专利名称：9个用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一类可用于预测原发性肝癌是 否复发的microRNA标志物以及用途。本发明还涉及检测所述microRNA标志物的芯片和试剂盒。
背景技术：
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例约占全球50%。肝癌的 恶性程度高，发展迅速，治疗困难，病死率高。因此，肝癌的尽早诊断就愈发显得迫切。任何事物的发生发展都处于内外因共同作用之下，内因为主，外因为辅。基因作为 生命的遗传介质，在生物体的生、老、病、死中处于基础内因的地位。绝大部分基因通过转录 生成核糖核酸，再翻译生成蛋白质而发挥生物学功能。microRNA (miR或miRNA，微小RNA)是一类在较高等的真核生物体内广泛存在的， 长度约18-26个碱基的单链RNA分子。它可以通过碱基配对原则特异性地与一些mRNA上 的靶位点相结合，引起靶mRNA降解或翻译抑制，进而在转录后水平对靶基因进行调控。microRNA来源于长度约为IOOObp的长链RNA初始转录产物(Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在细胞核中经Drosha酶剪切形成长度约60 80nt的具有茎环结构的 miRNA前体(Pre-miRNA)。Pre_miRNA转运至胞质后，被Dicer酶进一步切割成长约22nt的 双链miRNA。双链miRNA解开后，成熟的miRNA进入RNA诱导基因沉默复合物(RNA_induced silencing complex, RISC)，与互补mRNA完全或不完全配对，降解靶mRNA或阻遏其表达。尽管microRNA在细胞总RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地对所有具有 靶位点的mRNA产生调控作用，microRNA在生物体的发育乃至肿瘤的发生、发展过程所起的 作用仍不可小视。然而，迄今为止，本领域对于与肿瘤(如肝癌)相关的microRNA 了解甚少，因此本 领域迫切需要进一步地分离各种microRNA，尤其是与肿瘤的发生、转移、复发或检测有关的 microRNAο
发明内容
本发明的目的就是提供一类新的、可用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA 标志物。本发明的另一目的就是提供所述microRNA标志物的用途。在本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自⑴序列如SEQ ID NO :n所示的miRNA，其中η为选自1_9的正整数；或(ii)与 SEQ ID NO :n 所示序列互补的 miRNA。在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。在本发明的第二方面，提供了一种miRNA集(set)或组合(combination)，所述的 集或组合由序列如SEQ ID NO 1-9所示的9种miRNA所构成。
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在本发明的第三方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体 miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第一方面中所述的miRNA。在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞 转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第一方面中所 述的miRNA。在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构Seq正向-X-Seq反向 式 I，式I 中，Seq1自为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seqfi自为与Seq1自基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq1^P Seqg之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1^P Seq反向 不互补，并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构
权利要求
1.一种分离的miRNA，其特征在于，所述的miRNA选自(i)序列如SEQID NO :n所示的miRNA，其中η为选自1-9的正整数；或(ii)与SEQID NO :n所示序列互补的miRNA。
2.—种miRNA集，其特征在于，所述的集由序列如SEQ ID NO 1_9所示的9种miRNA所 构成。
3.一种分离的或人工构建的前体miRNA，其特征在于，所述的前体miRNA能在人细胞内 剪切并表达成权利要求1所述的miRNA。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA， 所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成权利要求1所述的miRNA。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有式I所示的结构Seq正向 _X_Seq反向 ，式I中，Seq1^1为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列， Seqfi^1为与Seq1^1基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq1^P Seqg之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1^P Seqfi自不互补，并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构 Seq正向一^ν丨丨X式II，Seq反向式II中，Seqra、Seq反向和X的定义如上述， I表示在Seq1^i 之间形成的碱基互补配对关系。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的miRNA，或权利要求4所述的多核苷酸。
7.权利要求1所述的miRNA的用途，其特征在于，用于制备预测原发性肝癌是否复发或 区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本的芯片或试剂盒。
8.一种miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括 固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于 SEQ ID NO 1-9所示的部分或全部序列。
9.如权利要求8所述的miRNA芯片的用途，其特征在于，用于制备预测原发性肝癌是否 复发或区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本的试剂盒。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求8所述的miRNA芯片。
全文摘要
本发明涉及9个用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物。具体地，本发明涉及一类可用于预测原发性肝癌是否复发的microRNA标志物。经检验证明，这些特异性的microRNA标志物可非常有效地区分原发性肝癌的有复发样本和无复发样本。本发明还涉及检测所述microRNA标志物的芯片和试剂盒。
文档编号C40B40/06GK102002490SQ20091019481
公开日2011年4月6日 申请日期2009年8月31日 优先权日2009年8月31日
发明者何祥火, 梁琳慧, 顾健人, 魏霖 申请人:上海市肿瘤研究所