专利名称：原位构建基因突变文库的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质工程、分子生物学技术、基因工程领域，具体涉及一种原 位构建基因突变文库的方法，以及用这种方法构建1至多级突变文库的试剂盒。
背景技术：
体外定向进化不仅为研究酶的底物特异性和确定酶的催化活性位点，改善酶 的热稳定性等方面提供了强有力的手段，而且有助于了解蛋白结构与功能之间的 关系。定向进化策略主要是体外模拟自然进化过程，快速，高效地建立一个随机 突变的基因文库，这已成为蛋白质工程研究的重要措施。
易错PCR是构建基因突变文库的一种基本方法，其原理是在PCR过程中通 过调整Mg^和Mn^浓度等因素，提高r叫酶在扩增过程中引入错配碱基的频 次，导致目标基因的扩增产物发生适量的随机突变(Kammann e ，Nucleic Acids Res. 1989, 17(13): 5404)。早期的通过易错PCR构建突变文库的步骤包括1)以 目标基因为模板在易错条件下进行扩增出含有错配碱基的突变基因；2)用限制 性内切酶对突变基因进行末端处理；3)用DNA连接酶将突变基因连接到表达载 体上；4)将重组的表达载体导入宿主细胞，获得带有各种不同突变基因的重组 细胞群体，即基因突变文库。这个过程相当于对目标基因进行了再一次克隆或称 亚克隆，所不同的是亚克隆只需要获得几个转化子，而一个基因随机突变文库需 要从成千上万个转化子，才能从中筛选出目标突变子。
随着现代科技的发展，早期发明的突变文库的构建方法显现出步骤烦琐和效 率低等问题。为了提高构建基因突变文库的效率，Miyazaki和Takenouchi于2002 年提出大引物扩增法(Biotechniques， 33(5): 1033-1036)，对上述方法中的第2 步和第3歩进行了替换以随机突变后的目标基因为大引物，以表达质粒为模板， 采用高保真DNA聚合酶进行PCR，扩增出质粒的全长片断；再用Z^" I的处理， 将模板质粒降解。这样产生的含有突变基因的双链质粒，避免了限制性内切酶处 理过程和突变基因与表达载体的连接过程。
大引物扩增法使构建基因突变文库的效率提高了一些，但是其中仍然有很多不足之处，例如，其中所使用的大引物是特定基因的突变群体，不具有通用性； 只有当大引物大小在500-1000 bp才能获得较好的扩增效果，突变基因的大小受 到限制；大引物扩增出来的是线性DNA，在退火时难以形成两个缺口的环状质 粒，转化效率低；大引物诱变方法同样需要对PCR产物进行酶切，对质粒模板 进行消化，步骤烦琐。因此，构建基因突变文库需要有简便、快捷、具有通用性 的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种原位构建基因突变文库的方法，以及用于方便实施 该方法的试剂盒。
本发明涉及用于原位构建基因突变文库的方法和试剂盒，所说的原位构建基 因突变文库的方法，其步骤是
(1) 将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成基因表 达质粒，并将基因表达质粒导入大肠杆菌，确认目标基因在大肠杆菌中得到表达；
(2) 以基因表达质粒为模板，用选择标记不同于基因表达质粒的载体片断 作引物，加入极耐热性DNA连接酶、7邵DNA聚合酶和PCR缓冲液(含dNTP， MgCl2)， MnCl2禾P NAD+等；
(3) 在全自动PCR仪中进行易错PCR和连接反应；
(4) 用PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，并在与引物所带的选择标记相 应的抗性平板上，选择性地培养含突变基因的转化子，获取含正突变基因的重组 质粒。
本发明的试剂盒含有 一种含pUC18/19复制基因的大小为2. 2至3 kb基因 高效表达载体；极耐热性DNA连接酶；与高效表达载体相应的带有不同抗性基 因的线性载体片段。
本发明方法的原理如图l所示，(a)在初次循环中，以带有抗性基因A(如 amp，氨苄青霉素抗性基因)的基因表达质粒为模板，带有抗性基因B (如kan， 卡那霉素抗性基因)的线性载体片段为引物，对模板中的目标基因或部分目标基 因在易错条件下进行聚合酶聚合反应，聚合完成后随即被DNA连接酶连接成环 状DNA，并进入下一个热循环；(b)易错PCR完成后，用PCR反应液转化大肠 杆菌细胞，并在与抗性基因B相应的抗生素平条件下筛选；(c)再以正突变子 中的带有抗性基因B质粒为模板，带有抗性基因A的线性载体片段为引物，进行下一轮突变和筛选(d)。
本发明的特点在于极耐热性DNA连接酶在PCR过程中介导扩增片段的环 化，产生的环状质粒可直接用于基因转化；在小型表达载体中以高保真性的线性 载体片段为引物，对表达质粒中的目标基因进行局部易错PCR;通过不同的筛选
标记选择性地培养含突变基因的转化子，达到基因突变产物与原始模板分离。
上述原位构建基因突变文库的方法步骤(1)和步骤(4)中涉及的目标基
因的克隆、大肠杆菌的基因转化等相关操作均按《分子克隆手册》第三版上的标
准方法进行的(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
上述原位构建基因突变文库的方法步骤(2)中MnCl2的浓度与易错PCR的 突变频率相关，推荐浓度范围为0.05 0.5mM，建议对小于1 kb的目标基因采 用较高的MnCl2浓度，对大于1 kb的基因适当降低MnCl2的浓度。极耐热性DNA 连接酶和NAD+按实施例中的用量使用；其它酶和试剂的浓度按常规PCR条件 使用。
上述原位构建基因突变文库的方法步骤(3)中，连接反应和PCR反应同步 进行，建议参考实施例提供的反应温度设定热循环程序。
上述步骤原位构建基因突变文库的方法(4)突变子的筛选方法因目标基因 性质而异，与本发明的技术没有直接关系。突变子中，基因产物的性状表现为向 所期望的目标性状转变的突变称为正突变。
从所获得的目标突变子中提取的含正突变基因的重组质粒可以被再次用作 模板，立即进入新一轮的随机突变和筛选(图l)。
所说的"原位"指对已经被插入表达载体的目标基因构建基因突变文库的过 程中不需要进行再次克隆。试剂盒EvoGen Kit为用该方法构建基因突变文库提 供了所需要的各种试剂和引物，其中包括普通制剂和特征性制剂。普通制剂包括 常规PCR所需要的DNA聚合酶和含dNTP和Mg"的PCR缓冲液、连接反应需要的 NAD+溶液，以及诱变所需要的MnCl2溶液。
本发明方法和试剂盒中，所使用的特征性制剂及其制备方法如下 (1)所说的表达载体是从pUC18/19改建的大小为2. 2至2. 5 kb基因高效 表达载体。本方法推荐使用pHsh系列的受cr32或(77()识别的表达载体，因为它 们分别带三种不同抗性基因，而且可根据需要选择分泌型表达、低温或无诱导表 达。pHsh系列表达载体的性质参见国际专利文献WO 2006/002574 Al和美国专利 文献US-2007-0254335-A1;其基因序列参见基因库资料(GenBank accession No.FJ571619, FJ571620， FJ571621， FJ715938， Fj715939)。
(2) 所说的极耐热性DNA连接酶是从嗜极端高温的细菌或古菌克隆和异源 表达的DNA连接酶，建议选用海栖热袍菌(77 er7z "o卵/z7arj'ti'鹏)热稳定性DNA 连接酶，其制备方法是用一对引物(5'-CTTCATATGAGTGAGAGAAAGAT C-3'禾n 5'-ACAAAGCTTACTCCATTCCTTCCAAC陽3')，从海栖热袍菌基因 组中扩增DNA连接酶基因(GenBank accession No: NC_000853)，克隆到表达载 体pET-20b(+) (Novagen, Darmstadt Germany)，构建成重组质粒pET-//gaw，导 入￡ co//JM109(DE3)中进行表达，并纯化出重组酶(图2)。具体操作参考《分 子克隆手册》第三版上的标准方法(Sambrook and Russell,2001,CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
(3) 表达载体线性片段试剂盒提供两种带有不同选择标记的表达载体片
段，其制备方法是分另ll以pHsh-amp、 pHsh-fe "或pHsh-c必 (GenBank accession No. FJ571619, FJ571620, FJ571621)为模板，用一对磷酸化的引物(5，-pCCTCC ATGGG TATAT CTCCT T-3'和5'—pAAGCT TGA AG GCCGC TTCCG A-3，)，并采
用高保真性的户,o6eWDNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。
本发明的有益效果体现在
(1) 原位随机突变，效率高，操作方便极耐热性DNA连接酶介导的环状
质粒扩增，省略了限制性酶切、连接等繁琐且降低效率的操作；
(2) 可进行大范围的突变目标基因的大小不影响突变效果，还可以根据 具体要求制备线性表达质粒的片段，对目标基因中的特定区域进行随机突变；
(3) 对突变体具有选择性通过不同的筛选标记选择性地培养含突变基因 的转化子，将基因突变产物与原始模板分离，便于平板筛选和高通量筛选；
(4) 材料与方法具有通用性 一套试剂适用于各种目标基因；
(5) 便于进行多级随机突变从筛选到的目标突变子中提取的含正突变基 因的重组质粒，可以用作模板直接进入突变文库的再次构建，通过筛选获得2 级或多级累加的正突变。
图l.原位随机突变原理示意图。
图2.海栖热袍菌热稳定性DNA连接酶的表达和纯化的电泳分析。聚丙烯 酰氨凝胶电泳图中，泳道M:蛋白分子量标准；泳道l:含pET-20b的大肠杆菌
JM109(DE3)的胞内全蛋白；泳道2:从含pET-//gaw的大肠杆菌JM109(DE3)提 取的粗酶液；泳道3:粗酶液经过75'C热处理和离心；泳道4: His-tagged亲和 层析后获得的纯酶。
图3.实施例1中的易错PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳分析。
M, DNA分子量标准；1 ,空白对照，不加Tm DNA ligase和ra《DNA聚合酶 的PCR反应；2,不加Tm DNA ligase，力P T叫DNA聚合酶的PCR反应；3和4， 加入Tm DNA ligase和T叫DNA聚合酶的PCR反应。
图4.实施例1中的易错PCR产物转化到宿主大肠杆菌中，突变子在含有 木聚糖的LB平板上生长。
图5.实施例2易错PCR产物转化到宿主大肠杆菌中，突变子在含有羧甲 基纤维素(CMC)的LB平板上生长。
具体实施例
下面结合具体的实施例及附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施 例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术 人员通常理解的含义；实施例中未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的 常规方法，可参考《分子克隆手册》第三版上的标准方法(SambrookandRussdl， 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York);所用特征性制剂在发明内容部 分已经描述，其它常规试剂的来源、商品名以及有必要列出组成成分者，均在首 次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
以下实施列中涉及的pHsh系列载体，由发明人实验室构建保存；公众可从 发明人实验室获取，也可根据现有技术自行构建。
实施例l:疏棉状嗜热丝孢菌(77iw附(w^ces/做"g/"仍附)木聚糖酶基因突变文
库的构建和筛选(1) 根据疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶基因序列(GenBank: U35436)合成 编码成熟肽的完整基因，并插入带有氨苄青霉素抗性基因的表达载体pHsh-amp 构建成重组表达质粒pHsh-Jcy"J，具体方法参见Yin Erkang等(World J Microbiol Biotechnol， 2008, 24: 275-280)。
(2) 以pHsh-:c""为模板，选用带有卡那霉素抗性基因的线性载体片段为 引物，配制以下PCR反应体系(20pl):
线性载体片段1 pi
热稳定性DNA连接酶1 pi
质粒模板(pHsh-x，J)1 pi (30 ng尔l)
10 mM MnCl20.8 pi
10xPCR buffer2 pi
10 mM NAD+ (sigma公司)1 ^
ddH2012.8 pi
ra《DNA聚合酶(TaKaRa)0.4 pi ( 0.5 U )
(3) PCR扩增，循环程序为95°C， 5min; (94°C， 1 min, 72°C， 1.5 min 和60°C， 2 min) X15循环；60。C延伸10 min。 PCR完成后对产物进行琼脂糖 凝胶电泳分析(图3)。结果表明，在同时加入r叫DNA聚合酶和TmDNAligase 的PCR反应中，环状质粒条带中DNA量有明显的提高。
(4) PCR产物转化￡ JM109感受态细胞(Promega Corp., Madison, WI, USA),涂布在含有2%木聚糖和卡那霉素的LB培养基平板上，置37匸温箱中 培养(图4)，菌落周围的透明圈的大小表明基因突变导致木聚糖酶活性发生很 大的变化。
实施例2:海栖热袍菌纤维素酶基因突变文库的构建和筛选
试剂盒由8种试剂组成热稳定性连接酶、2种线性载体片段、表达载体
pHsh、 Tag DNA聚合酶、10 mM MnCl2、 10 mM NAD+、 10xPCR buffer (含 MgCl2和dNTP)。
使用上述试剂盒构建海栖热袍菌纤维素酶CdB基因突变文库的方法如下 (1)根据海栖热袍菌纤维素酶CelB的基因序列(GenBank Accession No.NC—000853)设计引物(5'-GGGCT CGAGT TATTT TACAA CTTCG ACAG -3' 禾口 5，- CTAGC GTTGG TGCAACGGAC -3，)，以海栖热袍菌基因组DNA为模板， 扩增出除信号肽以外的全部编码基因，按照标准的分子克隆方法将基因插入带有 卡那霉素抗性基因表达载体pHsh-kan，构建成重组表达质粒pHsh-ce/S。
(2)以pHsh-cdS为模板、带有氨苄青霉素抗性基因的线性质粒片段为引物，
建立以下PCR反应体系
线性载体片段 1 nl
热稳定性DNA连接酶 1 ^
质粒模板(pHsh-x;%4) 1 pl (30 ng/^il)
10mMMnCl2 0.4^1
10xPCR buffer 2 |ul
10 mM NAD+ (sigma公司) 1
ddH20 13.2 (il
T叫DNA聚合酶(TaKaRa) 0.4 pi ( 0.5 U )
(3) PCR扩增程序为95°C， 5min; (94°C， lmin,72。C， 1.5min和60。C， 2min) X20循环;60。C延伸10min。
(4) PCR产物转化￡.co// JM109感受态细胞，涂布在含有氨节青霉素和2.5% 羧甲基纤维素的LB平板上，置于4(TC温箱中培养。生长的菌落释放纤维素酶， 对培养基中羧甲基纤维素进行降解；酶活性的强弱体现于菌落周围凹陷圈的大小
(图5)。
(5) 以pHsh-Ce/S转化子作对照，从凹陷圈明显增大的菌落挑取细胞接种， 提取质粒进行分析和验证。确认正突变后命名为pHsh-ce/S-ml。
实施例3:海栖热袍菌纤维素酶基因"仿的2级随机突变和筛选 以实施例2中得到的含1级正突变基因的质粒pHsh-"W-ml为模板，重复实施 例2中的步骤(2)至(5)，所不同的是步骤(2)中换以带有卡那霉素抗性基因 的线性质粒片段为引物；步骤(4)中的培养基平板换为含有卡那霉素而不是氨 苄青霉素LB平板。正突变得到确认后命名为pHsh-ceW-m2。
权利要求
1. 一种原位构建基因突变文库的方法，(1)将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成重组质粒，并将重组质粒导入大肠杆菌，确认目标基因在大肠杆菌中得到表达；(2)以重组质粒为模板，用选择标记不同于重组质粒的载体片断作引物，加入极耐热性DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液；(3)在全自动PCR仪中进行易错PCR和连接反应；(4)用PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，并在与引物所带的选择标记相应的抗性平板上，选择性地培养含突变基因的转化子，获取含正突变基因的重组质粒。
2. 根据权利要求1所说的原位构建基因突变文库的方法，其特征在于，步 骤(1)中所说的表达载体是从pUC18/19改建产生的载体。
3. 根据权利要求2所说的原位构建基因突变文库的方法，其特征在于，所 说的表达载体是从pUC18/19改建产生的载体，是pHsh系列载体。
4. 根据权利要求1或3所说的原位构建基因突变文库的方法，其特征在于， 步骤(1)中所说的极耐热性DNA连接酶是海栖热袍菌热稳定性DNA连接酶。
5. —种应用权利要求1的方法构建基因突变文库的试剂盒，其特征在于， 该试剂盒含有(1) 一种带有抗性基因的表达载体；(2) 极耐热性DNA连接酶；(3) 与表达载体相应的带有不同抗性基因的线性载体片段。
6. 根据权利要求5所说的原位构建基因突变文库的方法，其特征在于，(1) 中所说的表达载体是从pUC18/19改建产生的载体。
7. 根据权利要求6所说的原位构建基因突变文库的方法，其特征在于，所 说的表达载体是从pUC18/19改建产生的载体，是pHsh系列载体。
全文摘要
本发明为基因定向进化提供一种快速、通用的原位构建基因突变文库的新方法，以及应用该方法构建基因突变文库的试剂盒。该方法具有以下特点(1)极耐热性DNA连接酶在PCR过程中介导环状质粒的扩增；(2)在小型表达载体中对目标基因或部分目标基因进行原位易错PCR；(3)以不同的筛选标记将随机突变基因与原始模板分离；(4)一套试剂适用于各种目标基因，并且便于对筛选到的正突变基因再次构建突变文库，通过筛选获得多级累加的正突变。试剂盒EvoGen Kit为用该方法构建基因突变文库提供了所需要的各种试剂。
文档编号C40B50/06GK101532181SQ20091002592
公开日2009年9月16日 申请日期2009年3月13日 优先权日2009年3月13日
发明者乐易林, 裴建军, 邵蔚蓝 申请人:南京师范大学