专利名称：检测侵袭性真菌致病菌的基因芯片和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测九种常见侵袭性致病真菌的基因芯片和检测用试剂盒。
技术背景
近年来，由于抗生素、激素、免疫抑制剂和肿瘤放疗化疗的广泛应用，各种体内留 置管、人工瓣膜等的大量使用，以及艾滋病(AIDS)的增多，侵袭性真菌感染发病率有明显 上升的趋势，并且已成为危重病人死亡的重要原因之一。在美国，1990年住院患者深部真菌 感染率是1980年的1. 9倍，居各种病原体感染率上升之首位，2004年报道住院患者侵袭性 真菌感染率是20世纪90年代的2. 4倍，病死率为29%;在欧洲，1983 1997年间，侵袭性 真菌感染死亡患者占所有死亡患者的5. 1 %，而1998 2002年间由侵袭性真菌感染导致死 亡的患者占到了 7.8% ；在中国，北京协和医院1998年6月 1999年6月调查I⑶282例 患者中有53例发生深部真菌感染，感染率为18.8%，比1993年的5. 6%上升了 3. 4倍。侵袭性真菌感染多发生在医院内，主要由念珠菌、隐球菌等所致。其中，念珠菌是 血液系统感染的主要致病菌，由其导致的败血症病死率最高。在医学上常见的念珠菌除了 最常见的白色念珠菌外，近年来随着新一代抗真菌药物的应用，光滑假丝酵母，克柔假丝酵 母和热带假丝酵母等真菌造成的感染也日益增多。经研究发现，这些不同种类的假丝酵母 对抗生素敏感性存在差异。念珠菌感染是一种人类的机会感染，它可以急性或慢性感染的 形式发生。对口部粘膜的慢性增生性念珠菌疾病的研究是相当重要的，因为它与鳞状细胞 癌的发生有关。除了表面器官损伤以外，像心脏内膜炎和食道炎，深部念珠菌感染疾病，很 可能发生在免疫缺陷的个体中。对念珠菌的研究，很少将其鉴定到种的水平。在慢性增生性念珠菌病例中，研究仅 限于通过观察病变组织中念珠菌的菌丝来辨别菌种。人们已经认识到念珠菌菌种和亚种在 致病能力上存在很大差异。对念珠菌临床菌株进行鉴定和分类的传统方法包括形态学、生 物化学分析、菌落形态学分析、抗性分析以及血清学分类，这些方法很费时，而且依赖表型 特征，所以他们的可靠性不是很高。依靠基因的不同进行菌种检测是另一种可行的方法，基 因型分析方法已被用在念珠菌菌株的分类和检测中，但是并不常用在种的分类中。隐球菌的主要致病类型是新型隐球菌，隐球菌感染是艾滋病常见的并发症，发生 隐球菌脑膜炎后治愈率极低。隐球菌属包括许多种，其中新生隐球菌被认为是唯一的一种 人类病原体。新生隐球菌首先侵入肺中，然后通过血流扩散到达大脑和脑膜。在未被HIV感 染的隐球菌病患者中，特别是隐球菌引起的脑膜炎患者，经常有像红斑狼疮、肉状瘤病、白 血病、淋巴瘤、库欣综合症等一系列并发症出现。新生隐球菌病是一种经常与AIDS相伴的 疾病。新生隐球菌病和血清性感染迹象可以作为感染AIDS的一个判断依据。在将近45% 的AIDS患者中，新生隐球菌病经常被用于诊断AIDS。肺部新生隐球菌病的患者通常是很难 被诊断。诊断通常只能依靠检测肺部组织切片来完成，为了实现真菌的快速和简单的检测 需要更加灵敏和特异的方法。其中一种方法是检测血清中的抗原，然而，检测新生隐球菌抗 原的血清方法具有假阳性的缺点。在实验室中，诊断真菌感染经常很困难。培养从病人的尿液，血液以及唾液获得的样品经常很困难。在评价实验结果时，还要考虑到可能的污染问 题。近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括间区基 因序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP) 分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经 过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。生物芯片作为一种病原体分子检测技术具有高通量、快速、准确、可靠的特点，能 够实现对组群样品、多目标的同时检测，极大的提高检测效率。
发明内容
本发明的一个目的是将基因芯片技术应用于侵袭性真菌的检测，利用生物芯片高 通量、快速、灵敏、特异性好的特点，提高侵袭性真菌的检测速度、通量和灵敏度，大大降低 成本，缩短检测时间。 本发明所述的检测侵袭性真菌致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相 载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或 多种序列a.从白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵 母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的rDNA的18S-5. 8S或 5. 8S-28S内转录间区(ITS)、5· 8S rDNA选取的一种或多种DNA序列； b.所述a中选取的DNA序列的互补DNA序列；c. a或b中所述的DNA序列的互补RNA序列。本发明的一优选实施例中，上述a中从白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵 母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新 生隐球菌的rDNA的18S-5. 8S或5. 8S-28S内转录间区(ITS)、5. 8S rDNA选取的DNA片段 具有SEQ ID NO 3-38、除去其中的5、16的核苷酸序列中的一种或多种。本发明所述的基因芯片，还包括阳性对照探针、阴性探针和荧光探针。本发明的优选实施例中，上述阳性对照探针选自上述白色念珠菌、近平滑假丝酵 母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也 蒙假丝酵母、新生隐球菌的5. 8S rDNA序列。本发明的优选实施例中，上述阳性对照探针具有SEQ ID NO :16所示的核苷酸序 列。本发明所述的基因芯片可用于检测白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、 乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母或新生 隐球菌。本发明还提供一种检测侵袭性真菌的试剂盒，其包含上述的基因芯片，具体地，该 基因芯片可以包含具有SEQ ID N0:3-38、除去其中的5、16的核苷酸序列中的一种或多种 的寡核苷酸探针。本发明所述的试剂盒可应用于检测白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、 乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母或新生隐球菌。由上述的技术方案可见，本发明将特异rDNA间区序列与基因芯片技术相结合，建 立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、 乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐 球菌检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测九种侵袭性真菌致 病菌目的。本发明提供的检测侵袭性致病真菌的基因芯片，检测范围内的九种致病菌为白色 念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵 母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌，以弥补针对真菌检测技术存在的费时耗 力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点 能更明显易懂，下面特举较佳实施例， 并配合说明书附图，作详细说明如下。
图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图；图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图；图3A为利用本发明的基因芯片检测白色念珠菌时的杂交结果；图3B为利用本发明的基因芯片检测乳酒假丝酵母时的杂交结果；图3C为利用本发明的基因芯片检测热带假丝酵母时的杂交结果；图3D为利用本发明的基因芯片检测近平滑假丝酵母时的杂交结果；图3E为利用本发明的基因芯片检测克鲁斯假丝酵母时的杂交结果；图3F为利用本发明的基因芯片检测葡萄牙假丝酵母时的杂交结果；图3G为利用本发明的基因芯片检测季也蒙假丝酵母时的杂交结果；图3H为利用本发明的基因芯片检测新生隐球菌时的杂交结果；图31为利用本发明的基因芯片检测光滑假丝酵母时的杂交结果；图3J为利用本发明的基因芯片检测异常毕赤酵母时的杂交结果。
具体实施例方式实施例1探针的设计和制备核糖体DNA序列存在于所有的生物体内，在进化过程中具有相同的起源与功能， 可以反映物种间具有可比性的进化史。rDNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)是真核细胞rDNA中18S和28S rDNA基因拷贝区之间的一段区域，其中5. 8S rDNA位于ITS1、ITS2之间。5. 8SrDNA的核苷酸序列保守性很强，而ITSl和ITS2进化较 快，但种间同源性非常小，而种内同源性很高，可用于种间的鉴定。1.序列获得(1)18S-28S间区基因序列的获得从GenBank公共数据库分别下载得到白色念珠 菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光 滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的18S-28S间区基因序列。(2)5. 8S rDNA基因序列的获得从GenBank公共数据库分别下载得到白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光 滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的5. 8S rDNA基因序列。2.探针设计(1)特异基因探针将上述从GenBank公共数据库下载得到的特异基因序列用序 列比对软件Clustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入Primer premier 5. 0软件中，选取长度在20bp到30bp的DNA序列作为候选探针，分别将从GenBank上下载 的真菌的间区与自己选取的DNA序列进行比对，选取发卡结构、二聚体结构及错误引发结 构的 AG > -10kcl/mol 并且 Tm = 65V 士5°C的序列。
(2)阳性对照探针将上述从GenBank公共数据库下载得到的待检测的九种菌的 5.8S rDNA基因序列用序列比对软件Clustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区 段导入Primer premier 5. 0软件中，选取长度在20bp到30bp的DNA序列作为候选探针， 分别将从GenBank上下载的真菌的间区与自己选取的DNA序列进行比对。选取发卡结构、 二聚体结构及错误引发结构的AG > -10kcl/mol并且Tm = 65°C 士5°C的序列。3.探针合成将下表1中的探针序列的5’端延长10个T(表1所示的荧光探针 序列中没有包含延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备 用。4.探针筛选将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片 基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需 的特异、灵敏的探针。在本发明的一优选实施例中，选择了 35条长度在25bp士5bp、Tm = 65°C 士5°C 的探针，并通过120次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号 为NO. 16 (SEQ ID NO 16)的探针序列选自的九种菌的5. 8S rDNA，作为阳性对照用，编号 为W). 2的探针为空白对照探针，编号为W). 5的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号为 NO. 1的探针为荧光探针，编号NO. 3-N0. 4的2条探针序列(SEQ ID NO :3_SEQID NO 4)选 自乳酒假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO. 6-N0. 10的5条探针序列(SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 10)选自热带假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO. 11-NO. 15的5条 探针序列(SEQ IDNO =Il-SEQ ID NO :15)选自近平滑假丝酵母的18S-28S间区基因序列， 编号NO. 17-N0. 20的4条探针序列(SEQ ID NO :17_SEQ ID NO 20)选自克鲁斯假丝酵母 的18S-28S间区基因序列，编号N0. 21-NO. 23的3条探针序列(SEQ ID NO 21-SEQ ID NO 23)选自季也蒙假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO. 24-N0. 25的2条探针序列(SEQ ID NO :24-SEQID NO :25)选自葡萄牙假丝酵母的18S-28S间区基因序列，编号NO. 26-N0. 28 的3条探针序列(SEQ ID NO :26-SEQ ID NO :28)选自新生隐球菌的18S-28S间区基因序 列，编号NO. 29-N0. 35的7条探针序列(SEQ IDNO :29_SEQ ID NO :35)选自光滑假丝酵母 的18S-28S间区基因序列，编号NO. 36-N0. 38的3条探针序列(SEQ ID NO :36_SEQ ID NO 38)选自白色念珠菌的18S-28S间区基因序列。表1 本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌
权利要求
一种检测侵袭性真菌致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列a.从白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的rDNA的18S 5.8S或5.8S 28S内转录间区、5.8S rDNA选取的一种或多种DNA序列；b.所述a中选取的DNA序列的互补DNA序列；c.a或b中所述的DNA序列的互补RNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述a中从白色念珠菌、近平滑假丝 酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季 也蒙假丝酵母、新生隐球菌的rDNA的18S-5. 8S或5. 8S-28S内转录间区、5. 8S rDNA选取的 DNA片段具有SEQID NO :3_38、除去其中的5、16的核苷酸序列中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于还包含阳性对照探针、阴性探针和 荧光探针。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针选自所述白色念珠 菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光 滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的5. 8S rDNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述阳性对照探针具有SEQID NO 16 所示的核苷酸序列。
6.权利要求1所述的基因芯片在检测白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳 酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母或新生隐 球菌中的应用。
7.—种检测侵袭性真菌的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的基因芯片。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述基因芯片为权利要求2所述的基因-H-· I I心片。
9.权利要求7或8所述的试剂盒在检测白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、 乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母或新生 隐球菌中的应用。
全文摘要
本发明提供一种检测侵袭性致病真菌的基因芯片和试剂盒，其中基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述探针包含从白色念珠菌、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、乳酒假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、葡萄牙假丝酵母、光滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母、新生隐球菌的rDNA的18S-5.8S或5.8S-28S内转录间区(ITS)以及从上述九种真菌的5.8S rDNA中选取的DNA序列。利用本发明的基因芯片和试剂盒检测九种常见致病菌，操作简便，准确性高，重复性强。
文档编号C40B40/06GK101967507SQ20091015207
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月28日 优先权日2009年7月28日
发明者冯露, 喻群芳, 曹勃阳, 杨磊, 王磊 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司