专利名称：基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于随机基因突变方法领域。具体而言，本发明涉及基因搜寻系统所用的载体、随机基因调控方法、筛选高转移人肿瘤细胞株的方法、筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法、利用所述随机基因调控方法获得的全基因组随机突变文库及利用所述筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法筛选获得的基因的制药用途、所述基因的抑制剂的制药用途和所述基因的蛋白质表达产物的抑制剂的制药用途。
背景技术：
随着人类基因组计划的顺利完成，生命科学研究领域已进入后基因组时代。
基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步，更大的挑战将是如何确定基因的功能和破译全部的遗传信息U。目前很多遗传学技术被用来寻找控制癌症转移的基因，包括化学诱变DNA、逆转录病毒插入诱变、小型干扰RNA(siRNA)、核酸酶(ribozymes)、基因打靶(Shot-Gun)、转基因动物和生物芯片技术，这些方法功能基因组学研究方法广泛应用于癌症的研究，新基因的发现已经应用于恶性肿瘤的早期发现、诊断和治疗3_6。最近关于胰腺癌的全基因组测序分析显示胰腺癌约有63个基因突变，涉及到12个关键的信号转导通路7，其中核心通路包括只有单个基因突变占优势的通路，如KRAS信号转导通路；几个基因突变的通路，如TGF-P信号转导通路；许多基因突变的通路，如调节侵袭的整合素的信号转导通路，Guanine Triphosphatase (GTPase)依赖的信号转导通路等。这些关键信号转导通路的失调和频繁的基因突变足以解释胰腺癌自身独特复杂的生物学特性，也为深入理解胰腺癌转移的分子机制带来一定的难度。因此，确定胰腺癌频繁的基因突变和这些突变与其独特的生物学特性之间的联系对研究胰腺癌的转移具有很重要的作用。现阶段利用功能基因组学技术研究癌症转移的方法主要有微阵列分析、RNA干扰和插入突变等。微阵列是20世纪80年代末发展起来的以高密度为特征的可用于大规模检测基因表达差异的一项新的基因功能研究技术；主要原理是利用分子杂交原理将印有大量已知部分序列的DNA探针与检测样品杂交，通过检测杂交信号强度及数据处理，从而全面的对基因的表达进行定量分析；其主要优点是高通量，能对大量基因的表达情况进行比较8_1(1。利用生物芯片分析转移性和非转移性肿瘤之间基因表达的差异，现阶段已有研究者找到一些与癌症转移相关的基因。但是，生物芯片比较实验组和对照组表达差异得到的基因成千上万，为后续的分析带来了巨大困难，研究者必须具有很高的专业水平并且需要后续的功能验证，所得到的基因都是一些癌症转移相关基因。近年来，RNA干扰筛选肿瘤发生和转移相关基因方面取得了很大进步，利用该技术已经筛选出肿瘤发生相关的P53通路上新的关键基因、与上皮性肿瘤细胞的迁移即癌症转移第一步相关的基因、肝癌发生相关的新基因、黑色素瘤转移的相关基因n_16。然而，该技术需要提前知道靶基因的序列，才能设计出沉默此靶基因的dsRNA，这样会缩小基因筛选的范围，往往会漏掉一些未知基因；另外，RNAi技术只能将靶基因敲除，无法过表达某个基因，需要配合使用cDNA文库技术17，这样也限制其应用。插入突变是利用已知的外源DNA插入序列作为标记，不必事先确定基因表达和基因产物，破坏基因的结构而导致突变，可以直接验证个别基因与所筛选性状之间关系，是一种理想的功能基因组学研究方法。目前有文献报道利用该技术筛选到与肿瘤发生、转移相关基因，但是困扰该方法应用的问题在于其插入突变的效率，一方面需要外源DNA高效整合到基因组，另一方面需要将两个等位基因同时突变18。目前，利用插入突变进行功能基因组学研究应用较多的工具是转座子。1996年有研究报道应用逆转录病毒作为基因插入的工具并结合相应的表型筛选出新的肿瘤抑制基因tsglOl 19。除了逆转座子外，使用较多的有Sleeping Beauty和PiggyBac转座子,插入突变和标记基因组中的基因，然后根据相应的功能特征进行筛选突变细胞株，最后分离和克隆基因2°_24。Sleeping Beauty是第一个应用于哺乳动物细胞的DNA转座系统-SB转座子，有研究证实与逆转座子相比，其转座位点偏倚性相对小，免疫原性低，转座效率高等多项优势，可随机突变基因，对于基因功能研究和疾病研究均具有重要意义'PiggyBac是一种从飞蛾中分离出来的可移动的DNA元件，插入位点偏好于基因的内含子区域，且其整合频率高，受生物体种类的限制性较少。2005年首次证明了 piggyBac转座子系统在在哺乳动物细胞中能够实现高效稳定的转座26 ;且很多实验已证实PB转座系统携带的外源基因片段的能力强，最高可携带14. 3kb片段且不会影响转座效率；插入位点更多(67% )位于转录单 位附近或其中；转座效率高；转座后在细胞全套染色体上均有分布，基因覆盖率高27_29。此夕卜，有研究利用PB系统在小鼠胚胎干细胞中建立全基因组范围内的突变文库，结果显示其文库的基因覆盖率理想，易于发现新基因3°’31。因此，PiggBac转座子系统较为理想的高效插入突变工具，能在全基因组水平筛选基因中发挥重要作用的，而且更多影响编码基因的特征使其在功能基因组学研究中具有突出的优势。胰腺癌是预后最差的消化系统恶性肿瘤之一。在过去二十年内，关于其发生、发展、诊断、治疗研究取得了重要的进展，年平均死亡率与年平均发病率比例有所下降，但是仍不能改善胰腺癌患者的远期生存时间。由于胰腺特殊的解剖位置、高度侵袭的生物学特性使其难以早期发现，临床就诊时多为晚期患者，在病人体内已经发生转移，手术切除率小于20%，五年生存率仍然小于5%，其中转移是治疗失败的最主要原因32’33。肿瘤转移是指肿瘤细胞离开原发部位并在新器官或组织中生长的复杂过程，是一个多步骤的进程，包括癌细胞丧失黏附能力，血管生成，侵袭脉管，进入循环，逃避机体的免疫监视而存活，在毛细血管处停留，穿出血管壁进入周围组织，并在远处器官定位生长形成新的转移灶34。目前认为其发生的分子机制是这一复杂过程中的许多基因及其编码的蛋白质发挥了重要作用35’36。因此，找出背后的这些基因及其相关的遗传通路将是解决肿瘤转移的突破口。因此，需要一种独特的分子遗传学方法来研究胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的转移，该技术能直接确定基因突变和癌症转移的因果关系，非常高效地筛选到控制胰腺癌和/或其他恶性肿瘤转移的关键基因和候选通道，深入分析转移的分子机理，为胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的诊断和治疗奠定基础。
发明内容
因此，本发明的技术目的在于寻求一种高效的研究胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的转移、基因突变和癌症转移的因果关系及高效筛选控制胰腺癌和/或其他恶性肿瘤转移的关键基因和候选通道的方法，并利用所述方法筛选到的基因制备药物。
因此，本发明的第一方面涉及一种基因搜寻载体，其包含四环素反应元件、Piggbac转座子，优选地，所述四环素反应元件通过两段四环素反应元件拼接得到，优选地，所述基因搜寻载体还含有新霉素抗性基因，优选地，所述基因搜寻载体还含有质粒复制起点。本发明的第二方面涉及一种随机基因调控方法，其包括步骤I)将人肿瘤细胞株用cag-tTA质粒转染，获得稳定表达转录激活因子(tTA)的Tet-off细胞株，优选地，所述人肿瘤细胞株为人胰腺癌细胞株，最优选地，所述人肿瘤细胞株为人胰腺癌细胞株Aspc-I ；
2)将如上所述的基因搜寻载体和有效表达转座酶MPB的质粒共转染步骤I)获得的Tet-off细胞株，获得全基因组纯合细胞突变体，优选地，所述有效表达转座酶的质粒为MPB37。本发明的第三方面涉及一种筛选高转移人肿瘤细胞株的方法，其包括步骤3)将有效量的如上所述的步骤2)中获得的全基因组纯合细胞突变体接种裸鼠，优选地，所述裸鼠为BALB/C裸鼠(购自中国药品生物制品检定所)；4)待接种的裸鼠体内长出肿瘤或显现病态后处死小鼠，分离获得转移灶并进行体外原代培养，获得与对照的人肿瘤细胞株相比高转移和/或低转移的人肿瘤细胞株，所述对照的人肿瘤细胞株为人胰腺癌Aspc-I细胞株。本发明的第四方面涉及一种筛选提高和/或降低人肿瘤细胞株转移的基因的方法，其包括步骤5)将如上所述的步骤4)中获得的高转移和/或低转移的人肿瘤细胞株通过Splinkette PCR的方法克隆出基因搜寻载体周围的序列，再通过blast比对找到该位置的基因。本发明的第五方面涉及一种利用如本发明第二方面所述的随机基因调控方法获得的全基因组随机突变文库。本发明的第六方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌。本发明的第七方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因，其用做抗肿瘤的药物，优选地，所述肿瘤为胰腺癌。本发明的第八方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌，优选地，所述抑制剂为siRNA。本发明的第九方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因的抑制齐IJ，其用作抗肿瘤的药物，优选地，所述肿瘤为胰腺癌，优选地，所述抑制剂为siRNA。本发明的第十方面涉及一种利用本发明第4方面所述的方法获得的基因的蛋白质表达产物的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌，优选地，所述抑制剂为特异性抗利用本发明第4方面所述的方法获得的基因的蛋白质表达产物的抗体，优选地，所述抗体为单克隆抗体。本发明所构建的基因搜寻载体、利用所述基因搜寻载体和表达转录激活因子(tTA)的Tet-off细胞株以及有效表达转座酶MPB的质粒随机调控基因的方法、筛选高转移人肿瘤细胞株的方法、筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法为研究胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的转移、直接确定基因突变和癌症转移的因果关系、高效地筛选到控制胰腺癌和/或其他恶性肿瘤转移的关键基因和候选通道、深入分析胰腺癌和/或其他恶性治疗转移的分子机理、为胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的诊断和治疗奠定基础提供了一整套有利的工具，利用所述随机调控基因的方法获得的全基因组随机突变文库为筛选其他控制目标形状的基因提供了基础。利用本发明上述方法获得的基因，该基因的抑制剂，该基因的表达产物及该基因的表达产物的抑制剂，可以开发特异性抗肿瘤的药物。
图I :显示了本发明所述随机基因突变调控技术的原理。基因搜寻载体(GSV)包括piggyBac转座子骨架、两个四环素反应元件、新霉素抗性基因、质粒的复制起点。piggyBac转座子在转座酶的帮助下可以通过“剪切-粘贴”的机制整合到基因组；四环素反应元件受转录激活因子(tTA)的激活，启动转录；新霉素抗性基因作为筛选标记，可以降解新霉素药物G418 ;质粒的复制起点是质粒扩增复制必不可少的元件。当基因搜寻载体整合到编码基 因内并且受tTA的激活后转录方向与该基因转录方向相反时，可以得到与该基因转录产物互补的反义RAN(AntisenseRNA),从而阻断该基因的翻译(A图)；若GSV插入到编码基因之间且启动转录方向与该基因相同时，则可增强该基因的表达(B图)。四环素类衍生物(DOX)可结合TtTA并诱导其构象发生变化，阻碍其结合四环素反应元件，从而不能启动转录；因此，可以通过添加DOX来实现对插入基因的表达人为控制。图2 :显示了利用随机基因突变调控技术平台筛选控制胰腺癌转移的关键基因的实验流程图。首先在人胰腺癌细胞株(Aspc-I)建立Tet-off表达调控系统得到Tet-off细胞株，然后利用基因搜寻载体建立全基因组纯合细胞突变库，经过裸鼠体内筛选得到高转移细胞株，再经过Dox进行基因突变和功能的因果关系验证，最后通过分子克隆和blast比对得到候选基因。图3 :A显示了构建基因搜寻载体的流程图，其包括TATA_14Tet片段和Neo-PA-Ori片段的获取与拼接，TATA-14Tet-Neo-PA_0ri片段插入piggyBac转座子及CMV启动子的插入显示了本发明构建的基因搜寻载体的图谱。图4 :显示了荧光素酶报告基因检测转录激活因子(tTA)的表达利用荧光素酶报告基因检测tTA对四环素反应元件的激活活性以及受DOX的调控程度，与对照的Aspc-I细胞株相比，2B6、2D2、5A3三个克隆的tTA活性较高，且受DOX的调控超过500倍。图5 :显示了 GSV与MPB的浓度摸索。GSV的高效整合需要MPB的帮助，为了得到足够大的全基因组纯合细胞突变库，需要合适的GSV和MPB的浓度，且尽量避免GSV的随机插入。MPB能大大提高GSV的整合效率(A图)，为了减少GSV随机插入，要尽量降低GSV的转染量，但是GSV的含量太少会影响后续得到的突变克隆数目，因此需要综合考虑来决定GSV用量，随着GSV的增加，所得到克隆数目也逐渐增多(B图)，GSV与MPB的比例也决定所得至IJ突变克隆的多少，有文献报道随着MPB量的增加会出现过度抑制现象，故将GSV用量固定在25ng和50ng来摸索合适的MPB用量(C图，D图)。图6 :显示了 DOX验证高转移胰腺癌细胞株M45转移特性与基因突变的因果关系的结果。A、C为接种M45后，解剖经口喂食DOX裸鼠的肉眼下的肺脏和肝脏，B、D是未在应用水中添加DOX组的肉眼下裸鼠肺脏和肝脏。
图7 :显示了 DOX验证高转移胰腺癌细胞株M45转移特性与基因突变的因果关系的结果。A、C为接种M45后，解剖经口喂食DOX裸鼠的显微镜下(20X)的肺脏和肝脏，B、D是未在应用水中添加DOX组的显微镜下(20X)裸鼠肺脏和肝脏，图中箭头所示为转移灶。图8 :显示了基因克隆与定位的结果。A中为通过splinkette PCR后得到的GSV两端PCR产物大小，B是将PCR产物测序后进行基因定位。
具体实施例方式本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，发明一种随机基因突变调控的方法并使用该方法筛选控制胰腺癌和/或其他恶性肿瘤的转移的基因。该方法的特点包括能产生全基因组纯合基因突变；提供全基因组基因筛选和基因功能分析；同时发现并证实其基因突变和功能表达的关系；系统性基因功能定位和分析其在遗传和生化通路中的功能特点；快速分离与疾病有关基因和变阻器式基因表达调控。该方法的原理是通过基于能在真核细胞中高效整合的piggyBac转座子(GI 226433913)构建基因搜寻载体(gene search vector, GSV),将其随机插入基因组,其中GSV所携带的四环素反应元件(TRE，GI =76667907)优选为利用两段四环素反应元件拼接得到，这样转录激活因子对其的激活作用更强，启动转录的距离更远，能够受到转录激活因子tTA的激活，piggbac转座子在真核细胞中能高效整合，并且整合位点偏向于编码基因，并且在插入基因组后可以通过转座酶进行无痕切除，这些都符合一个理想的基因搜寻载体的要求。在tTA的作用下，GSV中的14Tet能够很强地启动附近DNA序列的转录；若转录出的RNA与上游基因转录方向相反，则可得到反义RNA，与上游基因的mRNA结合从而阻止该基因的翻译表达；若方向相同，则可过表达下游基因，故通过该载体可将插入位点附近的基因突变。GSV中还可以包含新霉素抗性基因，该抗性基因在真核细胞中可以利用G418筛选阳性克隆，在原核细胞表现为卡那霉素抗性，用于筛选阳性菌落。当然，所述GSV中的抗性基因可以为任何适于可以在真核细胞和原核细胞中分别进行抗性筛选的原件。此外，转录激活因子tTA与TRE的结合还受到四环素类药物例如强力霉素(Doxcyclin)的调控，通过添加或者不添加DOX可以人为的调控tTA是否激活TRE启动转录，从而能够同时发现并证实其基因突变和功能表达的关系，故是一种突变调控技术，其原理如图I所示。本领域技术人员熟知，为了实现或更好地实现本发明的目的，本发明的基因搜寻载体还可以包含质粒复制起点，该质粒复制起点并无特殊要求，只要其能有效起始质粒在相应宿主中的复制即可，如P15A复制子；利于外源片段插入的多克隆位点；调控目标基因转录翻译的四环素反应元件，如TRE ;能在真核细胞中随机整合的转座子，如PiggyBac ;利于在原核系统中筛选阳性菌落的氨苄青霉素抗性基因；能有效启动基因搜寻载体在宿主细胞中转录翻译的启动子，如P-CMV ;以及其他质粒常见元件，如增强子、便于基因表达检测的荧光蛋白基因、终止子，
坐寸o本发明是通过如下技术方案来实行组建基于piggyBac转座子的基因搜寻载体；建立人胰腺癌Aspc-I细胞株Tet-off表达调控系统和高效率基因搜寻载体转化方法；构建Aspc-I细胞全基因组纯合基因突变细胞库；裸鼠体内筛选突变后高转移胰腺癌细胞株；体外原代培养转移灶；验证筛选出的高转移细胞株与基因突变的因果关系(通过四环素调控的特异性转录激活因子活性激活或失活)；克隆和鉴定候选基因，见图2。
本领域技术人员公知，在保证实现基因搜寻的目的的前体下，所述基因搜寻载体还可以包含其他功能元件，所述功能元件均被有效连接，以实现在原核宿主细胞中被复制、扩增、检测、筛选、分离或纯化，和/或在真核宿主细胞中被复制、扩增、与宿主基因组整合、转录、翻译、检测、筛选、分离或纯化的目的。同时，本领域技术人员公知，在保证实现基因搜寻的目的的前提下，所述基因搜寻载体的组成元件的顺序可以进行适当地调整，例如，所述原核抗性基因和真核抗性基因的位置可以相互调换。这样的变形也包括在本发明的范围内。本领域技术人员理解，本发明所述基因搜寻载体内所使用的各个组成元件均是本领域公知的作用元件，其具体的核苷酸序列可以方便地在本领域公知的数据库中找到并适用。本领域技术人员公知，本发明所述的随机基因调控方法、筛选高转移和/或低转移人肿瘤细胞株的方法、筛选提高和/或降低人肿瘤细胞株转移的基因的方法不仅适用于人胰腺癌肿瘤细胞系，也适用于其他人肿瘤细胞系。
本发明所述方法获得的全基因组随机突变文库随机产生且突变性状能够遗传，包含的突变的基因从概率上覆盖了整个基因组，可以应用于筛选待检测的作用于目标性状的控制基因或信号通路，所述目标性状例如但不限于加速肿瘤细胞转移、降低肿瘤细胞转移及筛选肿瘤发生、耐药等，也可通过流式细胞术FACS筛选细胞表面表达某种特异性分子标记的细胞。本领域技术人员公知，本发明所述方法获得的基因可以应用于抗肿瘤药物的制备，此时，所述基因为抑制肿瘤细胞转移的基因。所述基因可以按照公知的基因治疗药物的制备形式予以制备，例如所述基因可以连接入腺病毒载体以重组载体的形式制备，或所述基因可以连接入原核或真核表达载体，在相应的宿主细胞中表达、纯化，以纯化的蛋白质的形式提供。本领域技术人员公知，本发明所述方法获得的基因的抑制剂可以应用于抗肿瘤药物的制备，此时，所述基因为促进肿瘤细胞转移的基因。所述基因的抑制剂可以是利用RNA干扰原理实现治疗目的的siRNA。对于这样的siRNA的设计及制备方法，本领域已经有大量可选的文献可供参考。所述基因的抑制剂也可以是microRNA等直接抑制靶基因的转录和/或表达的作用元件。本领域技术人员公知，本发明所述方法获得的基因的蛋白质表达产物的抑制剂可以应用于抗肿瘤药物的制备，此时，所述基因为促进肿瘤细胞转移的基因。所述基因的蛋白质表达产物的抑制剂可以是中和所述基因的蛋白质表达产物的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。本领域技术人员公知，本发明所述方法能够治疗的肿瘤绝不仅限于本发明下述实施例所例证的胰腺癌。由于本发明的原理在于利用肿瘤细胞在转染本发明所述的载体后发生的肿瘤转移性状的可测表现筛选与之对应的控制基因，因此所测定的基因直接与所使用的检测用的肿瘤细胞系在功能上相关。由于本发明所述的载体对所使用的肿瘤细胞系并无特殊要求，因此，本发明所述药物能够治疗的肿瘤也并无特殊的限定。下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实施例I主要实验材料限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司，引物、测序、Taq聚合酶均购自Invitrogen公司，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司，Aspc-I细胞株(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)，胎牛血清、DMEM培养基、PBS购自Hyclone公司，FugenHD购自Roche公司，各种细胞培养耗材均购自Corning公司，嘌呤霉素(puromycin)、Luciferin底物购自 Invivo 公司，新霉素(neomyicn,G418)购自 Merck 公司，胸腺缺陷裸鼠(BALB/c nu/nu)雌鼠购于中国药品生物制品检定所。实施例2 :基因搜寻载体的组建 本发明中基因搜寻载体包括四环素反应元件、新霉素抗性基因、质粒复制起点和Piggbac转座子等几个部分，需要将这些核心部分拼接在一起，总流程见图3A，具体包括以下几个部分I. TATA-14Tet片段的获取，该部分包括真核基因转录起始点TATA盒和2个四环素反应元件；利用限制性内切酶Smal、XhoI和EcoRI分别单切和双切pUHD13_3质粒38，方法如下SmaI单切质粒pUHD13_3,反应体系如下述表I所示表I :
成分(含量)体积((J)
pUHD13-3质粒2咫10XBuffer45SmaI (20U/^il) 0.5 u I
加入去离子水至总体积((J)50反应条件为25 °C孵育此。XhoI和EcoRI双切质粒pUHD13_3，反应体系如下述表2所示表2 成分(含量)体积((J)
pUHD13-3质粒2咫
10XBuffer45
IOOXBSA0.5(^1
EcoRI (20U/^1)0.5(^1
XhoI (2OU/0)0.5 u I
加入去离子水至总体积((J)50反应条件为37 °C水浴此。凝胶分别回收纯化约3kb及0. 45kb酶切产物，将回收后的产物16°C连接过夜，反应体系如下述表3所示
权利要求
1.一种基因搜寻载体，其包含四环素反应元件、Piggybac转座子，优选地，所述四环素反应元件通过两段四环素反应元件拼接得到，优选地，所述基因搜寻载体还含有新霉素抗性基因，优选地，所述基因搜寻载体还含有质粒复制起点。
2.一种随机基因调控方法，其包括步骤 1)将人肿瘤细胞株用cag-tTA质粒转染,获得稳定表达转录激活因子的Tet-off细胞株，优选地，所述人肿瘤细胞株为人胰腺癌细胞株，最优选地，所述人肿瘤细胞株为人胰腺癌细胞株Aspc-I ； 2)将权利要求I所述的基因搜寻载体和有效表达转座酶MPB的质粒共转染步骤I)获得的Tet-off细胞株，获得全基因组纯合细胞突变体，优选地，所述有效表达转座酶的质粒为 mpb。
3.一种筛选高转移人肿瘤细胞株的方法，其包括步骤 3)将有效量的权利要求2步骤2)中获得的全基因组纯合细胞突变体接种裸鼠，优选地，所述裸鼠为BALB/C裸鼠； 4)待接种的裸鼠体内长出肿瘤或显现病态后处死小鼠，分离获得转移灶并进行体外原代培养，获得与对照的人肿瘤细胞株相比高转移和/或低转移的人肿瘤细胞株，所述对照的人肿瘤细胞株为人胰腺癌Aspc-I细胞株。
4.一种筛选提高和/或降低人肿瘤细胞株转移的基因的方法，其包括步骤 5)将权利要求3步骤4)中获得的高转移和/或低转移的人肿瘤细胞株通过Splinkette PCR的方法克隆出基因搜寻载体周围的序列，再通过blast比对找到该位置的基因。
5.一种利用如权利要求2所述的随机基因调控方法获得的全基因组随机突变文库。
6.一种利用权利要求4所述的方法获得的基因在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌。
7.一种利用权利要求4所述的方法获得的基因，其用做抗肿瘤的药物，优选地，所述肿瘤为胰腺癌。
8.一种利用权利要求4所述的方法获得的基因的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌，优选地，所述抑制剂为siRNA。
9.一种利用权利要求4所述的方法获得的基因的抑制剂，其用作抗肿瘤的药物，优选地，所述肿瘤为胰腺癌，优选地，所述抑制剂为siRNA。
10.一种利用权利要求4所述的方法获得的基因的蛋白质表达产物的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，优选地，所述肿瘤为胰腺癌，优选地，所述抑制剂为特异性抗利用权利要求4所述的方法获得的基因的蛋白质表达产物的抗体，优选地，所述抗体为单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途。具体而言，本发明涉及基因搜寻系统所用的载体、随机基因调控方法、筛选高转移人肿瘤细胞株的方法、筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法、利用所述随机基因调控方法获得的全基因组随机突变文库及利用所述筛选提高人肿瘤细胞株转移的基因的方法筛选获得的基因的制药用途、所述基因的抑制剂的制药用途和所述基因的蛋白质表达产物的抑制剂的制药用途。利用本发明上述方法获得的基因，该基因的抑制剂，该基因的表达产物及该基因的表达产物的抑制剂，可以开发特异性抗肿瘤的药物。
文档编号C40B40/08GK102747096SQ20111009629
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者常德, 李利民 申请人:中国医学科学院基础医学研究所