐或水合物形式的质量差异性标签组中的标签标记一种或多种非同位素富集的标准物化合物，将所述一种或多种被标记分析物化合物的一种或多种的至少一部分与每种所述被标记分析物化合物的至少一部分合并以产生合并样品(步骤450b)，之后对该合并样品的至少一部分进行PDITM并测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(步骤430b)。
所测的与合并样品中一种或多种被标记标准物化合物中的一种或多种对应的一种或多种报告物离子的离子信号然后可用于测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度。因此，在多个实施方案中，至少基于比较所检测的相应报告物离子的离子信号与所检测的与合并样品中一种或多种被标记标准物化合物中的一种或多种对应的一种或多种报告物离子的离子信号，测定被标记分析物化合物的浓度(步骤440b)。对该合并样品的至少一部分进行PDITM的步骤可包括例如直接引入到质量分析器系统中(工作流程路径452ab和步骤430b)；首先将该合并样品的至少一部分加样到色谱柱上(工作流程路径453b和步骤425b)，之后对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行PDITM并测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(工作流程路径423b和步骤430b)；或者它们的组合。
在多个实施方案中，至少基于比较所检测的相应报告物离子的离子信号与所检测的与一种或多种标准物化合物中一种或多种浓度曲线对应的一种或多种报告物离子的离子信号，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度(步骤440b)。在多个实施方案中，提供具有第一浓度(步骤460b)和利用来自式(I)或其盐或水合物形式的标签组中的标签进行标记(步骤470b)的非同位素富集的标准物化合物。对被标记标准物化合物的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测(其中被传输的母离子m/z范围包括被标记标准物化合物的m/z值，被传输的子离子m/z范围包括与所述被标记标准物化合物的标签对应的报告物离子的m/z值)，并测量报告物离子的离子信号(步骤480b)。将标记步骤(步骤470b)以及PDITM和测量被传输的报告物离子的离子信号的步骤(步骤480b)对至少一个不同于第一浓度的标准物化合物浓度进行重复，以生成标准物化合物的浓度曲线(步骤490b)。
所述对被标记标准物化合物的至少一部分进行PDITM的步骤可包括例如直接引入到质量分析器系统中(工作流程路径471b和步骤480b)(例如利用ESI离子源引入处于合适溶液中的合并样品，或者将合并样品与合适的基质混合以及利用合适的MALDI离子源引入样品)；首先将该合并样品的至少一部分加样到色谱柱上(工作流程路径472b和步骤475b)，之后对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行PDITM并测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号(工作流程路径473b和步骤480b)；或者它们的组合。
在多个实施方案中，可在包含第一质量分离器、离子断裂器和第二质量分离器的质量分析器系统上进行标准物化合物的PDITM。选择PDITM扫描的被传输的母离子m/z范围(通过第一质量分离器选择)以包括一种或多种被标记标准物化合物的m/z值，选择PDITM扫描的被传输的子离子m/z范围(通过第二质量分离器选择)以包括与被传输的标准物化合物对应的一种或多种报告物离子的m/z值。
在多个实施方案中，浓度曲线的生成可利用被包含在标准物化合物的至少一部分中的一种或多种内标物，以例如有助于浓度测定、解释注射体积的不同等。
在多个实施方案中，浓度曲线可以下列方式生成利用PDITM检测与相应的标准物化合物相关的报告物离子的离子信号，以及通过所检测的浓度的线性外推使得零浓度与零报告物离子信号对应，生成浓度曲线。在多个实施方案中，浓度曲线可以下列方式生成利用PDITM检测与相应的标准物化合物相关的报告物离子的离子信号，以及通过拟合所检测的报告物离子信号的函数来生成浓度曲线。合适的拟合函数可取决于例如检测器的响应(例如检测器饱和、非线性等)。在多个实施方案中，所述拟合函数是线性函数。
在多个实施方案中，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度(步骤440b)至少基于以下两点(i)比较所检测的相应报告物离子的离子信号与所检测的与一种或多种标准物化合物中一种或多种浓度曲线对应的一种或多种报告物离子的离子信号，以及(ii)比较所检测的相应报告物离子的离子信号与所检测的与和被标记分析物化合物合并的一种或多种被标记标准物化合物对应的一种或多种报告物离子的离子信号。在多个实施方案中，提供了具有第一浓度(步骤460b)和利用来自式(I)或其盐或水合物形式的标签组中的标签进行标记(步骤470b)的非同位素富集的标准物化合物。被标记标准物化合物的一部分与每种被标记分析物化合物的至少一部分合并以产生合并样品(工作流程路径476b和步骤450b)，然后可如本文所述进一步分析该合并样品。在多个实施方案中，用于产生合并样品的相同被标记标准物化合物的一部分还用于生成浓度曲线，如本文所述。
在本教导的多个实施方案(包括但不限于图4A和图4B的上下文中所述的实施方案)中，用于检测报告物离子信号的相同标准物化合物部分或另一部分可用于确定质量分析器的母离子-子离子跃迁监测条件。例如，当所述质量分析器系统含有液相色谱(LC)组件时，所述标准物化合物可用于测定色谱保留时间。在多个实施方案中，所述标准物化合物可用于对羟基化化合物测定其在多种条件下在离子源中的电离效率和在离子断裂器中的断裂效率。
可应用本教导的多个实施方案的羟基化化合物可来自多种来源，例如生理性流体样品、细胞或组织裂解物样品、蛋白质样品、细胞培养物样品、发酵肉汤培养基样品、农产品样品、动物产品样品、动物饲料样品、供人消费的食品或饮料样品、以及它们的组合。所述样品可来自不同的来源、条件或者既来自不同来源又来自不同条件；例如对照对比实验、来自不同时间点的样品(例如以形成序列)、疾病对比正常、实验对比疾病、被污染的对比未被污染的等。生理性流体的实例包括但不限于血液、血清、血浆、汗液、泪液、尿、腹腔液、淋巴、阴道分泌物、精液、脊髓液、腹水、唾液、痰液、乳腺流出物以及其组合。
多种化合物可用作标准物化合物。在多个实施方案中，标准物化合物包含非同位素富集的羟基化的目标化合物。在多个实施方案中，所述标准物化合物可以是存在于一种或多种对照样品、已知浓度的样品或其组合中的一种或多种化合物。在多个实施方案中，提供了标准物化合物用于分析中的每种羟基化目标化合物。
在多个实施方案中，可利用PDITM检测与两个或更多个已知浓度的标准物化合物相关的报告物离子的离子信号，生成标准物化合物的浓度曲线。在多个实施方案中，从例如样品的时间序列得到的一种或多种化合物的组织学分布图可用作对时间的浓度曲线以测定一种或多种化合物的一种或多种定性、相对或定量浓度。在多个实施方案中，组织学分布图可用于确定例如疾病状态的存在或向疾病状态的增强倾向、遗传或代谢条件、类固醇使用等。
一种或多种被标记标准物化合物、含有在一种或多种被标记标准物化合物的一种或多种标准物样品、一种或多种被标记分析物化合物、含有一种或多种被标记分析物化合物的一种或多种样品、或其组合的任何合适的组合都可用于本教导的方法中以例如提供合并样品。例如，一般而言，合并样品中不同的被标记成分的数目N小于或等于标签组中的标签数T。在任何一个合并样品中，被标记标准物成分和一种或多种被标记分析物成分的可能组合可被表示为 (S+C)≤T (1)， 其中T表示标签组中的标签数；S表示含有不同标记物的被标记标准物成分的数目并且范围为0至T(包括端值)；C表示含有不同标记物的被标记分析物成分的数目并且范围为从0至T(包括端值)。如本文所用的，成分可指化合物，当例如样品中所有的化合物都用标签组中的相同标签进行标记时，成分可指样品中所有的化合物。
例如，在多个实施方案中，将一种或多种被标记标准物化合物(例如来自对照样品、来自已知浓度的样品等)与一种或多种被标记目标分析物化合物合并，所述一种或多种被标记标准物化合物提供可用作例如内部浓度标准物的一种或多种报告物离子信号。在多个实施方案中，被标记标准物化合物的加入可作为合并样品中一个或多个含有羟基的化合物的内标。在多个实施方案中，给合并样品中每种不同的羟基化目标化合物添加不同的被标记标准物化合物(例如S＝C)，每种不同的被标记标准物化合物例如作为不同的羟基化目标化合物的内标。
在多个实施方案中，合并样品中待分析的两种或更多种羟基化化合物包括相同的羟基化的目标化合物。例如，羟基化的化合物#1至#X(其中X>1)可包含相同的羟基化目标化合物，但该相同的羟基化目标化合物可例如来自不同样品，采用不同标记物用于每种不同的样品。例如，所述不同的样品可来自相同系统(例如运动员、患者或场所等)的不同时间点并且用于例如监测某些过程(例如疾病、发酵等)的进展、性能提高的类固醇使用等。因此，在多个实施方案中，第一样品中基本上所有的被标记化合物将利用标签组中的第一标签进行标记；第二样品中基本上所有的被标记化合物将利用标签组中的不同于第一标签的第二标签进行标记等。在多个实施方案中，所述样品中的一种或多种包含标准物样品，其中标准物样品中的被标记化合物是利用标签组中的不同于其它样品上所用的标签的标签进行标记的。
在多个实施方案中，利用用于相同的羟基化化合物的不同标签处理样品。例如，一式三份地处理样品，所述三份(然后被合并以提供合并样品的至少一部分(其还可包含一种或多种标准物化合物))中的每一部分使用不同的标签以在合并样品的单次实验分析中提供例如所述羟基化化合物浓度的三个测量值。一式三份，或者更一般而言多份的测量值通常是提供统计学显著的和/或准确的结果所必需的。本教导的多个实施方案以单次实验运行提供羟基化化合物浓度的多个测量值的能力可有助于减少由于运行间变化导致的不准确性。
在多个实施方案中，不将被标记标准物化合物添加到合并样品中；在多个实施方案中，例如，可至少基于比较羟基化化合物的相应的报告物离子信号与标准物化合物的浓度曲线或者基于这两者测定一种或多种羟基化目标化合物的浓度。在多个实施方案中，在所述合并样品用于测量报告物离子信号之前将其净化(例如通过高效液相色谱(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交换分级、阳离子交换、高分离度阳离子交换等以及其组合以除去例如干扰样品、人工加入的缓冲剂等)。
在多个实施方案中，提供了用于分析两种或更多种样品中的一种或多种含有类固醇的化合物、含有甾醇的化合物或其类似物的方法。在多个实施方案中，所述方法包括(a)向每种所述一种或多种目标样品中添加来自质量差异性标签组中的不同质量的区分标签以提供被标记样品，使得标签标记一种或多种目标样品中的一种或多种含有类固醇的化合物以产生通式(XI)的被标记类固醇 RP-BX-LG-O-BY-AR(XI)， 其中RP是质量差异性标签或同量异位的标签的报告物部分，LG是连接基团，O是氧，AR是含类固醇化合物、含甾醇化合物或其类似物的含环化合物，其中BX表示RP和LG的原子之间的键，BY表示氧O和标记反应之前被羟基化的A的碳之间的键。在多个实施方案中，LG包含一个或多个羰基基团。
合并被标记样品以提供合并样品，并将所述合并样品加样到色谱柱上。对来自色谱柱的洗脱液进行母离子-子离子跃迁监测，其中(i)给定的被标记含类固醇化合物的被传输的母离子m/z范围包括一种或多种所述被标记含环化合物的m/z值，第一被传输的子离子m/z范围包括与被标记含类固醇化合物的标签的至少一种对应的至少一种报告物离子的m/z值，以及检测一种或多种被传输的报告物离子的离子信号。至少基于比较所测的相应报告物离子的离子信号与所测的相应于标准物化合物的离子信号，测定一种或多种被标记含类固醇化合物的浓度。
试剂盒 在多个方面，本教导提供了用于分析羟基化化合物的试剂盒。在多个实施方案中，试剂盒包含通式(I)或其盐或水合物形式的同量异位的标签组中的两种或更多种同量异位的标签的组、以及一种或多种试剂、容器、酶、缓冲剂和/或使用说明。
在多个实施方案中，本教导的试剂盒包含载体的一个或多个组，每种载体包含通式(I)或其盐或水合物形式的不同的同量异位的标记试剂，其通过可裂解连接物与所述载体可裂解地连接。可裂解连接物的实例包括但不限于可化学裂解的连接物或可光裂解的连接物。所述载体可与不同的样品反应从而利用与各载体相关的同量异位的标签标记样品的分析物。例如，来自不同样品的分析物可与不同载体相接触并因此被不同的报告物/连接物组合进行标记。
质量分析器 多种质量分析器系统可用于本教导中以进行PDITM。合适的质量分析器系统包括带有离子断裂器的两个质量分离器，所述离子断裂器被布置在两个质量分离器之间的离子飞行轨道中。合适的质量分离器的实例包括但不限于四级杆、RF多极杆、离子阱、飞行时间(TOF)、以及与定时离子选择器(timed ion selector)联合的TOF。合适的离子断裂器包括但不限于按以下原理运行的那些碰撞诱导解离(CID，也称为碰撞辅助解离(CAD))、光诱导解离(PID)、表面诱导解离(SID)、源后衰变、通过与电子束相互作用(例如电子诱导解离(EID)、电子捕获解离(ECD))、通过与热辐射相互作用(例如热/黑体红外辐射解离(BIRD))、源后衰变或者它们的组合。
用于质量分析器的合适的质谱系统的实例包括但不限于含有一个或多个三重四极杆、四极杆线性离子阱(例如4000Q
LC/MS/MS系统、Q
LC/MS/MS系统)、四极杆TOF(例如
LC/MS/MS系统)、以及TOF-TOF的系统。
用于质谱的合适的离子源包括但不限于电喷雾电离(ESI)源、基质辅助激光解吸电离(MALDI)源、大气压化学电离(APCI)源、大气压光电离(APPI)源。例如，ESI离子源可用作将来自LC柱的离子化样品引入到质量分离器设备中的装置。ESI的几个理想的特性之一在于来自色谱柱的级分可直接从柱进入ESI离子源中。
在多个实施方案中，所述质量分析器系统包含MALDI离子源。在多个实施方案中，将所述合并样品的至少一部分与MALDI基质材料相混合并且利用带有MALDI电离源的质量分析器进行母离子-子离子离子跃迁监测。在多个实施方案中，将合并样品的至少一部分加样到色谱柱上，将洗脱液的至少一部分与MALDI基质材料相混合并利用带有MALDI电离源的质量分析器进行母离子-子离子离子跃迁监测。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含三重四极杆质谱仪，用于选择母离子和检测其片段子离子。在多个实施方案中，第一个四极杆选择母离子。第二个四极杆被维持在足够高的压力和电压下使得发生多次引起一些母离子断裂的低能量碰撞。选择第三个四极杆以将所选的子离子传送到检测器。在多个实施方案中，三重四极杆质谱仪可包括布置在离子源和三重四极杆之间的离子阱。所述离子阱可被设置为收集离子(例如所有离子、具有特定m/z范围的离子等)并在填充时间(fill time)后，通过末端电极施加脉冲而将所选的离子传送到第一个四极杆以允许所选的离子离开所述离子阱。可以例如基于离子数、离子阱内的电荷密度、不同信号肽的洗脱之间的时间、负载周期(duty cycle)、激发态物质或多电荷离子的衰变速率、或其组合来测定所期望的填充时间。
在多个实施方案中，三重四极杆质谱仪中的一个或多个四极杆可被配置为线性离子阱(例如通过加入末端电极以在所述四极杆内提供基本上长圆柱形的捕获体积)。在多个实施方案中，第一个四极杆选择母离子。第二个四极杆被维持在足够高的碰撞气压和电压下使得发生引起一些母离子断裂的多次低能量碰撞。选择第三个四极杆捕获片段离子。经过填充时间后，通过脉冲终电极将所选的离子传送到第一重四极杆以允许所选的离子离开离子阱。可例如基于离子数、离子阱内的电荷密度、不同信号肽的洗脱之间的时间、负载周期、激发态物质或多电荷离子的衰变速率或其组合测定所期望的填充时间。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含两个四极杆质量分离器和TOF质谱仪用于选择母离子和检测气片段子离子。在多个实施方案中，第一个四极杆选择母离子。第二个四极杆被维持在足够高的压力和电压下使得发生多次引起一些母离子断裂的低能量碰撞，TOF质谱仪选择用于检测的子离子，例如通过监测含有目标子离子的质量范围内的离子以及所产生的提取离子色谱、通过使在所选子离子的时间窗之外出现的离子偏转离开检测器、以及通过对所选子离子的到达时间窗的检测器设置时间门控或者它们的组合来进行选择。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统包含两个TOF质量分析器和离子断裂器(例如CID或SID)。在多个实施方案中，第一个TOF选择母离子(例如通过使在所选母离子的时间窗之外出现的离子偏转离开断裂器)以将其引入到离子断裂器中，第二个TOF质谱仪选择用于检测的子离子，例如通过监测含有目标子离子的质量范围内的离子以及所产生的提取离子色谱、通过使在所选子离子的时间窗之外出现的离子偏转离开检测器、通过对所选子离子的到达时间窗的检测器设置时间门控或者它们的组合来进行选择。所述TOF分析器可以是线性分析器的或反射分析器。
在多个实施方案中，所述质谱仪系统含有串联MS-MS仪器，其包含具有定时离子选择器的第一零电场漂移区(first field-free driftregion)以选择目标母离子、断裂室(或离子断裂器)以产生子离子、以及质量分离器以传送所选的子离子用于检测。在多个实施方案中，所述定时离子选择器包含脉冲式离子偏转器。在多个实施方案中，所述离子偏转器可用作脉冲式离子偏转器。所述质量分离器可包括离子反射器。在多个实施方案中，所述断裂室是被设计成引起离子断裂和延迟引出的碰撞室。在多个实施方案中，所述断裂室还可用作延迟引出离子源，其用于通过飞行时间质谱分析所述片段离子。
实施例 还可根据下述实施例进一步理解本教导的各方面，所述实施例不是穷举的，并且不应当以任何方式解释为限制本教导的范围。
实施例1-4 在实施例1-4中，除非另外指明，使用下述材料和方法。
基本上如图19所图示说明的那样将标记试剂加入到两步反应中。第一步在THF(四氢呋喃)溶液中进行。第二步是在四丁基碘化铵(Bu4N+I-)催化剂的存在下在乙酸乙酯(EtOAc)中进行的。
使用Applied Biosystems/MDS Sciex 3200 Q
牌或5000 Q
牌LC/MS/MS系统获得色谱数据和质谱数据。利用氮碰撞气得到MS/MS数据(在约1毫托至10毫托的压力下)。色谱装置包括配有自动进样器、C18反相柱和柱加热器的二元梯度HPLC系统。
表1进一步总结了实施例1-4的各个实验条件，其中化合物名称之前的符号N-M-PIP指被标记分析物。
表1 实施例1-3哌嗪异氰酸酯标记物 实施例1-3显示了有关采用氮碰撞气的CID碰撞能(CE)对利用根据本教导的哌嗪异氰酸酯标记物进行标记的各种分析物的断裂的作用的数据。实施例1显示了被标记雌二醇的数据，实施例2显示了被标记胆固醇的数据；以及实施例3显示了多种被标记维生素D化合物和代谢物的数据。
对被标记分析物进行PDITM，当母离子是实施例1、2和3的被标记分析物时(分别参见例如图21、23和25)，扫描产物离子。图21、23和25还指出了产生实施例1(图22A-C)和实施例2(图24A-B)的质谱中所观察到的多种片段的断裂点(键断裂)。实施例3的图26提供了多种母离子子离子跃迁的信号强度的概况(其中图26中的符号568→158例如表示约568原子质量单位的母离子传输和约158原子质量单位的子离子传输)。图27中的箭头指出了在CE＝45eV时观察到的非常小的184原子质量单位的峰。
实施例3还以图示方式说明了在多个实施方案中哌嗪异氰酸酯标记物可用于测定例如一种或多种样品中的维生素D3及其一种或多种代谢物的浓度。例如，在多个实施方案中，同量异位的哌嗪异氰酸酯标记物组可用于测定根据本教导方法的一种或多种样品中的维生素D3及其一种或多种代谢物的浓度。
实施例4色谱改进 在多个方面，本教导提供了用于改善进行色谱分离的分析物检测限的方法。不受任何理论的约束，相信本教导的被标记分析物的各种实施方案有助于通过减少系统结转(carry over)来改善检测限。
实施例4显示了本发明标记物的多个实施方案促进改善色谱信号的能力。图34比较了利用被标记分析物获得的信号增强，显示出在分析物和被标记分析物浓度的宽范围内有至少一个数量级的增加(图34中的x-轴)。例如在图34中，被标记信号与未标记信号的比大于约12:1。在图34中，实心菱形表示未标记的分析物数据，实心方块表示被标记的分析物数据。
图36和38中仅显示了被标记分析物的数据；图36提供了所监测的MRM跃迁的峰面积和高度的数据。被标记分析物的估计检测限(DL)还显示在了图36和38中。
图35和37比较了被标记分析物和未标记分析物的MRM谱。
实施例5-10质量差异性数据 在下述实施例5-10中，使用具有特定和预定Δ质量的两种质量差异性标签来标记两个含环化合物的样品组(例如，标准物样品和测试样品)，以得到在利用质谱仪分析时可通过Δ质量进行分离的含有修饰环的化合物的衍生物。在多个实施方案中，两个m/z峰的强度的比可得出所述两个样品组中分析物的相对定量。可使用CID产生来自被标记含环化合物的一种或多种报告物离子。来自不同标签的报告物片段的强度的比还可提供有关所述两个样品组中分析物的相对定量的信息。因此，可对分析物例如进行PDITM监测用于鉴定、定量或者鉴定和定量二者。
尽管实施例5-10显示的是关于质量差异性标记物的数据，但是所述方法适用于通过标记物中适当的同位素取代而利用同量异位的标记物。
在实施例5-10中，除非另外指明，使用下述材料和方法。
在含有0.1M的含羟基化合物、1M的DIPEA和0.5M的HATU的DMF(二甲基甲酰胺)溶液中进行标记反应。所述标记试剂含有甲基哌嗪乙酸，所用的具体试剂在多个实施例中说明。
基本上如下进行用于标记反应的活化甲基哌嗪乙酸的制备。称取甲基哌嗪乙酸，向所述甲基哌嗪乙酸中添加2当量的溶于DMF中的1M二异丙基乙胺，旋涡以溶解所述酸。然后添加1当量的溶于DMF中的0.5M HATU，旋涡并放置20分钟。多种甲基哌嗪乙酸标记物的实例以通式(IXa)-(IXl)举例说明。
基本上如下进行含有被标记羟基化含环化合物的制备。制备溶于DMF中的羟基化含环化合物的0.1M溶液。加入3当量的上述制备的活化的甲基哌嗪乙酸并旋涡。使之在室温下反应过夜。干燥并再次溶解在甲醇中以使得浓度为1mg/mL。
使用Applied Biosystems/MDS Sciex 3200 Q
牌或5000 Q
牌LC/MS/MS系统获得色谱数据和质谱数据。利用氮碰撞气得到MS/MS数据(在约1毫托至10毫托的压力下)。色谱装置包括配有自动进样器、C18反相柱和柱加热器的二元梯度HPLC系统。
实施例5雌二醇 下述实施例举例说明被标记(利用质量差异性标签标记)雌二醇的标记和质谱测量。图39A的插入结构举例说明了雌二醇上3位和17位的任何一个羟基或两个羟基均可接受所述质量差异性标记物。
雌二醇来自Sigma Chemical Co.。被标记雌二醇通过与式(IXh)的标签反应而被标记。
图39A示意性地描述了被标记雌二醇样品的色谱。由于雌二醇四环的3位和17位上两个不同的标记可能性，观察到了两个洗脱峰。
图39B和39C分别示意性地描述了在图39A中约5.0分钟和5.3分钟时洗脱液的电喷雾(ESI)质谱。M/Z值为约417的峰与被标记的雌二醇对应。
图39D和39E分别示意性地描述了在图39A中约5.0分钟和5.3分钟时洗脱液的ESI-MS/MS谱。当断裂发生在Y键时，M/Z值为约117的峰与标签的报告物离子对应，如图39D中的插图所举例说明的。当断裂发生在X键时，M/Z值为约159和163的峰与标签的报告物离子对应。
该实施例中的MS数据确认了被标记羟基化含环化合物的质量，MS/MS数据显示了通过CID进行断裂时产生报告物离子以及报告物离子产生的一致性，这通过存在于报告物离子片段信号之中的离子信号的实质部分(即m/z值为约117、159和/或163)来表明。
为了对比，图39F显示了未标记雌二醇的ESI-MS/MS谱。可以看出，未标记雌二醇的断裂是通过多种途径驱动的，这大大降低了MRM的灵敏度。
实施例6睾酮和表睾酮 下述实施例举例说明了被标记(利用质量差异性标签标记)和未标记的睾酮和表睾酮的标记和质谱测量。图40A和41A的插入结构图示说明了17位上的标记。
睾酮和表睾酮来自Sigma Chemical Co.。被标记睾酮和被标记表睾酮是通过与式(IXh)的标签反应而被标记的。
图40A和40B分别比较了被标记和未标记的睾酮的色谱，表明被标记睾酮较早进行洗脱。图40C和40D分别示意性地描述了未标记和被标记的睾酮的ESI-MS/MS谱。当发生断裂时，m/z值为约117的峰与标签的报告物离子对应，如插图所图示说明；当发生断裂时，m/z值为约159和163的峰与标签的报告物离子对应，如图40D中的插图所图示说明。
图41A和41B分别比较未标记和被标记的表睾酮的色谱，表明被标记的表睾酮较早进行洗脱。图41C和41D分别示意性地描述了未标记和被标记的表睾酮的ESI-MS/MS谱。当发生断裂时，m/z值为约117的峰与标签的报告物离子对应，如插图所图示说明；当发生断裂时，m/z值为约163的峰与标签的报告物离子对应，如图41D中的插图所图示说明。
该实施例中的MS数据确认了被标记羟基化含环化合物的质量，MS/MS数据显示通过CID进行断裂时产生报告物离子以及报告物离子产生的一致性，这通过存在于报告物离子片段信号中的离子信号的实质部分(即m/z值为约117、159和/或163)来表明。
实施例7豆甾醇 下述实施例举例说明了被标记(利用质量差异性标签标记)和未标记(未标记)的豆甾醇的标记和质谱测量。图42B的插入结构以图示方式说明了3位上的标记。
豆甾醇来自Sigma Chemical Co.。标记豆甾醇是通过与式(IXh)的标签反应而被标记的。
图42A和42B分别比较了未标记和被标记的豆甾醇的色谱，表明被标记豆甾醇较早进行洗脱。图42C示意性地描述了被标记豆甾醇的ESI-MS/MS谱。当发生断裂时，m/z值为约163的峰与标签的报告物离子对应，如图42C中的插图所图示说明。
该实施例中的MS数据确认了被标记羟基化含环化合物的质量，MS/MS数据显示通过CID进行断裂时产生报告物离子，报告物离子产生的一致性通过存在于报告物离子片段信号中的m/z值为约163的离子信号部分来表明。
实施例8胆固醇 下述实施例举例说明了利用两种质量差异性标签进行被标记(利用质量差异性标签标记)胆固醇的标记和质谱测量。图43A的插入结构图示说明了3位上的标记。
胆固醇来自Sigma Chemical Co.。使用两种不同的标签标记胆固醇，“重”试剂标记的胆固醇(H)是通过与式(IXh)的标签反应而标记的，“轻”试剂标记的胆固醇(L)是通过与式(IXa)的标签反应而标记的。
相应于利用(IXa)标签标记的胆固醇的数据被指定为轻或L，相应于利用(IXh)标签标记的胆固醇的数据被指定为重或H。
图43A示意性地描述了H和L标记的胆固醇的色谱，这两种成分基本上共洗脱。图43B示意性地描述了被标记胆固醇的ESI-MS/MS谱。当断裂发生在X键时，m/z值为约163的峰与标签的报告物离子对应，如图43B中的插图所图示说明。图43C和43D分别比较了H标记的胆固醇和L标记的胆固醇的ESI-MS谱，图43E和43F分别比较了H标记的胆固醇和L标记的胆固醇的ESI-MS/MS谱。
在图43G和43H中可以看出更细微的和更广泛的细节。图43G显示了L标记的胆固醇的ESI-MS谱中更小的部分，而图43H显示了L标记的胆固醇的ESI-MS/MS谱中更大的部分。
该实施例中的MS数据确认了被标记羟基化含环化合物的质量，MS/MS数据显示通过CID进行断裂时产生报告物离子以及报告物离子产生的一致性，这通过存在于报告物离子片段信号中的离子信号的实质部分(即m/z值为约117、159和/或163)来表明。
图43I显示了未标记胆固醇的ESI-MS/MS谱。可以看出，未标记胆固醇的断裂是通过多种途径驱动的，这大大降低了MRM的灵敏度。
实施例9维生素D 下述实施例举例说明了被标记(利用质量差异性标签标记)的胆钙化醇(维生素D3)、被标记的25-羟胆钙化醇(维生素D3的代谢物)的标记和质谱测量。图44A和44B的插入结构图示说明了标记位置。
胆钙化醇和25-羟胆钙化醇来自Sigma Chemical Co.。通过与式(IXa)的标签反应标记胆钙化醇和25-羟胆钙化醇。
图44A和44B分别示意性地描述了被标记胆钙化醇(维生素D3)的ESI-MS谱，图44C和44D分别示意性地描述了被标记胆钙化醇(维生素D3)和被标记25-羟胆钙化醇的ESI-MS/MS谱。
当发生断裂时，m/z值为约159的峰与标签的报告物离子对应，如图44C和44D中的插图所图示说明。
实施例10前列腺素 下述实施例举例说明了被标记(利用质量差异性标签标记)的前列腺素的标记和质谱测量。前列腺素来自Sigma Chemical Co.并通过与式(IXa)的标签反应而进行标记。图45A和45B的插入结构图示说明了标记位置。
图45A示意性地描述了被标记前列腺素的ESI-MS谱，图45B示意性地描述了被标记前列腺素的ESI-MS/MS谱。当发生断裂时，m/z值为约159的峰与标签的报告物离子对应，如图45B中的插图所图示说明。
该实施例中的MS数据确认了被标记羟基化含环化合物的质量，MS/MS数据显示通过CID进行断裂时产生报告物离子以及报告物离子产生的一致性，这通过存在于报告物离子片段信号中的m/z值为约159的离子信号的实质部分来表明。
实施例11-12苯甲酰基异氰酸酯标记物 除非另外指明，在实施例11-12中使用下述材料和方法。
如实施例11和12的图46和49中分别图示说明的那样，基本上在一步式反应中进行标记。
使用Applied Biosystems/MDS Sciex 3200 Q
牌或5000 Q
牌LC/MS/MS系统获得色谱数据和质谱数据。利用氮碰撞气得到MS/MS数据(在约1毫托至10毫托的压力下)。色谱装置包括配有自动进样器、C18反相柱和柱加热器的二元梯度HPLC系统。
在实施例11和12中都观察到钠离子被添加到所有片段中，使基础片段质量变化了约22原子质量单位。在碰撞能范围内观察到122+22＝144原子质量单位的报告物离子，在高于约30eV的碰撞能下，166+22＝188原子质量单位的报告物被实质性地减少。
实施例13-14三甲基铵标记物 除非另外指明，在实施例13-14中使用下述材料和方法。
如实施例13和14的图52和55中所分别图示说明的那样，基本上在两步式反应中添加标记试剂。
基本上如下述实施例13进行被标记分析物化合物的制备。在室温下，向胆固醇(0.65mmol)溶于THF(3mL)中的溶液中添加氯乙酰异氰酸酯(2.6mmol)，通过旋涡混合，然后在50℃加热1小时。然后使反应平衡到环境温度并在水(4mL)和EtOAc(10mL)之间分配。利用25mL Me3N溶液(35％，在EtOH中)处理含有氯乙酰异氰酸酯标记的胆固醇的EtOAc层，允许在环境温度下反应40分钟。然后在旋转蒸发仪中浓缩反应混合物，利用二氯甲烷-甲醇-1％Et3N溶剂系统通过硅胶柱色谱进行纯化。作为氯化物盐被分离的纯化的材料为白色固体。ES-MS计算值M+＝529.44，实测值＝529.40。
基本上如下述实施例14进行被标记分析物化合物的制备。在步骤1中，基本上按照下述方法制备维生素D3的氯乙酰基氨基甲酸盐，向维生素D3(20mg，0.052mmol)溶于无水THF(500μL)的溶液中添加4当量的氯乙酰异氰酸酯(25mg，0.21mmol)。然后将反应混合物在50℃于加热器中加热1小时。此时利用TLC确认反应的完成。利用乙酸乙酯将反应混合物稀释到5mL，加入5mL水。然后将所得混合物振荡2分钟而得到浑浊液。通过离心分离各层。利用Pastuer移液管小心地吸取上面的有机层，利用Na2SO4进行干燥、过滤，将滤液在离心浓缩仪(speedvac)中浓缩。所得的黄色固体不需要进一步纯化而直接用于下一步。
基本上按照下述方法进行步骤2，将来自上一步的粗的维生素D3的氯乙酰基氨基甲酸盐溶解在乙酸乙酯(1ml)中，加入溶于乙醇中的三甲基铵的溶液(24.5mg，99μL，0.42mmol)。然后在室温下搅拌混合物过夜。通过TLC分析等分试样以确认反应完成。然后在离心浓缩仪(speedvac)中浓缩混合物，利用乙醚研磨残余物。离心后倾析出乙醚。在高真空下干燥残余物得到白色固体(24mg，总产率83％)(MS527(M+H))。
使用Applied Biosystems/MDS Sciex 3200 Q
牌或5000 Q
牌LC/MS/MS系统获得色谱和质谱数据。利用氮碰撞气得到MS/MS数据(在约1毫托至10毫托的压力下)。色谱装置包括配有自动进样器、C18反相柱和柱加热器的二元梯度HPLC系统。
实施例13显示了被标记胆固醇分析物的数据。在该实施例的碰撞能范围内，可见在117原子质量单位处的初始报告物离子信号。实施例14显示了被标记维生素D3的数据。在实施例14中，在该实施例的碰撞能范围内，可见初始报告物离子信号也在117原子质量单位处。因此，在117原子质量单位处监测离子信号可起到在利用三甲基铵标记物的多个实施方案中的报告物离子的作用。
实施例15-17 实施例15-17进一步显示了关于标记本教导多个实施方案中羟基化化合物的数据和被标记分析物化合物的断裂数据。在实施例15-17中，使用Applied Biosystems/MDS Sciex 3200 Q
牌或5000 Q
牌LC/MS/MS系统获得色谱和质谱数据。利用氮碰撞气得到MS/MS数据(在约1毫托至10毫托的压力下)。色谱装置包括配有自动进样器、C18反相柱和柱加热器的二元梯度HPLC系统。
实施例15二乙基氨基标记物 基本上如图58所图示说明的那样，在两步式反应中添加二乙基氨基标记试剂，在图59中图示说明了被标记分析物的多种理论断裂，图60A-F中显示了有关断裂的数据。
实施例164-二甲基氨基苯基标记物 基本上如图61所图示说明的那样，在两步反应中添加4-二甲基氨基苯基标记试剂，图62中图示说明了被标记分析物的多种理论断裂，图63A-F中显示了有关断裂的数据。
实施例17N，N-二甲基乙基氨基标记物 将N，N-二甲基乙基氨基标记试剂添加到胆固醇中，图64中图示说明了被标记分析物的多种理论断裂，图65A-F中显示了有关断裂的数据。
为了所有目的，本申请中所引用的所有文献和类似材料包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和网页(不管这些文献和类似材料的形式如何)的全部内容均明确通过引用并入本文。在所并入的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所限定的术语、术语的使用、所描述的技术等)，以本申请为准。
本文所用的章节标题仅仅是为了组织的目的，不应当解释为以任何方式限制本文所述的主题。
虽然已经结合多个实施方案和实施例描述了本教导，但本教导并非旨在局限于这些实施方案或实施例。相反，本领域技术人员应当理解，本教导包含各种替代、变化和等价方式。
除非指明作用，本教导不应当理解为限于所述的顺序或元素。应当理解，在不背离本教导范围的情况下，可做出形式和细节方面的各种变化。通过实例的方式，任何所公开的方法步骤都可与任何其它所公开的步骤相组合以提供用于分析根据本教导多个实施方案的含环化合物的方法。因此，要求保护包含在本教导的范围和精神内的所有实施方案及其等价物。
权利要求
1.标记物组，其包括两种或更多种通式(I)的化合物或其盐或水合物形式
Z-R1(I)，
其中所述标记物组中的一种或多种所述化合物含有一种或多种重原子同位素，以及其中
Z表示取代或未取代的直链、支链或环状烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的氨基；或者取代或未取代的硫代基；
R1表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
X表示Cl、Br、I或乙酰基；以及
R2表示取代或未取代的烷基；取代或未取代的卤代烷基；或者取代或未取代的芳基。
2.权利要求1的标记物组，其中所述标记物组中的一种或多种通式(I)的化合物在同位素方面富集了两种或更多种重原子。
3.权利要求1的标记物组，其中所述标记物组中的一种或多种通式(I)的化合物在同位素方面富集了三种或更多种重原子。
4.权利要求1的标记物组，其中所述标记物组中的一种或多种通式(I)的化合物在同位素方面富集了四种或更多种重原子。
5.权利要求1的标记物组，其中所述重原子同位素各自独立地是13C、15N、18O、33S或34S。
6.权利要求14的标记物组，其中所述标记物是同量异位的非盐形式或非水合物形式，每种所述同量异位的标记物包含一种或多种重原子同位素。
7.权利要求1的标记物组，其中所述非盐形式或非水合物形式的标记物的质量差异小于约0.05个原子质量单位。
8.权利要求1的标记物组，其中所述两种或更多种化合物是通式(IV)的化合物或其盐或水合物形式
9.权利要求8的标记物组，其中R1表示
10.权利要求1的标记物组，其中所述两种或更多种化合物是通式(V)的化合物或其盐或水合物形式
其中
R3表示C、N、O或S；
R4表示氢、直链或支链的C1-C6烷基基团、或者直链或支链的C1-C6烷氧基基团，以及
R5各自独立地表示氢、氘、氟、氯、溴、碘、氨基酸侧链、可任选地含有取代或未取代的芳基基团的直链或支链的C1-C6烷基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子各自独立地与一个或多个氢、氘或氟原子键合。
11.权利要求10的标记物组，其中R1表示
或
12.权利要求10的标记物组，其中所述标记物组中的每种标记物以大于约1原子质量单位的质量差异与所述组中的另一种标记物相区分。
13.权利要求12的标记物组，其中R1表示
14.权利要求10的标记物组，其中R1表示
15.权利要求14的标记物组，其中所述标记物是同量异位的非盐形式或非水合物形式，每种所述同量异位的标记物包含一种或多种重原子同位素。
16.权利要求14的标记物组，其中非盐形式或非水合物形式的标记物的质量差异小于约0.05原子质量单位。
17.权利要求1的标记物组，其中所述两种或更多种通式(I)的化合物是其单TFA盐、单HCl盐、双HCl盐或双TFA盐或其水合物的形式。
18.一种用于标记羟基化化合物的试剂盒，其包括权利要求1的标记物组，以及试剂、容器、缓冲剂和使用说明中的一种或多种。
19.通式(II)的被标记化合物或其盐或水合物形式
其中
A表示在形成被标记化合物之前含有一个或多个羟基的化合物；
Z表示取代或未取代的直链、支链或环状烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的氨基；或者取代或未取代的硫代基；
n表示1至在形成被标记化合物之前A中羟基基团数的整数；
Rx表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
；以及
RY表示与在形成被标记化合物之前含有羟基的A的碳原子形成键的氧原子。
20.权利要求19的被标记化合物，其中所述被标记化合物的Z-RX部分在同位素方面富集了两种或更多种重原子。
21.权利要求20的被标记化合物，其中被标记化合物的Z-RX部分在同位素方面富集了三种或更多种重原子。
22.权利要求21的被标记化合物，其中被标记化合物的Z-RX部分在同位素方面富集了四种或更多种重原子。
23.权利要求20的被标记化合物，其中所述重原子同位素各自独立地是13C、15N、18O、33S或34S。
24.权利要求19的被标记化合物，其中A包括含有多环的化合物。
25.权利要求24的被标记化合物，其中A包括含有四环的化合物。
26.权利要求25的被标记化合物，其中A包括通式(III)的四环
其中所述四环上不与RY成键的一个或多个位置各自独立地被氢、烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基、氰基、烷基芳基或芳族或杂芳族基团取代。
27.权利要求26的被标记化合物，其中RY与3位的碳成键。
28.权利要求26的被标记化合物，其中RY与17位的碳成键。
29.权利要求19的被标记化合物，其中Z-RX具有通式(IIa)结构
30.权利要求29的被标记化合物，其中Rx表示
31.权利要求19的被标记化合物，其中Z-RX具有通式(IIb)结构
其中
R3表示C、N、O或S；
R4表示氢、直链或支链的C1-C6烷基基团、或者直链或支链的C1-C6烷氧基基团，以及
R5各自独立地表示氢、氘、氟、氯、溴、碘、氨基酸侧链、可任选地含有取代或未取代芳基基团的直链或支链的C1-C6烷基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子各自独立地与一个或多个氢、氘或氟原子键合。
32.权利要求31的被标记化合物，其中RX表示
33.权利要求31的被标记化合物，其中RX表示
34.一种利用标记物标记羟基化化合物的方法，其包括以下步骤
使通式(XIIa)的化合物或其盐或水合物形式
L—R1(XIIa)
与羟基化化合物反应，形成通式(XIIIa)的前体被标记化合物
L—RX—RY—A(XIIIa)
以及
使通式(XIVb)的化合物或其盐或水合物形式
ZR8(XIVb)
与所述前体被标记化合物反应，形成通式(II)的被标记化合物或其盐或水合物形式
其中L表示离去基团；
R8表示离去基团、反离子或氢；
A表示在形成被标记化合物之前含有一个或多个羟基的化合物；
Z表示取代或未取代的直链、支链或环状烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的氨基；或者取代或未取代的硫代基；
n表示1至在形成被标记化合物之前A中羟基基团数的整数；以及
Rx表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
；
RY表示与在形成被标记化合物之前含有羟基的A的碳原子形成键的氧原子；
R1表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
X表示Cl、Br、I或乙酰基；以及
R2表示取代或未取代的烷基；取代或未取代的卤代烷基；或者取代或未取代的芳基。
35.一种利用标记物标记羟基化化合物的方法，其包括以下步骤
使通式(I)的化合物或其盐或水合物形式
Z-R1(I)
与羟基化化合物反应，形成通式(II)的被标记化合物或其盐或水合物形式
A表示在形成所述被标记化合物之前含有一个或多个羟基的化合物；
Z表示取代或未取代的直链、支链或环状烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的氨基；或者取代或未取代的硫代基；
n表示1至在形成所述被标记化合物之前A中羟基基团数的整数；
Rx表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
RY表示与在形成所述被标记化合物之前含有羟基的A的碳原子形成键的氧原子；
R1表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
X表示Cl、Br、I或乙酰基；以及
R2表示取代或未取代的烷基；取代或未取代的卤代烷基；或者取代或未取代的芳基。
36.权利要求34和35中的一项或多项的方法，其中所述离去基团是Cl、Br、I或乙酰基。
37.权利要求34和35中的一项或多项的方法，其中所述Z和Rx部分一起在同位素方面富集了两种或更多种重原子。
38.权利要求38的方法，其中所述Z和Rx部分一起在同位素方面富集了三种或更多种重原子。
39.权利要求39的方法，其中所述Z和Rx部分一起在同位素方面富集了四种或更多种重原子。
40.权利要求37的方法，其中所述重原子同位素各自独立地是13C、15N、18O、33S或34S。
41.权利要求34和35中的一项或多项的方法，其中A包括含有多环的化合物。
42.权利要求41的方法，其中A包括含有四环的化合物。
43.权利要求42的方法，其中A包括通式(III)的四环
其中所述四环上不与RY成键的一个或多个位置各自独立地被氢、烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、烷氧基、氰基、烷基芳基或芳族或杂芳族基团取代。
44.权利要求43的方法，其中RY与3位的碳成键。
45.权利要求43的方法，其中RY与17位的碳成键。
46.权利要求34和35中的一项或多项的方法，其中Z-RX具有通式(IIa)结构
47.权利要求46的方法，其中Rx表示
48.权利要求34和35中的一项或多项的方法，其中z-RX具有通式(IIb)结构
其中
R3表示C、N、O或S；
R4表示氢、直链或支链的C1-C6烷基基团或者直链或支链的C1-C6烷氧基基团，以及
R5各自独立地表示氢、氘、氟、氯、溴、碘、氨基酸侧链、可任选地含有取代或未取代的芳基基团的直链或支链的C1-C6烷基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子各自独立地与一个或多个氢、氘或氟原子键合。
49.权利要求48的方法，其中RX表示
50.权利要求48的方法，其中RX表示
51.权利要求34和35中的一项或多项的方法，其中反应步骤包括在偶联剂存在下的反应。
52.权利要求51的方法，其中所述偶联剂包括六氟磷酸盐化合物、四氟硼酸盐化合物以及乙基二乙基氨基丙基碳二亚胺化合物中的一种或多种。
53.一种用于分析一种或多种样品中的一种或多种羟基化化合物的方法，其包括以下步骤
提供标准化合物；
利用来自式(I)的化合物或其盐或水合物形式的标记物组中的标记物
Z—R1(I)
标记所述标准化合物，其中所述标记物组中的一种或多种标记物含有一种或多种重原子同位素；
利用来自所述标记物组中的不同标记物各自标记一种或多种羟基化化合物，以形成被标记的分析物化合物；
将所述被标记标准物化合物的至少一部分与每种被标记分析物化合物的至少一部分合并以产生合并样品；
将所述合并样品的至少一部分加样到色谱柱上；
对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测，其中，
第一被传输的母离子m/z范围包括一种或多种被标记分析物化合物的m/z值，第一被传输的子离子m/z范围包括与被标记分析物化合物的至少一种标签对应的至少一种报告物离子的m/z值；以及
第二被传输的母离子m/z范围包括被标记标准物化合物的m/z值，第二被传输的子离子m/z范围包括与所述被标记标准物化合物的标签对应的报告物离子的m/z值；
测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号；以及
至少基于比较所测的相应报告物离子的离子信号和所测的与所述被标记标准物化合物对应的报告物离子的离子信号，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度；
其中
Z表示取代或未取代的直链、支链或环状烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的氨基；或者取代或未取代的硫代基；
R1表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
X表示Cl、Br、I或乙酰基；以及
R2表示取代或未取代的烷基；取代或未取代的卤代烷基；或者取代或未取代的芳基。
54.一种用于分析一种或多种样品中的一种或多种羟基化化合物的方法，其包括以下步骤
利用来自通式(I)化合物或其盐或水合物形式
Z-R1(I)
的标记物组中的不同标记物各自标记一种或多种羟基化化合物，以形成被标记的分析物化合物，其中所述标记物组中的一种或多种标记物含有一种或多种重原子同位素；
合并每种所述被标记分析物化合物的至少一部分以产生合并样品；
将所述合并样品的至少一部分加样到色谱柱上；
对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测，其中被传输的母离子m/z范围包括一种或多种被标记分析物化合物的m/z值，被传输的子离子m/z范围包括与被标记分析物化合物的至少一种标签对应的至少一种报告物离子的m/z值；以及
测量一种或多种被传输的报告物离子的离子信号；以及
至少基于比较所测的相应报告物离子的离子信号与标准物化合物的浓度曲线，测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度；
其中
Z表示取代或未取代的直链、支链或环状烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的杂芳基；取代或未取代的氨基；或者取代或未取代的硫代基；
R1表示取代或未取代的下列基团
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
或
X表示Cl、Br、I或乙酰基；以及
R2表示取代或未取代的烷基；取代或未取代的卤代烷基；或者取代或未取代的芳基。
55.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述标记物组中的每种标记物是同量异位的非盐形式或非水合物形式，并且每种标记物包含一种或多种重原子同位素。
56.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述标记物组中的每种非盐形式或非水合物形式的标记物的质量差异小于约0.05原子质量单位。
57.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述标记物组中的一种或多种标记物在同位素方面富集了两种或更多种重原子。
58.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述标记物组中的一种或多种标记物在同位素方面富集了三种或更多种重原子。
59.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述标记物组中的一种或多种标记物在同位素方面富集了四种或更多种重原子。
60.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述重原子同位素各自独立地是13C、15N、18O、33S或34S。
61.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述一种或多种样品包括生理性流体。
62.权利要求53的方法，其中所述标准物化合物是非同位素富集的化合物。
63.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述一种或多种羟基化化合物包括一种或多种类固醇。
64.权利要求63的方法，其中所述一种或多种类固醇包括皮质醇、11-去氧皮质醇(化合物S)、皮质酮、DHT、睾酮、表睾酮、去氧甲基睾酮(DMT)、四氢孕三烯酮(THG)、雌二醇、雌酮、4-羟基雌酮、2-甲氧基雌酮、2-羟基雌酮、16-酮基雌二醇、16α-羟基雌酮、2-羟基雌酮-3-甲醚、泼尼松、泼尼松龙、孕烯醇酮、孕酮、DHEA(脱氢表雄酮)、17OH孕烯醇酮、17OH孕酮、17OH孕酮、雄酮、表雄酮、D4A(Δ4雄烯二酮)、豆甾醇以及胆固醇中的一种或多种。
65.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述一种或多种羟基化化合物包括一种或多种形式的维生素D或其代谢物。
66.权利要求65的方法，其中所述一种或多种形式的维生素D包括麦角钙化醇、胆钙化醇、其代谢物和类似物中的一种或多种。
67.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测的步骤包括利用三重四极杆、四极杆/飞行时间质谱仪、线性离子肼质谱仪或串联式飞行时间质谱仪中的一种或多种。
68.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测的步骤包括在基质中混合所述合并样品以及利用基质辅助激光解吸电离产生用于母离子-子离子跃迁监测的离子。
69.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述测定一种或多种被标记分析物化合物的浓度的步骤包括测定一种或多种被标记分析物化合物的绝对浓度。
70.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述标记物组的标记物是通式(IV)的化合物或其盐或水合物形式
71.权利要求70的方法，其中R1表示
72.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述标记物组的标记物是通式(VI)的化合物或其盐或水合物形式
其中
R3表示C、N、O或S；
R4表示氢、直链或支链的C1-C6烷基基团、或者直链或支链的C1-C6烷氧基基团，以及
R5各自独立地表示氢、氘、氟、氯、溴、碘、氨基酸侧链、可任选地含有取代或未取代的芳基基团的直链或支链的C1-C6烷基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子各自独立地与一个或多个氢、氘或氟原子键合。
73.权利要求72的方法，其中R1表示
或
74.权利要求72的方法，其中所述标记物组中的每种标记物以大于约1原子质量单位的质量差异与所述组中的另一种标记物相区分。
75.权利要求74的方法，其中R1表示
76.权利要求72的方法，其中R1表示
77.权利要求53和54中的一项或多项的方法，其中所述标记物组中的一种或多种标记物是单TFA盐、单HCl盐、双HCl盐或双TFA盐或其水合物形式。
78.权利要求54的方法，其中通过以下步骤生成标准物化合物的浓度曲线
(a)提供具有第一浓度的标准物化合物；
(b)利用来自所述标记物组中的标记物来标记所述标准物化合物；
(c)将所述被标记标准物化合物的至少一部分加样到色谱柱上；
(d)对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测，其中，所述被传输的母离子m/z范围包括所述被标记标准物化合物的m/z值，所述被传输的子离子m/z范围包括与所述被标记标准物化合物的标签对应的报告物离子的m/z值；
(e)测量所述被传输的报告物离子的离子信号；
(f)对一种或多种不同的标准物化合物浓度，重复步骤(a)-(e)；以及
(g)至少基于在两种或更多种标准物化合物浓度下所测量的被传输的报告物离子的离子信号生成所述标准物化合物的浓度曲线。
79.权利要求78的方法，其中所述标准物化合物是非同位素富集的化合物。
80.同量异位的标记物组，其包括两种或更多种通式(XIV)的化合物或其盐或其水合物形式，
其中所述同量异位的标记物组中的每种同量异位的标记物含有一种或多种重原子同位素。
81.权利要求80的标记物组，其中所述标记物组中的每种标记物在同位素方面富集了两种或更多种重原子。
82.权利要求80的标记物组，其中所述标记物组中的每种标记物在同位素方面富集了三种或更多种重原子。
83.权利要求80的标记物组，其中所述标记物组中的每种标记物在同位素方面富集了四种或更多种重原子。
85.权利要求80的标记物组，其中所述重原子同位素各自独立地是13C、15N或18O。
86.权利要求80的标记物组，其中所述通式(I)的两种或更多种化合物是单TFA盐、单HCl盐、二HCl盐或二TFA盐或其水合物形式。
87.标记物组，其包括通式(XV)的两种或更多种N-取代的哌啶、哌嗪或吗啉化合物或其盐或水合物形式，
其中
R9表示卤化物、-OH或-OC(＝O)R11，其中R11是氢或直链或支链的烷基基团；
R10表示C、N或O；
R4表示氢、直链或支链的C1-C6烷基基团、或者直链或支链的C1-C6烷氧基基团，以及
R5各自独立地表示氢、氘、氟、氯、溴、碘、氨基酸侧链、可任选地含有取代或未取代的芳基基团的直链或支链的C1-C6烷基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子各自独立地与一个或多个氢、氘或氟原子键合；
其中所述标签组中的一种或多种化合物包含一种或多种重原子同位素。
88.权利要求87的标记物组，其中所述重原子同位素各自独立地是13C、15N、18O、33S或34S。
89.权利要求87的标记物组，其中R9表示-OH。
90.权利要求87的标记物组，其中R9表示氯或氟。
91.权利要求87的标记物组，其中R9表示-OC(＝O)R11，其中R11是氢或者直链或支链的烷基基团。
92.权利要求87的标记物组，其中R11表示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
93.权利要求87的标记物组，其中R10表示氮。
94.权利要求87的标记物组，其中R4表示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
95.权利要求87的标记物组，其中R5各自独立地表示氢、甲基或甲氧基。
96.权利要求87的标记物组，其中所述两种或更多种N-取代的哌啶、哌嗪或吗啉化合物是通式(XVI)的化合物
97.权利要求96的标记物组，其中R4表示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
98.同量异位标记物组，其包括通式(XVII)的两种或更多种N-取代的哌啶、哌嗪或吗啉化合物或其盐或水合物形式，
其中所述同量异位标记物组中的每种同量异位标记物包含一种或多种重原子同位素，并且其中
R10表示C、N或O；
R4表示氢、直链或支链的C1-C6烷基基团、或者直链或支链的C1-C6烷氧基基团，以及
R5各自独立地表示氢、氘、氟、氯、溴、碘、氨基酸侧链、可任选地含有取代或未取代的芳基基团的直链或支链的C1-C6烷基基团，其中所述烷基和芳基基团的碳原子各自独立地与一个或多个氢、氘或氟原子键合。
99.权利要求98的标记物组，其中所述标记物组中的每种标记物在同位素方面富集了四种或更多种重原子。
100.权利要求98的标记物组，其中所述重原子同位素各自独立地是13C、15N或18O。
101.权利要求98的标记物组，其中R12表示＝C＝O。
102.权利要求98的标记物组，其中R10表示氮。
103.权利要求98的标记物组，其中R4表示甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
104.权利要求98的标记物组，其中R5各自独立地表示氢、甲基或甲氧基。
105.权利要求98的标记物组，其中所述两种或更多种N-取代的哌啶、哌嗪或吗啉化合物是通式(XVIII)的化合物
106.权利要求105的标记物组，其中R4是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
107.一种用于分析两种或更多种样品中的一种或多种含有类固醇的化合物、含有甾醇的化合物或其类似物的方法，其包括以下步骤
向一种或多种目标样品的每种样品中添加来自质量区别性标签组中的不同质量区别性标签以提供被标记样品，使得标签标记一种或多种目标样品中的一种或多种含有类固醇的化合物，以产生通式(XI)的被标记类固醇
RP-BX-LG-O-BY-AR(XI)，
其中RP是质量区别性标签的报告物部分，LG是连接基团，O是氧，AR是含类固醇化合物、含甾醇化合物、或者其类似物的含环化合物，其中BX表示RP和LG的原子之间的键，BY表示氧O和在标记反应之前被羟基化的A的碳之间的键；
合并每种被标记样品的至少一部分以提供合并样品；
将所述合并样品的至少一部分加样到色谱柱上；
对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；其中
给定的被标记含类固醇化合物的被传输的母离子m/z范围包括一种或多种所述被标记含环化合物的m/z值，第一被传输的子离子m/z范围包括与被标记含类固醇化合物的至少一种标签对应的至少一种报告物离子的m/z值；以及
检测一种或多种所述被传输的报告物离子的离子信号；以及
至少基于比较所测的相应报告物离子的离子信号和所测的与标准物化合物对应的报告物离子的离子信号，测定一种或多种被标记含类固醇化合物的浓度。
108.权利要求107的方法，其还包括在色谱柱上分离一种或多种被标记含类固醇化合物的步骤。
109.权利要求107的方法，其中所述测定一种或多种被标记含类固醇化合物的浓度的步骤包括测定一种或多种类固醇的绝对浓度。
110.权利要求107的方法，其中所述测定一种或多种被标记含类固醇化合物的浓度的步骤包括测定两种或更多种类固醇之间相对浓度的变化。
111.权利要求107的方法，其中一种或多种目标样品包括含有一种或多种标准物化合物的标准物样品，其中所测的与标准物化合物对应的报告物离子的离子信号对应所测的所述标准物样品中一种或多种被标记标准物化合物的报告物离子信号。
112.权利要求111的方法，其中所述标准物样品包括对照样品、参比样品或者对照样品和参比样品二者。
113.一种用于分析两种或更多种样品中的一种或多种含类固醇化合物、含甾醇化合物或其类似物的方法，其包括以下步骤
向一种或多种目标样品的每种样品中添加来自质量区别性标签组中的不同质量区别性标签以提供被标记样品，使得标签标记一种或多种目标样品中的一种或多种含类固醇化合物，以产生通式(XI)的被标记类固醇
RP-BX-LG-O-BY-AR (XI)，
其中RP是同量异位的标签的报告物部分，LG是连接基团，O是氧，AR是含类固醇、含甾醇化合物、或者其类似物的含环化合物，其中BX表示RP和LG的原子之间的键，BY表示氧O和在标记反应之前被羟基化的A的碳之间的键；
合并每种被标记样品的至少一部分以提供合并样品；
将所述合并样品的至少一部分加样到色谱柱上；
对来自色谱柱的洗脱液的至少一部分进行母离子-子离子跃迁监测；其中
给定的被标记含类固醇化合物的被传输的母离子m/z范围包括一种或多种所述被标记含环化合物的m/z值，第一被传输的子离子m/z范围包括与被标记含类固醇化合物的至少一种标签对应的至少一种报告物离子的m/z值；以及
检测一种或多种被传输的报告物离子的离子信号；以及
至少基于比较所测的相应报告物离子的离子信号和所测的与标准物化合物对应的报告物离子的离子信号，测定一种或多种被标记含类固醇化合物的浓度。
114.权利要求113的方法，其还包括在色谱柱上分离一种或多种被标记含类固醇化合物的步骤。
115.权利要求113的方法，其中所述测定一种或多种被标记含类固醇化合物的浓度的步骤包括测定一种或多种类固醇的绝对浓度。
116.权利要求113的方法，其中所述测定一种或多种被标记含类固醇化合物的浓度的步骤包括测定两种或更多种类固醇之间相对浓度的变化。
117.权利要求113的方法，其中一种或多种目标样品包含含有一种或多种标准物化合物的标准物样品，其中所测的与标准物化合物对应的报告物离子的离子信号对应所测的所述标准物样品中一种或多种被标记标准物化合物的报告物离子信号。
118.权利要求117的方法，其中所述标准物样品包括对照样品、参比样品或者对照样品和参比样品二者。
全文摘要
本教导在多个方面提供了用于羟基化化合物的相对定量、绝对定量或者相对定量和绝对定量二者的标记试剂和标记试剂组，所述羟基化化合物包括但不限于含羟基化环的化合物、类固醇和甾醇。本教导还在多个方面，提供了通过MS/MS法分析羟基化化合物(包括但不限于含羟基化环的化合物、类固醇和甾醇)的方法。
文档编号C40B30/10GK101454488SQ200780019323
公开日2009年6月10日 申请日期2007年5月29日 优先权日2006年5月26日
发明者苏巴西什·普尔卡亚斯塔 申请人:阿普里拉股份有限公司